Bioinżynieria niszy neuralnych komórek macierzystych

Transkrypt

1 Bioinżynieria niszy neuralnych komórek macierzystych STRESZCZENIE Prawidłowy rozwój i zdolności regeneracyjne tkanki w dużym stopniu zależą od wzajemnych oddziaływań komórek macierzystych z elementami mikrośrodowiska (niszy), w której się znajdują. O naturze takich oddziaływań decydują właściwości biochemiczne i biofizyczne składników niszy. Coraz więcej wiadomo na temat składu i architektury mikrośrodowiska komórek macierzystych określonych tkanek, pozostają jednak niewyjaśnione mechanizmy kontroli prawidłowego funkcjonowania niszy, umożliwiające różnicowanie komórek macierzystych i utrzymanie homeostazy tkanki. Poznanie takich mechanizmów jest możliwe dzięki rozwojowi nowoczesnych metod nano/biotechnologicznych, które ułatwiają skonstruowanie sztucznego mikrośrodowiska in vitro przypominającego naturalną niszę komórek macierzystych. Wykorzystując biomateriały nowej generacji, zarówno naturalne jak i syntetyczne, można obecnie uzyskać trójwymiarowe nisze biomimetyczne dla komórek macierzystych, które, umożliwiając kontrolę uwalniania czynników aktywnych, dostarczają im w sposób precyzyjny określone sygnały rozwojowe, podobne do fizjologicznych. Kontrolowane w czasie i przestrzeni mikrośrodowisko in vitro, zasiedlone komórkami macierzystymi stanowi unikalny system badawczy, w którym możliwe jest kierunkowanie różnicowania i uzyskanie funkcjonalnej tkanki. Artykuł przedstawia nowoczesne strategie badawcze oparte na bioinżynierii niszy neuralnych komórek macierzystych i przytacza przykłady zastosowania systemów komórkowo-biomateriałowych (dwuwymiarowych domen funkcjonalnych lub trójwymiarowych rusztowań zasiedlonych komórkami) do badań podstawowych, przedklinicznych i w pierwszych próbach terapii schorzeń układu nerwowego. WPRROWADZENIE Nisza naturalne mikrośrodowisko komórek macierzystych W organizmach komórki macierzyste przebywają w określonych, tkankowo specyficznym mikrośrodowisku, zwanym niszą, które decyduje o dalszym ich losie samoodnowie, bądź różnicowaniu [1,2,3]. Niszę cechują wzajemne, kontrolowane czasowo i przestrzennie oddziaływania komórek z jej strukturalnymi i rozpuszczalnymi składnikami. Sygnały mechaniczne, biofizyczne i biochemiczne, które docierają do komórki i wpływają na jej rozwój, są zależne od składu niszy. Zrąb niszy stanowią białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i proteoglikany, które decydują o sztywności i elastyczności otoczenia, a także o rodzaju adhezji komórek do macierzy (oddziaływania specyficzne, przez receptory integrynowe lub niespecyficzne, elektrostatyczne) [4,5]. Typowymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej są fibronektyna, laminina, wimentyna i kolagen. Białka te posiadają określone sekwencje aminokwasowe wiążące receptory integrynowe, obecne na błonach komórkowych (np. domena RGD występująca w większości białek macierzy lub IKVAV, typowa dla lamininy) [6]. Struktura i skład macierzy zewnątrzkomórkowej wpływa również na możliwość dyfuzji składników pokarmowych i migracji komórek. Bardzo istotnym elementem jest obecność naczyń krwionośnych, które regulując dostawy tlenu i substancji odżywczych wraz z innymi oddziaływaniami humoralnymi i troficznymi, tworzą funkcjonalne sprzężenie homeostatyczne pomiędzy niszą a całością organizmu. Prawidłowe funkcjonowanie komórek macierzystych zależy również od czynników niestrukturalnych niszy, takich jak związane z komórkowymi receptorami i obecne we frakcji rozpuszczalnej niszy czynniki troficzne oraz białka sygnałowe i dodatkowo kontakty między komórkami [7]. Leonora Bużańska * Marzena Zychowicz Anna Sarnowska Krystyna Domańska-Janik Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN, Warszawa * Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN, ul. Pawińskiego 5, Warszawa; tel. (22) , buzanska@imdik.pan.pl Artykuł otrzymano 8 marca 2013 r. Artykuł zaakceptowano 12 kwietnia 2013 r. Słowa kluczowe: neuralne komórki macierzyste, nisza komórek macierzystych, rusztowania biopolimerowe, bioinżynieria Wykaz skrótów: ECM (ang. extracellular matrix) macierz zewnątrzkomórkowa; HUCB- -NSC (ang. human umbilical cord blond derived neural stem cells) neuralne komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej krwi pępowinowej; KM komórki macierzyste; MSC (ang. mesenchymal stem cells) mezenchymalne komórki macierzyste; NSC (ang. neural stem cells) neuralne komórki macierzyste; OUN ośrodkowy układ nerwowy Podziękowania: Badania prowadzone przez autorów niniejszej pracy przeglądowej są finansowane ze środków na naukę przyznanych przez Narodowe Centrum Nauki 2011/01/B/ NZ3/05401, 05728/B/NZ4/2011/01; Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego 5978/B/ P01/2010/38 oraz Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im M. Mossakowskiego PAN. Reasumując, losy komórek macierzystych regulowane są wzajemnymi oddziaływaniami w niszy, o charakterze zarówno biochemicznym jak i biofizycznym, o których decyduje jej architektura i właściwości mechaniczne. Kontakty międzykomórkowe oraz sygnałowe czynniki rozpuszczalne mikrośrodowiska stanowią kluczowe elementy wielokierunkowych interakcji kontrolujących różnicowanie komórek macierzystych. Poznanie oddziaływań KM ze składnikami niszy w danym typie tkanki może dostarczyć dodatkowych informacji ważnych dla optymalizacji metod zastosowania KM w medycynie regeneracyjnej. Do realizacji tego celu mogą posłużyć bioinżynieryjnie wytwarzane sys- Postępy Biochemii 59 (2)

2 Rycina 1. Schemat budowy niszy komórek macierzystych, w której obecne są czynniki strukturalne (białka i proteoglikany macierzy zewnątrzkomórkowej, inne komórki, a także naczynia krwionośne), jak również czynniki rozpuszczalne (substancje troficzne, hormony, neurotransmitery, białka sygnałowe). Wzajemne oddziaływania między komórkami a macierzą i sąsiadującymi komórkami, przyłączanie się ligandów do określonych receptorów, a także dostęp czynników troficznych i humoralnych, decydują o prawidłowym funkcjonowaniu komórek macierzystych w ich mikrośrodowisku. temy komórkowo-biomateriałowe stosowane w badaniach in vitro oraz w badaniach przedklinicznych in vivo. Nisza neuralnych komórek macierzystych w dojrzałym OUN Dojrzały mózg charakteryzuje ograniczona zdolność do regeneracji. Przez wiele lat kwestia powstawania nowych komórek nerwowych w mózgu pozostawała sporna. Dopiero pod koniec XX wieku zidentyfikowano i zlokalizowano obszary mózgu człowieka charakteryzujące się ciągłą i aktywną neurogenezą [8]. Istnieją dwie główne strefy neurogenne, w których zlokalizowano neuralne komórki macierzyste, różnicujące się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Rejony te to strefa okołokomorowa komór bocznych mózgu (SVZ, ang. subventricular zone), z której nowopowstałe neurony migrują do opuszki węchowej, oraz strefa podziarnista zakrętu zębatego hipokampa (SGZ, ang. subgranular zone), która zaopatruje jego warstwę ziarnistą w nowe neurony [9-11]. Obszary te charakteryzują się określoną kompozycją składników stanowiących niszę. Neuralne komórki macierzyste, które w czasie rozwoju stanowią w SVZ tzw. glej promienisty (ang. radial glia), nazywane są w literaturze komórkami typu B. Są to komórki wolno dzielące się i wykazujące obecność białek GFAP (ang. glial fibrillary acidic protein) oraz CD133 (glikoproteina charakterystyczna dla NSC). Z komórek tych powstają szybko dzielące się i namnażające się progenitory (określane mianem komórek typu C ), które dają początek neuroblastom ( komórki typu A ), migrującym do opuszki węchowej w donosowym strumieniu migracyjnym (RMS, ang. rostral migratory stream). W drugiej strefie neurogennej (SGZ hipokampa), komórki macierzyste zwane są komórkami typu 1 i charakteryzują się obecnością markerów typowych dla NSC, takich jak: GFAP, Sox2 i Nestyny [1]. Komórki te tworzą populację samoodnawiających się progenitorów ( komórki typu 2 ), z których powstają neuroblasty różnicujące się w neurony ziarniste hipokampa. W obu typach nisz ośrodkowego układu nerwowego (SVZ i SGZ) występują również komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, a w przypadku SVZ również komórki wyściółki komór (ependymocyty) [12]. Neuralne komórki macierzyste strefy SVZ mają specyficzny układ przestrzenny decydujący o ich funkcjonalności: z jednej strony poprzez penetrację warstwy ependymocytów mają kontakt z płynem mózgowo-rdzeniowym komory (za pomocą rzęsek na których zlokalizowano obecność receptorów dla białka Sonic hedgehog Shh), a z drugiej za pomocą długich wypustek kontaktują się ze ścianami naczyń krwionośnych [13,14]. Komórki wyściółki komór bocznych wytwarzają czynniki neurogenne, takie jak proneuralne białko noggin (antagonista ścieżki BMP, ang. bone morphogenetic protein), czy też czynnik wzrostu pochodzący z nabłonka barwnikowego PEDF (ang. pigment epithelium-derived factor) [15,16]. Astroglej leżący w bezpośrednim sąsiedztwie NSC wpływa na podziały komórek macierzystych integrując sygnały płynące do mikrośrodowiska niszy z innych obszarów mózgu [12,17]. Obszar neurogenny warstwy podziarnistej hipokampa nie jest anatomicznie wydzieloną strukturą, jednakże neuralne komórki macierzyste występujące w tej niszy otoczone są astrocytami w których ekspresji podlega białko Wnt3 wspomagające generację neuronów z NSC [12,18]. Sygnały zewnątrzkomórkowe obecne w mikrośrodowisku SVZ i SGZ zapewniają tym strukturom unikalną zdolność do podtrzymywania i promowania neurogenezy. Cząsteczki sygnałowe kluczowe dla rozwoju układu nerwowego wpływają również na neurogenezę w dorosłym mózgu [1]. Są nimi zarówno czynniki rozpuszczalne jak i trwale związane z błoną komórkową, takie jak białko Shh, Wnt, BMP czy receptor Notch, które poprzez regulację profilu transkrypcyjnego decydują zarówno o utrzymywaniu samoodnowy komórek macierzystych, jak i ich proliferacji oraz różnicowania neuronalnego bądź astroglejowego [19]. Zarówno elementy komórkowe, jak i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej tworzące niszę, stanowią trójwymiarowe rusztowanie i źródło sygnałów regulacyjnych dla NSC [20]. Zakotwiczenie komórek macierzystych w błonie podstawnej, bądź ich przyleganie do komórek sąsiadujących wpływa na przestrzenne sprecyzowanie płaszczyzny ich podziału i determinację rodzaju podziałów: symetrycznych bądź asymetrycznych. Dodat

3 Rycina 2. Bioinżynieria geometrii i składu podłoża w systemach hodowlanych dwuwymiarowych: A) podłoże jednoskładnikowe sygnał jednorodny, taka sama odpowiedź komórek; B) podłoże jednoskładnikowe o różnej elastyczności różny kształt komórek; C) podłoże jednoskładnikowe o różnej geometrii (widok z góry, część schematu pod kreską) różny kształt i orientacja komórek (widok z góry, część schematu nad kreską); D) podłoże wieloskładnikowe odpowiedź komórek zależna od specyficznych sygnałów indywidualnych. Kolorowe trójkąty oznaczają receptory, kółka i wielokąty symbolizują immobilizowane cząsteczki sygnałowe. Schemat przygotowany na podstawie [35]. kowo macierz zewnątrzkomórkowa oraz glikoproteiny wchodzące w skład błony podstawnej śródbłonka naczyń krwionośnych wpływają na zdolność komórek niszy do gromadzenia i wydzielania specyficznych czynników w formie nieaktywnej i aktywnej [3]. Ta cecha ECM, a także jej fizykochemiczne właściwości, takie jak elastyczność, usieciowanie i określona topografia strukturalnych elementów niszy silnie wpływają na różnicowanie komórek macierzystych [21,22,23]. BIOINŻYNIERIA NISZY KOMÓREK MACIERZYSTYCH Systemy dwuwymiarowe z domenami bioaktywnymi do hodowli i różnicowania komórek macierzystych Standardowo komórki macierzyste hoduje się na podłożu płaskim (np. polistyrenowe naczynia hodowlane), które mogą być dodatkowo pokryte białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak kolagen czy laminina, lub pochodnymi białek ECM (żelatyna, matrigel). Można również prowadzić wspólne hodowle z komórkami odżywczymi (ang. feeder cell layer). Dodatkowe czynniki odżywcze w obydwu przypadkach dostarczane są w formie rozpuszczalnej w pożywce hodowlanej. Takie warunki znacznie różnią się od naturalnej, trójwymiarowej niszy tkankowej, w jakiej przebywają komórki macierzyste in vivo. Pomimo tych zastrzeżeń zastosowanie układów dwuwymiarowych z wykorzystaniem bioinżynieryjnych systemów hodowli komórek do badań podstawowych stanowi wygodny i uproszczony sposób identyfikacji oddziaływań komórek macierzystych ze składnikami niszy. Umożliwia to badanie mechanizmów molekularnych decydujących o ich losie. Schemat odpowiedzi komórek macierzystych na rodzaj sygnału odbieranego z podłoża 2D przedstawia Ryc. 2. Dwuwymiarowe systemy hodowlane pozwalają na zidentyfikowanie i określenie efektywnych stężeń białek macierzy zewnątrzkomórkowej wpływających na procesy rozwojowe komórek macierzystych. Pozwalają również zastosować czynniki specyficznie aktywujące określoną odpowiedź komórkową. Stosuje się układy jednorodne, zawierające jeden rodzaj cząsteczek ECM (Ryc. 2A, B, C), bądź układy wieloskładnikowe (Ryc. 2D), zapewniające specyficzne, sygnały indywidualne [24-26]. Domeny jednoskładnikowe o różnej geometrii i właściwościach fizyko-chemicznych podłoża mogą powstać przy zastosowaniu techniki drukowania mikrokontaktowego, polegającej na wytworzeniu polimerowego stempla zawierającego wyżłobioną kompozycję domen i pokrytego np. białkiem ECM, a następnie odciśnięciu go na powierzchni naczynia hodowlanego. Dzięki tej metodzie na powierzchni nieadhezyjnej możemy otrzymać wzory biomateriałów o określonej geometrii, z rozdzielczością umożliwiającą pozycjonowanie pojedynczej komórki (Ryc. 3) [27]). Rycina 3. Neuralne komórki macierzyste pozycjonowane na pokrytej fibronektyną powierzchni biofunkcjonalnej, otrzymanej metodą mikrodrukowania kontaktowego: A) kwadraty o boku 10 µm; B) linie o szerokości 20 µm; C) kwadraty o boku 100 µm; D) kwadraty o boku 120 µm połączone liniami. Dzięki możliwości otrzymania powierzchni biofunkcjonalnej o ustalonej wielkości i kształcie, jesteśmy w stanie pozycjonować komórki do ściśle zdefiniowanej powierzchni i obserwować odpowiedzi jednej komórki lub ich grup na określone czynniki mikrośrodowiska. Badania nasze wykazały istotny wpływ zarówno kształ- Postępy Biochemii 59 (2)

4 Rycina 4. Neuralne komórki macierzyste rosnące na: A) liniach o szerokości 10 µm; B) kwadratach o boku 120 µm; C) kwadratach o boku 120 µm połączonych liniami o szerokości 10 µm. Znakowanie immunocytochemiczne na obecność β-tubuliny III (marker neuronalny, kolor zielony), GFAP (marker astrocytalny, kolor czerwony w A,C) oraz Ki67 (marker komórek dzielących się, kolor czerwony). Jądra wybarwione Hoechst kolor niebieski. Strzałka wypustki aksonalne komórek różnicujących się w neurony w liniach łączących domeny biofunkcjonalne. tu jak i składu domen biofunkcjonalnych na kluczowe procesy rozwojowe neuralnych komórek macierzystych: adhezję, migrację, proliferację i różnicowanie [26,28-30]. Domeny biofunkcjonalne utworzone metodą drukowania mikrokontaktowego białek macierzy zewnątrzkomórkowej fibronektyny, o kształcie cienkich linii o szerokości 10 mikrometrów, powodują silne wydłużanie się neuralnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej (HUCB-NSC), a także promują ich różnicowanie, przejawiające się m.in. wzrostem poziomu markera zaawansowanego różnicowania neuronalnego Map-2. Na takich domenach, w przeciwieństwie do domen punktowych, pozycjonujących pojedyncze komórki (małych znaczków o wymiarach 10 x 10 mikrometrów), zaobserwowano znaczącą przewagę występowania komórek wykazujących fenotyp neuronalny, syntetyzujących β-tubulinę III i Map-2 [27]. Specyficzna geometria domen biofunkcjonalnych jednoskładnikowych połączonych liniami wymuszała kierunkowy wzrost wyrostków aksonalnych [31] (Ryc. 4). Rycina 5. Komórki HUCB-NSC rosnące na wieloskładnikowych domenach biofunkcjonalnych, otrzymanych metodą piezoelektrycznego mikronakraplania na powierzchnię pokrytą mikrofilmem substancji nieadhezyjnej. Nakraplano fibronektynę z białkami sygnałowymi, takimi jak A) CNTF; B) DKK-1; C) WNT3a. Znakowanie immunocytochemiczne przeprowadzono na obecność β-tubuliny III (marker neuronalny, kolor zielony) oraz GFAP (marker astrocytalny, kolor czerwony). Jądra barwiono Hoechst (kolor niebieski). Inne grupy badawcze wykazały, że ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste, rosnące na małych domenach adhezyjnych uzyskanych metodą mikrodrukowania, słabo przylegały do podłoża, przyjmowały okrągły kształt i różnicowały w kierunku tkanki tłuszczowej, podczas gdy rosnąc na domenach o większej powierzchni rozpłaszczały się wykazując zwiększoną reorganizację cytoszkieletu, gęstości kontaktów adhezyjnych (ang. focal adhesions) i różnicowanie kostne [32]. Hodowla ludzkich zarodkowych komórek macierzystych na przestrzennie ograniczonych powierzchniach skutkowała zwiększoną liczbą kolonii zawierających komórki syntetyzujące marker pluripotencji (OCT4+), podczas gdy na domenach o dużej powierzchni komórki te różnicowały się [33]. Nie tylko wielkość domen adhezyjnych może mieć wpływ na drogę różnicowania komórek macierzystych, ale również ich geometria. Ruiz i Chen stosowali mikrodrukowane domeny adhezyjne o różnej geometrii i uzyskali, w zależności od siły oddziaływań międzykomórkowych, zmianę różnicowania komórek w kierunku kostnym bądź tłuszczowym [34]. W przypadku naszych doświadczeń kształt i wielkość domen i ich geometria miały wpływ na to, czy komórki HUCB-NSC pozostawały jako niezróżnicowane, czy też różnicowały w kierunku neuronalnym [27]. Wykazaliśmy również, że geometria domen miała jedynie efekt wspomagający i wzmacniający różnicowanie neuronalne HUCB-NSC, ponieważ główną rolę odgrywał rodzaj biomateriału na domenach, który decydował o specyficznym (przez receptory integrynowe) lub niespecyficznym (elektrostatycznie) oddziaływaniu komórek z powierzchnią. Zastosowano poli-l-lizynę jako substancję o działaniu niespecyficznym i fibronektynę, wiążącą aktywnie komórki do podłoża. Okazało się, że specyficzne oddziaływania komórek z powierzchnią domen sprzyjają różnicowaniu neuronalnemu [31]. Domeny wieloskładnikowe mogą stanowić mieszaninę zarówno komponentów ECM jak i immobilizowanych do podłoża czynników rozpuszczalnych, będących czynnikami specyficznie aktywującymi szlaki wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów (ligandy receptorów, białka sygnałowe). Do produkcji domen wieloskładnikowych stosuje się automatyczne urządzenia, takie jak roboty dozujące. Powstają mikromacierze z domenami, które zawierają zarówno wiele różnych rodzajów białek ECM (fibronektyna, laminina, kolageny, witronektyna), ale również różne kombinacje mieszanin tych białek z białkami sygnałowymi, takimi jak np. BMP-4, FGF-4, JAGGED, WNT3a [24-26] modulując w ten sposób uzyskiwaną odpowiedź komórkową (Ryc. 5). Stwierdzono, iż obecne w domenach wieloskładnikowych wraz z fibronektyną białka sygnałowe, takie jak CNTF, JAGGED czy NOTCH promują różnicowanie w kierunku astrocytarnym, co wyraża się przewagą komórek 178

5 syntetyzujących GFAP (Ryc. 5A), podczas gdy zastosowanie białka SHH bądź DKK-1 (Ryc. 5B) stymuluje komórki HUCB-NSC do różnicowania w kierunku neuronalnym, a więc syntetyzujące β-tubulinę III. Białko Wnt-3a sprzyja natomiast utrzymaniu immobilizowanej do powierzchni populacji komórek w stanie niezróżnicowanym [26, Zychowicz i wsp., dane niepublikowane]. Dwuwymiarowe systemy in vitro mogą być wykorzystywane w badaniach podstawowych do identyfikacji czynników kontrolujących los komórek macierzystych, wpływających na cykl komórkowy, różnicowanie czy reprogramowanie. Takimi czynnikami mogą być składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, czynniki wzrostu czy białka sygnałowe. Systemy trójwymiarowe do hodowli i różnicowania komórek macierzystych Zastosowanie trójwymiarowych nośników przestrzennych (rusztowań, ang. scaffolds) do wzrostu i ochrony przeszczepianych komórek macierzystych/progenitorowych znajduje coraz szersze zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. Systemy trójwymiarowe, w związku ze swoimi właściwościami biologiczno-fizyko-chemicznymi ściślej odwzorowują warunki niszy, umożliwiając stworzenie in vitro mikrośrodowiska optymalnego dla różnicowania, proliferacji i przeżywalności KM. Takie systemy są pomocne również w badaniu odpowiedzi KM na zmieniające się warunki mikrośrodowiska [35]. Przykładowe modele 3D odziaływań komórek z mikrośrodowiskiem in vitro niszy komórek macierzystych przedstawia Ryc. 6. Obecnie do najczęściej stosowanych trójwymiarowych sposobów hodowli KM należy enkapsulacja komórek, a także ich preimplantacyjna hodowla na określonych rusztowaniach: hydrożelach, nanorurkach, nanowłóknach lub na rusztowaniu ECM uzyskanym po decelularyzacji tkanki (Ryc. 7). W rusztowaniach hydrożelowych fazą rozproszoną jest woda, a fazę formującą stanowią albo naturalne tworzywa takie jak kolagen, elastyna, fibryna lub chitozan albo tworzywa syntetyczne w rodzaju polikoprolaktonu (PCL), polidioxanonu (PDO), kwasu poliglikolowego (PGA), kwasu poli-l-mlekowego (PLLA), glikolowanego kwasu poli-d,l-mlekowego (PGLA) itp. [38,39,40]. Hydrożel w swojej budowie przypomina gąbkę z licznymi porami o różnej wielkości. Zmieniając stopień uwodnienia materiał formujący i stopień jego usieciowana, można wpływać na szybkość biodegradacji, elastyczność i twardość szkieletu. Hodowane w rusztowaniu komórki penetrują strukturę hydrożelową i osiedlają się w obecnych tam porach, spełniających rolę nisz dla ich dalszego rozwoju. Nanorurki i nanowłókna są wydłużonymi strukturami o mikro i nanometrowych średnicach (odpowiednio), których cechą charakterystyczną i wykorzystywaną w inżynierii tkankowej jest duży stosunek powierzchni adhezyjnej do masy. Dzięki temu wspólnie hodowane komórki przylegają ściśle do powierzchni, a ich różnicowanie i dojrzewanie odbywa się zgodnie z kierunkiem włókna. Stosowane jako rusztowania do hodowli komórek nanorurki węglowe powstają w procesie rozkładu lotnej substancji zawierającej węgiel na wybranym katalizatorze, zaś nanowłókna powstają w procesach tzw. elektroprzędzenia czy rozdzielania faz. Materiałem stosowanym do ich wytwarzania są najczęściej związki węglowe, syntetyczne polimery, jedwab, tlenek glinu czy krzemionka [41,42]. Cechą różnicującą nanowłókna jest ich średnica. Rusztowanie utworzone z nanowłókien o określonej średnicy może mieć różną porowatość. Można również otrzymać hydrożele wytwarzane z nanowłókien, które łączą zalety obu tych materiałów: elastyczność i uwodnienie szkieletów hydrożelowych z dużą powierzchnią adhezyjną nanowłókien. Opracowanie biomateriałów sprzyjających wzrostowi i różnicowaniu komórek macierzystych in vitro, które po przeszczepie do określonej tkanki będą nadal chronić ich przeżycie i dalszy rozwój, jest głównym celem bioinżynierii medycznej [43]. Transplantacja do OUN jest trudna w porównaniu z wprowadzeniem biorusztowania do innych narządów, np. kości czy wątroby, głównie ze względu na bardzo dużą wrażliwość na niedokrwienie, czy uraz oraz silną odpowiedź immunologiczną. Rycina 6. Modele in vitro niszy 3D komórek macierzystych. Kolor niebieski reprezentuje przykładowy biopolimer o określonych właściwościach fizykochemicznych; A) zastosowanie czynników sieciujących polimer homogennie, zapewnia jednorodny rozkład sygnału przekazywanego do komórek (kolorowe strzałki); B) zastosowanie polimeru gradientowego, o różnej gęstości usieciowania, zapewnia zróżnicowany rozkład sygnału przekazywanego do komórek; C) zastosowanie nowoczesnej technologii tworzenia trójwymiarowych hydrożeli z przestrzennie kontrolowanym usieciowaniem (ang. electropatterning ) umożliwia zakotwiczenie komórek macierzystych w ściśle określonym porządku i w kontakcie z wybranymi komórkami towarzyszącymi (podporowymi, kolor żółty) zapewniającymi wydzielanie czynników wspierających komórki macierzyste; D) strukturą i funkcją biopolimeru można manipulować w czasie rzeczywistym, co umożliwia regulację uwalniania określonych czynników aktywnych, które są fizycznie lub chemicznie związane z biopolimerem. Uwalnianie tych czynników może być sterowane temperaturą, promieniami UV [36] lub polem elektromagnetycznym [37]. Taka bioinżynieria niszy ułatwia dostarczanie zróżnicowanych i specyficznych sygnałów w ściśle kontrolowany sposób, schemat przygotowany na podstawie [35]. W przypadku przeszczepów do OUN jednym z ważnych czynników warunkujących przeżycie agregatu komórkowego jest jego rozmiar. Rusztowania drobne nie uszkadzają mózgu i mogą być z łatwością dostarczone domózgowo w iniekcjach stereotaktycznych. Rusztowania o większej średnicy wymagają wprowadzenia operacyjnego i zapewnienia im warunków prawidłowej Postępy Biochemii 59 (2)

6 perfuzji regulującej dopływ tlenu i substancji odżywczych po przeszczepie. Strategia wspomagania przez unaczynienie regenerujących obszarów uszkodzonej tkanki nerwowej jak i miejsc transplantacji egzogennych komórek macierzystych/progenitorowych lub też biotechnologicznych implantów komórkowych [44,45], polega głównie na: dostarczeniu angiogenetycznych czynników wzrostowych takich jak np. VEGF (naczyniowy czynnik wzrostu), jego funkcjonalny partner i regulator FGF-2 i -4 oraz stabilizujący powstawanie i dojrzewanie naczyń PIGF (łożyskowy czynnik wzrostu); zastosowaniu wstępnego unaczynienia trójwymiarowych rusztowań nośnikowych dla hodowanych in vitro komórek prekursorowych; poprawie unaczynienia poprzez mechaniczną [46] lub elektryczną [47] stymulację, którą można stosować zarówno w hodowli in vitro jak i in situ w miejscu transplantacji. wyborze biomateriałów sprzyjających wnikaniu i różnicowaniu prekursorowych komórek endotelialnych (EPC) o potencjale angiogennym. [48]. W praktyce stosuje się zazwyczaj połączenie kilku z wymienionych powyżej sposobów stymulacji unaczynienia, zarówno w miejscu przeszczepu jak i w hodowlach wieloskładnikowych bio-konstruktów tkankowych in vitro. Takie postępowanie wykazało swoją efektywność w badaniach przedklinicznych. Potwierdzono, że wstępne unaczynienie przeszczepu może znacząco wydłużyć czas jego przeżycia i integrację z tkanką biorcy [49] oraz znacząco zwiększyć proliferację transplantowanych komórek progenitorowych. Należy przy tym pamiętać, że ograniczona dyfuzja tlenu w parenchymie mózgu zapewnia przeżycie komórkom znajdującym się w promieniu nie większym niż 100 μm od penetrującego ją naczynia [50]. Jak wspomniano powyżej istotnym czynnikiem wpływającym na powodzenie przeszczepu jest rodzaj materiału użytego do wykonania rusztowania. Najbardziej optymalne do zastosowania wydają się być materiały biodegradowalne, np. glikol polietylenowy (PEG), kwas poliglikolowy (PGA) czy kwas hialuronowy. Jednakże wykonane z tych tworzyw rusztowania ze względu na swoje rozmiary wymagają z reguły wprowadzenia domózgowego z towarzyszącym otwarciem czaszki. W celu ominięcia tak inwazyjnej procedury pojawiły się nowe materiały, które podlegają sieciowaniu dopiero w kontakcie z tkankami gospodarza (w temperaturze 36 o C) i mogą być podawane w zawiesinie razem z przeszczepianymi komórkami. Do materiałów takich należą karboksymetylceluloza (ang. CMC) i polietyleneimina [51,52]. Z kolei rusztowania wykonane z nanowłókien i nanorurek węglowych charakteryzują się bardzo dużą powierzchnią adhezyjną dobrze sprzyjającą zasiedlaniu się komórek. Stwierdzono również, że wielkość i rodzaj cząsteczek stosowanych do wytworzenia szkieletu może wpływać bezpośrednio na odpowiedź immunologiczną biorcy. Małe cząsteczki, np. hydroksyapatyt (1 30 μm), indukują po transplantacji silniejszą odpowiedź zapalną w tkance biorcy niż większe agregaty. Biodegradowalność materiału również wpływa na odpowiedź tkanki gospodarza na przeszczep. Szybka degradacja szkieletu powoduje zbyt nagłe uwolnienie dużej ilości substancji chemicznych do otoczenia, a w konsekwencji wzrost osmolarności przylegającej do rusztowania tkanki, jej ostrego obrzęku i ewentualnej martwicy. Za szybkość degradacji oprócz rodzaju materiału odpowiada również stopień usieciowania rusztowania. Zbyt gęste usieciowanie utrudnia penetrację komórek do jego wnętrza, a zbyt małe warunkuje jego przyspieszoną degradację in vivo [53]. Zarówno w przypadku rusztowań hydrożelowych jak i rusztowań z nanowłókien bardzo korzystne wydaje się stosowanie niejednorodnej wielkości porów. W zależności od średnicy porów zasiedlające rusztowanie komórki będą proliferować (pory o wymiarze < 80 µm) lub różnicować ( µm), a obecność porów o średnicy > 120 µm umożliwi im lepszą wymianę gazów [53]. Rodzaj uwolnionych do tkanki związków w trakcie degradacji szkieletu jest również ważny, dlatego PGLA, który ulega rozkładowi do całkowicie obojętnych cząsteczek CO 2 i H 2 O jest często stosowanym biomateriałem. Rycina 7. Systemy 3D stosowane do wspólnych hodowli i transplantacji komórek macierzystych. A) system mikrosfer opłaszczających komórki (enkapsulacja), które mogą wydzielać określone czynniki np. wzrostowe lub też białka sygnałowe; B) hydrożele o zróżnicowanej wielkości porów, zapewniające zarówno proliferację jak i różnicowanie penetrujących je komórek; C) nanorurki węglowe, charakteryzujące się dużą powierzchną adhezyjną, która ułatwia kontakt z komórkami. Kolejnym istotnym parametrem warunkującym powodzenie przeszczepu jest elastyczność zastosowanego materiału (Ryc. 8). Tworzywa miękkie odtwarzające elastyczność i twardość mózgu (o podatności, czyli zdolności do odkształcenia wynoszącej ok. 0,1 5 kpa) predysponują do różnicowania się komórek macierzystych/progenitorowych w kierunku neuralnym, w tym odpowiednio: w kierunku neuronów materiały o podatności 0,3 1,5 kpa, a w kierunku astrogleju 1,5 kpa do 5 kpa [54]. Materiały 180

7 Rycina 8. Wpływ twardości podłoża na przeżycie i różnicowanie komórek macierzystych. Powyższy schemat prezentuje podsumowanie eksperymentów prowadzonych przez różne grupy badawcze z zastosowaniem m.in. mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) otrzymanych ze szpiku kostnego. Komórki mezenchymalne są obecnie najczęściej stosowanymi w badaniach klinicznych komórkami macierzystymi [55], schemat wg [56]. o pośredniej podatności (8 17 kpa) ukierunkowują różnicowanie we włókna mięśniowe, a te o największej sztywności (25 40 kpa) powodują różnicowanie z wytworzeniem tkanki kostnej [21]. Kształt rusztowania powinien być dopasowany do kształtu ubytku tkanki nerwowej zobrazowanego np. w tomografii komputerowej. Wykazano, że lepszą integrację z tkanką gospodarza mają rusztowania o kształtach obłych lub cylindrycznych niż ostrych i kanciastych [57]. Oprócz kształtu i innych podstawowych właściwości materiału tworzącego rusztowanie, ważne są również takie cechy jak wytwarzany w środowisku tkankowym potencjał elektryczny, jego hydrofilność czy hydrofobowość. W celu stworzenia warunków środowiska zbliżonych do naturalnych rusztowania mogą być wzbogacane białkami macierzy zewnątrzkomórkowej i innymi cząsteczkami sygnałowymi, wpływającymi na procesy życiowe komórek i ich różnicowanie, w tym również na bardzo istotny potencjał neowaskularyzacyjny. Do najczęściej stosowanych substancji pokrywających szkielet należą: kolagen, który zwiększa adhezyjność komórek macierzystych; laminina 332 wpływająca na ukierunkowanie osteoblastyczne; fibronektyna, która zwiększa proliferację komórek macierzystych i miogenezę [58], lamininy 211 i 111 odpowiadające za ich ukierunkowanie proneuralne [59,60]. Proces różnicowania komórek do konkretnego fenotypu w hodowlach in vitro czynników rozpuszczalnych dodawanych do pożywki lub trwale związanych z powierzchnią hodowlaną. W przypadku struktur 3D molekuły wpływające na różnicowanie komórek mogą być prezentowane przez białka pokrywające rusztowanie, np. zawierające domeny integrynowe wiążące się z sekwencją aminokwasów RGD (arginina glicyna kwas asparaginowy) [6], których obecność zwiększa podatność komórek do różnicowania w kierunku osteoblastów, lub związany z lamininą epitop IKVAV (izoleucyna-lizyna-walina-alanina-walina), promujący różnicowanie neuronalne. Innym sposobem na funkcjonalizację powierzchni jest połączenie substancji pokrywającej z polimerem HSPG (ang. poliglycol heparansulfate) [61]. Dzięki temu związana z fibrynogenem heparyna może służyć jako transporter dla BMP2, czynnika promującego różnicowanie osteoblastyczne. Można również wiązać w rusztowaniu czynniki regulatorowe t.j. TGFb czy Shh [62,63]. Jeszcze innym sposobem jest zastosowanie do pokrycia szkieletu materiałów, które aktywują się pod wpływem enzymów uwalnianych przez komórki [64], np. oddziaływujących proangiogennie [65,66]. Manipulując powyżej przedstawionymi właściwościami biofizycznymi stworzono rusztowania umożliwiające kontrolowanie losu zasiedlających je komórek macierzystych. I tak, otrzymano rusztowania, które predysponują komórki progenitorowe do różnicowania i wytwarzania funkcjonalnych sieci neuronalnych. Przykładem jest doświadczenie przeprowadzone przez grupę Ma i wsp., w którym już po 14 dniach hodowli neuroepitelialne komórki embrionalne hodowane na hydrożelach fibrynowych lub kolagenowych w obecności kwasu retinowego, różnicowały się do funkcjonalnych neuronów, wykazujących aktywność elektryczną, oraz ekspresję charakterystycznych markerów i receptorów neuronalnych [67]. Natomiast w celu utrzymania pluripotencjalności komórek progenitorowych warunkujących ich zwiększoną proliferację [68], można zastosować rusztowania zawierające kwas hialuronowy (HA, ang. hialuronic acid) skoniugowany z przeciwciałem skierowanym przeciwko receptorowi białka Nogo inhibitorem wzrostu neurytów [69]. Sygnałem do różnicowania komórek było tu podanie kwasu retinowego. Znaczne przyspieszenie różnicowania NSC jak i MSC w kierunku neuronalnym otrzymano również po pokryciu rusztowań (zarówno zawierających HA jak i poli-2-hydroksyetylometakrylanowych) lamininą z prezentowanym epitopem IKVAV oraz systemem uwalniania czynnika BDNF (ang. brain-derived neurotrophic factor). Obecność epitopu IKVAV wydaje się być kluczowa w różnicowaniu neuronalnym [70]. Poza wspomnianymi powyżej przykładami wpływu specyficznych oddziaływań receptorowych na różnicowanie neuralne, sama zmiana struktury z 2D na przestrzenną 3D występująca po przeszczepie, powoduje zmianę kierunku różnicowania komórek. Mysie NSC rosnące w postaci jednej warstwy na podłożu chitynowym różnicowały się głównie w kierunku astrocytarnym. Po przeniesieniu ich na chitynowe rusztowania 3D znacząca część komórek uległa zróżnicowaniu do neuronów (15%). Podobny efekt obserwowano po wysianiu komórek na nanowłókna [71]. Ten typ rusztowania, o optymalnej średnicy nm, jest opisywany jako predysponujący do różnicowania neuronalnego w stopniu porównywalnym do matrigelu [72]. Umieszczenie na powierzchni nanowłókien epitopu IKVAV dodatkowo zwiększało różnicowanie w kierunku neuronalnym i obniżało ilość astrocytów powstających zarówno z komórek MSC jak i NPCs (< 5% GFAP i 35% β-tubulina III) [73]. Kolejnym parametrem biofizycznym wpływającym na ukierunkowanie neuronalne komórek macierzystych jest opisana wcześniej elastyczność podłoża. Rusztowania hydrożelowe o elastyczności zbliżonej do elastyczności mózgu Postępy Biochemii 59 (2)

8 noworodka (1.5 kpa) zwiększają ilość połączeń międzykomórkowych i ekspresję markera neuronalnego β-tubulina III natomiast twardsze materiały (2,6 kpa) predysponują komórki do różnicowania w kierunku astrocytarnym. W badaniach własnych wykazaliśmy, że pod względem elastyczności, twardości, a przede wszystkim niskiej immunogenności, rusztowania żelatynowe mają znaczną przewagę nad dekstranowymi w przeszczepach domózgowych. Ponadto, zasiedlone ludzkimi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze sznura pępowinowego (tzw. galarety Whartona) wydłużają znacząco przeżycie tych komórek po przeszczepie, hamują proliferację astrogleju wokół miejsca przeszczepu, a dzięki dodatkowemu pokryciu powierzchni szkieletu lamininą, ukierunkowują komórki proneuralnie. Dzięki porowatej i niehomogennej strukturze hydrożelu stworzyliśmy, w zależności od wielkości porów, wielofunkcyjne bio-konstrukty z oddzielnymi centrami proliferacji, różnicowania i wymiany gazów [53]. NEURALNE KOMÓRKI MACIERZYSTE HODOWANE NA RUSZTOWANIACH BIOPOLIMEROWYCH W BADANIACH PRZEDKLINICZNYCH I KLINICZNYCH W doświadczeniach prowadzonych in vitro z zastosowaniem komórek macierzystych, biofunkcjonalizacja dwuwymiarowych powierzchni hodowlanych umożliwiła ukierunkowanie różnicowania tych komórek. Z doświadczeń przedklinicznych wynika jednakże, że los tych komórek w warunkach hodowli przestrzennej 3D in vivo znacznie odbiega od obserwowanego w warunkach hodowli jednowarstwowej. Unieśmiertelniona poprzez adenowirusową transformację linia komórek płodowych nerki (HEK293), rosnąca w pojedynczej warstwie in vitro wykazywała cechy typowe dla komórek nabłonkowych. Po wymuszeniu hodowli nieadherentnej w postaci pływających agregatów, w komórkach wzrastała ekspresja genów, których produkty są markerami pluripotencji t.j. Oct4, Nanog, Sox2, Klf4 i Lin28. Po przeszczepie tych komórek pod skórę zwierząt, w odróżnieniu od komórek hodowanych w warunkach adhezyjnych, stwierdzono częstsze pojawianie się nacieków i guzów nowotworowych. Sugeruje to, że przerwanie kontaktu komórek z podłożem może promować zmiany nowotworowe po ich transplantacji [74]. W przeciwieństwie do doświadczeń opisanych przez Su, w badaniach własnych, po zastosowaniu również wymuszonej, nieadherentnej hodowli pierwotnej nietransfekowanych komórek progenitorowych izolowanych z krwi pępowinowej i zwiększającej ich proliferację oraz ekspresję genów charakterystycznych dla pluripotencjalności (Oct4, Nanog, Sox2, Rex1), nie zaobserwowaliśmy wystąpienia żadnych cech ich transformacji nowotworowej [68]. Ten sam typ hodowli zastosowany do przeszczepu w klinicznym eksperymencie medycznym [75] również okazał się bezpieczny w czasie 4-letniej prospektywnej obserwacji klinicznej (wyniki Rycina 9. Różne poziomy złożoności systemów badawczych stosowanych w inżynierii tkankowej; A) system hodowli dwuwymiarowej i kontroli na poziomie komórki (zaznaczono specyficzne oddziaływania komórki z podłożem i czynnikami znajdującymi się w pożywce); B) system hodowli trójwymiarowej (z zastosowaniem rusztowań biomateriałowych) do badań nad wzrostem i różnicowaniem KM oraz formowaniem tkanek; C) system hodowli trójwymiarowej (z zastosowaniem rusztowań biomateriałowych i naturalnych) stosowany do odtwarzania organów lub ich części in vitro. Kontekst biomimetyczny prowadzonych badań oznacza określenie warunków mikrośrodowiska in vitro, które są zbliżone do panujących w fizjologicznej niszy KM in vivo, (schemat przygotowany na podstawie [91])

9 w przygotowaniu do publikacji). Wydaje się, że w przypadku somatycznych komórek macierzystych/progenitorowych, prosta zależność pomiędzy bezpieczeństwem przeszczepu, a stopniem zróżnicowania nie jest tak jednoznaczna jak w naturalnie nieśmiertelnych liniach komórek embrionalnych czy też unieśmiertelnionych onkogenami dorosłych komórkach macierzystych i przeszczep nieadherentnych komórek progenitorowych nie prowadzi do tworzenia teratom, jak również do powstania transformacji nowotworowej. Jednak dalsze badania nad charakterem mikrośrodowiska, które mogłoby zwiększać bezpieczeństwo przeszczepu są niezwykle istotne. Ze względu na odmienny charakter regeneracji obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego właściwości stosowanych w nich wspomagających biorusztowań są różne. W uszkodzeniach nerwów obwodowych i rdzenia kręgowego oczekiwaną funkcją rusztowania jest stworzenie matrycy, która ukierunkuje endogenną regenerację włókien nerwowych lub transplantatu zawierającego komórki macierzyste, równolegle do włókien występujących fizjologicznie. W tym celu stworzono hydrożele zawierające wewnątrz podłużne kanały o średnicy od 450 do 650 µm i zasiedlono je typowymi dla nerwów obwodowych wspomagającymi komórkami Schwanna [76]. Stosowano również nanowłókna o minimalnej średnicy µm, wytworzone z kolagenu, kwasu hialuronidowego lub polimerów tj. PLGA czy PCL, na które nasadza się komórki macierzyste i które spełniały rolę prowadnic dla wzrostu tych komórek [77,78]. Zastosowanie cylindrycznych hydrożeli otrzymanych z białek osocza biorcy [79] również dało pozytywne wyniki. Szkielety o takim składzie charakteryzują się znacznie mniejszą immunogennością oraz obecnością licznych czynników sprzyjających wzrostowi komórek. Inną funkcję spełniają biorusztowania podawane domózgowo, głównie w ogniskowych uszkodzeniach OUN. Ich zadaniem jest ochrona przeszczepianych komórek przed atakiem immunologicznym ze strony biorcy, a przez zmniejszenie nacieku zapalnego zahamowanie powstania blizny wokół przeszczepu oraz stworzenie ochronnej niszy dla przeżycia, proliferacji i dalszego funkcjonowania transplantowanych komórek. Do wytwarzania takich szkieletów często wykorzystywane są mikrowłókna o dużej powierzchni adhezyjnej umożliwiającej gęste zasiedlenie komórkami [80]. W przypadku chorób neurozwyrodnieniowych (t.j w modelach zwierzęcych chorób Huntingtona, Alzheimera czy Parkinsona), w których procesem patologicznym dotknięty jest cały OUN, stosuje się inną strategię transplantacji komórek macierzystych do mózgu. Komórki macierzyste nasadzane są na mikrosfery (enkapsulaty) najczęściej kolagenowe lub PLGA [81,82], zawierające substancje neuroprotekcyjne, molekuły sygnałowe, czynniki wzrostowe lub angiogenne. Przykładem takich rusztowań sferycznych są mikrosfery algininowe [83,84], szklane [85,86] lub żelatynowe [87]. Po ich iniekcji domózgowej opisywano dłuższe przeżycie przeszczepu, wytworzenie mniejszego odczynu zapalnego, a w chorobie Alzheimera redukcję depozytu β amyloidu [84] i poprawę częściowo utraconych funkcji neurologicznych (w zależności od głównego schorzenia poprawę pamięci lub funkcji ruchu). Terapia regeneracyjna z zastosowaniem ludzkich komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych i ostrych uszkodzeń OUN przeszła obecnie w fazę prób klinicznych, a pierwsze publikowane wyniki potwierdzają bezpieczeństwo jej stosowania [55]. Jednakże we wszystkich tych doniesieniach publikacyjnych komórki dostarczane były w postaci zawiesiny. Metoda przeszczepu komórek osadzonych na rusztowaniu, choć przeszła pozytywnie liczne próby przedkliniczne [51], dopiero w ostatnich latach znalazła zastosowanie w niektórych jednostkach chorobowych, głównie w ortopedii i chirurgii naczyniowej [48,88]. Teoretycznie terapia neurologiczna z zastosowaniem agregatów 3D mogłaby być z korzyścią stosowana w tych jednostkach chorobowych, w których proces patologiczny doprowadził do ubytku tkanki, przerwania jej ciągłości, powstania cyst lub jam pomartwiczych. Główny problem stanowi nadal sposób dostarczenia takiego biorusztowania do uszkodzonego OUN. Transplantacja domózgowa, zwłaszcza do struktur głębokich, jest obarczona dużym ryzykiem dodatkowego uszkodzenia tkanki. Z tego powodu pierwsze doniesienia stosowania bioinżynierii klinicznej dotyczą rekonstrukcji nerwów obwodowych. Standardowe leczenie polega m.in. na uzupełnieniu ubytku nerwu autologicznym fragmentem innego nerwu o mniejszym znaczeniu funkcjonalnym (np. nerwu czuciowego). W 2011 r. grupa Kufflera [89] opublikowała raport z badania klinicznego obejmującego 8 pacjentów leczonych z zastosowaniem rusztowań o długości od 2 do 12 cm w celu wypełnienia ubytków w nerwie łokciowym lub promieniowym. Rusztowanie stanowiła kolagenowa tuba wypełniona osoczem wzbogaconym w koncentrat płytkowy. W okresie 3 lat obserwacji stwierdzono u znacznej większości chorych powrót funkcji ruchowej jak i czuciowej uszkodzonego nerwu. Badanie z zastosowaniem rezonansu magnetycznego potwierdziło cechy odbudowy uszkodzonych włókien nerwowych, spowodowane wzrostem i regeneracją aksonów wewnątrz rusztowania. W roku 1999 na Uniwersytecie Stanford rozpoczęto próbę kliniczną obejmującą chorych po uszkodzeniach nerwów obwodowych z zastosowaniem szkieletów kolagenowych opłaszczonych komórkami Schwanna [90]. Kolejne dwie próby kliniczne rozpoczęto w 2009 r. z użyciem szkieletów nowej generacji dostępnych komercyjnie, a otrzymanych po decelularyzacji i sterylizacji nerwów obwodowych (NCT ) lub sztucznych szkieletów polimerowymi (NCT ). Niestety ciągle brak jest podsumowujących wyników końcowych tych badań. Zastosowanie w terapii chorób neurologicznych inżynierii tkankowej opartej na rusztowaniach polimerowych zasiedlonych przez komórki macierzyste wydaje się jedynie kwestią czasu. Z uwagi na bezpieczeństwo pacjentów należy dołożyć wszelkich koniecznych starań, aby wprowadzenie tej terapii było zgodne z zasadami EMB (ang. medical evidence basement, medycyny opartej na faktach), po uzyskaniu atestu jakości stosowanych procedur i sposobu przygotowania materiału stosowanego do transplantacji. PODSUMOWANIE Bioinżynieria niszy komórek macierzystych rozwija się współcześnie na trzech różnych poziomach poznawczych, Postępy Biochemii 59 (2)

10 mających konkretne odzwierciedlenie w przedstawionych w tym opracowaniu badaniach, prowadzonych zarówno w naszym zespole jak i w wielu innych laboratoriach na świecie. Pierwszy poziom stanowią platformy z domenami bioaktywnymi w systemach 2D stosowanych do wzrostu i różnicowania komórek. Takie układy modelowe umożliwiają poznanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi komórek na zmienne sygnały płynące z otaczającego mikrośrodowiska, dzięki możliwościom bezpośredniej detekcji ekspresji genów, zmian epigenetycznych i aktywności określonych dróg sygnałowych. Drugi poziom badawczy stosowany w bioinżynierii tkankowej stanowią rusztowania biopolimerowe 3D. Tworzą one strukturalną i funkcjonalną matrycę dla wzrostu komórek i modelowania formowanych in vitro tkanek. Co więcej, dzięki zastosowaniu nowoczesnych technologii biomateriał tworzący rusztowanie może być zaprojektowany w sposób, który umożliwia czasowo-przestrzenną regulację zarówno uwalniania jak i sieciowania określonych czynników wpływających na kierunek i dynamikę rozwoju komórek macierzystych. Trzeci poziom zaawansowania innowacyjnej inżynierii tkankowej dotyczy prób odwzorowania budowy całych organów lub ich części oraz zastosowania wytworzonych in vitro, biokonstruktów w transplantologii klinicznej. Hodowle organów i całych tkanek na rusztowaniach biopolimerowych in vitro w tym opracowaniu nie zostały omówione, ponieważ, jak do tej pory, nieznane są takie przykłady dla OUN. Znaczny postęp w tej dziedzinie dotyczy organów, których naturalne rusztowanie stanowi chrząstka (np. tchawica, zastawki serca, nos lub ucho). Spektakularnym przykładem takiego sukcesu inżynierii tkankowej jest hodowla in vitro tchawicy na naturalnym, decelularyzowanym rusztowaniu pobranym od dawcy [92] lub na biokompatybilnym rusztowaniu polimerowym [93] z zastosowaniem komórek macierzystych pobranych od pacjenta. W obydwu przypadkach przeszczep kliniczny wyhodowanej in vitro tchawicy zakończył się sukcesem. Postęp w obrazowaniu strukturalnym i funkcjonalnym in vivo przeszczepionych komórek, tkanek lub rusztowań biopolimerowch zasiedlonych komórkami, umożliwia współcześnie analizę zarówno przeżywalności jak i funkcjonalności badanych struktur już po ich transplantacji do organizmu biorcy. Układy biomimetyczne in vitro mają zapewnić optymalne warunki dla właściwego przygotowania takich przeszczepów i do ich skutecznego, monitorowanego zastosowania w medycynie regeneracyjnej. PIŚMIENNICTWO 1. Mu Y, Lee SW, Gage FH (2010) Signaling in adult neurogenesis. Curr Opin Neurobiol 20: Pierret C, Spears K, Morrison JA, Maruniak JA, Katz ML, Kirk MD (2007) Elements of a neural stem cell niche derived from embryonic stem cells. Stem Cells Dev 16: Riquelme PA, Drapeau E, Doetsch F (2008) Brain micro-ecologies: neural stem cell niches in the adult mammalian brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 12: Dityatev A, Seidenbecher CI, Schachner M (2010) Compartmentalization from the outside: the extracellular matrix and functional microdomains in the brain. Trends Neurosci 33: Marthiens V, Kazanis I, Moss L, Long K, Ffrench-Constant C (2010) Adhesion molecules in the stem cell niche--more than just staying in shape? J Cell Sci 15: Yang F, Williams CG, Wang DA, Lee H, Manson PN, Elisseeff J (2005) The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials 26: Nagao M, Sugimori M, Nakafuku M (2007) Cross talk between notch and growth factor/cytokine signaling pathways in neural stem cells. Mol Cell Biol 27: Eriksson PS, Perfilieva E, Björk-Eriksson T, Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA, Gage FH (1998) Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med 4: Doetsch F, Caillé I, Lim DA, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A (1999) Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 11: Doetsch F (2003) A niche for adult neural stem cells. Curr Opin Genet Dev 13: Seri B, García-Verdugo JM, McEwen BS, Alvarez-Buylla A (2001) Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. J Neurosci 15: Kazanis I, Lathia JD, Vadakkan TJ, Raborn E, Wan R, Mughal MR, Eckley DM, Sasaki T, Patton B, Mattson MP, Hirschi KK, Dickinson ME, ffrench-constant C (2010) Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. J Neurosci 21: Berninger B (2010) Making neurons from mature glia: a far-fetched dream? Neuropharmacology 58: Han YG, Spassky N, Romaguera-Ros M, Garcia-Verdugo JM, Aguilar A, Schneider-Maunoury S, Alvarez-Buylla A (2008) Hedgehog signaling and primary cilia are required for the formation of adult neural stem cells. Nat Neurosci 11: Lim DA, Tramontin AD, Trevejo JM, Herrera DG, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A (2000) Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis. Neuron 28: Peretto P, Dati C, De Marchis S, Kim HH, Ukhanova M, Fasolo A, Margolis FL (2004) Expression of the secreted factors noggin and bone morphogenetic proteins in the subependymal layer and olfactory bulb of the adult mouse brain. Neuroscience 128: Giaume C, Venance L (1998) Intercellular calcium signaling and gap junctional communication in astrocytes. Glia 24: Gage FH (2010) Molecular and cellular mechanisms contributing to the regulation, proliferation and differentiation of neural stem cells in the adult dentate gyrus. Keio J Med 59: Massirer KB, Carromeu C, Griesi-Oliveira K, Muotri AR (2011) Maintenance and differentiation of neural stem cells. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med 3: Owen SC, Shoichet MS (2010) Design of three-dimensional biomimetic scaffolds. J Biomed Mater Res A 15: Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE (2006) Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell 25: Reilly GC, Engler AJ (2010) Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. J Biomech 43: Guilak F, Cohen DM, Estes BT, Gimble JM, Liedtke W, Chen CS (2009) Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell 2: Flaim CJ, Teng D, Chien S, Bhatia SN (2008) Combinatorial signaling microenvironments for studying stem cell fate. Stem Cells Dev 17: Soen Y, Mori A, Palmer TD, Brown PO (2006) Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol 2: Bużańska L, Zychowicz M, Ruiz A, Ceriotti L, Coecke S, Rausher H,. Sobanski T, Wheland M, Domanska-Janik K, Colpo P, Rossi F (2010) Neural stem cells from human cord blood on bioengineered surfaces - novel approach to multiparameter bio-tests. Toxicology 270:

11 27. Zychowicz M, Mehn D, Ruiz A, Frontczak-Baniewicz M, Rossi F, Buzanska L (2012) Patterning of human cord blood-derived stem cells on single cell posts and lines: Implications for neural commitment. Acta Neurobiol Exp 72: Ruiz A, Zychowicz M, Buzanska L, Mehn D, Mills CA, Martinez E, Coecke S, Samitier J, Colpo P, Rossi F (2009) Single stem cell positioning on polylysine and fibronectin microarrays. Micro and Nanosystems 1: Zychowicz M, Mehn D, Ana Ruiz A, Colpo P, Francois Rossi F, Frontczak-Baniewicz M, Domanska-Janik K, Buzanska L (2011) Proliferation capacity of cord blood derived neural stem cell line on different micro-scale biofunctional domains. Acta Neurobiol Exp 71: Ruiz A, Zychowicz M, Ceriotti L, Mehn D, Sirghi L, Rauscher H, Mannelli I, Colpo P, Buzanska L, Rossi F (2013) Microcontact printing and microspotting as methods for direct protein patterning on plasma deposited polyethylene oxide: application to stem cell patterning. Biomed Microdevices 31. Buzanska L, Ruiz A, Zychowicz M, Rausher H, Ceriotti L, Rossi F, Colpo P, Domanska-Janik K, Coecke S (2009) Patterned growth and differentiation of human cord blood-derived neural stem cells on bio- -functionalized surfaces. Acta Neurobiol Exp 69: McBeath R, Pirone DM, Nelson CM, Bhadriraju K, Chen CS (2004) Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell 6: Peerani R, Rao BM, Bauwens C, Yin T, Wood GA, Nagy A, Kumacheva E, Zandstra PW (2007) Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J 26: Ruiz SA, Chen CS (2008) Emergence of patterned stem cell differentiation within multicellular structures. Stem Cells 26: Lutolf MP, Gilbert PM, Blau HM (2009) Designing materials to direct stem-cell fate. Nature 26: Kloxin A M, Kasko AM, Salinas CN, Anseth KS (2009) Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science 324: Zhao C, Yang C. AC field induced-charge electroosmosis over leaky dielectric blocks embedded in a microchannel. Electrophoresis 32: Namba RM, Cole AA, Bjugstad KB, Mahoney MJ (2009) Development of porous PEG hydrogels that enable efficient, uniform cell-seeding and permit early neural process extension. Acta Biomater 5: Wang TW, Spector M (2009) Development of hyaluronic acid-based scaffolds for brain tissue engineering. Acta Biomater 5: Yang CY, Song B, Ao Y, Nowak AP, Abelowitz RB, Korsak RA, Havton LA, Deming TJ, Sofroniew MV (2009) Biocompatibility of amphiphilic diblock copolypeptide hydrogels in the central nervous system. Biomaterials 30: Hu A, Zuo B, Zhang F, Zhang H, Lan Q (2013) Evaluation of electronspun silk fibroin-based transplants used for facial nerve repair. Otol Neurotol 34: Weber J (2010) Nanostructured poly(benzimidazole): from mesoporous networks to Nanofibers. ChemSusChem 22: Walker PA, Aroom KR, Jimenez F, Shah SK, Harting MT, Gill BS, Cox CS, Jr (2009) Advances in progenitor cell therapy using scaffolding constructs for central nervous system injury. Stem Cell Rev 5: Miller JS, Stevens KR, Yang MT, Baker BM, Nguyen DH, Cohen DM, Toro E, Chen AA, Galie PA, Yu X, Chaturvedi R, Bhatia SN, Chen CS (2012) Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nat Mater 11: Hanjaya-Putra D, Bose V, Shen YI, Yee J, Khetan S, Fox-Talbot K, Steenbergen C, Burdick JA, Gerecht S (2011) Controlled activation of morphogenesis to generate a functional human microvasculature in a synthetic matrix. Blood 118: Zhang P, Baxter J, Vinod K, Tulenko TN, Di Muzio PJ (2009) Endothelial differentiation of amniotic fluid-derived stem cells: synergism of biochemical and shear force stimuli. Stem Cells Dev 18: Morimoto T, Yasuhara T, Kameda M, Baba T, Kuramoto S, Kondo A, Takahashi K, Tajiri N, Wang F, Meng J, Ji YW, Kadota T, Maruo T, Kinugasa K, Miyoshi Y, Shingo T, Borlongan CV, Date I (2011) Striatal stimulation nurtures endogenous neurogenesis and angiogenesis in chronic-phase ischemic stroke rats. Cell Transplant 20: Nguyen LH, Annabi N, Nikkhah M, Bae H, Binan L, Park S, Kang Y, Yang Y, Khademhosseini A (2012) Vascularized bone tissue engineering: approaches for potential improvement. Tissue Eng Part B Rev 18: Chen X, Aledia AS, Ghajar CM, Griffith CK, Putnam AJ, Hughes CC, George SC (2009) Prevascularization of a fibrin-based tissue construct accelerates the formation of functional anastomosis with host vasculature. Tissue Eng Part A 15: Kasischke KA, Lambert EM, Panepento B, Sun A, Gelbard HA, Burgess RW, Foster TH, Nedergaard M (2011)Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J Cereb Blood Flow Metab 31: Delcroix GJ, Garbayo E, Sindji L, Thomas O, Vanpouille-Box C, Schiller PC, Montero-Menei CN (2011) The therapeutic potential of human multipotent mesenchymal stromal cells combined with pharmacologically active microcarriers transplanted in hemi-parkinsonian rats. Biomaterials 32: Pakulska MM, Ballios BG, Shoichet MS (2012) Injectable hydrogels for central nervous system therapy. Biomed Mater 7: Jurga M, Forraz N, McGuckin CP (2010) Artificial human tissues from cord and cord blood stem cells for multi-organ regenerative medicine: viable alternatives to animal in vitro toxicology. Altern Lab Anim 38: Saha K, Pollock JF, Schaffer DV, Healy KE (2007) Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol 11: Drela K, Siedlecka P, Sarnowska A, Domanska-Janik K (2013) Human mesenchymal stem cells in the treatment of neurological diseases. Acta Neurobiol Exp 73: Aurand ER, Lampe KJ, Bjugstad KB (2012) Defining and designing polymers and hydrogels for neural tissue engineering. Neurosci Res 72: Laquerriere P, Grandjean-Laquerriere A, Jallot E, Balossier G, Frayssinet P, Guenounou M (2003) Importance of hydroxyapatite particles characteristics on cytokines production by human monocytes in vitro. Biomaterials 24: Gerard C, Forest MA, Beauregard G, Skuk D, Tremblay JP (2012) Fibrin gel improves the survival of transplanted myoblasts. Cell Transplant 21: Bosman FT, Stamenkovic I (2003) Functional structure and composition of the extracellular matrix. J Pathol 200: Potter W, Kalil RE, Kao WJ (2008) Biomimetic material systems for neural progenitor cell-based therapy. Front Biosci 13: Farach-Carson MC, Carson DD (2007) Perlecan a multifunctional extracellular proteoglycan scaffold. Glycobiology 17: Ho JE, Chung EH, Wall S, Schaffer DV, Healy KE (2007) Immobilized sonic hedgehog N-terminal signaling domain enhances differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A 83: Motoyama M, Deie M, Kanaya A, Nishimori M, Miyamoto A, Yanada S, Adachi N, Ochi M (2009) In vitro cartilage formation using TGF-betaimmobilized magnetic beads and mesenchymal stem cell-magnetic bead complexes under magnetic field conditions. J Biomed Mater Res A 92: Lutolf MP, Lauer-Fields JL, Schmoekel HG, Metters AT, Weber FE, Fields GB, Hubbell JA (2003) Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci USA 29: Cao L, Jiao X, Zuzga DS, Liu Y, Fong DM, Young D, During MJ (2004) VEGF links hippocampal activity with neurogenesis, learning and memory. Nat Genet 36: Silva AK, Richard C, Bessodes M, Scherman D, Merten OW (2009) Growth factor delivery approaches in hydrogels. Biomacromolecules 10: 9-18 Postępy Biochemii 59 (2)

12 67. Ma W, Fitzgerald W, Liu QY, O Shaughnessy TJ, Maric D, Lin HJ, Alkon DL, Barker JL (2004) CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp Neurol 190: Habich A, Domanska-Janik K (2011) Aggregation-promoted expansion of neuraly committed human umbilical cord blood progenitors in vitro. Acta Neurobiol Exp 71: Pan L, Ren Y, Cui F, Xu Q (2009) Viability and differentiation of neural precursors on hyaluronic acid hydrogel scaffold. J Neurosci Res 1: Chew SY, Low WC (2011) Scaffold-based approach to direct stem cell neural and cardiovascular differentiation: an analysis of physical and biochemical effects. J Biomed Mater Res A 97: Sing CE, Alexander-Katz A (2011) Dynamics of collapsed polymers under the simultaneous influence of elongational and shear flows. J Chem Phys 135: Gelain F, Bottai D, Vescovi A, Zhang S. (2006) Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cells 3-dimensional cultures. PLoS One 1: e Silva GA, Czeisler C, Niece KL, Beniash E, Harrington DA, Kessler JA, Stupp SI (2004) Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science 303: Su G, Zhao Y, Wei J, Han J, Chen L, Xiao Z, Chen B, Dai J (2013) The effect of forced growth of cells into 3D spheres using low attachment surfaces on the acquisition of stemness properties. Biomaterials 34: Jóźwiak S, Habich A, Kotulska K, Sarnowska A, Kropiwnicki T, Janowski M, Jurkiewicz E, Lukomska B, Kmiec T, Walecki J, Roszkowski M, Litwin M, Oldak T, Boruczkowski D, Domanska-Janik K (2010) Intracerebroventricular Transplantation of Cord Blood-Derived Neural Progenitors in a Child With Severe Global Brain Ischemic Injury. Cell Medicine 1: Moore MJ, Friedman JA, Lewellyn EB, Mantila SM, Krych AJ, Ameenuddin S, Knight AM, Lu L, Currier BL, Spinner RJ, Marsh RW, Windebank AJ, Yaszemski MJ (2006) Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials 27: De Laporte L, Yan AL, Shea LD (2009) Local gene delivery from ECM- -coated poly(lactide-co-glycolide) multiple channel bridges after spinal cord injury. Biomaterials 30: Kang C, Poon P, Tator CH, Shoichet MS (2009) A new paradigm for local and sustained release of therapeutic molecules to the injured spinal cord for neuroprotection and tissue repair. Tissue Eng A15: Taylor SJ, Sakiyama-Elbert SE (2006) Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J Control Release 116: Hu A, Zuo B, Zhang F, Zhang H, Lan Q (2013) Evaluation of electronspun silk fibroin-based transplants used for facial nerve repair. Otol Neurotol 34: Menei P, Montero-Menei C, Venier MC, Benoit JP (2005) Drug delivery into the brain using poly(lactide-co-glycolide) microspheres. Expert Opin Drug Deliv 2: Watts RL, Raiser CD, Stover NP, Cornfeldt ML, Schweikert AW, Allen RC (2003) Stereotaxic intrastriatal implantation of human retinal pigment epithelial (hrpe) cells attached to gelatin microcarriers: a potential new cell therapy for Parkinson s disease. J Neural Transm Suppl Emerich DF (2004) Sertoli cell grafts for Huntington s disease. An opinion. Neurotox Res 5: Lee JK, Jin HK, Bae JS (2009) Bone marrow-derived mesenchymal stem cells reduce brain amyloid-beta deposition and accelerate the activation of microglia in an acutely induced Alzheimer s disease mouse model. Neurosci Lett 450: Borlongan CV, Thanos CG, Skinner SJ, Geaney M, Emerich DF (2008) Transplants of encapsulated rat choroid plexus cells exert neuroprotection in a rodent model of Huntington s disease. Cell Transpl 16: Drucker-Colin R, Verdugo-Diaz L (2004) Cell transplantation for Parkinson s disease: present status. Cell Mol Neurobiol 24: Flores J, Cepeda IL, Cornfeldt ML, O Kusky JR, Doudet DJ (2007) Characterization and survival of long-term implants of human retinal pigment epithelial cells attached to gelatin microcarriers in a model of Parkinson disease. J Neuropathol Exp Neurol 66: Zhang P, Moudgill N, Hager E, Tarola N, Dimatteo C, McIlhenny S, Tulenko T, DiMuzio PJ (2011) Endothelial differentiation of adipose- -derived stem cells from elderly patients with cardiovascular disease. Stem Cells Dev 20: Kuffler DP, Reyes O, Sosa IJ, Santiago-Figueroa J (2011) Neurological recovery across a 12-cm-long ulnar nerve gap repaired 3.25 years post trauma: case report. Neurosurgery 69: E Sabelman EE, Hentz VR (1999) Clinical Trial of Peripheral Nerve Graft. ClinicalTrials.gov. 91. Vunjak-Novakovic G, Scadden DT (2011) Biomimetic platforms for human stem cell research. Cell Stem Cell 8: Macchiarini P, Jungebluth P, Go T, Asnaghi MA, Rees LE, Cogan TA, Dodson A, Martorell J, Bellini S, Parnigotto PP, Dickinson SC, Hollander AP, Mantero S, Conconi MT, Birchall MA (2008) Clinical transplantation of a tissue engineered airway. Lancet 13: Delaere PR (2013) Stem-cell-based, tissue-engineered tracheal replacement in a child. Lancet 381: 113. doi: /S (13) Bioengineering of neural stem cell niche Leonora Bużańska *, Marzena Zychowicz, Anna Sarnowska, Krystyna Domańska-Janik Mossakowski Medical Research Centre, 5 Pawińskiego St., Warsaw, Poland * buzanska@imdik.pan.pl Key words: neural stem cells, stem cell niche, biopolymer scaffolds, bioengineering Abstract Maintenance of developmental and regenerative capability of the tissue highly depends upon mutual interaction of the stem cells with the components of their microenvironment (niche). The nature of this interaction is determined by the biochemical and biophysical properties of the niche constituencies. Although knowledge about the components of the stem cell microenvironment and their architecture is growing quickly, we still need to unravel the mechanisms underlying the control of the niche functioning, enabling stem cells differentiation and homeostasis of the tissue. Advancement in biotechnology provides tools to build up in vitro biomimetic microenvironments resembling a natural stem cell niche, where the cell is provided with diverse extracellular signals exerted by soluble and structural cues, mimicking those found in vivo. To obtain such microenvironment in vitro emerging nano/biotechnology methods were applied, using biomaterials of new generation, which enable controlling of the stem cell differentiation by time and special related release of the active factors. This article is providing an overview of the new research strategies for the bioengineering of the stem cell niche and gives the examples of the cell/biomaterial 2D and 3D complex systems used for basic and preclinical research as well as entering clinical applications for the therapy of the nervous system