Wykład 6 Źródła preparatów enzymatycznych Produkcja enzymów, ich oczyszczanie oraz immobilizacja

Transkrypt

1 ENZYMOLOGIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr I Wykład 6 Źródła preparatów enzymatycznych Produkcja enzymów, ich oczyszczanie oraz immobilizacja WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

2 Zakres materiału ENZYMOLOGIA 1. Biochemia, Autor: Jeremy Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko, PWN Warszawa (2005) Rozdziały: 8. Enzymy:: podstawowe pojęcia i kinetyka 9. Strategie katalityczne 10. Strategie regulacyjne:: enzymy i hemoglobina 2. Ćwiczenia z enzymologii i technik biochemicznych. Bartoszewska, Niziołek, Paszowski, Wydawnictwo SGGW 3. Handbook of Food Enzymology ed. John R. Whitaker et al., CRC Press; (2002) 4. Enzymes in Food Technology - ROBERT J. WHITEHURST, BARRY A. LAW, Editors Sheffield Academic Press CRC Press (2002) 3. Food chemistry - Hans- Dieter Belitz, Werner Grosch, Peter Schieberle, Springer (2004)

3 Źródło preparatów enzymatycznych Źródła preparatów enzymatycznych: Grzyby i drożdże - ponad 50% Bakterie - 30% Zwierzęta - 8% Rośliny 4% Źródłem enzymów mikrobiologicznych są przede wszystkim: - grzyby strzępkowe (rodzaje: Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Mucor) - bakterie (rodzaj Bacillus, rzadziej Escherichia) - drożdże (rodzaj Saccharomyces, Kluyveromyces)

4 Bezpieczne źródła preparatów enzymatycznych Bezpieczne gatunki powszechnie stosowane: - grzyby: Asperillus oryzae, Asperillus Niger, Trichoderma reesei - drożdże: Saccharomyces cerevisiae, Klyveromyces lac=s - bakterie: Bacillus licheniformis, Bacillus sub=lis

5 Produkcja przemysłowa 1. Do produkcji enzymów polecane są szczepy, które produkują enzymy pozakomórkowo. 2. Najważniejsze cechy charakterystyczne procesów produkcji: - najczęściej oczyszczenie metodą wgłębną (rzadziej powierzchniową). - prowadzi się w bioreaktorach - fermentatorach o pojemności od kilku dm 3 do kilku m 3. - stosowanymi źródłami C, N i substancji wzbogacających są: mąka ziemniaczana, kukurydziana, sojowa, mannok kukurydziany, melasa buraczana, otręby pszenne, ekstrakty drożdżowe, mączka rybna lub żelatyna. - dla enzymów hydrolitycznych (hydrolaz) stosuje się substancje zawierające typ hydrolizowanego wiązania (Aspergillus na pożywce zawierającej skrobię wytwarza glukoamylazę - rozkłądającą skrobię, hodowla na pożywce tłuszczowej - wytwarzane lipazy rozkładające tłuszcz) - podczas hodowli technologicznej krytyczne jest odpowiednie wymieszanie i napowietrzanie.

6 Schemat otrzymywania preparatu enzymu wewnątrzkomórkowego Hodowla mikroorganizmów otrzymanie biomasy metod! powierzchniow! lub wg"#bn! $ Oddzielenie komórek od p!ynu pohodowlanego g"ównie wirowanie, filtracja $ Dezintegracja komórek $ Wirowanie, filtrowanie $ Supernat (zwi!zki rozpuszczalne w buforze ekstrakcyjnym) $ Wst"pne podczyszczanie najcz#%ciej frakcjonowanie - ró&nic w rozpuszczalno%ci $ Wirowanie, filtrowanie $ Oczyszczanie - metody chromatograficzne Stabilizacja Suszenie aktywno%ci rozpy"owe, fluidyzacyjne, enzymatycznej sublimacyjne (liofilizacja) $ $ Preparat w postaci syropu Preparat w postaci proszku

7 Dezintegracja komórek mikroorganizmów 1. Mechaniczne - stosuje się urządzenia z elementami rozdrabniającymi głównie młyny kulowe. Dezintegracja polega na bardzo, bardzo szybkim mieszaniu komórek organizmów z kulkami szklanymi- mechanizm uszkadzania ścian komórkowych 2. Fizyczne - ultradźwięki - prasy wysokociśnieniowe (spręża się komórki w powietrzu, N, CO 2 - a następnie szybko rozpręża) - szok osmotyczny (zmiany ciśnienia osmotycznego) - kilkakrotne zamrażanie i rozmrażanie (np. w ciekłym N) 3. Chemiczne - detergenty - rozpuszczalniki organiczne (rozpuszczające głównie fosfolipidy) mogą być niebezpieczne w stosowaniu: aceton, alkohol, może powodować denaturację enzymów 4. Enzymatyczne - enzymy lityczne rozkładają składniki ściany komórkowej, stosuje się najczęściej: lizozym, glukanazy, chitynazy, glikozydazy Na skalę przemysłową stosuje się najczęściej: - dezintegrację ciśnieniową - mechaniczną (z kulami szklanymi)

8 Bufor ekstrakcyjny związki rozpuszczalne Bufor ekstrakcyjny: - enzym powinien być rozpuszczalny w roztworze ekstrakcyjnym, ph odległe od punktu izoelektrycznego białka (bo wtedy białko łatwo wypada z roztworu) - mieć odpowiednią siłę jonową oraz pojemność buforową - temperatura buforu w okolicy +4ºC - ogranicza denaturację białek- hamuje peptydazy (opkmum temp ºC) - stosowanie inhibitorów peptydaz Pepstatyna- hamuje peptydazy aspartylowe np. chymozyna- w centrum aktywnym zawierają kwas asparaginowy Leupeptyna- hamuje peptydazy serynowe lub cysteinowe EDTA- hamuje metalopeptydazy lub metaloproteinazy- helatują jony metali - obecność dodatków stabilizujących cząsteczki białka głównie grupy karboksylowe COO - i aminowe NH 3+, gdyż związki te ograniczają niekorzystne działanie H 2 O (glicerol, sacharoza, glikol polietylenowy) zmuszają białko do przyjęcia struktury zwartej, gdyż są bardziej hydrofobowe od wody, stymulują otoczenie białek w komórce. - związki redukujące mostki siarczkowe - w centrum aktywnym często występują grupy SH, aby zapobiec ich utlenianiu i powstawaniu mostków S- S, stosujemy związki zawierające również grupy SH i to one się utleniają a nie centrum aktywne (glutakon, merkaptoetanol, DTT (dikotreitol))

9 Wstępne podczyszczanie W przemyśle enzymy oczyszcza się w ograniczonym stopniu, stosuje się preparaty wstępnie podczyszczone. Jest to możliwe dzięki: - optymalizacji biosyntezy: warunków hodowli i składników pożywki, aby uwarunkować produkcję na konkretne białko enzymatyczne. - mutanty otrzymane metodą inżynierii genetycznej także uwarunkowane na produkcję konkretnego białka - czasami stosuje się preparaty surowe lub wysuszone - przemysł gorzelniczy, skórzany, tekstylny - całe drobnoustroje - wypiek ciasta, sery pleśniowe - w przemyśle farmaceutycznym, do celów analitycznych oraz badania jakości stosuje się wysoko oczyszczone preparaty Główne oczyszczanie: - frakcjonowanie oparte na podstawie różnic w rozpuszczalności, - następnie metodą chromatografii jonowymiennej lub sita molekularnego

10 Rozdzielanie białek na zasadzie różnic w rozpuszczalności 1. Frakcjonowanie solami nieorganicznym i- wysalanie białka Wysalanie białka - wytrącanie białka z roztworu pod wpływem wysokich stężeń soli obojętnych będących elektrolitami. Polega na zniszczeniu płaszcza wodnego wokół białka. Gdy do roztworu białka dodamy np. siarczan amonu (najczęściej stosowany, ale można użyć także siarczan magnezowy lub sodowy), którego cząsteczki silniej przyciągają wodę niż białko, płaszcze wodne tworzą się wokół jonów (analogicznie jak przy białku, gdy jon ujemny, to miałko dodatnią stroną i na odwrót). Białko pozbawione otoczki wodnej łączy się z innymi białkami w podobnej sytuacji. Powstają agregaty białek, które wytrącają się z roztworu.

11 Wysalanie białek Właściwości soli nieorganicznych wynikają z tzw. szeregu Hofmeistera przedstawiającego sole zgodnie z rosnącą zdolnością wysalania białka: Aniony: SCN - <CIO 4- <NO 3- <Br - <Cl - <CH 3 COO - <SO 4 2- <PO 4 3- Kakony: Ba 2+ <Ca 2+ <Mg 2+ <Li + <Cs + <Na + <K + <Rb + <NH 4 + Słabe elektrolity Mocne elektrolity, całkowicie zdysocjowane - jest to proces odwracalny, po usunięciu soli (o ile nie dojdzie do denaturacji), - przeprowadza się w temp. 2-4 ºC, - ph zbliżone do ph izoelektrycznego białka, - tani, łatwy do przeprowadzenia w warunkach laboratoryjnych i przemysłowych - powoduje minimalne straty enzymu Białka które są bardziej hydrofilowe ulegają wysoleniu w wyższych stężeniach soli.

12 2. Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi Rozpuszczalniki organiczne obniżają stałą dielektryczną, zmniejszają stopień uwodnienia lub jonowy co powoduje wzrost siły przyciągania pomiędzy przeciwnie naładowanymi grupami n powierzchni cząsteczki białka. Najczęściej używane: etanol, aceton. Ze względu na niebezpieczeństwo denaturacji białka metoda ta jest rzadziej stosowana niż wysalanie. 3. Frakcjonowanie rozpuszczalnymi polimerami niejonowymi Np. dekstran i glikol polietylenowy w sposób niezupełnie wyjaśniony mogą wypierać białka i inne cząsteczki z roztworu, czyli przyjęcie zwartej struktury. Wielkość i kształt cząsteczek białka decyduje o rozpuszczalności polimeru. 4. Frakcjonowanie przez denaturację termiczną Wykorzystuje się różnice w temperaturach denaturacji różnych białek, jedne denaturują w temperaturze 40ºC a inne np. w 60ºC. 5. Wytrącanie w punkcie izoelektrycznym Pozostałe metody W ph = pkt. izoelektrycznemu białka najchętniej wypadają z roztworu. Trudno jest zastosować bez pomocy innych metod

13 Metody chromatograficzne W technologii oczyszczania enzymów stosuje się najczęściej następujące metody chromatograficzne: 1. Chromatografia jonowymienna - dość tania 2. Chromatografia powinowactwa oczyszczanie do kilka tysięcy razy, ale bardzo wysokie koszty 3. Chromatografia sita molekularnego - preparat rozwodniony, długotrwała ale tania 4. Chromatografia hydrofobowa - droga

14 IMMOBILIZACJA ENZYMÓW LUB KOMÓREK 1. Zespół metod umożliwiających unieruchomienie enzymów lub całych komórek w wyniku ich związania na powierzchni nośnika (adsorpcja, wiązania kowalencyjne), zamknięcie w porach żelu lub kapsułkach z półprzepuszczalnych błon bądź unieruchomienia w wyniku kowalencyjnego usieciowania. 2. Największe zastosowanie immobilizowanego enzymu w produkcji przemysłowej dotyczy izomerazy glukozowej. ZALETY STOSOWANIA IMMOBILIZOWANYCH ENZYMÓW - możliwość wielokrotnego użycia enzymu lub użycie go w procesie ciągłym, - wzrost stabilności struktury białka enzymatycznego (zazwyczaj, ale nie zawsze) => czasem może to prowadzić do niekorzystnych zmian w strukturze białka => wpływ na aktywność, => zazwyczaj wzrasta termo- i ph stabilność, odporność na działanie czynników denaturujących => możliwość zastosowania środowiska organicznego, - enzym nie zanieczyszcza środowiska reakcji, - ograniczenie inhibicji enzymu zarówno przez substrat, jak i produkt, który jest usuwany w sposób ciągły, - unieruchomienie kilku kolejno działających enzymów umożliwia prowadzenie złożonych przemian w jednym reaktorze, co zwiększa wydajność i obniża koszty procesu, - obniżenie kosztów katalizy w skali przemysłowej i wzrost wydajności.

15 UTRUDNIENIA PODCZAS IMMOBILIZACJI ENZYMÓW I PODCZAS STOSOWANIA - wysoki koszt otrzymania czystego preparatu enzymu (przed unieruchomieniem trzeba uzyskać czysty preparat) i później jego unieruchomienia => koszty początkowe procesu immobilizacji, - częściowa utrata aktywności enzymu (immobilizowane enzymy w porównaniu do swoich natywnych form - mogą mieć zmienione optymalne warunki przebiegu reakcji zmiana optymalnego ph, temperatury, specyficzność substratowa na ogół, ale nie zawsze, są to zmiany korzystne), - możliwość stopniowego zużycia nośnika/matrycy, na której unieruchamiamy enzym: - złoże rozdrobnione przez mieszanie, - możliwość oblepienia złoża zanieczyszczeniami => ograniczony kontakt z substratem, - utrudniony przepływ substratu przez złoże, - wylewanie substratu poza złoże. Podstawowym parametrem technologicznym pozwalającym na ocenę efektywności metody immobilizacji jest STABILNOŚĆ OPERACYJNA ENZYMU określa czas pracy enzymu, po którym zachodzi utrata ½ aktywności początkowej biokatalizatora. Wszystkie powyższe utrudnienia można wyeliminować jednak jest to bardzo praco- i czasochłonne.

16 NOŚNIK STOSOWANY DO UNIERUCHOMIENIA ENZYMÓW CECHY Podstawowe cechy optymalnego nośnika - nierozpuszczalny w środowisku, w którym prowadzona jest reakcja enzymatyczna (na ogół roztwór wodny), - odporny na degradację mechaniczną (ścieranie), chemiczną i mikrobiologiczną, - nietoksyczny, bierny chemicznie, - wysoka zdolność wiązania enzymu, która uzależniona jest od: a) ilości i rodzaju grup funkcyjnych, zdolnych do przyłączania białka i podatności na modyfikacje prowadzące do aktywacji nośnika, b) porowatości liczby i powierzchni porów (na tyle duże, aby pomieścić związany substrat)

17 NO!NIKI STOSOWANE W IMMOBILIZACJI ROZPUSZCZALNE NIEROZPUSZCZALNE rozpuszczalny dekstran, alkohol poliwinylowy ORGANICZNE NIEORGANICZNE SYNTETYCZNE 1) poliakrylamid, 2) silikony, 3) "ywice epoksydowe, 4) "ywice jonowymienne, 5) poliuretan, 6) polipropylen, 7) poliester. NATURALNE 1) agar, 2) alginian, 3) karagenian, 4) pochodne celulozy, 5) dekstran, 6) chitozan, 7) albumina, 8) kolagen, 9) "elatyna, 10) pektyna, 11) skrobia. 1. krzemionka i jej formy wodorotlenkowe, tj. szk!o ceramiczne, piasek, 1) ziemia okrzemkowa, 2) glin, tytan w formie tlenków, 3) cyrkon i jego formy wodorotlenkowe, 4) hydroksyapatyt. Wadą organicznych nośników jest ich niższa wytrzymałość mechaniczna w porównaniu z nieorganicznymi i słaba odporność na działanie mikroorganizmów. Nośniki nieorganiczne są wytrzymalsze, ale mniejsza jest ich pojemność/wydajność wiązania enzymu.

18 METODY UNIERUCHAMIANIA ENZYMÓW 1. FIZYCZNE polegają na powstaniu między złożem a enzymem słabych oddziaływań międzycząsteczkowych (wodorowe, jonowe, siły Van der Walsa) lub polegają na zamknięciu enzymu w porach żelu lub w kapsułkach z pólprzepuszczalnych błon. 2. CHEMICZNE tworzenie wiązań kowalencyjnych między enzymem a nierozpuszczalną matrycą. METODY ZALETY WADY FIZYCZNE CHEMICZNE 1) zachowanie struktury enzymu, 2)!atwo"# i niski koszt przeprowadzenia procesu 4) wi$ksza stabilno"# uk!adu enzym-no"nik 3) fakt dosy# cz$stego wymywania enzymu ze z!o%a 5) mo%liwa cz$"ciowa utrata aktywno"ci enzymu wi&zania kowalencyjne mog& zmienia# struktur$ bia!ka 6) metody kosztowne, zazwyczaj wymagaj&ce u%ycia dodatkowych zwi&zków sieciuj&cych, aktywuj&cych z!o%a lub enzym

19 1. ADSORPCJA ENZYMU NA POWIERZCHNI NOŚNIKA - unieruchomienie enzymu na powierzchni nośnika (porowatego ciała stałego) głównie na drodze słabych oddziaływań fizykochemicznych, - enzym adsorbuje się głównie na powierzchni wewnętrznej porów, - ziarna nośnika powinny być małe (5μm 1 mm), aby powierzchnia aktywna wiązania enzymu była dostatecznie duża, jednak nie mogą być zbyt małe, aby nie zwalniać reakcji, - najprostsza metoda immobilizacji. Metody fizyczne NOŚNIKI: celuloza, tlenek glinu, krzemionka (SiO 2 ), szkło porowate, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny oraz wymieniacze jonowe: -anionity o ładunku + - DEAE- celuloza, chitozan, - kationity o ładunku - CM- celuloza.!

20 2. PUŁAPKOWANIE W PORACH ŻELU - pułapkowanie (inkluzja) enzymu wewnątrz struktury naturalnych lub syntetycznych polimerów - polega na polimeryzacji żelu (polimeryzacji monomerów i ich usieciowaniu w strukturę żelu) w obecności enzymu i zamknięciu enzymu w porach żelu, - podczas tworzenia sieci polimerów cząsteczki enzymu zostają zamknięte, ZALETY: - proces tani, - niewymagany wysoki stopień oczyszczenia enzymu. WADY: - możliwość immobilizacji enzymów katalizujących przemiany substratów niskocząsteczkowych (możliwość dyfundowania do i z struktury żelu) => metoda nieodpowiednia np. do immobilizacji peptydaz (substratem są białka makrocząsteczki), amylaz (skrobia), - enzymy hydrolityczne mogą powodować degradację polimerów żelu.! NOŚNIKI: - heteropolisacharydy agaroza, alginian, karagenian, - kolagen, - poliakrylamid, polistyren, - żywice sieciowane energią świetlną.

21 3. IMMOBILIZACJA Z WYKORZYSTANIEM PÓŁPRZEPUSZCZALNYCH MEMBRAN a) kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie zamykanie enzymów we wnętrzu półprzepuszczalnej kapsułki, która imituje naturalne błony biologiczne, b) enzymatyczne reaktory membranowe zamykanie enzymów w przestrzeni pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami lub w wężach (np. silikonowych, nylonowych).! Wielkość kapsułek μm Wielkość porów membran nm Membrany powinny być hydrofilowe dla łatwej wymiany substratów i produktów oraz mechanicznie wytrzymałe i dobrze znoszące różnice ciśnień. Najczęściej nylonowe, silikonowe, liposomowe polimery tworzone najczęściej podczas polimeryzacji lub polikondensacji monomerów na granicy fazy organicznej i wodnej zawierającej enzym (złożone z chlorku poliwinylu, polipropylenu).

22 Metody chemiczne 1. IMMOBILIZACJA PRZEZ TWORZENIE WIĄZAŃ KOWALENCYJNYCH - najczęściej stosowana w przemyśle spożywczym => najtrwalsze unieruchomienie enzymów, - wiązanie enzymu z nośnikiem dzięki tworzeniu wiązań kowalencyjnych: peptydowych, estrowych, C- C, N- C, O- C i innych pomiędzy grupami czynnymi nośników a grupami funkcyjnymi enzymów (- NH 2, - COOH, - SH, - OH).!!

23 2. UNIERUCHAMIANIE BEZ MAKROSKOPOWEGO NOŚNIKA MECHANICZNEGO - sieciowanie przestrzenne związkami wielofunkcyjnymi - sieciowanie kryształów i agregatów białek enzymatycznych Enzym pełni rolę matrycy i biokatalizatora!!!!! Proces łatwy, tani, zapewnia dużą stabilność enzymu, jednak podstawową wadą jest niska stabilność mechaniczna dlatego sieciowanie jest raczej stosowane jako proces wspomagający inne rodzaje immobilizacji jako pojedyncza metoda stosowana bardzo rzadko. Np. trypsyna zaadsorbowana na krzemionce, a następnie utrwalona poprzez międzycząsteczkowe usieciowanie przy użyciu aldehydu glutarowego.

24 Klasyczne typy reaktorów stosowane w procesach z udziałem enzymów - urządzenia/zbiorniki, w których zachodzi reakcja, wykorzystywane do procesu unieruchamiania. 1. Reaktor zbiornikowy z ciągłym mieszaniem 3. Reaktor typu kolumny przepływowej z upakowanym złożem 2. Reaktor ze złożem fluidalnym!!!

25 PRZEMYSŁOWE ZASTOSOWANIE UNIERUCHOMIONYCH ENZYMÓW Enzym izomeraza glukozowa glukoamylaza lipaza inwertaza termolizyna pektynazy: endopoligalakturonaza pektynometyloesteraza!-d-galaktozydaza reduktaza diacetylowa Zastosowanie produkcja syropu fruktozowego ze skrobi kukurydzianej hydroliza maltodekstryn przetwórstwo skrobi hydroliza oleju (produkcja t"uszczów jadalnych) produkcja cukru inwertowanego produkcja aspartamu hydroliza pektyn klarowanie i ekstrakcja soków, maceracja miazgi ze #wie$ych jab"ek przed t"oczeniem hydroliza laktozy w mleku i serwatce produkcja piwa

26 Zastosowanie immobilizowanych komórek mikroorganizmów - do zwiększenia wydajności fermentacji alkoholowej trudnych do zhydrolizowania substratów np.: immobilizacja Schizosaccharomyces pombe wraz z izomerazą ksylozy, umożliwiło otrzymanie etanolu z ksylozy, - immobilizowane w żelu alginianowym komórki Kluyveromyces fragilis zastosowano do hydrolizy laktozy w mleku i przygotowania mleka przeznaczonego dla osób nietolerujących cukier mlekowy, - do biodegradacji cholesterolu w mleku zastosowano komórki Rhodococcus egni, immobilizowane komórki Streptococcus albus i olivaceus w biosyntezie izomerazy glukozowej, - immobilizowane Erwinia rhapon=ci lub Protaminobater rubrum zawierający syntezę izomaltulozy, do produkcji izomaltulozy cukru znajdującego się w miodzie, - bakterie z rodzaju Acetobacter zaadsorbowane na powierzchni porowatego nośnika, którym najczęściej są wióry bukowe do produkcji kwasu octowego poprzez utlenianie alkoholu etylowego pierwsza technologia, w której zastosowano biokatalizator unieruchomiony. Stosowanie całych komórek eliminuje procesy wyodrębniania i oczyszczania enzymów obniżenie kosztów produkcji. Stabilność enzymów w komórce jest wyższa niż enzymów wyizolowanych

27 1. IZOMERAZA GLUKOZOWA! 2. GLUKOAMYLAZA hydroliza wiązań glikozydowych maltodekstryn, skrobi, głównie wiązania β- 1,6- glikozydowe (rozgałęzienia skrobi) i α- 1,4- glikozydowe.!

28 3. LIPAZY hydroliza oleju (produkcja tłuszczów jadalnych), przeprowadzają częściową hydrolizę tłuszczów właściwych. W przemyśle przetwórczym wykorzystuje się kwasy tłuszczowe (szczególnie krótkołańcuchowe) uwalniane podczas hydrolizy => charakterystyczny smak i zapach. Mleczarstwo szybsze dojrzewanie serów Cukiernictwo lipolityczne właściwości (poprawa czekolady, cukierki).!

29 4. INWERTAZA (sacharaza, β- fruktofuranozydaza) - hydrolaza! Procesowi towarzyszy zmiana kierunku skręcania płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego z dodatniej na ujemną, tzw. "inwersja sacharozy", co jest źródłem nazwy enzymu. Optymalne ph działania inwertazy wynosi około 5. Występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie związana jest ze ścianą komórkową. Wytwarzana jest też przez pszczoły, hydrolizując sacharozę podczas powstawania miodu. Produkty dostępne handlowo uzyskiwane są z drożdży.

30 Lizozym 1. Lizozym odkrył Aleksander Fleming w 1922 roku. 2. Rozpuszcza on niektóre bakterie odszczepiając polisacharydowy składnik ich ścian komórkowych. 3. Polisacharyd ściany komórkowej składa się z dwóch rodzajów cukrów: N- acetyloglukozoaminy (NAG) i kwasu N - acetylomuraminowe go (NAM), które są połączone wiązaniami β- glikozydowymi. 4. Lizozym (glikozydaza) hydrolizuje wiązanie glikozydowe między węglem C- l NAM i C- 4 NAG Lizozym hydrolizuje wiązania glikozydowe (kolor zielony) między NAM i NAG (R oznacza resztę kwasu mlekowego należącą do NAM)

31 Lizozym 1. Lizozym jest stosunkowo małym enzymem (14,6 kda). 2. Wyizolowany z białka kurzego, które stanowi bogate źródło lizozymu, jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym, zbudowanym ze 129 aminokwasów. 3. W cząsteczce tego wysoce stabilnego białka występują cztery wiązania poprzeczne w postaci mostków dwusiarczkowych oraz posiada bardzo złożony sposób pofłdowania. 4. Wnętrze lizozymu, tak jak w przypadku mioglobiny i hemoglobiny, jest niemal całkowicie niepolame. Podobnie jak u większości białek, oddziaływania hydrofobowe odgrywają ważną rolę w procesie fałdowania lizozymu. Wiązania wodorowe między tri- NAG i lizozy- mem. Uczestniczące w wiązaniach wodorowych grupy należące do tri- NAG kolor niebieski, a do lizozymu - czerwony. Wiązania wodorowe zaznaczono strzałkami

32 Miejsce aktywne lizozymu 1. Wiele zasadniczych informacji na temat miejsca aktywnego można otrzymać z badań struktury kompleksu enzymu z inhibitorem kompetycyjnym. 2. Szybkość hydrolizy oligomerów N- acetyloglukozoaminy wzrasta gwałtownie przy wzroście ilości reszt z czterech do pięciu, tj. przy przejściu z NAG 4 do NAG 5 i dalej od NAG 5 do NAG 6, natomiast nie ulega zmianie przy dalszym wzroście ilości reszt do ośmiu. 3. Pozostaje to w zgodzie z wynikami badań rentgenograficznych, które wykazały, że w bruździe miejsca aktywnego może zmieścić się tylko sześć reszt cukru. 4. Dodatkowo przy wykorzystaniu znacznika izotopowego w postaci izotopu 18 O pozwoliło ustalić, w którym miejsc zostaje rozerwane wiązanie glikozydowe występujące w substracie złożonym z sześciu reszt cukrowych (między 4 i 5 resztą heksanu). Sposób wiązania heksa- NAG (kolor żółty) z lizozymem. Położenie grup cukrowych A, B i C (lewa część rysunku) ustalono na podstawie obserwacji kompleksu tri- NAG- lizozym, natomiast usytuowanie reszt D. E i F wywnioskowano na podstawie badań modelowych. Dwie reszty oznaczone kolorem czerwonym biorą bezpośredni udział w katalizie

33 Podstawowymi elementami przedstawionego schematu katalizy Ogólna kataliza kwasowa. Proton zostaje przeniesiony z niezjonizowanego kwasu glutaminowego 35, który zajmuje optymalne położenie w odległości 3 A od glikozydowego atomu tlenu. Określenie ogólna kwasowa wskazuje, że źródłem przenoszonego protonu jest grupa donorowa, a nie wolne protony. Czynniki sprzyjające powstaniu przejściowego jonu karboniowego. Reakcję enzymatyczną w dużym stopniu ułatwiają dwa czynniki, od- powiedzialne za stabilizację przejściowego jonu karboniowego: a) czynnik elektrostatyczny obecność ujemnie naładowanej grupy w odległości 3 A od przejściowego jonu karboniowego. Kwas asparaginowy, który zawiera ujemnie naładowaną grupę karboksylową, stabilizuje elektro- statycznie ładunek dodatni węgla C- l w pierścieniu D, b) czynnik geometryczny zmieniona konformacja pierścienia D. Heksa- NAG pasuje do miejsca aktywnego w bruździe tylko wtedy, gdy reszta cukru D zamiast zwykłej konformacji krzesełkowej przyjmie konformację półkrzesełkową. To przekształcenie konformacji ma decydujące znaczenie dla katalizy, ponieważ układ przestrzenny konfor- macji półkrzesełkowej w znacznym stopniu przyczynia się do powstania jonu karboniowego. Układ przestrzenny atomów węgla 1, 2 i 5 oraz atomu tlenu należącego do pierścienia w konformacji półkrzesełkowej umożliwia dzięki rezonansowi rozłożenie dodatniego ładunku między atomem węgla C- l i znajdującym się w pierścieniu atomem tlenu. Odkształcenie pierścienia D substratu lizozymu do formy półkrzesełkowej: A reszta cukrowa w normalnej formie krzesełkowej. B podczas wiązania z lizozymem atom tlenu i węgiel C- 5 reszty cukrowej D przemieszczają się w ten sposób, że atomy węgla C- 1. C- 2. C- 5 i tlenu znajdują się w jednej płaszczyźnie, zaznaczonej na rysunku C kolorem niebieskim.