Barwniki żółciowe Porfiryny

Transkrypt

1 ROZDZIAŁ 20 Barwniki żółciowe Porfiryny Tomasz Francuz Teresa Jurczak Bilirubina i hiperbilirubinemie Bilirubina powstaje w wyniku metabolizmu hemu, głównie uwalnianego z rozpadających się erytrocytów dziennie około mg. Zaledwie 20% bilirubiny powstaje z hemu zawartego w cytochromach, mioglobinie i enzymach zawierających hem: katalazy i peroksydazy. Powstała bilirubina jest w osoczu transportowana przez albuminy, a następnie trafia do wątroby. W wątrobie ulega sprzęganiu z glukuronidami, a następnie jest wydalana do żółci. Skoniugowana bilirubina zostaje wydzielona do żółci, a następnie w jelitach jest metabolizowana z udziałem flory bakteryjnej do urobilin. Mogą się one wchłaniać do krwi, a następnie część jest ponownie wydzielana do żółci, natomiast niewielka ilość zostaje wydzielona drogą nerkową jako urobilinogen (u dorosłych ok. 4 mg/dobę). Hiperbilirubinemia jest spowodawana: zwiększoną produkcją, zmniejszonym wychwytem wątrobowym, zmniejszonym wydzielaniem z żółcią. Zarówno zwiększona produkcja (np. na skutek hemolizy), jak i zmniejszony wychwyt przez wątrobę (uszkodzenia wątroby, zapalenia, choroby uwarunkowane genetycznie) prowadzą do wzrostu w osoczu bilirubiny niesprzężonej. Przyczyny powodujące zmniejszone wydzielanie bilirubiny i zastój żółci prowadzą do wzrostu stężenia bilirubiny sprzężonej, która następnie w 285

2 zwiększonych ilościach pojawia się w moczu. W warunkach prawidłowych bilirubina nie występuje w moczu. Do oznaczania poszczególnych typów bilirubiny służy odczyn van den Bergh a. Reakcję bezpośrednią daje bilirubina sprzężona, po dodaniu metanolu (lub innego akceleratora) możemy oznaczyć całkowitą bilirubinę. Różnica pomiędzy oznaczonymi wartościami równa jest stężeniu bilirubiny niesprzężonej. Stosując tą metodę oznaczania stężenia bilirubiny 99% zdrowych osób ma wynik bilirubiny całkowitej poniżej 1 mg/dl, z czego bilirubina bezpośrednia (skoniugowana stanowi około 30% <0,3mg/dl). Metoda ta zawyża stężenie bilirubiny skoniugowanej, gdyż część bilirubiny wolnej również daje reakcję bezpośrednią, podobną reakcję daje także bilirubina. Wykorzystując nowocześniejsze techniki oznaczania bilirubiny (m.in. HPLC) wykazano, że w surowicy praktycznie nie występuje bilirubina skoniugowana, pojawia się ona wyłącznie w chorobach wątroby i przewodów żółciowych. Przy podwyższeniu stężenia bilirubiny całkowitej w osoczu powyżej około 2,5 mg/dl pojawia się żółte zabarwienie białkówek oczu oraz skóry, co nazywamy żółtaczką. Podwyższenie stężenia bilirubny całkowitej w osoczu ponad 1 mg/dl (17,1 mol/l) nazywamy hiperbilirubinemią. Znacznej hiperbilirubinemii może towarzyszyć świąd skóry jako objaw podrażnienia nerwów przewodzących czucie bólu na skutek kumulacji kwasów żółciowych. Z wyjątkiem żółtaczki fizjologicznej noworodków, wszystkie inne żółtaczki świadczą o nadmiernej produkcji bilirubiny, uszkodzeniu wątroby lub zablokowaniu dróg wyprowadzających żółć. Najczęstsze przyczyny hiperbilirubinemii: - u dzieci: żółtaczka noworodków, wirusowe zapalenie wątroby (wirusami typu A, B, C, D lub E), anemia hemolityczna, wrodzone zaburzenia metabolizmu bilirubiny (zespół Gilberta, zespół Dubin- Johnsona), atrezja dróg żółciowych. - u dorosłych: zamknięcie przewodów żółciowych (guz, kamica pęcherzykowa lub przewodowa), wirusowe zapalenie wątroby (wirusy A-E, CMV[cytomegalii]), 286

3 cholestaza wywołana lekami, poalkoholowa marskość wątroby, guz trzustki, pierwotna marskość żółciowa, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, niedokrwistość hemolityczna, nabyte zaburzenia metabolizmu bilirubiny. Przyczyny wzrostu bilirubiny pośredniej (nieskoniugowanej): erytroblastoza płodowa, zespół Gilberta, zespół Crigler-Najjar, anemia hemolityczna, żółtaczka hemolityczna noworodków, anemia sierpowatokrwinkowa, anemia złośliwa. Przyczyny wzrostu bilirubiny bezpośredniej (skoniugowanej): zatkanie dróg żółciowych, zapalenie wątroby, zespół Dubin-Johnsona. Przy oznaczaniu bilirubiny należy pamiętać, że z oznaczeniem interferuje obecność: hemolizy krwi fałszywie zawyża wynik oznaczenia, hiperlipidemii fałszywie zaniża wynik oznaczenia, naświetlanie próbki surowicy światło rozkłada bilirubinę. Wyróżnia się 3 typy żółtaczek: hemolityczną, miąższową oraz cholestatyczną. Żółtaczka hemolityczna Ponieważ nieuszkodzona wątroba może metabolizować duże ilości bilirubiny powstałej z rozpadających się erytrocytów, temu typowi żółtaczki towarzyszy niewielkie podwyższenie stężenia bilirubiny (3-5 mg/dl). Z większymi stężeniami bilirubiny spotykamy się w przypadku towarzyszącego uszkodzenia miąższu wątroby. Hemoliza może występować na skutek: defektów enzymatycznych (np. brak dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej), defektów błony erytrocyta (sferocytoza, owalocytoza), 287

4 obecności nieprawidłowych hemoglobin (np. hemoglobina sierpowatokrwinkowa, hemoglbina C, talasemie), obecności przeciwciał przeciwerytrocytarnych, uszkadzania erytrocytów (np. sztuczne mechaniczne zastawki serca), czynniki zakaźne (zakażenie Hemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae itd.). Opłaszczone przeciwciałami lub uszkodzone erytrocyty są wychwytywane przez śledzionę i wątrobę. W przypadku powiększenia tych narządów mogą one wykazywać wzmożony wychwyt także prawidłowych krwinek. Rzadziej spotykamy się z hemolizą wewnątrznaczyniową, która po przekroczeniu możliwości wiązania hemoglobiny przez haptoglobiny prowadzi do hemoglobinurii. Hemoglobina jest wychwytywana przez komórki cewkowe w nerkach, gdzie jest przekształcana m.in. do hemosyderyny. Dlatego stwierdzenie obecności hemosyderyny w moczu świadczy o hemoglobinurii. W badaniach laboratoryjnych stwierdza się: wzrost stężenia bilirubiny pośredniej, zwiększone wydalanie urobilinogenu w moczu, podwyższenie wydalania sterkobilinogenu w kale, wzrost aktywności izoenzymu LDH 3, obniżoną oporność osmotyczną krwinek, obniżenie stężenia haptoglobulin, skrócony okres półtrwania krwinek znakowanych 51 Cr (norma dni), w przypadku przyczyn immunologicznych obecność zimnych aglutynin lub obecność erytrocytów opłaszczonych przeciwciałami (dodatni odczyn Coombs a). Żółtaczka miąższowa Jest najczęściej spotykaną żółtaczką. Główne jej przyczyny to: wirusowe zapalenie wątroby, marskość wątroby, guzy wątroby, uszkodzenie komórek wątroby spowodowane przez: o alkohol, o zartucia grzybami, o zatrucia związkami hepatotoksycznymi, np. tetrachlorek węgla. Dla tego typu żółtaczki charakterystyczne jest: 288

5 podwyższenie aktywności aminotransferaz: alaninowej oraz asparaginianowej >500 U, podwyższenie stężenia bilirubiny wolnej jak i sprzężonej, wydłużenie czasu protrombinowego. Szybkie normalizowanie się tego parametru pod wpływem witaminy K jest bardziej charakterystyczne dla żółtaczki cholestatycznej, w przewlekłych chorobach wątroby dochodzi do obniżenia stężenia albumin i wzrostu stężenia globulin w surowicy. Żółtaczka cholestatyczna Terminem cholestaza nazywamy obniżoną syntezę lub wydzielanie żółci do dwunastnicy na skutek: anatomicznego lub czynnościowego utrudnienia odpływu żółci, pierwotnego uszkodzenia komórek wątrobowych. Cholestazy możemy podzielić na: wewnątrzwątrobowe spowodowane przez patologie dróg żółciowych poniżej lewego i prawego przewodu wątrobowego, np.: o zaburzenia ukrwienia wątroby we wstrząsie, niewydolności krążenia, o atrezja przewodów żółciowych, o zaburzenia polaryzacji hepatocytów na skutek zamknięcia dróg żółciowych zewnątrzwątrobowe dotyczące dróg wyprowadzających żółć: o kamica żółciowa, o guzy zwężające drogi żółciowe, np.: guzy głowy trzustki, brodawki Vatera, powiększone węzły chłonne, guzy przerzutowe, zmiany łagodne brodawczaki i gruczolaki dróg żółciowych, o włóknienie przewodów żółciowych spowodowane chorobami autoimmunologicznymi. Cholestazie może towarzyszyć: żółtaczka, świąd skóry, powiększenie wątroby, odbarwione stolce, ciemny mocz. W badaniach biochemicznych występuje: hiperbilirubinemia związana, 289

6 przy znacznej hiperbilirubinemii występuje w surowicy bilirubina, czyli frakcja bilirubiny sprzężona kowalencyjnie z albuminą, w surowicy narasta stężenie Lp(X), kwasów żółciowych, cholesterolu, miedzi, w surowicy obserwujemy podwyższenie aktywności: o fosfatazy alkalicznej (izoenzym wątrobowy), o aminotransferazy alaninowej i asparaginianowej (AlAT i AspAT), o -glutamylotranspeptydazy (GGTP), wydłużeniu ulega czas protrombinowy. Dłużej trwająca żółtaczka cholestatyczna doprowadza do zmian w miąższu wątroby, w efekcie czego pojawiają się zmiany biochemiczne podobne do spotykanych w żółtaczce miąższowej. 290

7 Diagnostyka różnicowa żółtaczek Żółtaczka miąższowa hemolityczna cholestatyczna bilirubina całkowita bilirubina sprzężona N bilirubia niesprzężona N odczyn van den Berga dwufazowy pośredni bezpośredni urobilinogen w moczu brak sterkobilinogen i brak sterkobilina w kale (kał odbarwiony) bilirubina w moczu N (ciemny) żelazo w surowicy FA, GGTP, LAP N LDH 4 i LDH 5 N N/ (długotrwała) AlAT i AspAT N/ (długotrwała) protrombina N ( po wit. K) albuminy N N haptoglobina N N oporność osmotyczna krwinek N N LpX

8 Wrodzone zaburzenia metabolizmu bilirubiny Wrodzone hiperbilirubinemie można podzielić na: przebiegające ze wzrostem bilirubiny wolnej (nieskoniugowanej): o zespół Gilberta, o zespół Crigler-Najjar typu I, o zespół Crigler-Najjar typu II. przebiegające ze wzrostem bilirubiny sprzężonej (koniugowanej): o zespół Dubin-Johnsona, o zespół Rotora, o różne formy cholestazy wewnątrzwątrobowej (postępująca rodzinna cholestaza wewnątrzwątrobowa, nawracająca łagodna cholestaza wewnątrzwątrobowa, różne wrodzone defekty syntezy kwasów żółciowych). Zespół Gilberta Jest łagodnie przebiegającym zaburzeniem, dziedziczonym w sposób autosomalny dominujący, spowodowanym mutacją genu UDP-glukuronylotransferazy, co prowadzi do zmniejszenia aktywności tego enzymu do poziomu ok. 25% aktywności prawidłowej. Mutacja może dotyczyć samego genu lub promotora, w efekcie powstaje prawidłowe białko, ale aktywność transkrypcyjna genu jest obniżona. Stężenie bilirubiny w tym zespole zwykle wynosi 1-6 mg/dl, co odróżnia zespół Gilberta od innych zaburzeń przebiegających ze wzrostem bilirubiny wolnej. Defekt nie ma żadnych konsekwencji klinicznych, a obserwowane zażółcenie skóry szybko ustępuje po fenobarbitalu. Zespół Crigler-Najjar typu I Dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny. Charakterystyczna dla tego zespołu jest żółtaczka pojawiająca się zaraz po urodzeniu. W ciągu kilku dni do kilku tygodni część niemowlaków umiera z powodu uszkodzenia OUN. Stężenie bilirubiny typowo wynosi mg/dl i spowodowane jest całkowitym brakiem enzymu UDP-glukuronylotransferazy. Stosowanie fenobarbitalu nie prowadzi do obniżenia stężenia bilirubiny co odróżnia typ I od typu II zespołu. Stosowanie fototerapii u dzieci obniża stężenie bilirubiny do wartości poniżej 15 mg/dl, jednak jedynym skutecznym leczeniem jest transplantacja wątroby lub przeszczep komórek wątrobowych, a w przyszłości terapia genowa. 292

9 Zespół Crigler-Najjar typu II Choroba dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny lub pseudodominujący. W przeciwieństwie do typu I stężenie bilirubiny waha się w granicach 6-20 mg/dl, pod wpływem fenobarbitalu maleje o co najmniej 30%, a w żółci obecne są glukuronidy bilirubiny. Aktywność UDP-glukuronylotransferazy jest obniżona na skutek rożnych mutacji genu kodującego enzym. Zespół Dubin-Johnsona Dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny z ograniczoną penetracją. Zaburzenie dotyczy niespecyficznego kanalikowego transportera anionów organicznych (CMOAT, ang. canalicular multispecific organic anion transporter), w efekcie z komórki wątrobowej nie mogą być wydalane do żółci konigaty bilirubiny. Żółtaczka w zależności od penetracji genu może pojawić się w pierwszych tygodniach życia lub później. Chorobie towarzyszy hepatomegalia, czasami bóle brzucha oraz odkładanie barwnika podobnego do melaniny. Zaburzenie to może wpływać na wydalanie leków. Zespół Rotora Podobnie jak zespół Dubin-Johnsona dziedziczy się autosomalnie recesywnie, prowadzi do wzrostu stężenia sprzężonej bilirubiny, jednak doustna cholecystografia zwykle jest prawidłowa. Cechą odróżniającą oba zespoły jest wydalanie koproporfiryny. W homozygotycznej postaci zespołu Dubin-Johnsona prawie 90% wydala się jako koproporfiryna I, natomiast w homozygotycznej postaci zespołu Rotora koproporfiryna I stanowi 40-60% wydalanych porfiryn. Inne postacie zespołów są spowodowane różnymi mutacjami białek transportowych, m.in. ABCB (ang. ATP-binding cassette B) lub białek dostarczających energię w procesie transportu, np. ATPazy. Zaburzenia ich funkci mogą również prowadzić do zaburzenia wydalania leków są to tzw. białka oporności wielolekowej (MDR, ang. multidrug resistance protein). Porfiryny i porfirie Porfirie są chorobami związanymi z defektami biosyntezy hemu. Ujawniają się w sytuacjach zwiększonego zapotrzebowania na hem, najczęściej w wyniku działania takich czynników jak: leki i środki chemiczne, 293

10 hormony płciowe, nadużywanie alkoholu, niedożywienie, stresy i infekcje. Należy jednak pamiętać, że w około 30% przypadków nie da się zidentyfikować czynnika odpowiedzialnego za atak porfirii. Z drugiej strony u większości osób z defektami genów odpowiedzialnych za biosyntezę porfiryn nigdy nie dochodzi do wystąpienia objawów choroby. Porfirie ze względu na bogatą symptomatologię należą do chorób interdyscyplinarnych. Częstość ich występowania w populacji wynosi ok. 1:10-15 tys. Rzadkość występowania porfirii jest przyczyną pomijania tej choroby w diagnostyce różnicowej bólów brzucha, zaburzeń psychicznych oraz neuropatii. Objawy towarzyszące porfirii mogą sugerować objawy występujące w innych, znacznie częstszych jednostkach chorobowych. Głównie są one mylone z objawami tzw. ostrego brzucha (zapalenie otrzewnej, niedrożność). Porfiriom może towarzyszyć porażenie mięśni prowadzące do niewydolności oddechowej, zaburzenia sugerujące psychozy, w porfiriach skórnych także zmiany skórne. Nierozpoznanie porfirii prowadzi do stosowania leków nasilających jej objawy oraz niepotrzebnych laparotomii. W takiej sytuacji śmiertelność w ostrych napadach porfirii przekracza 10%, datego w leczeniu tych chorób najistotniejsza jest wczesna diagnoza i podjęcie odpowiedniego leczenia. Ponieważ różne typy porfirii mogą dawać podobne objawy kliniczne, diagnostyka porfirii opiera się na badaniach laboratoryjnych. W zależności od dominujących objawów klinicznych obowiązują różne schematy diagnostyczne (Tabela 20.1). 294

11 Tabela Diagnostyka laboratoryjna porfirii Symptomy sugerujące porfirię Ostre objawy neurowisceralne Nadwrażliwość na światło Testy I-linii ALA lub PBG w moczu (ilościowo w 24 godz. zbiórce lub w dowolnej chwili) Całkowite porfiryny w osoczu (metodą spektrofotometrii fluorescencyjnej) ALA, PBG i porfiryny w moczu (testem ilościowym w 24 godzinnej Porfiryny w erytrocytach Testy II-linii zbiórce) (w przypadku Porfiryny w kale (z frakcjami w ALA, PBG i porfiryny (ilościowo w nieprawidłowych przypadku ich zwiększonej ilości) 24 godzinnej zbiórce) wyników testów Porfiryny w kale (z frakcjami w I-linii) Erytrocytarna deaminaza PBG przypadku ich zwiększonej ilości) Porfiryny w osoczu Tabela Najczęściej występujące porfirie Objawy Ostra porfiria przerywana Ostre objawy neurowisceralne Porfiria skórna późna Blizny na skórze, pęcherze Protoporfiria Ból przy przełykaniu, zapalenie erytrocytarna skóry Najważniejsze testy screeningowe Porfobilinogen w moczu Porfiryny w osoczu lub moczu Porfiryny w osoczu lub erytrocytach Objawy kliniczne porfirii uzależnione są od miejsca bloku metabolicznego i w efekcie od typu gromadzących się metabolitów. Klasyfikacja porfirii oparta jest na miejscu bloku metabolicznego lub też na typie występujących objawów klinicznych. Klasyfikacja kliniczna jest przydatna, jednakże należy pamiętać, że różne porfirie mogą dawać zbliżone objawy kliniczne: ostre porfirie (ostra porfiria przerywana, porfiria z niedoborem dehydratazy ALA, wrodzona koproporfiria, porfiria mieszana) mogą dawać zwykle przejściowe objawy neurologiczne, 295

12 porfirie skórne (późna porfiria skórna, wrodzona koproporfiria, porfiria mieszana, porfiria erytropoetyczna, nabyta porfiria erytropoetyczna, porfiria wątrobowoerytropoetyczna) cechują się nadwrażliwością skóry na światło, co jest spowodowane gromadzeniem się porfiryn, które ulegają aktywacji pod wpływem światła UV, w efekcie czego powstają wolne rodniki uszkadzające skórę. Porfirie możemy też podzielić w zależności od miejsca gromadzenia się metabolitów na: porfirie wątrobowe, porfirie erytropoetyczne. Nietypowe bóle brzucha Objawy neuropatii, osłabienie Nietypowe zachowanie Podejrzenie porfirii zmiana koloru moczu PBG w moczu porfiryny w moczu fluoryscencja porfiryn w moczu Przynajmniej jeden test dodatni Wszystkie testy ujemne Porfiria wykluczona Kontakt z Instytutem Hematologii w Warszawie. Wykonanie badań ilościowych, enzymatycznych lub molekularnych. Rysunek Algorytm rozpoznawania porfirii. Testy laboratoryjne Testy laboratoryjne służące do diagnostyki porfirii wypadają nieprawidłowo w znakomitej większości ostrych ataków. W okresie bezobjawowym możemy nie wykazać obecności jakichkolwiek nieprawidłowości w testach laboratoryjnych. Screeningowo w ostrych porfiriach wykonuje się oznaczenia ALA i PBG w moczu. W przypadku porfirii dających objawy skórne oznacza się stężenie porfiryn w osoczu. W przypadku, kiedy powyższe testy I linii wypadną nieprawidłowo wykonuje się oznaczenia aktywności enzymów w erytrocytach 296

13 oraz pomiary stężenia porfiryn w moczu, kale i erytrocytach. Ważne jest, aby wykluczyć inne możliwe przyczyny podwyższenia stężenia porfiryn, ponieważ testy laboratoryjne nie są specyficzne wyłącznie dla tych chorób. Potencjalnie duże znaczenie w diagnostyce porfirii w przyszłości mogą mieć testy genetyczne. Obecnie są one kosztowne i rzadko stosowane. Potencjalna ilość mutacji prowadzących do defektu enzymatycznego i w efekcie objawów porfirii jest duża, co wymaga sekwencjonowania odpowiednich genów. Najczęściej spotykane porfirie to: ostra porfiria przerywana (AIP ang. acute intermittent porphyria), późna porfiria skórna (PCT ang. porphyria cutanea tarda) oraz protoporfiria erytropoetyczna (EP ang. erythropoetic protoporphyria). Ostra porfiria przerywana Dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący, defekt dotyczy deaminazy PBG. Jest najczęściej występującym typem porfirii (ok. 1:25000). Zmniejszoną aktywność enzymu (<50%) wykrywa się we wszystkich tkankach. Jednakże u większości nosicieli tego defektu nigdy nie występują objawy porfirii. Do czynników wywołujących AIP należą: hormony (progesteron, inne hormony steroidowe), dieta, niektóre leki (barbiturany, chemioterapeutyki sulfonamidowe), infekcje, operacje. Zazwyczaj do ataku dochodzi w wyniku zadziałania kilku czynników. Objawy są związane głównie z układem nerwowym. Częstym objawem jest ból brzucha, nudności, wymioty, zaparcia i biegunki. Objawy te są związane z porażeniem nerwów brzusznych. Zwraca uwagę duża rozbieżność pomiędzy ciężkością objawów klinicznych i niewielkimi odchyleniami w badaniu fizykalnym. Objawom nie towarzyszy gorączka, leukocytoza i inne cechy zapalenia, co pozwala odróżnić atak AIP od ostrego brzucha. Pojawiające się objawy są związane z defektem wydzielania acetylocholiny z zakończeń synaptycznych. W czasie ataku stwierdza się znacznie podwyższone stężenie ALA i PBG w moczu i osoczu. Stwierdzenie prawidłowych stężeń ALA i PBG wyklucza rozpoznanie ostrej porfirii. PBG w moczu ulega nieenzymatycznemu przekształceniu do uroporfiryny, co nadaje mu po pewnym czasie (szczególnie jeśli jest wystawiony na działanie światła) kolor czerwony lub brązowy. ALA może w innych tkankach ulegać również przekształceniu do porfiryn. Pomocne przy rozpoznaniu AIP może być oznaczanie aktywności deaminazy PBG w erytrocytach. Test ten nie może być stosowany jako test I linii, gdyż: aktywność tego enzymu może być podobna u ludzi z AIP i zdrowych, 297

14 aktywność zmienia się wraz ze starzeniem się erytrocyta (fałszywie dodatnie wyniki np. w przypadku krwotoków i zwiększonej erytropoezy), część mutacji znajdujących się na początku genu nie wpływa na aktywność deaminazy w erytrocytach lecz ujawnia się w innych tkankach, np. w wątrobie, aktywność tego enzymu jest zwykle prawidłowa w innych typach porfirii, co zmniejsza przydatnośćtego testu w diagnostyce, niska aktywność nie wyklucza innych niż porfiria przyczyn występujących objawów. Oznaczanie aktywności deaminazy PBG wraz z PBG w moczu jest przydatne do wykrywania AIP u krewnych chorego. W tym typie porfirii coraz większe znaczenie odgrywają testy oparte na analizie DNA. Późna porfiria skórna Jest wynikiem niedoboru dekarboksylazy uroporfirynogenu, jakkolwiek u większości pacjentów nie udaje się wykryć mutacji. Porfiria ta często występuje u osób, które przebyły infekcję wirusem WZW typu C. Zwykle obniżenie aktywności dotyczy wyłącznie dekarboksylazy w wątrobie. Do objawów w tym typie porfirii należy nadwrażliwość na światło oraz powstawanie pęcherzy, a następnie blizn na skórze, szczególnie w miejscach odsłoniętych. Gromadzące się porfirynogeny ulegają oksydacji do odpowiednich porfiryn. Za indukcję tego typu porfirii odpowiadają: żelazo, alkohol, wirus WZW typu C, estrogeny, palenie. Czynniki te inaktywują dekarboksylazę uroporfirynogenu w wątrobie. Duże ilości porfiryn kumulują się wątrobie, a następnie są transportowane z krwią do skóry, gdzie wytwołują objawy chorobowe. Diagnostyka opiera się na stwierdzeniu podwyższonego stężenia porfiryn w osoczu oraz w moczu. Główną porfiryną wydalaną z moczem jest uroporfiryna, w kale charakterystyczne dla PCT jest zwiększenie stosunku izokoproporfiryny do koproporfiryny. Przydatne dla rozpoznania PCT może być także stwierdzenie obniżonej aktywności dekarboksylazy uroporfirynogenu w erytrocytach. Protoporfiria erytropoetyczna Jest ona związana z defektem mitochondrialnego enzymu ferrochelatazy. Dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący. Głównym objawem jest nadwrażliwość na światło słoneczne, co jest spowodowane dużymi stężeniami w osoczu protoporfiryn powstających w wątrobie oraz erytrocytach. Gromadzące się w wątrobie protoporfiryny są przyczyną uszkodzenia tego narządu, co prowadzi do marskości oraz hepatosplenomegalii. Połowa 298

15 pacjentów z tym typem porfirii ma niewielkiego stopnia niedokrwistość niedobarwliwą (mikrocytarną). Diagnostyka opiera się oznaczeniu protoporfiryn w erytrocytach, ponadto erytrocyty wykazują fluorescencję przy naświetlaniu promieniowaniem o długościach fal w paśmie Soreta. Przydatny też jest dokładny wywiad rodzinny w kierunku występowania objawów porfirii. W leczeniu stosuje się duże dawki β-karotenu ( mg/d) co chroni skórę przed szkodliwym działaniem promieni słonecznych. 299

16 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 OZNACZANIE STĘŻENIA BILIRUBINY CAŁKOWITEJ W SUROWICY ZASADA METODY Kwas sulfanilowy reaguje z azotynem sodu tworząc dwuazowy kwas sulfanilowy. W obecności dwumetylosulfotlenku bilirubina całkowita reaguje z dwuazowym kwasem sulfanilowym tworząc rozpuszczalną w wodzie azobilirubinę, która w środowisku kwaśnym ma różowe zabarwienie. W reakcji tej możliwe jest rozróżnienie bilirubiny bezpośredniej, reagującej bez udziału akceleratora (dwumetylosulfotlenek) i bilirubiny pośredniej, która reaguje w jego obecności. Suma obu form powstających w obecności akceleratora, nazywana jest bilirubiną całkowitą. Intensywność zabarwienia powstającej azobilirubiny jest wprost proporcjonalna do stężenia odpowiedniej formy bilirubiny w surowicy. MATERIAŁ BADANY Surowica ODCZYNNIKI Odczynnik R1 (kwas sulfanilowy, dwumetylosulfotlenek, kwas solny) Odczynnik R2 (azotyn sodu) Kalibrator - odpowiadający stężeniu bilirubiny 5 mg/dl WYKONANIE Odmierzyć do probówek poniższe objętości roztworów: Składnik próby Próba ślepa Próba [ml] kalibratora kalibracyjna Próba ślepa Próba badana Odczynnik R1 1,5 1,5 1,5 1,5 Odczynnik R2-0,05-0,05 Kalibrator 0,1 0,1 - - Surowica - - 0,1 0,1 300

17 Wymieszać, inkubować 5 minut w temperaturze 37 C, a następnie 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zmierzyć absorbancje przy długości fali 555 nm względem wody. Zabarwienie jest stabilne do godziny. OBLICZENIA ĆWICZENIE 2 OZNACZANIE KWASU δ-aminolewulinowego W MOCZU ZASADA METODY Kwas δ-aminolewulinowy (ALA) jest prekursorem porfiryn. Powstaje on z sukcynylo CoA i glicyny. Reakcja ta katalizowana jest przez syntetazę δ-aminolewulinową. ALA w obecności acetyloacetonu w temperaturze około 100 C kondensuje do porfobilinogenu, który w reakcji z odczynnikiem Ehrlicha daje produkt o barwie różowej proporcjonalnie do ilości porfobilinogenu, a pośrednio do ilości ALA. MATERIAŁ BADANY Mocz z DZM ODCZYNNIKI Acetyloaceton Bufor octanowy ph 4,6 Odczynnik Ehrlicha Wzorzec macierzysty ALA 1 mg/ml WYKONANIE Próba badana: Do probówki dodać 4,4 ml buforu octanowego. Jednocześnie przygotować próbę ślepą z 0,5 ml badanego moczu oraz 4,5 ml buforu octanowego. Obie probówki ogrzewać bez korka 10 minut we wrzącej łaźni wodnej, po czym ostudzić pod bieżącą wodą. 1 ml płynu z próby badanej przenieść do nowej probówki i zmieszać z 1 ml odczynnika Ehrlicha. Podobnie postąpić z próbą ślepą. Dokładnie po 15 minutach odczytać absorbancję próby badanej wobec próby ślepej przy długości fali 553 nm. 301

18 Wykonanie wykresu kalibracyjnego: Z roztworu wzorca macierzystego (ALA) przygotować szereg rozcieńczeń: Wzorzec Numer Woda Stężenie ALA macierzysty ALA próbki destylowana (ml) mg/dl (ml) 1 0,05 9,95 0,5 2 0,1 9,9 1,0 3 0,2 9,8 2,0 4 0,3 9,7 3,0 5 0,4 9,6 4,0 6 0,5 9,5 5,0 Z każdego rozcieńczenia odmierzyć 0,5 ml, dodać po 0,1 ml acetyloacetonu zatkać korkiem i mieszać zawartość silnie wytrząsając. Do probówki dodać 4,4 ml buforu octanowego. Ogrzewać 10 minut w łaźni wodnej wrzącej i dalej postępować jak z próbą badaną. Pomiar wykonać wobec próby ślepej przy długości fali 553 nm. OBLICZENIA Z wykresu kalibracyjnego odczytać stężenie ALA w mg/dl moczu i znając dobową zbiórkę moczu przeliczyć wydalanie ALA na dobę. 302