CytoCount Nr kat. S 2366 Wydanie z

Transkrypt

1 CytoCount Nr kat. S 2366 Wydanie z Przeznaczenie Wstęp Do badań diagnostycznych in vitro. Produkt CytoCount jest przeznaczony do stosowania w cytometrii przepływowej. CytoCount stanowi zawiesinę fluorescencyjnych mikrokuleczek, które mogą być stosowane jako populacja porównawcza dla zliczenia liczby danej populacji leukocytów. CytoCount można stosować dla próbek krwi obwodowej, produktów leukoferezy, produktów krwi o zmniejszonej liczbie leukocytów oraz próbek krwi z pępowiny. Zliczenie bezwzględnych poziomów podzestawów komórek w próbkach klinicznych ma podstawowe znaczenie, np. w monitorowaniu stanu odporności pacjentów z obniżoną odpornością (liczenie limfocytów T CD4+), w określaniu czasu leukoferezy u pacjentów, którzy są kandydatami do autotransplantacji (liczenie hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+) oraz w ocenie produktów krwi z obniżoną liczbą leukocytów (liczenie pozostałych krwinek białych) (1). Liczenie komórek można wykonać stosując technikę liczenia z użyciem pojedynczej lub podwójnej platformy przy zastosowaniu metod cytometrii. W technice wykorzystującej pojedynczą platformę bezwzględne zliczanie wyróżnionych badanych komórek prowadzi się w próbce o ściśle określonej objętości. Do określenia objętości analizowanej próbki można stosować dodatek fluorescencyjnych kuleczek wzorcowych o znanym stężeniu, takich jak CytoCount. Metoda wykorzystująca pojedynczą platformę posiada mniej czynników wpływających na zmienność w porównaniu do wcześniej powszechnie stosowanej techniki wykorzystującej podwójną platformę, a badania wieloośrodkowe wykazały, że zapewnia lepszy współczynnik wariancji (CV) i ryzyko generowania wyników z odchyleniami jest niższe (1). Zasada testu Dokładnie zmierzona objętość badanej próbki zostaje wybarwiona odpowiednimi przeciwciałami skoniugowanymi z fluorochromem. Do liczenia CD4 można wybrać przeciwciała przeciwko CD45, CD4, CD8 i CD3. Do liczenia CD34 najczęściej stosuje się połączenie anty-cd45/fitc i anty-cd34/rpe. Po inkubacji ze skoniugowanym przeciwciałem przeprowadza się lizę krwinek czerwonych. Po dokonaniu lizy do próbki dodaje się dokładnie zmierzoną objętość kuleczek CytoCount stosując tzw. pipetowanie odwrotne (opis podano w punkcie Ogólna procedura). Objętość kuleczek powinna być taka sama jak objętość próbki. Próbka jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej, a badane komórki są badane przy zastosowaniu zalecanej strategii bramkowania (2,3). Liczba kuleczek CytoCount zostaje uzyskana przez ustawienie regionu wokół kuleczek na wykresie punktowym, gdzie kuleczki są wyraźnie oddzielone od zabarwionych komórek. Bramkowane zdarzenia kuleczek są przedstawione w czasie wobec histogramu FSC, a region zostaje narysowany wokół mono-dyspersyjnych zdarzeń. Bezwzględna liczba badanych komórek (komórki/ L) zostaje obliczona za pomocą następującego równania: Liczba komórek policzonych (np. CD4+ lub CD34+) x stężenie CytoCount x współczynnik rozcieńczenia Liczba policzonych kuleczek CytoCount Definicje: Liczba policzonych komórek: Np. liczba CD4+ lub CD34+ uzyskana za pomocą zalecanej strategii bramkowania (2, 3). Liczba policzonych kuleczek CytoCount Liczba zdarzeń kuleczek z tej samej próbki co badane komórki. Stężenie CytoCount : Liczba kuleczek/ L podana na fiolce. Współczynnik rozcieńczenia: Współczynnik rozcieńczenia oryginalnej próbki (procedura została zoptymalizowana dla wykonania analizy 10 6 leukocytów i dlatego też oryginalną próbkę często należy rozcieńczyć przed wykonaniem analizy). Zaleca się stosowanie techniki, która nie wymaga płukania próbki, ponieważ mogłoby to prowadzić do utraty związku pomiędzy liczbą krwinek a objętością krwi i wówczas nie byłoby możliwe dokładne obliczenie bezwzględnych liczb komórek (1) Agregacja kuleczek kontroli liczenia jest dobrze znanym zjawiskiem (1). Kuleczki CytoCount charakteryzują się szczególnie niską liczbą agregacji (poniżej 3%) ułatwiając w ten sposób bramkowanie kuleczek. Jeśli zostanie zauważona większa liczba agregacji CytoCount lub podejrzewa się wystąpienie błędu w związku z produktem, prosimy o skontaktować się z naszym Działem Pomocy Technicznej. Odczynnik dostarczony Wartości liczbowe Przechowywanie Środki ostrożności CytoCount stanowi zawiesinę polistyrenowych fluorokuleczek o wielkości 5,2 m w wodnym roztworze zawierającym środek powierzchniowo czynny. Kuleczki CytoCount zawierają mieszaninę firmowych barwników z emitujących światło o szerokim zakresie. Barwniki stanowią nierozpuszczalne w wodzie, fluorescencyjne związki nałożone równomiernie na kuleczki podczas procesu wytwarzania. Barwniki zostają wzbudzone przy fali 488 nm i emitują światło przy fali nm. Produkt CytoCount jest dostarczany jako pojedyncza fiolka zawierająca 17 ml zawiesiny kuleczek o stężeniu około 1100 kuleczek/ L. Dokładną liczbę kuleczek na L podano na etykiecie fiolki. Zawartość jednej fiolki wystarcza do wykonania około 150 testów (100 L na test). Stężenie kuleczek (C) i odpowiednie odchylenie standardowe (S) podano na etykiecie fiolki jako liczbę/ L. Liczba ta została uzyskana przez policzenie produktu na liczniku cząstek Coulter a Z1. Standardowe odchylenie stężenia kuleczek ma niewielki udział w łącznej niepewności wyniku analitycznego. Przechowywać produkt w ciemnym miejscu w temp. 2-8 C. Nie stosować po upływie daty ważności podanej na fiolce. Jeśli produkt jest przechowywany w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi zweryfikować takie warunki. Jednorazowo nie pozostawiać fiolki w mikserze obrotowym w temperaturze pokojowej przez okres dłuższy niż 2 godziny. 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. ( ) S 2366/PL/TIA/ p. 1/5

2 Rozproszenie boczne 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN 3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. W celu uniknięcia wycieku przechowywać CytoCount szczelnie zamknięty w pozycji pionowej. Przed użyciem kuleczki CytoCount ponownie dokładnie wymieszać, aby uzyskać zawiesinę. Intensywne mieszanie kuleczek CytoCount może wprowadzić pęcherzyki powietrza do płynu, co może zaniżyć planowaną pipetowaną objętość kuleczek CytoCount. Zaleca się delikatne obracanie (np. na mikserze obrotowym lub stole obrotowym do probówek). 4. Należy uważać, aby nie stracić zawiesiny CytoCount przed ponownym przygotowaniem zawiesiny. W przeciwnym razie liczba kuleczek nie będzie ważna. 5. Istotne znaczenie ma zastosowanie tej samej kalibrowanej pipety oraz tzw. mokrej końcówki w pipetowaniu odwrotnym zarówno dla próbki, jak i dla kuleczek CytoCount. Ważne jest, aby objętość kuleczek CytoCount i objętość próbki była dokładna. Objętości odczynników przeciwciał i odczynnika zastosowanego do lizy nie mają znaczenia w związku z oznaczeniem bezwzględnej liczby, istotny jest wyłącznie stosunek pomiędzy objętością próbki a objętością kuleczek. Ogólna procedura 1. Rozcieńczyć oryginalną próbkę do około 10 6 leukocytów na 100 L. Zwrócić uwagę na dokładny Współczynnik Rozcieńczenia. W niektórych przypadkach rozcieńczenie nie jest wymagane. 2. Za pomocą pipety przenieść 100 L próbki zawierającej 10 6 leukocytów do probówki. Zastosować pipetowanie odwrotne (patrz wskazówki poniżej). 3. Wykonać barwienie i lizę próbki zgodnie z instrukcją producenta. Dla zliczenia CD4+ zalecamy stosowanie Dako UtiLyse, nr kat. S 3325 lub S Dla zliczenia CD34+ zalecamy stosowanie Dako EasyLyse, nr kat. S W obu przypadkach zaleca się wykonanie lizy bez przemywania. 4. Wyjąć kuleczki CytoCount z miejsca, w którym są przechowywane w temp. 2-8 C. Należy upewnić się, czy nakrętka jest dokręcona, aby zapobiec wyciekowi i dokładnie wymieszać, aby ponownie uzyskać jednolitą zawiesinę kuleczek. Unikać mechanicznego mieszania, np. przy pomocy mieszadła, które może powodować wprowadzenie pęcherzyków powietrza mogących zaniżyć rzeczywistą objętość pipetowanych kuleczek. Wskazane jest umieszczenie kuleczek na mikserze obrotowym na 5-60 minut, aby upewnić się, że do chwili ich wykorzystania kuleczki tworzą zawiesinę. 5. Przed zastosowaniem pozostawić kuleczki do osiągnięcia temperatury pokojowej. 6. Dodać 100 L CytoCount do wybarwionego lizatu próbki. Przenoszenie za pomocą pipety zarówno próbki jak i kuleczek CytoCount powinno odbywać się za pomocą tej samej skalibrowanej pipety i techniki odwróconego pipetowania mokrą końcówką (1) (patrz wskazówki poniżej). 7. Przed pobraniem delikatnie mieszać próbkę i kuleczki na mieszadle przez 3 sekundy, aby zapewnić równomierny rozkład kuleczek CytoCount w całej próbce. 8. Pobrania próbek należy dokonać w ciągu 4 godzin od chwili dodania kuleczek CytoCount dla zapewnienia dokładnego stężenia kuleczek w próbce. Ponadto należy zapoznać się z treścią ulotek załączonych do przeciwciała i odczynników lizy w zakresie maksymalnego czasu inkubacji. 9. Pobrać przynajmniej 1000 kuleczek CytoCount i minimum 100 badanych komórek (1). 10. Nie zaleca się rozproszenia czołowego światła (FSC) jako parametru progowego dla zbierania danych, ponieważ może ono wykluczyć niektóre kuleczki CytoCount w związku z ich małą wielkością 5,2 m. Zaleca się stosowanie kanału stosowanego dla FITC (często zwanego FL1) jako parametru progowego. Alternatywna metoda polega na ustawieniu wartości progu FSC na zero i pobraniu przez miejsce niebramkowane w dolnym lewym rogu FSC wobec rozproszenia bocznego światła (SSC) wykresu punktowego (R8 na rys. 1). Wyeliminuje to większość szczątek bez wykluczenia kuleczek CytoCount (4). Rozproszenie czołowe ( ) S 2366/PL/TIA/ p. 2/5

3 Rys.1 Rozproszenie czołowe a rozproszenie boczne obrazujące normalną próbkę krwi. Próg ustawiono na parametr FSC. Aby uniemożliwić wykluczenie kuleczek CytoCount, próg FSC ustawiono na zero. Dla wyeliminowania szczątek niebramkowanie (R8) ustawiono w dolnym lewym rogu. 11. Należy pamiętać o zapisaniu parametru czasu podczas pobierania. 12. Przed rozpoczęciem pobierania należy ustabilizować prędkość przepływu. Wskazówki, technika odwróconego pipetowania mokrą końcówką Tą samą pipetę zastosować do odmierzania próbki i kuleczek. Dla każdego odczynnika stosować czyste końcówki pipety. Przyjęcie takiej samej techniki odmierzania zarówno dla próbki jak i dla kuleczek zapewni bardziej spójne wyniki. Próbka: 1. Przycisk docisnąć do drugiego oporu, zanurzyć końcówkę w płynie i zassać próbkę. Następnie nacisnąć przycisk do pierwszego oporu, aby odpipetować próbkę. Końcówka pipety powinna zawierać nadmiar płynu. 2. Powtarzać ten krok przynajmniej dwa razy utrzymując końcówkę pipety w próbce. 3. Teraz końcówka pipety jest gotowa do użycia. Przycisk docisnąć do drugiego oporu, zanurzyć końcówkę w płynie i zassać próbkę. Ostrożnie wyjąć końcówkę pipety z próbki i delikatnie wytrzeć końcówkę pipety bibułą w celu usunięcia nadmiaru płynu, uważając, aby nie dotknąć otworu pipety, ani niechcący nie usunąć próbki z wnętrza końcówki. 4. Należy starać się utrzymywać pipetę w pozycji pionowej. Sprawdzić, czy w końcówce obecne są pęcherzyki powietrza. Jeśli pęcherzyki są obecne przenieść płyn z powrotem do próbki i powtórzyć procedurę pobierania próbki. 5. Opróżnić próbkę do pierwszego oporu przycisku. Po opróżnieniu próbki w końcówce pipety powinny być obecne resztki płynu. Nie dotykać ścianek probówki podczas wyjmowania końcówki. Kuleczki: 6. Przygotować pipetę zgodnie z instrukcją dla próbki (kroki 1-3). 7. W celu opróżnienia roztworu kuleczek umieścić końcówkę pipety na ściance probówki nad powierzchnią próbki. Ustawienie probówki i pipety lekko pod kątem ułatwi tę czynność. Opróżnić do pierwszego oporu przycisku, po opróżnieniu płynu w końcówce pipety powinny być obecne resztki płynu. 8. W celu dalszego pipetowania kuleczek umieścić końcówkę we fiolce CytoCount i zassać więcej zawiesiny kuleczek bez opróżniania resztek płynu pozostałego w końcówce po pierwszym pipetowania. 9. Jeśli końcówka nie stykała się z próbką resztę płynu w końcówce opróżnić do fiolki CytoCount. Jeśli reszta płynu zostanie wylana, ilość odczynnika nie będzie już wystarczać do wykonania 150 próbek. Liczenie CD34 i CD4 Procedura dla liczenia komórek macierzystych CD34+ lub limfocytów T CD4+ przy użyciu CytoCount Próbkę należy wybarwić przeciwciałami skoniugowanymi z fluorochromem oraz wykonać lizę erytrocytów, patrz krok 3 Ogólnej procedury. Do identyfikacji komórek macierzystych CD34+ zalecamy stosowanie strategii bramkowania ISHAGE (1, 2), a dla zliczania komórek CD4+ strategii bramkowania CD45/SSC (3). CytoCount jest zoptymalizowany do stosowania z 100 L próbki zawierającej do 10 6 leukocytów. Oznaczenie zdarzeń CytoCount : 1. Wykonać wykres punktowy kanału fluorescencji użytego dla R-fikoerytryny (najczęściej zwany FL2) wobec SSC, kuleczki CytoCount są widoczne w prawej górnej ćwiartce wykresu. 2. Narysować region obejmujący populację kuleczek CytoCount, upewniając się, że jest on poza skalą na osi SSC pozwalając na objęcie wszystkich kuleczek CytoCount (R6 na wykresie 2A). Należy uważać, aby nie zawierać w regionie żadnych kuleczek, które nie są kuleczkami CytoCount. Uwaga: Połączenie wykresu punktowego z zastosowaniem R-fikoerytryny wobec SSC nie może być stosowane, jeśli CD45 jest stosowane wraz z R-fikoerytryną, ponieważ kuleczki będą się nakładać na wybarwione neutrofile. W takim przypadku dla oznaczenia liczby kuleczek należy zastosować kanał FITC lub RPE- Cy5. 3. Wykonać wykres punktowy czasu wobec FSC (wykres 2B) i bramkować taki wykres na region 6 z wykresu 2A. 4. Narysować drugi region (R7 na wykresie 2B) obejmujący populację mono-rozproszonych kuleczek CytoCount unikając wszelkich zdarzeń, które mogą leżeć poniżej lub powyżej FSC w porównaniu do głównej populacji. 5. Utworzyć logiczne połączenie bramkowania R6 i R7 (G7) w celu bardziej precyzyjnego określenia populacji kuleczek CytoCount (G7=R6 i R7). ( ) S 2366/PL/TIA/ p. 3/5

4 Rozproszenie boczne Rozproszenie czołowe Wykres 2A Wykres 2B R7 Czas (512,00 sekund) Rys. 2. Wykres 2A: CD34/RPE wobec rozproszenia bocznego obrazujące próbkę krwi obwodowej od pacjenta ze stymulacją czynnika wzrostu. Region został zakreślony wokół populacji kuleczek (R6). W celu objęcia wszystkich kuleczek CytoCount region R6 musi sięgać górnej granicy rozproszenia bocznego lub musi być umieszczony poza skalą. Wykres 2B: Czas wobec rozproszenia czołowego bramkowanego na zdarzenia R6. Aby określić liczbę kuleczek CytoCount rysowany jest region wokół kuleczek mono-rozproszonych na wykresie 2B (R7). Liczbę tę należy zastosować jako Liczbę policzonych kuleczek CytoCount podczas obliczania bezwzględnej liczby populacji badanych limfocytów. Czas jako kontrola jakości platformie Rozwiązywanie problemów Zastosowanie czasu jako wewnętrznej kontroli jakości dla oznaczeń wykonanych na pojedynczej Najnowsze badania wykazały, że liczba kuleczek pobranych w ustalonym czasie jest znacząco stała dla większości cytometrów przepływowych. Stąd też użytkownik może dla każdej nowej serii kuleczek wyprowadzić średnią liczbę kuleczek ± zakres 2 SD Każda próbka z liczbą kuleczek poza tym zakresem wskazuje na potencjalny błąd pipetowania i próbkę należy ponownie wybarwić (5). Bezwzględna liczba komórek wyższa niż spodziewana Bezwzględna liczba komórek, która jest wyższa niż spodziewana, może być prawidłowym wynikiem dla danej próbki. Jednak przyczyną może być również błędny wzrost liczby zliczonych zdarzeń komórek. Przyczyną może być błąd pipetowania, np. objętość próbki większa niż dodana objętość kuleczek, w związku z nieprawidłowym przetarciem końcówki pipety przed opróżnieniem próbki lub w związku z zastosowaniem różnych pipet do opróżnienia odpowiednio próbki i kuleczek. Powodem może również być nieprawidłowe umieszczenie bramkowania komórek pozwalające na zliczanie zbyt wielu nie komórkowych zdarzeń. Liczba komórek wyższa niż spodziewana może również wynikać ze zmniejszenia liczby zliczonych kuleczek CytoCount. Przyczyną może być błąd pipetowania, np. dodanie zbyt mało kuleczek w związku z przygotowaniem nieodpowiedniej zawiesiny kuleczek przed zastosowaniem, obecnością pęcherzyków powietrza w końcówce podczas opróżniania lub użycie różnych pipet do opróżniania próbki i kuleczek. Ponadto zmniejszenie zdarzeń CytoCount może być spowodowane ustawieniem zbyt wysokiego progu FSC lub nieprawidłowym umiejscowieniem bramkowania kuleczek prowadzącego do pominięcia niektórych kuleczek. Bezwzględna liczba komórek niższa niż spodziewana. Bezwzględna liczba komórek, która jest niższa niż spodziewana może być prawidłowym wynikiem dla danej próbki. Jednak przyczyną może być również błędne zmniejszenie liczby zliczonych zdarzeń komórek. Przyczyną może być błąd pipetowania, np. objętość próbki mniejsza niż dodana objętość kuleczek w związku z obecnością pęcherzyków powietrza podczas dozowania próbki (w próbce krwi trudno wykryć pęcherzyki powietrza) lub w związku z zastosowaniem różnych pipet do opróżniania odpowiednio próbki i kuleczek. Powodem może być również nieprawidłowe umiejscowienie bramkowania komórek prowadzące do pominięcia zdarzeń komórek lub strata komórek w związku z przedłużoną inkubacją z odczynnikiem lizującym. Liczba komórek niższa niż spodziewana może również wynikać ze zwiększenia liczby zliczonych kuleczek CytoCount. Może to wynikać z błędu pipetowania np. dodania większej objętości kuleczek niż objętość komórek, nieprawidłowego wytarcia końcówki pipety przed opróżnieniem lub zastosowania różnych pipet do opróżnienia próbki i kuleczek. Wzrost zdarzeń CytoCount może również wynikać z nieprawidłowego umiejscowienia bramkowania kuleczek pozwalając na zliczenie zbyt wielu zdarzeń "nie" kuleczek. Strata zawiesiny CytoCount przed ponownym prawidłowym przygotowaniem zawiesiny może powodować wzrost stężenia kuleczek. Przyczyną straty zawiesiny może być poluzowana nakrętka pozwalająca na wyciek płynu lub rozlanie zawartości fiolki CytoCount przed ponownym przygotowaniem zawiesiny. Piśmiennictwo 1. Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood (review). Cytometry 2000;42: Gratama JW, Keeney M, Sutherland DR. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. In: Robinson JP, Darzynkiewicz S, Dean PN, Dressler LG, Rabinovitch PS, Stewart CC, Tanke HJ, ( ) S 2366/PL/TIA/ p. 4/5

5 Wheeless LL. editors. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; p Schnizlein-Bick CT, Mandy FF, O Gorman MRG, Paxton H, Nicholson JKA, Hultin LE et al. Use of CD45 gating in three and four-color flow cytometric immunophenotyping: guideline from The National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry 2002;50: Brocklebank AM, Sparrow RL. Enumeration of CD34+ cells in cord blood: a variation on a single-platform flow cytometric method based on the ISHAGE gating strategy. Cytometry 2001;46: Bergeron M, Lustyik G, Phaneuf S, Ding T, Nicholson JKA, Janossy G, et al. Stability of currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric operation: time can tell all. Cytometry 2003;52B: Objaśnienia symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania Zużyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Sprawdzić w instrukcji stosowania Chronić przed światłem Numer serii Producent ( ) S 2366/PL/TIA/ p. 5/5