Kraków, dnia r. Prof. dr hab. Jadwiga Szostak-Kot, prof. zw. UEK Katedra Mikrobiologii Uniwersytet Ekonomiczny w Krakowie

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Jadwiga Szostak-Kot, prof. zw. UEK Katedra Mikrobiologii Uniwersytet Ekonomiczny w Krakowie Kraków, dnia r. RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr inż. Doroty Rodewald pt. Ocena trwałości mikrobiologicznej preparatów kosmetycznych w opakowaniach polimerowych modyfikowanych nanosrebrem napisanej pod kierunkiem prof. dr hab. Zenona Foltynowicza Recenzowana rozprawa obejmuje 140 stron w tym 22 tabele, 42 rysunki, a bibliografia zawiera 200 pozycji krajowych i zagranicznych. Praca składa się z dwóch części: teoretycznej (6 rozdziałów, 68 stron) i eksperymentalnej (3 rozdziały, 49 stron). Rozwój mikroorganizmów w produkcie prowadzi do obniżenia jego jakości, często zepsucia, a nawet może być przyczyną stanów chorobowych. Dotyczy to licznych towarów, w tym także kosmetyków, z których wiele jest bardzo podatnych na rozwój drobnoustrojów ze względu na swój skład chemiczny i dogodne właściwości fizyczne. Szczególnie narażone na zakażenie mikrobiologiczne są kremy, balsamy, odżywki, w mniejszym stopniu mydła, szampony, pudry, czy kosmetyki kolorowe. Należy tu wspomnieć, że kosmetyki tzw. naturalne, obecnie bardzo popularne, są łatwiej atakowane przez mikroflorę niż syntetyczne, gdyż stanowią dla niej dobrą pożywką. Oczywiście należy pamiętać, że rozwój mikroorganizmów zależy nie tylko od składników odżywczych, ale i od warunków zewnętrznych, które zwłaszcza w przypadku już używanych kosmetyków wydają się dobre, a czasem nawet optymalne. Kosmetyki, w szczególności wielokrotnego użytku, przechowywane są najczęściej w łazience, gdzie wilgotność i temperatura sprzyjają wzrostowi szerokiej gamy drobnoustrojów. Aby zachować wymaganą czystość mikrobiologiczną produktów, decydującą o ich bezpieczeństwie, najczęściej wprowadza się do nich chemiczne środki konserwujące o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych, które powinny zabezpieczyć przed pierwotnym, a także wtórnym zakażeniem, mającym często miejsce podczas użytkowania. Związki takie muszą odpowiadać określonym wymaganiom z punktu widzenia bezpieczeństwa użytkownika oraz zachowania odpowiedniej jakości produktu. Wymienia się, m.in. takie cechy jak: szybkie działanie w małych stężeniach na szerokie spektrum drobnoustrojów zarówno bakterii jak i grzybów, brak działania toksycznego, alergizującego i drażniącego oraz 1

2 aktywność i trwałość w środowiskach o różnej kwasowości i temperaturze. Wszystkie wymienione tu cechy są ważne również dla związków wprowadzanych do kosmetyków. Autorka pracy podeszła do zagadnienia w nieco odmienny sposób. Kosmetyk, którym był szampon, próbowała zabezpieczyć przez zastosowanie opakowania polimerowego z wprowadzonym nanosrebrem jako środkiem konserwującym. Oligodynamiczne działanie srebra znane jest od wieków, a obecnie stosowane jest ono często właśnie w postaci nanocząstek, jako bardziej reaktywnych, których skuteczność zależy od zawartości, wymiaru i dyspersji. Celem pracy było zbadanie możliwości zastosowania nowego rozwiązania układu kosmetyk-opakowanie, zapewniającego trwałość produktu bez konieczności stosowania konserwantów w wybranym preparacie kosmetycznym. Sformułowana została hipoteza główna oraz trzy hipotezy szczegółowe. Hipoteza główna: możliwe jest, w określonych warunkach, zastąpienie konserwantów dodawanych do wybranych kosmetyków nanosrebrem zawartym w ich opakowaniu z tworzyw sztucznych. Hipotezy szczegółowe: nanosrebro zawarte w wybranym opakowaniu polimerowym zapewnia utrzymanie trwałości mikrobiologicznej wybranego, przechowywanego w nim produktu kosmetycznego, z którego składu wyeliminowano środki konserwujące; nanocząstki srebra, w założonych warunkach badania, nie migrują z opakowania polimerowego do przechowywanego w nim produktu kosmetycznego; oddziaływanie przeciwdrobnoustrojowe nanocząstek srebra zawartych w opakowaniu polimerowym zależne jest w większym stopniu od rozmiaru cząstek aniżeli od ich stężenia. Hipotezy i cel zawarte zostały w części empirycznej pracy, a nie jak się spodziewałam we Wstępie, mimo, że właśnie we Wstępie Autorka wskazała na zakres niezbędnych badań koniecznych do zweryfikowania postawionych hipotez, których czytelnik jeszcze nie poznał. Zakres badań obejmował: ocenę trwałości mikrobiologicznej wybranych preparatów kosmetycznych przechowywanych w opakowaniach z nanosrebrem tzw. testy konserwacji i oznaczenie działania przeciwdrobnoustrojowego opakowań z nanosrebrem oraz poszczególnych składników mieszaniny kosmetycznej (weryfikacja hipotezy 1); oznaczenie poziomu migracji nanosrebra z opakowania do zapakowanego produktu (weryfikacja hipotezy 2); 2

3 charakterystykę fizykochemiczną użytych do badań pojemników PP i folii PE pod kątem zawartości nanosrebra i wielkości jego cząstek (weryfikacja hipotezy 3). Badaniom poddano cztery rodzaje pojemników PP zawierających nanosrebro oraz, jako próbę porównawczą, jeden pojemnik bez nanosrebra, a ponadto 8 rodzajów folii PE pięć z cząstkami srebra i trzy bez srebra. Kosmetykiem badanym był szampon do włosów przygotowany w warunkach laboratoryjnych. Na mikroorganizmy testowe wybrano bakterie: Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa oraz drożdże Candida albicans. W badaniach wykorzystano metody klasyczne i nowoczesne. Ocenę trwałości mikrobiologicznej szamponu przeprowadzono w pojemnikach PP z nanosrebrem i dla kontroli bez nanosrebra (p ). Testy konserwacji wykonano wg zaleceń Farmakopei 6. Miały one ocenić, czy srebro zawarte w pojemnikach wpływało na redukcję testowanych drobnoustrojów. Wyniki pokazały, że redukcję bakterii i drożdży, w stopniu wystarczającym (wg kryterium A), zaobserwowano w pojemnikach 1 i 2. Jest zastanawiająca redukcja Staphylococcus aureus już od 7-28 dnia aż o 7 logarytmów we wszystkich pojemnikach również w kontroli bez konserwantów. Może to świadczyć, iż sam szampon (a nie Ag) mógł wpływać na redukcję, na co wskazywałyby wyniki oceny właściwości przeciwdrobnoustrojowych składników szamponu (p tab. 18 i 19). Pokazują one, że sulforokanol i w mniejszym stopniu rokamid hamowały wzrost testowanych drobnoustrojów. Autorka wspomina o tym na str. 103, ale jej tłumaczenie tego faktu wydaje się mało przekonujące. Są rozbieżności dotyczące wymogów kryterium A dla grzybów w tekście (str. 92) i tabeli 15. W tekście napisano, że redukcja musi wynosić 3 logarytmy w tabeli, że 2. Zgodne z Farmakopeą 6 są to 2 logarytmy. Nawiasem mówiąc pod tabelą 15 jest chyba pomyłka, dotycząca źródła, gdyż jest ona, podobnie jak tekst z [Kurpiel 2008]. Należałoby również dodać, przy okazji omawiania wyników, że konserwanty obecne w kontroli redukowały wzrost w stopniu wystarczającym. Wyniki przedstawione w tabeli 16 miały zostać zobrazowane wykresami na rys , ale ponieważ krzywe pokrywają się są one mało czytelne. Dotyczy to również rys Ponadto na linii rzędnych znajduje się liczba bakterii wyrażona w log, a nie logarytm redukcji. Wykres pokazuje redukcję liczby drobnoustrojów w czasie, przedstawioną w skali logarytmicznej. W związku z tymi zastrzeżeniami sugeruję zrezygnowanie z wykresów w dalszych opracowaniach. Kolejny rozdział części doświadczalnej poświęcony jest ocenie właściwości przeciwdrobnoustrojowych składników szamponu. Zastosowano w tym celu dwie metody dyfuzji krążkowej i studzienkowej. W pracy zostało powiedziane, że zastosowanie obu 3

4 metod jednocześnie pozwala na otrzymanie miarodajnych wyników. Widać, że uzyskane wyniki różnią się w zależności od zastosowanej metody. Myślę, że wystarczyłaby jedna z metod chyba, że chodziłoby o wskazanie, która z nich jest korzystniejsza i dlaczego. W p zamieszczona została tabela 18 i rys. 30, pokazujące wyniki badań, ale brak jest jakiegokolwiek komentarza na ten temat, podobnie jest w p Wydaje się, że tytuł nie oddaje dokładnie treści, gdyż nie jest to klasyczne porównanie metod, lecz omówienie przedstawionych graficznie wyników uzyskanych obiema metodami. Ocena skuteczności przeciwdrobnoustrojowej folii PE znajduje się w p Wyniki stref zahamowania nie są podane natomiast Doktorantka pisze, że widoczny jest zahamowany wzrost drobnoustrojów w miejscach kontaktu z folią rys. 36. Na tym rysunku jednakże nie widać tego, gdyż brak w ogóle strefy zahamowania, a nie dodatkowej strefy. W tego typu badaniach ocenia się wielkość strefy (jak w p ), a nie miejsce kontaktu, gdyż pojemnik czy folia z substancją antydrobnoustrojową, np. srebrem, ma hamować wzrost nie tylko na styku. Dlatego powinien być sprawdzany również wzrost pod próbką (na odwrocie płytki), gdyż taka obserwacja pokazałaby czy na styku większej powierzchni (1cm 2 ) występuje hamowanie. Ponadto jeśli antybakteryjne składniki nie dyfundują do podłoża tylko są związane (jak pisze Autorka) to metoda badawcza nie była właściwie dobrana, gdyż jest to metoda dyfuzyjna. Sądzę zatem, że stwierdzenie, iż badane folie wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe jest mało uprawnione. Pokazują to wyniki, w stosunku do bakterii, zawarte w p Testy konserwacji pokazały, że folie PE, zawierające srebro, generalnie nie wykazywały zdolności redukcji liczby bakterii w zakażonym szamponie. Po 6 tygodniach przechowywania liczba bakterii Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa była wyższa od początkowej. Redukcję obserwowano w przypadku folii LLDPE bez srebra, ale zawierającą konserwanty, a także folii FŻ i FS obie nie zawierające Ag. W przypadku Staphylococcus aureus również dla folii AgTiO 2. Brak redukcji Doktorantka tłumaczy zbyt dużą początkową liczbą komórek, ale sądzę, że główna przyczyna tkwi w fizjologii i biochemicznych właściwościach bakterii. Szczególnie pałeczka Pseudomonas aeruginosa dlatego właśnie jest typowana do testów sprawdzających wpływ czynników hamujących na bakterie gdyż jest trudna do zwalczenia. Uodparnia się łatwo na pewne związki chemiczne w tym również leki i określana jest jako wielolekooporna, co stanowi problem terapeutyczny. Może zatem ta ilość srebra jest niewystarczająca do zahamowania jej wzrostu, albo na ten szczep nie działa. Natomiast drożdże były redukowane do zera w większości przypadków. Przy takiej redukcji należałoby postawić pytanie czy sam produkt nie miał na to wpływu. 4

5 Reasumując, uzyskane wyniki pozytywnie weryfikują hipotezę 2. Weryfikacja hipotezy 3 wykazała, że pojemniki PP1 i PP2, zawierające mniejszą ilość Ag i mające mniejsze cząstki o dobrym rozproszeniu, wykazały w testach konserwacji lepsze właściwości niż PP3 o większej zawartości srebra i cząstkach tworzących aglomeraty. Szkoda, że nie zostało to powiedziane przy omawianiu wyników w stosownych miejscach w p. 3.2., tylko omówione zostało oddzielnie w Podsumowaniu, a zgodnie z hp.3 miało świadczyć o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, omawianym we wspomnianym podrozdziale. Natomiast pozytywna weryfikacja 1 hipotezy szczegółowej, w moim odczuciu, jest dyskusyjna. Nie można powiedzieć, że srebro zawarte w foliach PE zapewniało utrzymanie trwałości mikrobiologicznej szamponu. (p i ), co najwyżej można uznać że pozytywnie zostały zweryfikowane właściwości przeciwdrobnoustrojowe pojemników PP1 i PP2, chociaż i to wymagałoby dodatkowych badań, czy np. sam szampon nie ma inhibującego wpływu, o czym wspominałam wcześniej. Szampon nie jest korzystnym środowiskiem dla rozwoju bakterii, a pewne jego składniki mogą mieć działanie przeciwbakteryjne. Sądzę, że kierunek badań jest przyszłościowy i należy go kontynuować. Pozytywne odpowiedzi na 2 i 3 hipotezę wnoszą cenne informacje zaś bardziej dogłębnych studiów wymaga hipoteza 1. Wyniki uzyskane w eksperymencie nie zawsze pozytywnie weryfikują postawione na początku pracy hipotezy. Natomiast należy z uzyskanych danych wyciągnąć wnioski na przyszłość. Badania mikrobiologiczne są żmudne, wymagające precyzji i trudne metodologicznie oraz interpretacyjnie, gdyż mamy do czynienia z organizmami żywymi na dodatek dosyć zmiennymi. Do badań higieny czy konserwacji typowane są mikroorganizmy różne morfologicznie i fizjologicznie tzn. bakterie (G + i G -), a także drożdże i grzyby strzępkowe. Na dodatek dobierane są szczepy zachowujące się opornie względem hamujących czy bójczych substancji, które muszą być stosowane w małych stężeniach. Dlatego uzyskane w niniejszej pracy wyniki dotyczące hipotezy 1 również wnoszą ważne informacje. Na pewno będą one pomocne w dalszych studiach nad tymi zagadnieniami. Nie ominiemy bowiem problemu konserwacji produktów gdyż mikroorganizmy żyjące w każdym środowisku zagrażają bezpieczeństwu zdrowotnemu. Zabezpieczenia należy jednak stosować z umiarem i pełną odpowiedzialnością, a do tego konieczne są gruntowne studia. Oprócz uwag poczynionych wcześniej mam jeszcze kilka pytań i sugestii. Dlaczego zastosowała Pani stężenie inokulum 1.5 w skali McFarlanda, co odpowiada ok. 4.5x10 8. W większości tego typu badań zalecane jest 0.5 McFarlanda tj. 1.5x10 8, a dla drożdży (Candida albicans), ze względu na ich duże rozmiary wartości te 5

6 należy podzielić przez 30. Czy jest zatem zgodność między gęstością inokulum w (10 8, nie wiadomo ile x 10 8, zakładam, że 1? ), a gęstością w ). Sądzę, że w dalszych studiach poszerzy Pani zakres testowanych mikroorganizmów o przedstawiciela grzybów strzępkowych, np. zalecanego Aspergillus niger, o którym wspomniano na str. 89, gdyż właśnie one często infekują produkty, w tym kosmetyki. Na str. 19 i 20 tab. 2. jest określenie przeciwgrzybiczne. Powszechnie stosuje się termin przeciwgrzybicze. Na str. 23 pisze Pani o zastosowaniu bakteriocydów jako konserwantów stosowanych najczęściej do żywności, a to jest grupa środków chemicznych stosowanych w ochronie roślin przed bakteriami. Sądzę, że jest to pomyłka, ale należy ją poprawić. Na str. 28 znalazła się omyłkowa informacja, gdyż Escherichia coli jest gramujemna, a Staphylococcus aureus gramdodatni, a w tekście jest odwrotnie. Za dyskusyjny uważam podział kosmetyków z nanosrebrem ze względu na bezpośrednie oddziaływanie na wodę, glebę i powietrze (str. 52). Kremy oddziałują bezpośrednio na glebę, a na wodę nie?, przecież je częściowo zmywamy. Podobnie wody toaletowe czy po goleniu one też są zmywane, zaś kosmetyki w sprayu dostają się do powietrza, ale i drogą sedymentacji do gleby i wody. Brak średnicy płytek Petriego, co jest istotne przy badaniach ilościowych; nawiasem mówiąc do rozważenia czy punkt 1.1. części doświadczalnej ze str. 73, (gdyż są dwa 1.1.) jest potrzebny; zarówno aparatura jak i sprzęt pomocniczy wynikają z zastosowanych metod. Na Cl 0.85%, a nie 8.5% (str. 75). Tabela 13 odwołuje się do tabel 8 i 9. W związku z tym pytanie: czy nie badano próbki 4 PP (tab. 8) i próbki 6 PE (tab. 9) na zawartość srebra, gdyż nie ma ich w tab. 13? Pozwolę sobie także na kilka uwag dotyczących redakcyjnej strony pracy. Podwójna numeracja rozdziałów (są dwa rozdziały nr 1, 2 i 3) utrudnia czytanie, zwłaszcza gdy Autorka odwołuje się do określonego punktu, np. na str. 104 jest odwołanie się do p (w którym z dwu rozdziałów 1?). Wnioski zwykle umieszcza się po Wynikach, z których wypływają, a Podsumowanie podsumowuje całą pracę i powinno być zamieszczone na końcu. Uwagi dotyczące Bibliografii: - w kilku przypadkach jest niejasność cytowanych w tekście pozycji bibliograficznych, np. Foltynowicz 2006 w bibliografii; są dwie pozycje (nie oznaczone a b) i przy cytowaniu 6

7 w tekście nie wiadomo o którą pozycję chodzi (str. 40, 58). Podobnie poz. Rodewald, Foltynowicz 2011 (str. 13, 15, 56, 58, 60) brak wskazania, o którą pozycję chodzi a, b, czy c; - brak w spisie pewnych cytowanych w tekście pozycji, np. Gocki, Bartuzi 2008 (str. 17), Golimowski, Urban 2009 (str. 32), Farmakopea Europejska (str. 74, 89), PN-EN ISO 11930:2012 (str. 90); - dlaczego nazwiska rozpoczynające się na Ch znajdują się w spisie po H, a nie pod C? Rys nie są objaśnione, bo co znaczy obraz. Autor chce coś pokazać i musi wskazać w tytule co, jak to zostało objaśnione na rys. 41 i 42. Rys. 31 i 36 mało czytelne, a 37 w ogóle nieczytelny. Uważam, że rys , 30, 31, 36, 37, 41, 42 należałoby oznaczyć jako fotografie, co jest zgodne z prawdą. W spisie treści brak p , , (rozdziały części doświadczalnej). Rys. 1 i 2 mają podwójny opis tytuł u góry i u dołu. Na zakończenie chciałabym podkreślić trafność wyboru tematyki, którą należy uznać za interesującą z punktu widzenia towaroznawstwa jako nauki o jakości procesów i produktów, a także jej aktualność. W części teoretycznej, powiązanej tematycznie z częścią doświadczalną, Doktorantka nakreśliła, na podstawie obszernej literatury, zagadnienie. Całość opracowania teoretycznego świadczy o dobrej znajomości problematyki. W części doświadczalnej przeprowadziła stosowne badania, prowadzące do uzyskania wyników i wyciągnięcia wniosków. Niezależnie od uwag pragnę stwierdzić, że Autorka, w sposób odpowiadający wymogom rozprawy doktorskiej, wywiązała się z postawionego w celu pracy zadania. Stwierdzam zatem, że przedłożona mi do recenzji rozprawa mgr inż. Doroty Rodewald spełnia, pod względem merytorycznym i formalnym, wymagania ustawowe stawiane pracom doktorskim i wnoszę o jej przyjęcie i dopuszczenie do publicznej obrony. Jadwiga Szostak - Kot 7