Badanie udziału jonotropowych receptorów glutaminianergicznych NMDA i AMPA w mechanizmie działania leków przeciwdepresyjnych

Transkrypt

1 UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI COLLEGIUM MEDICUM Badanie udziału jonotropowych receptorów glutaminianergicznych NMDA i AMPA w mechanizmie działania leków przeciwdepresyjnych Małgorzata Wolak Rozprawa doktorska Promotor: Prof. dr hab. Gabriel Nowak Kraków 2014 Pracownia Badań Receptorowych Katedra Farmakobiologii Wydział Farmaceutyczny UJ CM

2 2 Składam serdeczne podziękowania mojemu promotorowi Panu Prof. dr hab. Gabrielowi Nowakowi za pomoc merytoryczną w trakcie wykonywania pracy eksperymentalnej a także za udzielenie cennych wskazówek przy pisaniu pracy.

3 3 Spis treści WSTĘP... 6 Depresja... 6 Teorie wyjaśniające patomechanizm depresji... 7 Teoria monoaminergiczna depresji... 7 Teoria przewlekłego stresu... 8 Troficzna hipoteza depresji... 9 Teoria glutaminianergiczna depresji Układ glutaminianergiczny Receptory jonotropowe NMDA AMPA Receptory metabotropowe Leki przeciwdepresyjne CEL PRACY METODYKA Test wymuszonego pływania (Porsolta) Zwierzęta Podawane substancje Przebieg eksperymentu Test spontanicznej aktywności lokomotorycznej Western blotting Zwierzęta Podawane substancje Przygotowanie tkanki Rozdział elektroforetyczny na żelu poliakrylamidowym i transfer białek na membranę nitrocelulozową Immunodetekcja badanych białek WYNIKI Test wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność przeciwdepresyjną CGP37849 w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność przeciwdepresyjną CGP37849 w teście wymuszonego pływania Badanie dawkozależności CX614 w teście wymuszonego pływania

4 4 4. Badanie dawkozależności CX717 w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność CX614 w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność CX717 w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność CX614 w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność CX717 w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu łącznego podania CX614 i CGP37849 na aktywność myszy w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność imipraminy w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CX614 na aktywność imipraminy w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność imipraminy w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CGP37849 na aktywność imipraminy w teście wymuszonego pływania Badanie dawkozależności fluoksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność fluoksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CGP37849 na aktywność fluoksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność fluoksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CX614 na aktywność fluoksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie dawkozależności escitalopramu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność escitalopramu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CGP37849 na aktywność escitalopramu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność escitalopramu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CX614 na aktywność escitalopramu w teście wymuszonego pływania Badanie dawkozależności milnacipranu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność milnacipranu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CGP37849 na aktywność milnacipranu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność milnacipranu w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CX614 na aktywność milnacipranu w teście wymuszonego pływania Badanie dawkozależności reboksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NMDA na aktywność reboksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CGP37849 na aktywność reboksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu NBQX na aktywność reboksetyny w teście wymuszonego pływania Badanie wpływu CX614 na aktywność reboksetyny w teście wymuszonego pływania Test spontanicznej aktywności lokomotorycznej Wpływ chronicznego stosowania leków przeciwdepresyjnych na podjednostki GluN2A, GluN2B (receptora NMDA) oraz GluA1 (receptora AMPA) DYSKUSJA Udział receptorów NMDA i AMPA w mechanizmie w teście wymuszonego pływania u myszy

5 5 2. Wpływ chronicznego stosowania leków przeciwdepresyjnych na podjednostki GluN2A, GluN2B (receptora NMDA) oraz GluA1 (receptora AMPA) PODSUMOWANIE WNIOSKI STRESZCZENIE ABSTRACT BIBLIOGRAFIA WYKAZ SKRÓTÓW

6 6 WSTĘP Depresja Depresja jako choroba znana była i opisywana już w starożytności (Jaracz J. 2008). Obecnie jest ona najbardziej rozpowszechnionym zaburzeniem psychicznym, często źle diagnozowanym i nie leczonym. Zaliczana jest do chorób afektywnych i występuje w wielu różnych odmianach, co często utrudnia jej rozpoznawanie przez lekarzy. Jest przyczyną dużego cierpienia i zaburzenia prawidłowego funkcjonowania w rodzinie i społeczeństwie ok. 12% populacji (Dudek 2003, Murray i wsp. 1996). Do najbardziej charakterystycznych objawów depresji zalicza się silne obniżenie nastroju nieproporcjonalne do sytuacji życiowej, anhedonię, zaburzenia apetytu, bezsenność, spowolnienie psychomotoryczne, lęk, poczucie winy, niską samoocenę, pesymizm, myśli i próby samobójcze (Breslin 1998). Obecnie istnieje wiele leków przeciwdepresyjnych o różnej budowie i mechanizmach działania, jak również kilka sposobów terapii niefarmakologicznych, takich jak elektrowstrząsy, deprywacja snu, fototerapia, przezczaszkowa stymulacja elektromagnetyczna oraz psychoterapia. Wszystkie te metody łącznie z dostępną farmakoterapią nie przynoszą zadowalających efektów terapeutycznych u dużej grupy pacjentów. Ok. 30% chorych nie uzyskuje poprawy po pierwszej kuracji lekami przeciwdepresyjnymi a 10% nie udaje się wyleczyć mimo stosowania wielu różnych leków. Skuteczna terapia przeciwdepresyjna trwa od kilku tygodni do kilku miesięcy. Powyższe problemy skupiają uwagę naukowców na poszukiwaniu nowych teorii wyjaśniających patomechanizm depresji jak i bardziej skutecznych, bezpiecznych i szybko działających leków przeciwdepresyjnych (Zyss i wsp. 2010). Aktualnie znanych jest kilka teorii wyjaśniających mechanizmy powstawania i leczenia depresji.

7 7 Teorie wyjaśniające patomechanizm depresji Teoria monoaminergiczna depresji Odkrycie przeciwdepresyjnych właściwości inhibitorów wychwytu zwrotnego noradrenaliny i serotoniny, a także inhibitorów monoaminooksydazy zaowocowało powstaniem teorii monoaminergicznej depresji. Tłumaczy ona występowanie depresji brakiem monoamin w mózgu. Wiele obecnie dostępnych leków działa zgodnie z tą teorią, powodując wzrost poziomu noradrenaliny i/lub serotoniny w szczelinie synaptycznej. (Pilc i wsp. 2000). Hipoteza monoaminergiczna tylko częściowo tłumaczy patomechanizm depresji jak również mechanizm działania leków. Istnieją substancje, takie jak amfetamina i fenfluramina, które powodują wzrost stężenia monoamin w synapsie, nie działają jednak przeciwdepresyjnie. Takiego działania nie posiada również kokaina hamująca wychwyt katecholamin (Nowak 1997). Kolejnym słabym punktem tej teorii są leki takie jak tianeptyna aktywator wychwytu zwrotnego serotoniny, mianseryna czy trazodon blokery receptorów postsynaptycznych. Pomimo, że nie zwiększają one stężenia monoamin w synapsie, wykazują działanie przeciwdepresyjne (Kostowski 2004). Zmiany w synaptycznym stężeniu monoamin pojawiają się dość szybko po podaniu leku, natomiast efekt terapeutyczny w postaci poprawy nastroju chorego pojawia się dopiero po kilku tygodniach leczenia. Wskazuje to na istnienie innych mechanizmów, w których monoaminy są pierwszymi efektorami złożonej ścieżki sygnałowej, odpowiedzialnej za ich skuteczność terapeutyczną (Payne i wsp. 2002). W miarę odkrywania nowych faktów nasiliła się krytyka teorii monoaminergicznej, która nie tłumaczy w pełni przeciwdepresyjnego działania leków.

8 8 Teoria przewlekłego stresu W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań dotyczących roli stresu w powstawaniu objawów depresji (Tafet i wsp. 2003). Długotrwały stres prowadzi do patologicznych zmian w mózgu, między innymi w hipokampie i korze czołowej. Jest to związane z nadmierną aktywacją osi HPA (podwzgórze przysadka nadnercza), w której dochodzi do zaburzenia mechanizmu ujemnego sprzężenia zwrotnego. Uszkodzenie neuronów hipokampa, który pełni funkcję kontrolną względem osi HPA, przyczynia się do uwalniania zbyt dużych ilości kortyzolu, który jest jednym z hormonów stresu. Długotrwałe narażenie na działanie tego hormonu prowadzi do uszkodzenia neuronów glutaminianergicznych, serotoninergicznych i dopaminergicznych a także do ograniczenia ilości dendrytów i kolców dendrytycznych w hipokampie i korze czołowej. Potwierdzono to w badaniach u pacjentów cierpiących na ciężką postać depresji, u których wykryto także podwyższone stężenie CRH (z ang. corticotropin-releasing hormone) w płynie mózgowo rdzeniowym. W badaniach post mortem stwierdzono podwyższony poziom CRH jak i mrna kodującego syntezę tego peptydu. Wykryto także kilkakrotnie większą liczbę neuronów wydzielających CRH w jądrze przykomorowym podwzgórza (Hindmarch I. 2001, Nemeroff i wsp Raadsheer i wsp. 1994). Udowodniono ponadto, że narażenie na długotrwały stres w dzieciństwie prowadzi do uszkodzenia i nadaktywności osi HPA, co w życiu dorosłym prowadzi do depresji. Obecnie trwają badania nad wprowadzeniem skutecznych leków będących modulatorami tego układu (Kostowski W. 2004). Antagonista receptorów glukokortykoidowych mifepriston, a także antagoniści receptorów CRF 1 i CRF 2 wykazują właściwości przeciwdepresyjne (Belanoff i wsp. 2002, Healy D. 1999).

9 9 Troficzna hipoteza depresji Troficzna hipoteza depresji mówi, że w przebiegu tej choroby dochodzi do obniżenia poziomu neurotrofin w mózgu. Neurotrofiny są białkami, które odpowiadają za wzrost i dojrzewanie neuronów, a także zwiększają przeżywalność dojrzałych komórek nerwowych. Hipoteza ta poparta jest wieloma dowodami. Badania prowadzone na szczurach wykazały, że długotrwały stres prowadzi do obniżenia poziomu BDNF mózgowego czynnika neurotroficznego w strukturach mózgu związanych z depresją (Duman i Monteggia 2006, Cieślik i wsp. 2011). Stosowanie leków przeciwdepresyjnych hamuje wpływ stresu na BDNF, a jego podawanie do mózgu badanych zwierząt zabezpiecza przed obumieraniem neuronów w modelach stresu (Duman 2004) oraz działa przeciwdepresyjnie w teście wymuszonego pływania (Nibuya i wsp. 1995) i modelach depresji (Siuciak i wsp. 1997, Shirayama i wsp. 2002, Eisch i wsp. 2003). Podawanie leków przeciwdepresyjnych, aktywność fizyczna i elektrowstrząsy powodują wzrost poziomu BDNF w korze mózgowej i hipokampie (Nibuya i wsp. 1995, Dias i wsp. 2003, Farmer i wsp. 2004). Zbyt niski poziom BDNF może prowadzić do atrofii hipokampa i kory przedczołowej, co wykazano w badaniach post mortem (Kerage i wsp. 2005, Duman i wsp. 2006). Troficzna hipoteza depresji może tłumaczyć opóźniony efekt terapeutyczny leków przeciwdepresyjnych. Prawdopodobnie czas kilkutygodniowego stosowania leków jest potrzebny do osiągnięcia odpowiedniego poziomu czynników neurotroficznych. Badania na zwierzętach dowodzą, że BDNF jest niezbędny do uzyskania odpowiedzi na leki przeciwdepresyjne (Duman i Monteggia 2006, Castren i Rantamaki 2010). Następstwem długotrwałego przyjmowania leków przeciwdepresyjnych jest aktywacja receptorów związanych z białkiem G S (receptory noradrenergiczne beta, serotoninergiczne 5HT 4 ). Pobudza to działanie cyklazy adenylanowej prowadząc do powstawania camp (Avissar S, Schreiber G. 2006). Ten wtórny przekaźnik aktywuje szereg kinaz białkowych, między innymi PKA (z ang: camp dependent protein kinase), która katalizuje fosforylację wielu białek, m. in. czynnika transkrypcyjnego CREB (z ang. camp response element binding protein). Następstwem tego jest nasilona synteza białka BDNF mózgowego czynnika neurotroficznego (Hindmarch I. 2001, Holsboer F. 1999).

10 10 Teoria glutaminianergiczna depresji Wiele dowodów wskazuje, że przekaźnictwo glutaminianergiczne jest zaburzone w przebiegu depresji, jednakże charakter tych zaburzeń oraz ich powiązanie z patomechanizmem choroby nie są dokładnie poznane. U pacjentów z depresją wykazano zmiany w poziomie glutaminianu w surowicy i płynie mózgowo rdzeniowym (Nowak i wsp. 2003, Machado-Vieira i wsp. 2009), a także w różnych strukturach mózgu w badaniach post mortem (Hashimoto i wsp. 2007). W badaniach przeprowadzonych z zastosowaniem spektroskopii rezonansu magnetycznego zaobserwowano wzrost poziomu glutaminianu i obniżenie poziomu GABA w korze mózgowej pacjentów z depresją (Auer i wsp. 2000, Sanacora i wsp. 2004). W 2007 roku Beneyto i wsp. opublikowali wyniki badań post mortem, w których wykazują zmiany w poziomach poszczególnych podjednostek wchodzących w skład receptora NMDA w różnych strukturach mózgu, co wpływa w aktywność elektrofizjologiczną tych receptorów. Ligandy receptorów glutaminianergicznych jono- i metabotropowych wykazują działanie przeciwdepresyjne w wielu testach i modelach zwierzęcych depresji a także u pacjentów cierpiących na tę chorobę (Sanacora i wsp. 2008, Zarate i wsp. 2002). Riluzol jest lekiem stosowanym w leczeniu stwardnienia zanikowego bocznego, który inaktywuje potencjałozależne kanały sodowe i hamuje presynaptyczne uwalnianie aminokwasów pobudzających, w tym glutaminianu. Wykazuje on aktywność przeciwdepresyjną w testach i modelach depresji u zwierząt (Gourley i wsp. 2012, Takahashi i wsp. 2011) a także u pacjentów z depresją lekooporną (Zarate i wsp. 2004). Lamotrygina jest lekiem stosowanym w leczeniu padaczki, który hamuje uwalnianie glutaminianu poprzez blokowanie kanałów sodowych, potasowych i wapniowych. (Grunze i wsp. 1998). Eksperymenty na zwierzętach wykazały aktywność przeciwdepresyjną tego leku (Bourin i wsp. 2005, Consoni i wsp. 2006), co znajduje także potwierdzenie u pacjentów z depresją i chorobą afektywną dwubiegunową. Powiązanie układu glutaminianergicznego z depresją jest obecnie intensywnie badane.

11 11 Układ glutaminianergiczny Układ glutaminianergiczny jest głównym układem pobudzającym w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Wspólnie z hamującym układem GABA-ergicznym odpowiada za utrzymanie homeostazy w mózgu (Schoepp 2001). Zaburzenia funkcji układu glutaminianergicznego obserwuje się w przebiegu wielu chorób psychicznych, takich jak schizofrenia, uzależnienia, choroba Alzheimera, autyzm i depresja (Danysz i wsp. 1995, Javitt i wsp. 2011). Glutaminian jest neuroprzekaźnikiem w ponad połowie neuronów w OUN. Może on być syntetyzowany de novo z glukozy w cyklu Krebsa lub w cyklu glutaminian (Glu) glutamina (Gln) przy udziale astrocytów (Pacher i Kecskemeti 2004). Jest on transportowany przy udziale białek transportujących glutaminian do pęcherzyków synaptycznych (VGLUT) do zakończenia aksonu i tam przechowywany. Uwalnianie tego przekaźnika do szczeliny synaptycznej zachodzi na drodze egzocytozy i jest zależne od jonów Ca 2+ oraz wymaga ATP. Transportery glutaminianu (EAAT) wychwytują glutaminian ze szczeliny synaptycznej do astrocytów, gdzie jest on przekształcany w glutaminę w reakcji katalizowanej przez syntetazę glutaminy. Glutamina jest następnie transportowana do neuronu, gdzie na drodze hydrolizy zostaje zamieniona w glutaminian przy udziale enzymu glutaminazy. (Pittenger i wsp. 2007, Alt i wsp. 2006, Car 2009, Sanacora 2008). Uwalnianie glutaminianu do szczeliny synaptycznej jest kontrolowane przez szereg receptorów, takich jak metabotropowe glutaminianergiczne grupy II i III ale także należące do innych układów neuroprzekaźnikowych cholinergiczne nikotynowe i muskarynowe, adenozynowe, ĸ-opioidowe, gabaergiczne GABA B, cholecystokininowe, oraz receptory dla neuropeptydu Y (Meldrum BS. 2000).

12 12 Ryc. 1: Synapsa glutaminianergiczna (wg Pittenger i wsp. 2007) Glutaminian uwolniony do szczeliny synaptycznej działa na receptory jono i metabotropowe.

13 13 Receptory jonotropowe Do receptorów jonotropowych układu glutaminianergicznego zaliczamy receptory NMDA (kwas N-metylo-D-asparaginowy), AMPA (kwas α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4- isoksazolepropionowy) i kainianowe (KA kwas kainowy) (Sommer i wsp. 1992, Du i wsp. 2006). NMDA Ryc. 2: Schemat budowy receptora NMDA. Źródło: Receptory NMDA odgrywają istotną rolę w plastyczności synaptycznej i procesie zapamiętywania (tworzenie nowych synaps) (Riedel i wsp. 2003, Hunt i Castillo 2012). Są także odpowiedzialne za powstawanie procesów patologicznych takich jak ostre i przewlekłe schorzenia neurologiczne, choroby psychiatryczne oraz ból neuropatyczny (Parsons i wsp. 1999, Zhuo i wsp. 2011). Są one szeroko rozmieszczone w OUN, szczególnie duża ich ilość występuje w hipokampie, korze mózgowej, jądrach podstawy, przegrodzie i jądrze migdałowatym. Poza OUN występują w zwojach układu wegetatywnego, nadnerczach, śledzionie a także w układzie pokarmowym (Nowak i Zawilska 2004).

14 14 Receptory NMDA są zlokalizowane głównie postsynaptycznie w pobudzających synapsach glutaminianergicznych. Receptor NMDA jest kanałem przepuszczalnym dla jonów Na +, K + oraz Ca 2+. Do otwarcia kanału konieczna jest obecność agonisty glutaminianu oraz koagonisty - glicyny lub D-seryny a także depolaryzacja błony postsynaptycznej w której znajduje się receptor, w celu usunięcia jonu Mg 2+ blokującego kanał. Uwolnienie glutaminianu do szczeliny synaptycznej powoduje otwarcie kanałów AMPA i wstępną depolaryzację błony, przez co następuje usunięcie blokady magnezowej w NMDA (Nowak i wsp. 1984). NMDA jest tetramerem, w którym występują po dwie podjednostki GluN1 i GluN2, rzadziej GluN3. Są one kodowane przez kilka różnych genów: GluN1A-G, GluN2A-D oraz GluN3A-B (Cull-Candy i Leszkiewicz 2004). Miejsce wiązania glutaminianu znajduje się w podjednostce GluN2 a glicyny (lub D-seryny) w podjednostce GluN1 (Rambhadran i wsp. 2010). Skład podjednostkowy warunkuje właściwości funkcjonalne receptora NMDA. Podjednostka GluN1 występuje we wszystkich neuronach na każdym etapie rozwoju. Geny kodujące podjednostki GluN2 wykazują różną aktywność w kolejnych etapach rozwoju układu nerwowego. W fazie embrionalnej dominują geny kodujące GluN2B i GluN2D podczas gdy pozostałe typy podjednostek praktycznie nie występują. W dojrzałym mózgu najwięcej jest GluN2A, ekspresja GluN2B jest najwyższa w korze, hipokampie, ciele migdałowatym, jądrze brzusznym wzgórza oraz w opuszkach węchowych (Monyer i wsp. 1994). W dojrzałym rdzeniu kręgowym ekspresja GluN2B ogranicza się do blaszki II rogów tylnych, gdzie dochodzą impulsy z receptorów bólowych. Fakt ten może częściowo tłumaczyć przeciwbólowe działanie antagonistów tej podjednostki (Mony i wsp. 2009). Każda z podjednostek zbudowana jest z czterech fragmentów białkowych M1 M4 o charakterze lipofilnym. Odcinek M2 tworzy w błonie pętlę i stanowi ścianę kanału jonowego. Pozostałe fragmenty przechodzą przez całą grubość błony. Koniec aminokwasowy łańcucha białkowego każdej podjednostki znajduje się na zewnątrz, a karboksylowy wewnątrz komórki. Końcowe odcinki M1, M3 i M4 znajdujące się na zewnątrz błony tworzą miejsce wiązania agonisty (w podjednostce GluN2) oraz koagonisty (w podjednostce GluN1). Odcinek M2 ma kluczowe znaczenie dla przepuszczalności kanału dla jonów Ca 2+ oraz jego blokady przez jony Mg 2+ i inne substancje (Vyklicky i wsp. 2014).

15 15 Głównym endogennym agonistą receptora NMDA jest kwas L-glutaminowy, ale podobną rolę mogą pełnić też takie substancje jak kwas asparaginowy, chinolinowy oraz L-homocysteinowy. NMDA jest agonistą egzogennym (Patneau i Mayer 1990). Koagonistą receptora NMDA jest glicyna a także D-seryna, które przyłączają się do podjednostki GluN1 w miejscu GLY B. Do otwarcia kanału konieczne jest przyłączenie dwóch cząsteczek agonisty i koagonisty po jednej do każdej z podjednostek. Ważną cechą receptora NMDA jest blokada kanału przez jony Mg 2+ zależna od potencjału błonowego. Zniesienie blokady jest możliwe po wstępnej depolaryzacji błony. W warunkach potencjału spoczynkowego nawet w obecności agonisty i koagonisty kanał nie jest przepuszczalny dla jonów. Dopiero kiedy błona ulegnie wstępnej depolaryzacji dzięki receptorom AMPA pobudzanym przez glutaminian blokada magnezowa zostaje zniesiona i przepuszczalność kanału NMDA rośnie. Siła blokowania kanału zależy od składu podjednostkowego receptora, np. połączenie GluN1 z GluN2C stanowi receptor o małym powinowactwie do Mg 2+ a GluN1 z GluN2A lub GluN1 z GluN2B wykazują silną blokadę magnezową w warunkach spoczynkowego potencjału błonowego (Dingledine i wsp. 1999). Poza jonami magnezu kanał receptora może być także blokowany przez inne substancje na zasadzie antagonizmu bezkompetycyjnego. Oznacza to, że aby bloker mógł przyłączyć się do swojego miejsca wiązania kanał musi być wcześniej otwarty, a więc konieczna jest obecność agonisty. Antagoniści niekompetycyjni wiążą się do swoistych miejsc na receptorze niezależnie od obecności agonisty. Związki blokujące kanał NMDA to m. in. memantyna, amantadyna, ketamina, fencylkidyna (PCP), oraz dizocylpina (MK-801). Siła blokady podobnie jak w przypadku Mg 2+ zależy od potencjału błony. Amantadyna i jej pochodna memantyna mają stosunkowo niskie powinowactwo do kanału, obniżają jego aktywność o ok. 50%. Badania kliniczne wykazały ich skuteczność w leczeniu choroby Parkinsona, Alzheimera a także innych typów demencji bez poważnych efektów niepożądanych. Amantadyna wykazuje właściwości przeciwdepresyjne w badaniach na zwierzętach jak i klinicznych, jednakże jej stosowanie jest ograniczone ze względu na oddziaływanie także z układem dopaminergicznym (Huber i wsp. 1999). Memantyna skraca czas bezruchu myszy i szczurów w teście wymuszonego pływania, ponadto nasila działanie imipraminy i fluoksetyny w tym teście (Maeng i Zarate 2007, Sanacora i wsp. 2008).

16 16 Ketamina jest antagonistą o wyższym powinowactwie do receptora NMDA od innych blokerów kanału, jest pochodną fencyklidyny. Jako lek stosowana jest w znieczuleniu ogólnym. Podanie ketaminy wywołuje efekty przeciwdepresyjne i przeciwlękowe w zwierzęcych modelach depresji i lęku jak również u ludzi. W badaniach klinicznych znacząca poprawa stanu pacjentów z depresją pojawiała się już 72 godziny po iniekcji (0,5 mg/kg) ketaminy, czyli znacznie szybciej niż w przypadku stosowania leków przeciwdepresyjnych. Dodatkowo, pomimo krótkiego (około 2 godzin) czasu półtrwania ketaminy, efekt terapeutyczny utrzymywał się ponad tydzień. Podobnie u zwierząt skrócenie czasu bezruchu w teście wymuszonego pływania obserwowano nawet 2 tygodnie po jednorazowym podaniu ketaminy (Maeng i wsp. 2008, Berman i wsp. 2000, Skolnick 1999, Engin i wsp. 2009). Inhibitorami niekompetycyjnymi receptora NMDA są zewnątrzkomórkowe protony (H + ), które hamują jego aktywność niezależnie od napięcia. Jest to prawdopodobnie mechanizm ograniczający uszkodzenie neuronu poprzez niedokrwienie czy drgawki, którym towarzyszy łagodna kwasica. Wrażliwość receptorów na protony zależy od ich budowy. Receptory zawierające podjednostkę GluN2C są najmniej wrażliwe, najwyższą wrażliwość na zmiany ph wykazują te o budowie GluN1A/GluN2B oraz GluN1A/GluN2D. W warunkach fizjologicznych około połowa z tych receptorów jest łagodnie hamowana, a nawet niewielkie zmiany zewnątrzkomórkowego ph mogą znacząco wpływać na ich przepuszczalność (Mony i wsp. 2009). Mechanizm działania protonów wiąże się ze stabilizacją zamkniętego kanału, pozostając bez wpływu na czas jego otwarcia (Banke i wsp. 2005). Aktywność receptora NMDA może być modulowana przez poliamidy, takie jak spermina lub spermidyna. Efektem działania poliamin może być zmiana siły wiązania glutaminianu lub glicyny do receptora. Efekt ten zależy od składu podjednostkowego receptora. Ważnym antagonistą NMDA jest cynk. Miejsce wiązania cynku znajduje się na zewnątrz kanału receptora. Przy dużych stężeniach jony Zn 2+ mogą bezpośrednio blokować kanał jonowy w sposób zależny od potencjału błony neuronu. Receptory zawierające podjednostki GluN2A są hamowane przez niższe stężenia cynku niż te zawierające GluN2B.

17 17 Inną grupą substancji modulujących aktywność receptorów NMDA są neurosteroidy syntetyzowane w mózgu (Robel i Baulieu 1994). Fizjologicznie występują one w OUN w ilościach nanomolarnych, jednakże ich stężenie może znacząco rosnąć pod wpływem takich czynników jak np. stres. W odróżnieniu od steroidów produkowanych przez gruczoły dokrewne, neurosteroidy działają lokalnie i wywołują silny wpływ na pobudliwość neuronów. Głównym celem ich działania są receptory GABA A (Belelli i Lambert 2005) należące do układu hamującego w OUN. Efekt, jaki neurosteroidy wywierają na receptory NMDA, zależy od ich budowy chemicznej, jak również od składu podjednostkowego receptora. Siarczan pregnenolonu działa pobudzająco na receptory GluN1/GluN2A i GluN1/GluN2B, hamuje natomiast GluN1/GluN2C oraz GluN1/GluN2D (Malayev i wsp. 2002, Horak i wsp. 2006). Badania na liniach komórkowych dowiodły, że aktywność tego neurosteroidu jest znacznie wyższa, jeśli jego podanie poprzedza stan aktywacji receptora NMDA. Oznacza to, że przyłączenie glutaminianu znacznie obniża wiązanie siarczanu pregnenolonu (Horak i wsp. 2004). Modulowanie funkcji receptora przy pomocy substancji selektywnie wiążących poszczególne podjednostki daje potencjalne możliwości leczenia wielu chorób OUN. W odróżnieniu od nieselektywnych antagonistów NMDA, które wykazują wiele efektów niepożądanych, m. in. sercowo-naczyniowych, jak również aktywność cytotoksyczną, substancje będące selektywnymi antagonistami GluN2B są dobrze tolerowane. Antagoniści GluN2B mogą mieć zastosowanie w leczeniu chronicznego lęku, choroby Parkinsona, choroby Huntingtona, Alzheimera, udaru mózgu oraz depresji (Kemp i wsp. 1999). Jednym z czynników wykazujących dużą selektywność do podjednostki GluN2B jest ifenprodil i jego pochodne. (Williams 1993, Perin-Dureau i wsp. 2002) Lek ten znany wcześniej jako rozkurczający naczynia mózgowe (Carron i wsp. 1971) posiada także właściwości neuroprotekcyjne przez niekompetycyjny antagonizm receptora NMDA (Carter i wsp. 1988). Rosnąca ilość badań potwierdzających korzystne działanie pochodnych ifenprodilu przyczyniła się do powstania dużej rodziny pochodnych tego leku. Najlepiej dotychczas poznane to traksoprodil (CP101,606) (Chenard i wsp. 1995, Skolnick i wsp. 2009), besonprodil (Cl-1041) (Chizh i wsp. 2001) oraz Ro (Fischer i wsp. 1997). Traksoprodil wykazał w badaniach klinicznych znaczące i relatywnie szybkie działanie przeciwdepresyjne u chorych z depresją lekooporną (Preskorn i wsp. 2008). Ifenprodil i jego pochodne wykazują

18 18 silniejsze powinowactwo do receptora NMDA będącego w stanie aktywacji i desensytyzacji niż będącego w stanie niepobudzonym (Kew i wsp. 1996, Gill i wsp. 2002). Nadaktywność receptorów NMDA występuje często w stanach patologicznych, a ich selektywne hamowanie bez jednoczesnego wpływu na fizjologicznie działające receptory stanowi korzystny czynnik terapeutyczny. Siła antagonistycznego działania poprzez wiązanie podjednostki GluN2B rośnie również ze spadkiem ph, co także ma miejsce w warunkach patologicznych, jak np. niedokrwienie. (Silver i wsp. 1992). Dotychczasowe badania wskazują na potencjalnie korzystne działanie terapeutyczne selektywnych allosterycznych modulatorów GluN2B w takich stanach jak ból neuropatyczny (Chizh i wsp. 2001, 2007), choroba Parkinsona (Del Dotto i wsp. 2001), Huntingtona (Zeron i wsp. 2002), Alzheimera (Parsons i wsp. 2007), niedokrwienie (Kemp i wsp. 1999) i depresja (Preskorn i wsp. 2008). Receptory NMDA są zaangażowane w ważne procesy fizjologiczne, takie jak plastyczność synaptyczna i tworzenie synaps, co jest warunkiem koniecznym powstawania pamięci. Mają one udział także w patomechanizmie chorób OUN takich jak udary, epilepsja, stwardnienie zanikowe boczne, choroba Huntingtona i Alzheimera (Yamakura i Shimoji 1999). Receptory NMDA a depresja Pierwsze doniesienia o udziale receptora NMDA w patomechanizmie i leczeniu depresji pojawiły się w latach 50. XX wieku, kiedy odkryto, że D-cykloseryna (częściowy agonista miejsca glicynowego) - stosowana wówczas jako lek przeciwtuberkulinowy wykazuje właściwości przeciwdepresyjne (Crane 1959, Crane 1961). Związek pomiędzy NMDA a chorobami afektywnymi jest nadal intensywnie badany i obecnie znanych jest wiele dowodów na to, że neurotransmisja z udziałem tego receptora jest mocno zaangażowana w powstawanie i leczenie depresji. Badania przedkliniczne pokazały przeciwdepresyjne działanie ligandów receptora NMDA. Są to m. in.: AP-7 (kwas 2-amino-7-fosfoheptanowy) antagonista kompetycyjny, ACPC (kwas 1-aminocyklopropanokarboksylowy) i GLYX-13 częściowi agoniści miejsca

19 19 glicynowego, (Trullas i Skolnick 1990, Burgdorf i wsp. 2013), memantyna i amantadyna blokery kanału (Huber i wsp. 1999), eliprodil i ifenprodil antagoniści niekompetycyjni działający na miejsce poliaminowe. Antagonista kompetycyjny receptora NMDA CGP37849 stosowany chronicznie podobnie jak dezipramina prowadzi do obniżenia gęstości receptorów β-adrenergicznych u szczurów poddanych testowi wymuszonego pływania (Wędzony i wsp. 1995). Wskazuje to na właściwości przeciwdepresyjne antagonisty NMDA. Antagoniści NMDA hamują atrofię neuronów hipokampa oraz zabezpieczają przed osłabieniem neurogenezy w odpowiedzi na stres (D Sa i Duman 2002, Duman 2002). Bloker kanału NMDA ketamina oraz selektywny antagonista GluN2B Ro odwracają strukturalne i funkcjonalne zmiany powstałe w modelu chronicznego nieprzewidywalnego stresu u szczurów. Badane zmiany to spadek ilości białek synaptycznych i kolców dendrytycznych oraz częstotliwości i amplitudy prądów synaptycznych w korze przedczołowej (Li i wsp. 2011). Istnieje wiele doniesień na temat przeciwdepresyjnych właściwości soli cynku w testach i modelach depresji u myszy i szczurów (Kroczka i wsp. 2000, Nowak i wsp. 2003). Ponadto suplementacja cynkiem poprawia skuteczność terapii lekami przeciwdepresyjnymi oraz zmniejsza częstość nawrotów choroby (Nowak i wsp. 2003, Siwek i wsp. 2009, Siwek i wsp. 2010, Lai i wsp. 2012). Badania osób chorych na depresję pokazują obniżenie poziomu tego pierwiastka we krwi, który powraca do normy po skutecznej terapii przeciwdepresyjnej (Maes i wsp. 1997, Nowak i wsp. 2005). W badaniach przedklinicznych z udziałem zwierząt stosowane są testy i modele depresji. Najbardziej popularne testy to: test wymuszonego pływania (test Porsolta) test zawieszenia za ogon Mają one na celu szybką wstępną ocenę przeciwdepresyjnych właściwości substancji niezależnie od mechanizmu ich działania. Modele depresji polegają na poddawaniu zwierząt działaniu określonych bodźców w celu wywołania u nich stanu naśladującego objawy depresji u ludzi. Najbardziej popularne to:

20 20 model chronicznego łagodnego stresu model przewlekłego nieprzewidywalnego stresu model wyuczonej bezradności model usunięcia opuszek węchowych Modele te pozwalają na badanie patomechanizmu depresji, a ich objawy cofają się pod wpływem działań terapeutycznych, co pozwala nie tylko na ocenę skuteczności, ale także mechanizmu działania leków. W modelu nieuniknionego stresu zaobserwowano osłabienie plastyczności synaptycznej w hipokampie szczurów, która jest zależna od receptorów NMDA (Shors i wsp. 1989). Chroniczny łagodny stres powoduje wzrost powinowactwa glicyny do miejsca GLY B w korze mózgowej szczura (Nowak i wsp. 1998). W modelu przewlekłego nieprzewidywalnego stresu a także po usunięciu opuszek węchowych zaobserwowano efekt przeciwny spadek wiązania glicyny do miejsca GLY B (Nowak 1996). Niezależnie od rodzaju efektów zachodzących pod wpływem modelów depresji w receptorach NMDA wiadomo, że modele te wywołują zmiany adaptacyjne w tych receptorach, co sugeruje, że ich funkcjonowanie w przebiegu depresji jest zmienione. W badaniach post mortem na mózgach ludzi cierpiących na depresję stwierdzono zmiany w składzie podjednostkowym receptorów NMDA w różnych regionach mózgu. W hipokampie zaobserwowano spadek ilości transkryptów kodujących podjednostki GluN1 i GluN2A, podczas gdy ekspresja GluN2B pozostawała bez zmian. W tych samych tkankach stwierdzono osłabienie wiązania antagonistów CGP39653 oraz MK-801. Podobne zmiany udowodniono także w innych badaniach prowadzonych na mózgach ludzkich (Nowak i wsp. 1995, Sanacora i wsp. 2008). Stosowanie terapii przeciwdepresyjnej zarówno farmakologicznej jak i elektrowstrząsów - również wywołuje zmiany w obrębie receptorów NMDA. Trójcykliczne leki przeciwdepresyjne (imipramina, dezipramina), selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (fluoksetyna, sertralina), bupropion oraz elektrowstrząsy stosowane chronicznie prowadzą do obniżenia zdolności glicyny do wypierania kwasu [3H]-5,7-dichlorokynureninowego antagonisty miejsca GLY B (Paul i wsp. 1993, Paul i wsp. 1994, Nowak i wsp. 1993, Nowak i wsp. 1996).

21 21 AMPA Ryc. 3: Schemat budowy receptora AMPA. Źródło: Receptory AMPA słabiej wiążą kwas glutaminowy niż NMDA ale są szybciej aktywowane odpowiadają za szybkie przekaźnictwo synaptyczne układu glutaminianergicznego. Ilość AMPA w błonie postsynaptycznej jest zmienna. Tylko ok. 50% tych receptorów jest wbudowanych w błonę, reszta znajduje się we wnętrzu komórki. Pula wewnątrzkomórkowa może zostać wbudowana w błonę a następnie ponownie wchłonięta. Dynamiczna regulacja gęstości AMPA w błonie neuronu jest jedną z przyczyn plastyczności mózgu (Nowak i Zawilska 2004). Receptory AMPA są obecne w całym OUN. Są związane z kanałem jonowym przepuszczalnym dla jonów Na + i K +. Kanał zbudowany jest z czterech podjednostek, które mogą być kodowane przez cztery różne geny GluA1-4. Dodatkowo, w wyniku potranskrypcyjnej modyfikacji mrna (ang. splicing) każda podjednostka może występować w postaci wariantów flip i flop. W skład kompleksu receptora wchodzą najczęściej dwa różne ich typy. Kanały pozbawione podjednostki GluA2 mogą być przepuszczalne dodatkowo

22 22 dla jonów Ca 2+ (Zarate i wsp. 2003, Du i wsp. 2004). Budowa podjednostek jest podobna jak w przypadku receptora NMDA składają się one z czterech fragmentów lipofilnych, z których trzy (M1, M3 i M4) przechodzą przez błonę komórkową a czwarta (M2) tworzy w błonie pętlę i stanowi ścianę kanału. Ważną rolę w regulacji aktywności receptorów AMPA poza glutaminianem odgrywają modulatory allosteryczne. Ich znaczenie odkryto badając wpływ pochodnej pirolidynonu aniracetamu na prądy mediowane przez ten receptor. Zaobserwowano nasilenie przepływu jonów przez kanał ale tylko w obecności agonisty (Ito i wsp. 1990). Dalsze poszukiwania przyczyniły się do poznania kolejnych modulatorów AMPA o różnych strukturach chemicznych takich jak benzotiazydy (np. cyklotiazyd), pochodne pirolidynonu (piracetam), benzylopiperydyny (np. CX516, CX546) oraz diarylpropylsulfonamidy (np. LY392098, LY404187) (Miu i wsp. 2001). Allosteryczne modulatory tych receptorów można podzielić w zależności od tego, jak działają na procesy ich desensytyzacji i deaktywacji. Aniracetam osłabia deaktywację nie wpływając prawie na desensytyzację receptora AMPA. Cyklotiazyd natomiast znacznie osłabia jego przejście w stan desensytyzacji (Alt i wsp. 2006, Sanacora i wsp. 2008). Niektóre ampakiny, jak na przykład CX614 hamują zarówno desensytyzację jak i deaktywację. Mechanizm tego działania nie jest dokładnie poznany (Arai i wsp. 2000). Deaktywacja i desensytyzacja receptora AMPA są wywoływane przez zmiany konformacyjne miejsca wiążącego glutaminian (LBC z ang. ligand - binding core). Przyłączenie glutaminianu wywołuje zmiany konformacyjne w LBC podjednostek prowadzące do otwarcia kanału. Odłączenie agonisty pozwala na zamknięcie kanału deaktywację receptora. Długotrwała obecność glutaminianu wywołuje inne zmiany w obrębie LBC, poprzez które nie jest możliwe otwarcie kanału. Taki stan niewrażliwości receptora na agonistę nazywamy desensytyzacją. Procesy deaktywacji i desensytyzacji są zależne m. in. od wariantów potranskrypcyjnych, w jakich występują podjednostki wchodzące w skład kanału receptora. Forma flip wykazuje wolniejszą desensytyzację. Podobnie modulatory allosteryczne wykazują różną zdolność do regulowania aktywności receptora AMPA w zależności od jego budowy. Cyklotiazyd posiada 50-krotnie większą zdolność do pobudzania formy GluA1 flip w porównaniu z formą GluA1 flop. Podobną preferencję opisano dla LY a odwrotną dla aniracetamu.

23 23 Warianty flip i flop mają różne rozmieszczenie w OUN, np. forma flip GluA2 przeważa w regionie CA3 hipokampa a forma flop w zakręcie zębatym oraz CA1. Takie zjawisko daje możliwość wykorzystywania modulatorów allosterycznych ze znaną preferencją form potranskrypcyjnych podjednostek do regulowania neurotransmisji glutaminianergicznej w określonych strukturach mózgu. Ryc. 4: Zmiany konformacyjne w receptorze AMPA (Traynelis i wsp. 2010) Aktywność receptorów AMPA jest regulowana przez fosforylację aminokwasów (seryny, treoniny, tyrozyny) wchodzących w skład C-końca łańcucha znajdującego się wewnątrz komórki. W procesach tych bierze udział kinaza białkowa A (PKA), kinaza białkowa C (PKC), kinaza białkowa II zależna od jonów Ca 2+ i kalmoduliny (CaMK II) oraz kinaza tyrozynowa (Trk). Fosforylacja GluA1 w miejscu Ser845 przez PKA nasila proces jej insercji do błony neuronu. Reakcja odwrotna defosforylacja powoduje ponowne wchłonięcie tej podjednostki do endosomu, gdzie może ona ulegać kolejnej fosforylacji przez kinazę białkową A i znowu zasilić pulę błonową AMPA. PKA może być aktywowana poprzez podawanie leków przeciwdepresyjnych, a także poprzez stymulację innych receptorów, jak dopaminowe D1, serotoninowe oraz metabotropowe glutaminianergiczne. Pobudzenie CaMK II prowadzi do fosforylacji GluA1 w błonie postsynaptycznej w pozycji Ser831, jak również nasila wbudowywanie tej podjednostki w błonę neuronu. Wykazano, że leki przeciwdepresyjne nasilają aktywność CaMK II, bierze ona udział w procesach uczenia

24 24 i pamięci. Fosforylacja GluA2 przez PKC w miejscu Ser880 nasila internalizację tej podjednostki (Derkach i wsp. 2007). Receptory AMPA a depresja Dowodem na udział receptorów AMPA w patomechanizmie depresji są wyniki badań pokazujących zmiany w tych receptorach u samobójców a także u zwierząt w modelach depresji. W badaniach post mortem wykazano zmiany w poziomie podjednostek GluA1 i GluA3 w hipokampach ludzi chorych na depresję. Podobne zaburzenia zaobserwowano u szczurów w modelu chronicznego nieprzewidywalnego stresu, a ich powstawanie jest odwracane przez leki przeciwdepresyjne (Duric i wsp. 2012). Wyniki innych badań wskazują na zmiany poziomu podjednostek GluA1 oraz wiązania [3H]AMPA w prążkowiu pod wpływem leków przeciwdepresyjnych (Meador-Woodruff i wsp. 2001). Dezipramina i paroksetyna nasilają ekspresję tych samych podjednostek w hipokampie szczurów (Martinez Turrillas i wsp. 2002, 2005). Ampakiny pozytywne allosteryczne modulatory receptora AMPA hamują internalizację i/lub deaktywację tego receptora w obecności agonisty (Black 2005). Badania przedkliniczne ampakin zaliczanych do różnych grup chemicznych ujawniają ich aktywność w modelach schizofrenii (O Neill i wsp. 2004), choroby Parkinsona (Murray i wsp. 2003) a także działanie prokognitywne (Bernard i wsp. 2010) neuroprotekcyjne i przeciwdepresyjne (Machado-Vieira i wsp. 2012). LY skraca czas bezruchu w teście wymuszonego pływania u myszy i szczurów oraz w teście zawieszenia za ogon u myszy (Li i wsp. 2001). LY oraz LY wykazują aktywność przeciwdepresyjną w tych testach u myszy (Quirk i Nisenbaum 2002). Modulatory AMPA działają przeciwdepresyjnie podane samodzielnie, a także nasilają działanie leków przeciwdepresyjnych. LY w sposób dawko-zależny nasilał działanie fluoksetyny, citalopramu, imipraminy, duloksetyny, i rolipramu, od 2 do 10- krotnie w teście wymuszonego pływania u myszy, (tzn. obniżał minimalną dawkę efektywną - MED). Podobnie badane leki podawane w dawkach nieaktywnych nasilały (od 4 do 10-krotnie) aktywność przeciwdepresyjną LY w teście Porsolta (Li i wsp. 2003).

25 25 Aktywność przeciwdepresyjną LY wykazano także w modelu chronicznego nieprzewidywalnego stresu u myszy, w którym znosił większość objawów depresyjnych. Antagonista AMPA GYKI w tym samym teście hamował przeciwdepresyjne działanie fluoksetyny (Farley i wsp. 2010). Ampakiny nie powodują wzrostu stężenia norepinefryny, serotoniny ani dopaminy w dializatach kory przedczołowej. Wskazuje to na mechanizm działania niezależny od hamowania wychwytu zwrotnego tych amin ani od nasilania ich uwalniania do przestrzeni synaptycznej. Potencjatory receptora AMPA, podobnie jak leki przeciwdepresyjne, nasilają ekspresję BDNF (Alt i wsp. 2006, Bleakman i wsp. 2007, O`Neill i Witkin 2007), efekt ten jest hamowany przez NBQX. Tradycyjne leki przeciwdepresyjne zwiększają synaptyczny poziom monoamin takich jak serotonina i norepinefryna poprzez blokowanie ich degradacji przez monoaminooksydazę lub blokując ich wychwyt zwrotny przez transportery. To prowadzi do aktywacji szlaku camp i pobudzenia kinazy białkowej A, która poprzez CREB indukuje ekspresję BDNF. Zwiększone stężenie monoamin może indukować BDNF także poprzez kinazę zależną od Ca 2+ i kalmoduliny. Fluoksetyna, imipramina oraz tianeptyna, modulują pozytywnie receptor AMPA poprzez fosforylację seryny GluA1 katalizowaną przez DARPP-32 (z ang. dopamineand camp-regulated phosphoprotein of M r 32,000). Prowadzi to do nasilenia przekaźnictwa AMPA (Alt i wsp. 2006, Bleakman i wsp. 2007, Svenningson i wsp. 2007).

26 26 Interakcje NMDA - AMPA NBQX antagonista receptora AMPA blokuje działanie ketaminy w teście wymuszonego pływania u myszy (Maeng i wsp. 2008). Fakt ten sugeruje, że efekt przeciwdepresyjny ketaminy blokera kanału NMDA polega głównie na aktywacji receptora AMPA. Podobną zależność pomiędzy tymi receptorami udowodniono w przypadku zastosowania MK-801 nieselektywnego antagonisty NMDA oraz Ro selektywnego antagonisty GluN2B. Obie te substancje powodują skrócenie czasu bezruchu u myszy w teście Porsolta i w obu przypadkach efekt ten jest znoszony przez zastosowanie NBQX. W tych samych badaniach podanie NBQX nie wpłynęło na przeciwdepresyjne działanie imipraminy. Innym dowodem wzajemnych powiązań funkcjonalnych jonotropowych receptorów glutaminianergicznych jest wpływ ketaminy na desensytyzację AMPA w obecności agonisty. Ważną rolę w desensytyzacji tego receptora odgrywa fosforylacja podjednostki GluA1. Badania na myszach wykazały, że podanie ketaminy znacznie obniża fosforylację GluA1 w hipokampie, nie wpływając jednak na jej ilość. Efekt ten był blokowany przez wcześniejsze podanie NBQX. W tym samym eksperymencie imipramina nie wpływała na ilość oraz stopień fosforylacji GluA1 (Maeng i wsp. 2008). Interakcje NMDA AMPA potwierdzono również w badaniu przeciwdepresyjnych właściwości cynku antagonisty NMDA. Cynk wykazuje aktywność w teście wymuszonego pływania u myszy, a efekt ten jest odwracany przez NBQX. Ponadto łączne podanie cynku i CX614 w dawkach nieaktywnych statystycznie znamiennie skraca czas bezruchu myszy w teście Porsolta (Szewczyk i wsp. 2010). Jednym z efektów działania antagonistów NMDA jest wzrost synaptycznego stężenia glutaminianu, będący wynikiem blokowania tych receptorów zlokalizowanych presynaptycznie i/lub na interneuronach. Uwolniony glutaminian aktywuje postsynaptyczne receptory AMPA, które prawdopodobnie są niezbędnym etapem w mechanizmie działania antagonistów NMDA. Efekt ten zachodzi w krótkim czasie, co może tłumaczyć szybkie działanie przeciwdepresyjne ketaminy. Klasyczne leki przeciwdepresyjne osiągają efekt terapeutyczny poprzez złożone zmiany wewnątrzkomórkowe, co wymaga dłuższego czasu.

27 27 Jonotropowe receptory glutaminianergiczne biorą udział w procesach plastyczności synaptycznej, czyli tworzeniu nowych połączeń oraz powiększaniu synaps na szlakach neuronalnych intensywnie pobudzanych. Zjawisko plastyczności synaptycznej pełni kluczową rolę w procesach uczenia się i zapamiętywania. Jednym z mechanizmów umożliwiających modyfikację już istniejących synaps jest długotrwałe wzmocnienie synaptyczne LTP (z ang. long-term potentiation) (Santos i wsp. 2009). LTP polega na nasileniu wydajności przekaźnictwa synaptycznego pod wpływem intensywnego, krótkotrwałego pobudzenia synapsy. Takie wzmocnienie synaptyczne można wywołać w warunkach eksperymentalnych stymulując elektrycznie komórkę presynaptyczną z dużą częstotliwością lub stymulując jednocześnie obie komórki tworzące synapsę. Efektem tego jest uwolnienie glutaminianu do przestrzeni synaptycznej i aktywacja receptorów NMDA, czego efektem jest zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+ (indukcja LTP) (Hess 2007). Pozwala to na uruchomienie procesów biochemicznych zależnych od tych jonów, m. in. regulację aktywności białek transportujących i strukturalnych poprzez ich fosforylację i defosforylację. Zmianie ulegają także właściwości i skład podjednostkowy receptorów AMPA, które pojawiają się w błonie pozasynaptycznej na drodze egzocytozy a następnie są transportowanie do zagęszczenia postsynaptycznego. Są wśród nich zarówno heteromeryczne białka zbudowane z podjednostek GluA1 i GluA2, jak również homomery GluA1, przepuszczalne dla jonów Ca 2+. Na skutek aktywacji kinaz dochodzi do fosforylacji podjednostki GluA1 w pozycji Ser831 przez CaMK II, Ser845 przez kinazę białkową A oraz Ser818 przez kinazę białkową C, czego efektem jest zwiększone przewodnictwo przez kanał AMPA i nasilenie prądów postsynaptycznych (etap utrzymywania LTP). (Ahn i Choe 2009, Wang i wsp. 2006). Po pewnym czasie (ok. 25 minut od stymulacji) homomeryczne receptory AMPA są zastępowane przez bardziej stabilne heteromery zawierające podjednostkę GluA2, a więc o znikomej przepuszczalności dla jonów Ca 2+. Powyższe etapy stanowią tzw. wczesną fazę LTP, niezależną od syntezy białka. W fazie późnej dochodzi do biosyntezy nowych białek, zarówno lokalnej produkcji białek wchodzących w skład receptorów i cytoszkieletu jak i długotrwałej, zależnej od ekspresji genów. Dzięki tym procesom dochodzi do reorganizacji budowy i funkcji kolca dendrytycznego, co umożliwia długotrwałe utrzymywanie się LTP (Derkach i wsp. 2007).

28 28 Ryc. 5: Derkach et al. Nature Reviews Neuroscience 8, (February 2007) doi: /nrn2055

29 29 Receptory metabotropowe Receptory metabotropowe glutaminianergiczne zawierają trzy podtypy receptorów związanych z białkami G. Podzielono je ze względu na budowę, właściwości farmakologiczne i mechanizmy transdukcji sygnału. Grupa I Grupa II Grupa III mglur 1 mglur 2 mglur 4 mglur 5 mglur 3 mglur 6 mglur 7 mglur 8 Ryc. 6: Podział receptorów glutaminianergicznych metabotropowych. Metabotropowe receptory glutaminianergiczne modulują aktywność kanałów dla wapnia i potasu, przez co regulują aktywność synaptyczną neuronów, wpływając na uwalnianie glutaminianu i innych neuroprzekaźników (Cartmell i Schoepp 2000). Receptory grupy I zlokalizowane są głównie postsynaptycznie na powierzchni ciał komórkowych i kolców dendrytycznych neuronów występujących głównie w strukturach mózgu związanych z depresją. mglua1 znajdują się w móżdżku, opuszkach węchowych, regionie CA3 i zakręcie zębatym hipokampa, wzgórzu oraz substancji czarnej. mglu5 są zlokalizowane w kresomózgowiu, regionach CA1 i CA3 hipokampa, jądrach podstawy, ciele migdałowatym i prążkowiu (Pilc i wsp. 2008). Aktywacja grupy pierwszej stymuluje fosfolipazę C, która katalizuje hydrolizę fosfatydyloinozytolo-(4,5)-bisfosforanu (PIP2) w błonie komórkowej, prowadząc do powstania dwóch wtórnych przekaźników: inozytolotrójfosforanu (IP3) i diacyloglicerolu (DAG) (Nicoletti i wsp. 1986, Sladeczek i wsp. 1985). DAG stymuluje kinazę białkową C a IP3 wiąże się do receptorów na błonie retikulum endoplazmatycznego, powodując uwolnienie jonów wapnia (Finch i Augustine 1998, Murphy i Miller 1998, Whitham i wsp. 1991).

30 30 Agoniści tej grupy receptorów nasilają odpowiedź receptorów NMDA na glutaminian (Benquet i wsp. 2002) oraz powodują zmniejszenie gęstości receptorów AMPA (Xiao i wsp. 2001). Pozytywne modulatory mglua5 zarówno pobudzają, jak i znoszą hamowanie NMDA przez inhibitory (Chen i wsp. 2011). Antagoniści mglua5 MTEP i MPEP działają przeciwdepresyjnie w modelach depresji (Wierońska i wsp. 2002, Li i wsp. 2006) a fenobam wykazał silne, porównywalne z benzodiazepinami działanie przeciwlękowe w badaniach klinicznych (Pałucha i Pilc 2007). Receptory mglua2 należące do grupy II znajdują się głównie na błonie presynaptycznej, gdzie pełnią rolę auto- lub heteroreceptorów, natomiast mglua3 są zlokalizowane głównie postsynaptycznie (Pilc i wsp. 2008). Zarówno receptory grupy II jak i III mglur powodują zahamowanie cyklazy adenylanowej (AC), prowadząc do spadku stężenia camp i obniżenia pobudliwości neuronalnej (Conn i Pin 1997). Ligandy metabotropowych receptorów glutaminianergicznych wykazują właściwości przeciwlękowe (Niswender i Conn 2010), przeciwpsychotyczne (Nikiforuk i wsp. 2010) i neuroprotekcyjne (Sabelhaus i wsp. 2000, Yoshimizu i Chaki 2004) oraz przeciwdepresyjne (Bolozertseva i wsp. 2007, Chaki i wsp. 2004, Pałucha i Pilc 2002, Pilc 2008, Witkin i wsp. 2007). Przeciwdepresyjne działanie antagonisty grupy II MGS0039 jest powiązane z aktywnością receptora AMPA. NBQX antagonista tego receptora wpływa hamująco na skrócenie czasu bezruchu w teście zawieszenia za ogon u myszy a także na wydzielanie serotoniny w korze przedczołowej pod wpływem MGS0039 (Karasawa i wsp. 2005).

31 31 Ryc.7: Schemat budowy metabotropowego receptora glutaminianergicznego. Leki przeciwdepresyjne Leki przeciwdepresyjne są grupą leków psychotropowych, które wywierają terapeutyczny wpływ na podstawowe i wtórne cechy zespołu depresyjnego, w tym na chorobowe zaburzenia nastroju (Pużyński, 2005). Leki te różnią się między sobą pod względem budowy chemicznej, mechanizmów działania, farmakokinetyki, tolerancji i interakcji z innymi lekami.