Directigen EZ RSV Do bezpoœredniego wykrywania wirusa RSV (Respiratory Syncytial Virus; syncytialny wirus oddechowy)

Transkrypt

1 Directigen EZ RSV Do bezpoœredniego wykrywania wirusa RSV (Respiratory Syncytial Virus; syncytialny wirus oddechowy) L009004JAA 2008/12 PRZEZNACZENIE Polski Test Directigen EZ RSV jest to szybkie chromatograficzne badanie immunologiczne do bezpoœredniego jakoœciowego wykrywania antygenu wirusa RSV (Respiratory Syncytial Virus) w pop³uczynach, aspiratach i wymazach z nosogard³a oraz w treœci pobranej metod¹ wymazu/p³ukania z nosogard³a od pacjentów z podejrzeniem wirusowego zaka enia dróg oddechowych. Ten test przeznaczony jest do diagnostyki in vitro jako pomoc w rozpoznawaniu zaka eñ wywo³anych przez wirus RSV u noworodków, dzieci i osób do 20 r.. Zaleca siê, aby ujemne wyniki testu potwierdzane by³y za pomoc¹ hodowli komórkowej. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE Wirusowe zaka enia dróg oddechowych s¹ szeroko rozpowszechnionymi chorobami. Wirus RSV jest wiod¹c¹ przyczyn¹ zaka eñ dolnych dróg oddechowych u ma³ych dzieci w sezonie zimowym. 1 Wirus RSV mo e równie wywo³ywaæ ciê kie zaka enia dróg oddechowych u osób w podesz³ym wieku oraz z upoœledzonym systemem odpornoœci. 2,3 Stwierdzono niedawno, e wirus RSV zosta³ zidentyfikowany jako przyczyna 20% zaka eñ grypopodobnych u osób w wieku lat. 4 Tradycyjne metody wykrywania wirusa RSV obejmowa³y hodowlê komórkow¹ oraz stosowanie bezpoœrednich przeciwcia³ fluorescencyjnych (direct fluorescent antibody, DFA). 5 7 Ostatnio wykazano kliniczn¹ u ytecznoœæ PCR (reakcja ³añcuchowej polimerazy) do wykrywania wirusów, w tym miêdzy innymi wirusa RSV. 8 Dla niektórych wirusów, takich jak wirusy grypy A/B oraz wirus RSV, dostêpny jest test immunoenzymatyczny (enzyme immunoassay, EIA) oraz szybkie systemy rêczne. Szybkie testy pozwalaj¹ na b³yskawiczne postawienie rozpoznania tak, aby mo na odpowiednio izolowaæ i leczyæ pacjentów i tym samym zapobiegaæ rozszerzaniu siê zaka eñ szpitalnych na innych pacjentów z upoœledzon¹ czynnoœci¹ uk³adu kr¹ enia, uk³adu oddechowego lub obni on¹ odpornoœci¹. 9 Ponadto szybkie testy pomagaj¹ w wyborze odpowiedniego leczenia przeciwwirusowego. Najczêstszymi próbkami pobieranymi w celu przeprowadzenia diagnostyki w kierunku RSV s¹ pop³uczyny, aspiraty lub wymazy z nosogard³a. Pop³uczyny oraz aspiraty z nosogard³a wykazuj¹ przewagê nad wymazami i traktowane s¹ jako próbki pierwszego wyboru. 10 Test do wykrywania antygenu RSV Directigen EZ jest to test chromatograficzny maj¹cy na celu wykrywanie antygenów RSV w ró nych próbkach pobranych od objawowych pacjentów. Szybkoœæ oraz sposób przeprowadzenia testu Directigen EZ RSV sprawia, e znajduje on zastosowanie jako test natychmiastowy do wykrywania antygenu RSV, dostarczaj¹c szybkiej, odpowiedniej informacji, która pomaga przy w³¹czaniu leczenia przeciwwirusowego oraz przy podejmowaniu innych decyzji klinicznych i wspomagaj¹cych. ZASADA PROCEDURY Directigen EZ RSV jest to test chromatograficzny s³u ¹cy do jakoœciowego wykrywania antygenu RSV w próbkach uzyskanych z treœci pobranej z dróg oddechowych. Po wprowadzeniu uzyskanych próbek do urz¹dzenia testowego antygeny A i/lub B wirusa RSV wi¹ ¹ siê do koniugatów z³o onych z przeciwcia³ oraz koloidalnego z³ota na pasku testowym, tworz¹c kompleks antygen przeciwcia³o. Kompleks ten migruje przez pasek testowy do obszaru reakcji i wychwytywany jest przez pas przeciwcia³ skierowanych przeciwko wirusowi RSV, znajduj¹cy siê na b³onie. Nadmiar koniugatu wi¹ e siê do drugiej linii, zawieraj¹cej inaktywowany antygen RSV, który s³u y jako kontrola funkcjonalna. Wynik dodatni wskazuje pojawienie siê dwóch czerwono purpurowych linii w okienku odczytu, jednej na wysokoœci oznakowania testu T, a drugiej na wysokoœci kontroli C. Brak czerwono purpurowej linii na wysokoœci T i obecnoœæ czerwono purpurowej linii na wysokoœci C wskazuje na wynik ujemny. Test nie mo e zostaæ zinterpretowany, je eli na wysokoœci C nie pojawia siê widoczna czerwono purpurowa linia.

2 ODCZYNNIKI W sk³ad zestawu Directigen EZ RSV wchodz¹ nastêpuj¹ce elementy: Urz¹dzenia 30 Ka de urz¹dzenie ma na b³onie liniê kontroln¹ BD RSV zawieraj¹c¹ inaktywowany antygen RSV oraz liniê testow¹ zawieraj¹c¹ przeciwcia³a monoklonalne przeciwko wirusowi RSV. Odczynnik do 4,0 ml Odczynnik do ekstrakcji, czynnik mukolityczny oraz ekstrakcji E detergent, zawieraj¹cy azydek sodu 0,2% (œrodek konserwuj¹cy). Kontrola + 2,0 ml Kontrola dodatnia, komórki zaka one RSV i traktowane detergentem, zawieraj¹ce 0,1% azydku sodu (œrodek konserwuj¹cy). Kontrola 2,0 ml Kontrola ujemna, niezaka one komórki traktowane detergentem, zawieraj¹ce 0,1% azydku sodu (œrodek konserwuj¹cy). Probówki 30 Probówki do ekstrakcji próbek i dostarczania ich DispensTube do urz¹dzenia. Koñcówki 30 Koñcówki do filtrowania próbki po jej dostarczeniu DispensTube do urz¹dzenia. Materia³y potrzebne, ale niedostarczone: Pipeta (za pomoc¹ której mo na pobraæ 250 µl), timer, mieszad³o vortex oraz pod³o e transportowe (zobacz Pobieranie i przygotowywanie próbek). Ostrze enia i œrodki ostro noœci: Do stosowania w diagnostyce in vitro. 1. Odczynnik RSV Kontrola + oraz linia kontrolna urz¹dzenia BD RSV sporz¹dzone zosta³y z komórek hodowli tkankowej zainfekowanych wirusem RSV, które inaktywowano za pomoc¹ detergentu oraz sonikacji, a nastêpnie przetestowano, wykorzystuj¹c procedury biologiczne. 2. Nie stosowaæ zestawu, je eli odczynniki Kontrola + i Kontrola nie daj¹ odpowiednich wyników. 3. W próbkach mog¹ byæ obecne mikroorganizmy patogenne, takie jak wirusy zapalenia w¹troby i wirus HIV. Przy kontakcie z wszelkimi materia³ami zanieczyszczonymi krwi¹ lub innymi p³ynami ustrojowymi nale y przestrzegaæ Uniwersalnych œrodków ostro noœci oraz instrukcji stosowanych w placówce. 4. Nie stosowaæ sk³adników zestawu po up³ywie terminu wa noœci. 5. NIE mieszaæ odczynników pochodz¹cych z partii zestawów o ró nych numerach. Nie u ywaæ wielokrotnie jednego urz¹dzenia. 6. Odczynniki zawieraj¹ azydek sodu, który jest szkodliwy przy wdychaniu, przy kontakcie ze skór¹ oraz w razie po³kniêcia. Przy kontakcie z kwasami uwalnia silnie toksyczny gaz. Jeœli dojdzie do kontaktu ze skór¹, natychmiast sp³ukaæ du ¹ objêtoœci¹ wody. Azydek sodu mo e reagowaæ z o³owiem i miedzi¹ wystêpuj¹cymi w instalacjach kanalizacyjnych, w wyniku czego mog¹ powstaæ silnie wybuchowe azydki metali. Po wylaniu przep³ukaæ du ¹ objêtoœci¹ wody, aby wykluczyæ gromadzenie siê azydku. Przechowywanie i sposób postêpowania: Zestawy mo na przechowywaæ w temperaturze 2 30 C. NIE ZAMRA AÆ. Podczas przeprowadzania badania odczynniki i urz¹dzenia BD RSV musz¹ znajdowaæ siê w temperaturze pokojowej (15 30 C). POBIERANIE I PRZYGOTOWYWANIE PRÓBEK Transport i przechowywanie próbek: Œwie e próbki nale y jak najszybciej przetransportowaæ do laboratorium w odpowiednim p³ynnym systemie transportowym. Próbki nale y poddawaæ obróbce jak najszybciej po pobraniu. W razie potrzeby próbki mo na przechowywaæ w temperaturze 2 8 C przez 72 h lub w temperaturze 20 C przez 7 dni po pobraniu. Istotne jest, aby stosowaæ odpowiednie metody pobierania i przygotowywania próbki. Nie odwirowywaæ próbek przed u yciem testu Directigen EZ RSV, poniewa usuniêcie materia³u komórkowego wp³ywa niekorzystnie na czu³oœæ testu. 2

3 Pod³o e transportowe: Wymienione ni ej pod³o a transportowe zosta³y przebadane i wykazano, e s¹ kompatybilne z testem Directigen EZ RSV: Sól fizjologiczna Bulion sojowy Trypticase + 0,5% elatyna* Roztwór soli fizjologicznej buforowany Bulion sojowy Trypticase + 0,5% albumina fosforanem (Phosphate Buffered Saline, PBS) wo³owa (Bovine Serum Albumin, BSA) PBS + 0,5% elatyna* Pod³o e Earle's Minimal Essential Medium PBS + 0,5% BSA (EMEM) Bulion infuzyjny cielêcy (Veal Infusion EMEM + 0,5% BSA Broth, VIB) EMEM + 1% BSA VIB + 0,5% BSA EMEM + 0,5% hydrolizat laktoalbuminy HBSS roztwor soli Hanksa EMEM + 1,0% hydrolizat laktoalbuminy Pod³o e M4 Media* Pod³o e zmodyfikowane Stuart (w p³ynie) Pod³o e M4-RT* CultureSwab Pod³o e M5 Media Pod³o e Amies (w p³ynie) CultureSwab Pod³o e Bartels ViraTrans Starplex Multitrans* Fosforan sacharozy (2-SP) Uniwersalne pod³o e transportowe BD* *Pod³o e zawiera elatynê. Pobieranie i przygotowywanie próbek: Wykazano, e pop³uczyny oraz aspiraty z nosogard³a stanowi¹ lepsze próbki ni wymazy z nosogard³a i dlatego s¹ to próbki pierwszego wyboru. 9,10 Próbki, które mo na badaæ za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV, to pop³uczyny z nosogard³a, aspiraty z nosogard³a, wymazy z nosogard³a oraz próbki pobrane metod¹ wymazu/p³ukania z nosogard³a. UWAGA: Do pobierania wymazów z nosogard³a zaleca siê stosowanie tamponów poliestrowych lub tamponów z jedwabiem, na pa³eczkach aluminiowych. Analiza wymazówek k³aczkowatych wykaza³a, e s¹ one zgodne z testem Directigen EZ RSV. 15 Wymazówki z koñcówk¹ wykonan¹ z alginianu wapnia nie nadaj¹ siê do pobierania próbek wirusowych. 16 Procedura dla pop³uczyn z nosogard³a oraz próbek pobranych metod¹ wymazu/p³ukania: 1. Zaleca siê stosowanie próbek o objêtoœci 2 3 ml. 2. Nale y unikaæ nadmiernych objêtoœci p³ynu p³ucz¹cego, poniewa mo e to doprowadziæ do zmniejszenia czu³oœci testu. 3. Próbkê nale y poddaæ obróbce zgodnie z opisem w dziale Procedura testowa. Procedura dla wymazów z nosogard³a: 1. Wacik nale y wprowadziæ do pod³o a transportowego o objêtoœci 350 µl 2 ml. 2. Wymieszaæ wacik i pod³o e transportowe za pomoc¹ urz¹dzenia vortex. 3. Mo liwie najdok³adniej wycisn¹æ wacik. UWAGA: Wacik mo na równie pozostawiæ w probówce. 4. Wyrzuciæ wacik do odpowiedniego pojemnika. 5. Próbkê nale y poddaæ obróbce zgodnie z opisem w dziale Procedura testowa. Procedura dla aspiratów z nosogard³a: 1. Przed obróbk¹ próbki mo na zawiesiæ w 1 3 ml pod³o a transportowego lub soli fizjologicznej. 2. Próbkê nale y poddaæ obróbce zgodnie z opisem w dziale Procedura testowa. 3

4 PROCEDURA Procedura testowa UWAGI: Podczas przeprowadzania badania odczynniki, próbki i urz¹dzenia BD RSV musz¹ znajdowaæ siê w temperaturze pokojowej (15 30 C). Dok³adnie wymieszaæ wszystkie próbki przed pobraniem czêœci do ekstrakcji. Nie odwirowywaæ próbek przed zastosowaniem testu Directigen EZ RSV, poniewa usuniêcie materia³u komórkowego wp³ywa niekorzystnie na czu³oœæ testu. Aby zapewniæ odpowiednie wprowadzenie próbek, probówki DispensTube oraz butelki z odczynnikami musz¹ byæ trzymane pionowo (w odleg³oœci oko³o 2 2,5 cm od studzienki s³u ¹cej do wprowadzenia próbki do urz¹dzenia BD RSV lub DispensTube) i jednoczeœnie nale y delikatnie, szybko wprowadzaæ po jednej kropli. 1. Wyj¹æ urz¹dzenie BD RSV z woreczka foliowego bezpoœrednio przed u yciem. 2. Oznakowaæ urz¹dzenie BD RSV i probówkê DispensTube dla próbki kontrolnej oraz badanej próbki. 3. Umieœciæ oznakowan¹ probówkê DispensTube w odpowiednim miejscu stacji roboczej lub stojaka. 4. Delikatnie wymieszaæ odczynnik do ekstrakcji E poprzez odwrócenie. Wprowadziæ 3 krople do probówki DispensTube. Podczas wprowadzania kropli butelkê z odczynnikiem trzymaæ pionowo (w odleg³oœci oko³o 2 2,5 cm od probówki DispensTube). 5. Dok³adnie wymieszaæ badan¹ próbkê lub próbkê kontroln¹ i postêpowaæ wed³ug dalszego opisu: a. Dla próbek badanych: 1. Dok³adnie wymieszaæ próbkê rêcznie lub za pomoc¹ urz¹dzenia vortex. Nie wirowaæ. 2. Za pomoc¹ pipety przenieœæ 250 µl próbki do probówki DispensTube. b. Dla próbek kontrolnych: 1. Delikatnie wymieszaæ fiolki Kontrola + i Kontrola. 2. Dodaæ 6 kropli odczynnika Kontrola + do odpowiedniej probówki DispensTube. 3. Dodaæ 6 kropli odczynnika Kontrola do odpowiedniej probówki DispensTube. 6. Wprowadziæ koñcówkê DispensTube do ka dej probówki DispensTube. UWAGA: Nie stosowaæ koñcówek z innych produktów Directigen. 7. Dok³adnie wymieszaæ rêcznie lub za pomoc¹ urz¹dzenia vortex. 8. Odwróciæ probówkê DispensTube i trzymaj¹c probówkê w górnej czêœci, z dala od koñcówki, delikatnie wycisn¹æ trzy (3) krople wyekstrahowanej próbki do odpowiednio oznakowanej studzienki BD RSV. UWAGA: Œciœniêcie probówki blisko koñcówki mo e spowodowaæ wypchniêcie koñcówki i wyciek zawartoœci z probówki. 9. Odczytaæ wyniki po min. Wyniki dodatnie mo na rozpoznaæ ju po 5 min, o ile widoczna jest linia kontrolna i linia testowa. UWAGA: W wypadku stosowania pod³o a zawieraj¹cego elatynê wyniki nale y odczytaæ po 15 minutach. Patrz Ograniczenia procedury. 4

5 10. Dokonaæ odczytu w dobrze oœwietlonym miejscu i zapisaæ wynik testu. Kontrola jakoœci: Nale y przestrzegaæ wymagañ co do kontroli jakoœci, zgodnie z odpowiednimi przepisami lokalnymi i krajowymi lub wymaganiami akredytacji laboratorium i jego standardowymi procedurami kontroli jakoœci. U ytkownik powinien zapoznaæ siê z zaleceniami CLSI (dawniej NCCLS) EP12-A 17 i 42 CFR (c) 18 dotycz¹cymi odpowiednich zasad kontroli jakoœci. Ka de urz¹dzenie BD RSV zawiera wbudowane kontrole. Wbudowane kontrole s¹ to: Kontrola wewnêtrzna: Pojawienie siê czerwono purpurowej linii kontrolnej stanowi wewnêtrzn¹ kontrolê antygenu (dodatnia kontrola wewnêtrzna), która s³u y jako kontrola dla koniugatu oraz wychwytuj¹cego przeciwcia³a, jak równie zapewnia, e przep³yw kapilarny jest prawid³owy. Brak tej linii oznacza, e testu nie mo na zinterpretowaæ. Kontrola b³ony testowej (ujemna kontrola wewnêtrzna): Niereaktywna powierzchnia b³ony otaczaj¹ca liniê wewnêtrznej kontroli dodatniej oraz liniê testow¹ kontrastuje z dodatnim wynikiem reakcji i dlatego s³u y jako odniesienie t³a dla interpretacji koloru reakcji. Dodatnia i ujemna kontrola zewnêtrzna: Z ka dym zestawem dostarczana jest równie p³ynna kontrola dodatnia (Kontrola +) i ujemna (Kontrola ). Mo na je stosowaæ jako dodatkowe kontrole jakoœci w celu wykazania reakcji dodatniej lub ujemnej. Kontrole zewnêtrzne powinny byæ wykonywane w ramach procedury kontroli jakoœci dla ka dej nowo otrzymanej serii lub przesy³ki. Czerwono purpurowa linia w okienku odczytu na wysokoœci T przy zastosowaniu odczynnika Kontrola + wskazuje, e zachowane s¹ w³aœciwoœci wi¹ ¹ce antygenu RSV znajduj¹cego siê na b³onie. Nie podawaæ wyników testu, je eli odczynniki Kontrola + lub Kontrola nie daj¹ odpowiednich wyników. Kontrole p³ynne mog¹ byæ tak e stosowane w celu wykazania s³abej reakcji dodatniej. S³absza reakcja dodatnia mo e byæ wykazana poprzez ³¹czne rozcieñczenie odczynników Kontrola + i Kontrola w tej samej probówce DispensTube (3 krople odczynnika Kontrola + i 3 krople odczynnika Kontrola ). Je eli nie uzyskuje siê oczekiwanych wyników kontrolnych, nie nale y podawaæ wyników badañ pacjenta. Warto w takim przypadku skorzystaæ z pomocy lokalnego przedstawiciela firmy BD lub serwisu technicznego. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wynik dodatni testu (antygen jest obecny) W okienku odczytu pojawiaj¹ siê dwie wyraÿne czerwono purpurowe linie: na wysokoœci oznakowania testu T i na wysokoœci kontroli C. Oznacza to, e w próbce zosta³ wykryty antygen RSV. Obszar t³a powinien mieæ kolor od bia³ego do jasnoró owego. Ujemny wynik testu (antygen nie zosta³ wykryty) Brak czerwono purpurowej linii na wysokoœci oznakowania T. Oznacza to, e w próbce nie zosta³ wykryty antygen RSV. Czerwono purpurowa linia na wysokoœci oznakowania C wskazuje, e test zosta³ odpowiednio przeprowadzony i e odczynniki by³y aktywne. Obszar t³a powinien mieæ kolor od bia³ego do jasnoró owego. niemo liwy do interpretacji Test niemo liwy do interpretacji Je eli na wysokoœci oznakowania C nie jest widoczna czerwono purpurowa linia lub je eli kolor t³a zak³óca interpretacjê linii testowej lub kontrolnej, testu nie mo na zinterpretowaæ. Je eli test nie jest mo liwy do interpretacji, nale y go powtórzyæ lub uzyskaæ i przebadaæ now¹ próbkê albo konieczne jest wys³anie próbki do laboratorium w celu wykonania hodowli. PODAWANIE WYNIKÓW Wynik dodatni Dodatni pod wzglêdem obecnoœci antygenu wirusa RSV. Wynik dodatni mo na uzyskaæ przy braku ywego wirusa. Wynik ujemny Ujemny pod wzglêdem obecnoœci antygenu wirusa RSV. Nie mo na wykluczyæ zaka enia wirusem RSV, poniewa stê enie antygenu w próbce mo e byæ ni sze ni poziom wykrywany przez test. Zaleca siê potwierdzenie wyników ujemnych za pomoc¹ hodowli komórkowej. 5

6 OGRANICZENIA PROCEDURY 1. Test Directigen EZ RSV mo e wykrywaæ zarówno ywotne cz¹stki wirusa RSV, jak i cz¹stki niezdolne do prze ycia. Dzia³anie testu Directigen EZ RSV zale y od iloœci antygenu i mo e nie korelowaæ z hodowl¹ komórkow¹ wykonan¹ z tej samej próbki. Za pomoc¹ tego testu nie mo na ustaliæ etiologii zaka eñ dróg oddechowych wywo³anych przez mikroorganizmy inne ni RSV. 2. Nieodpowiednie pobranie próbki, niew³aœciwe postêpowanie z próbk¹/transport lub ma³e stê enie wirusa w próbce mog¹ dawaæ wyniki fa³szywie ujemne. Dlatego te ujemny wynik testu nie wyklucza mo liwoœci zaka enia wirusem RSV. Podobnie jak w przypadku wszystkich procedur diagnostycznych, wyniki uzyskane za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV nale y interpretowaæ ³¹cznie z innymi dostêpnymi lekarzowi informacjami klinicznymi. 3. W przypadku chromatograficznych badañ immunologicznych jest bardziej prawdopodobne, e wynik jest fa³szywie dodatni, je eli linie s¹ s³abo widoczne, ni wówczas, gdy linie s¹ wyraÿnie widoczne. Podobnie jak w przypadku wszystkich procedur diagnostycznych, wyniki uzyskane za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV nale y interpretowaæ ³¹cznie z innymi dostêpnymi lekarzowi informacjami klinicznymi. 4. Nie udowodniono przydatnoœci testu Directigen EZ RSV do identyfikacji/potwierdzenia izolatów z hodowli komórkowych i nie powinien on byæ w tym celu stosowany. 5. Nale y dok³adnie zapoznaæ siê ze sk³adem pod³o a transportowego, które ma byæ u ywane, aby ustaliæ, czy zawiera ono elatynê. W wypadku stosowania pod³o a zawieraj¹cego elatynê wyniki nale y odczytaæ po 15 minutach. Odczyt dokonany póÿniej ni po 15 minutach mo e spowodowaæ pojawienie siê s³abo widocznych linii w pozycji testu (T) okienka odczytu. 6. Pod³o e Amies Gel CultureSwab Plus nie jest kompatybilne z testem Directigen EZ RSV. Przechowywanie próbek w tym pod³o u przez d³u szy czas mo e wp³yn¹æ na uzyskanie wyników fa³szywie ujemnych. 7. Nie badano reaktywnoœci krzy owej tego testu z wirusem ludzkim metapneumovirus. 8. Przeciwcia³a monoklonalne mog¹ nie wykryæ wszystkich wariantów antygenowych lub nowych szczepów wirusa RSV. 9. Za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV nie przebadano wystarczaj¹cej liczby próbek z dolnych dróg oddechowych, wymazów z dolnej czêœci nosa, wymazów z nosa/gard³a oraz wymazów z gard³a, aby mo na by³o oszacowaæ jego dzia³anie dla tych rodzajów próbek. OCZEKIWANE WARTOŒCI Zakres wyników dodatnich uzyskiwanych w teœcie na RSV bêdzie ró ny w zale noœci od metody pobrania próbki, wykorzystywanego systemu transportu, stosowanej metody detekcji, pory roku, wieku pacjenta, lokalizacji geograficznej i co najwa niejsze, lokalnej czêstoœci wystêpowania choroby. Czêstoœæ wystêpowania obserwowana w hodowli komórkowej podczas badania klinicznego zawiera³a siê w przedziale 4,2 46,5%. CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŒCIOWA Charakterystyka wydajnoœciowa testu Directigen EZ RSV zosta³a ustalona w badaniu wielooœrodkowym przeprowadzonym w siedmiu oœrodkach klinicznych w sezonie zachorowalnoœci na RSV w latach Oœrodki kliniczne znajdowa³y siê w Kanadzie oraz w geograficznie odmiennych obszarach na terenie USA. Wszystkie próbki by³y pobierane i transportowane do laboratorium zgodnie z procedur¹ ka dego laboratorium. Ka da próbka by³a oceniana za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV, hodowli komórkowej oraz rutynowej metody laboratoryjnej (tzn. DFA, EIA). Wszelkie pozosta³e próbki przechowywano w temperaturze nie wy szej ni 20 C. W celu przeprowadzenia hodowli komórkowej dokonywano inokulacji czêœci próbki do linii komórkowej odpowiedniej do hodowli wirusa RSV, zgodnie z procedur¹ ka dego laboratorium. Komórki badano pod k¹tem wyst¹pienia efektu cytopatycznego (cytopathic effects, CPE). Zaka enie komórek przez RSV potwierdzano za pomoc¹ barwienia immunofluorescencyjnego. Próbki, w których nie obserwowano efektu cytopatycznego po czternastu dniach, barwiono gatunkowo specyficznym barwnikiem immunofluorescencyjnym w celu uzyskania potwierdzenia wyniku ujemnego. Za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV przebadano 1176 próbek, wœród których by³y pop³uczyny z nosogard³a, aspiraty z nosogard³a, wymazy z nosogard³a oraz próbki pobrane metod¹ wymazu/p³ukania z nosogard³a, pochodz¹ce od pacjentów z podejrzeniem zaka enia wirusem RSV. Wydajnoœæ kliniczna: W porównaniu do hodowli komórkowej, ca³kowita czu³oœæ i specyficznoœæ testu Directigen EZ RSV wobec RSV wszystkich przebadanych próbek wynosi³y odpowiednio 80 i 91%. Odsetek wyników niemo liwych do interpretacji by³ równy 0%. Charakterystyki 6

7 wydajnoœciowe testu Directigen EZ RSV w porównaniu do linii komórkowej, dla ka dego rodzaju próbek, przedstawiono w tabeli 1. Charakterystyki wydajnoœciowe w porównaniu do linii komórkowej dla ka dego oœrodka klinicznego przedstawiono w tabeli 2. Tabela 1: Podsumowanie wydajnoœci testu Directigen EZ RSV (EZ) w porównaniu do hodowli komórkowej dla wszystkich rodzajów próbek Hodowla komórkowa/ez Rodzaj próbki n +/+ /+ a +/ / Czu³oœæ (%) Swoistoœæ (%) (95% CI) (95% CI) Pop³uczyny ,2 85,5 z nosogard³a (NPW) (80,7 92,1) (79,8 90,1) Aspiraty ,9 91,6 z nosogard³a (NPA) (68,2 84,2) (87,7 94,5) Próbki pobrane metod¹ ,8 95,0 wymazu/p³ukania (55,1 85,0) (89,7 98,2) z nosogard³a (NPSW) Wymaz z nosogard³a ,7 91,6 (NPS) (47,2 82,7) (87,3 94,8) (+) = wynik dodatni wobec RSV ( ) = wynik ujemny wobec RSV a Metoda PCR stosowana do badania próbek, dla których uzyskano wynik ujemny w hodowli komórkowej i wynik dodatni w teœcie Directigen EZ RSV, nie jest dopuszczona przez FDA. W przypadku 79 próbek wynik hodowli komórkowej by³ ujemny, podczas gdy wynik testu Directigen EZ RSV by³ dodatni. Metod¹ PCR przebadano 73 spoœród 79 próbek; w przypadku 46 z 73 przebadanych próbek wynik uzyskany za pomoc¹ PCR by³ dodatni. Tabela 2: Podsumowanie wydajnoœci testu Directigen EZ RSV (EZ) w porównaniu do hodowli komórkowej dla poszczególnych oœrodków klinicznych Hodowla komórkowa/ez Oœrodek Rodzaj n +/+ /+ +/ / Czu³oœæ (%) Swoistoœæ (%) próbki (95% CI) (95% CI) Oœrodek 1 50% NPW ,6 45% NPA (71,5 100) (83,8 99,4) 5% NPS Oœrodek 2 100% NPW ,9 82,4 (67,6 87,7) (73,6 89,2) Oœrodek 3 59% NPA ,9 76,7 37% NPW (77,1 92,3) (67,3 84,5) 4% NPS Oœrodek 4 100% NPS ,4 91,4 (13,7 78,8) (86,6 94,9) Oœrodek 5 73% NPSW ,4 94,9 24% NPS (62,7 85,5) (90,3 97,8) 2% NPW 1% NPA Oœrodek 6 100% NPW ,2 100 (76,3 98,1) (91,8 100) Oœrodek 7 100% NPA ,4 95,3 (57,8 82,7) (91,5 97,7) (+) = wynik dodatni wobec RSV ( ) = wynik ujemny wobec RSV Wyniki dodatnie testu Directigen EZ RSV rozk³ada³y siê w zakresie od linii s³abo widocznych do linii wyraÿnie widocznych. Dla 39 spoœród 70 próbek, dla których za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV uzyskano wynik dodatni o s³abo widocznych liniach, otrzymano dodatni wynik hodowli komórkowej, a dla 58 uzyskano wynik dodatni za pomoc¹ co najmniej jednej metody (tzn. hodowla, DFA, EIA lub PCR a ). Dla 130 spoœród 170 próbek, w których za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV uzyskano wynik 7

8 dodatni o wyraÿnie widocznych liniach, otrzymano dodatni wynik hodowli komórkowej, a dla 166 uzyskano wynik dodatni za pomoc¹ co najmniej jednej metody (tzn. hodowla, DFA, EIA lub PCR a ). Dla 98 spoœród 106 próbek, w których za pomoc¹ testu Directigen EZ RSV uzyskano wynik dodatni o bardzo wyraÿnie widocznych liniach, otrzymano dodatni wynik hodowli komórkowej, a dla 106 uzyskano wynik dodatni za pomoc¹ co najmniej jednej metody (tzn. hodowla, DFA, EIA lub PCR a ). a Metoda PCR stosowana do badania próbek, dla których uzyskano wynik ujemny w hodowli komórkowej i wynik dodatni testu Directigen EZ RSV, nie jest dopuszczona przez FDA. Powtarzalnoœæ: Powtarzalnoœæ testu Directigen EZ RSV oceniano w trzech oœrodkach. Panel do badania powtarzalnoœci zawiera³ 12 próbek niezaka onych wirusem RSV oraz cztery takie same próbki s³abo dodatnie wobec antygenu RSV (w pobli u granicy wykrywalnoœci [Limit of Detection, LOD]) i cztery takie same próbki umiarkowanie dodatnie wobec antygenu RSV, zawieszone w rozcieñczalniku kontroli ujemnej. Panel zawiera³ ponadto cztery próbki, niezaka one wirusem RSV, które stanowi³y czysty rozcieñczalnik kontroli ujemnej. Ca³kowita powtarzalnoœæ testu Directigen EZ RSV wynosi³a 99,1%. Badania analityczne Czu³oœæ analityczna (granica wykrywalnoœci) Granicê wykrywalnoœci (Limit of Detection, LOD) dla testu Directigen EZ RSV ustalono dla piêciu szczepów RSV: dwóch szczepów RSV A i trzech szczepów RSV B. Typ Szczep wirusa RSV LOD (TCID 50 ) * A RSV (Long) 3,95 x 10 3 A RSV (A-2) 7,9 x 10 3 B RSV (9320) 4,05 x 10 2 B RSV (Washington) 7,03 x 10 3 B RSV (szczep dziki) 5,56 x 10 2 * TCID 50 = dawka zakaÿna dla hodowli tkankowej (Tissue Culture Infectious Dose), przy której 50% komórek ulega lizie. Swoistoœæ analityczna Test Directigen EZ RSV oceniono za pomoc¹ 99 mikroorganizmów (58 gatunków bakterii, dwóch rodzajów dro d y oraz 39 wirusów). Bakterie i dro d e badano przy stê eniach 10 8 CFU/mL. Mycoplasma orale testowano przy stê eniu >10 7 CFU/mL. Mycoplasma pneumoniae testowano przy stê eniu >10 6 CCU/mL (CCU color changing units jednostki zmieniaj¹ce kolor). Mycobacterium tuberculosis testowano przy stê eniu 7,0 x 10 6 CFU/mL. Szczepy wirusów testowano w mianie od 10 3,5 do 10 9,5 TCID 50 /0,20 ml. Wirusy grypy testowano w mianie od 10 3,5 do 10 9,5 CEID 50 **/0,20 ml. Dla adnego z wymienionych mikroorganizmów nie stwierdzono wyniku dodatniego w teœcie Directigen EZ RSV. ** CEID 50 = dawka zaka aj¹ca dla zarodka kurczaka (Chick Embryo Infectious Dose), przy której 50% zarodka kurczaka ulega zaka eniu. 8

9 Acinetobacter baumannii (calcoaceticus) Actinobacillus suis Bacteriodes fragilis Bordetella pertussis Candida albicans Candida glabrata Cardiobacterium hominis Chlamydia psittaci Chlamydia trachomatis LGVII Corynebacterium diphtheriae Eikenella corrodens Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarum Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus aphrophilus Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Haemophilus paraphrophilus Panel bakterii i dro d y Kingella kingae Klebsiella pneumoniae Lactobacillus casei Lactobacillus fermentum Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Moraxella catarrhalis Mycobacterium avium Mycobacterium intracellulare Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma orale Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Neisseria mucosa Neisseria sicca Neisseria subflava Peptostreptococcus anaerobius Porphyromonas asaccharolyticus Prevotella oralis Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Salmonella choleraesuis subsp minnesota Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus-cowan Staphylococcus epidermidis Streptococcus bovis II Grupa D Streptococcus mutans Streptococcus oralis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Grupa A Streptococcus sanguis Streptococcus sp. Grupa B Streptococcus sp. Grupa C Streptococcus sp. Grupa F Streptococcus sp. Grupa G Veillonella parvula Panel wirusów Adenovirus, Typ 3 Influenza B/GL/1739/54 Adenovirus, Typ 5 Influenza B/Hong Kong/5/72 Adenovirus, Typ 7 Influenza B/Lee/40 Adenovirus, Typ 10 Influenza B/Allen/45 Adenovirus, Typ 18 Influenza B/Maryland/1/59 Coronavirus Influenza B/Taiwan/2/62 Coxsackievirus Typ A9 (Griggs) Influenza C/Taylor/1233/47 Coxsackievirus Typ A9 (P.B. Bozek) Wirus odry Coxsackievirus Typ B5 Wirus œwinki Coxsackievirus Typ B6 Parainfluenza Typ 1 Coxsackievirus Typ A21 Parainfluenza Typ 2 Cytomegalovirus Parainfluenza Typ 3 Echovirus Typ 2 Rhinovirus Typ 1A Echovirus Typ 3 Rhinovirus Typ 2 Echovirus Typ 6 Rhinovirus Typ 13 Echovirus Typ 11 Rhinovirus Typ 15 Herpes Simplex Wirus Typ 1 Rhinovirus Typ 16 Herpes Simplex Wirus Typ 2 Rhinovirus Typ 37 Influenza A (H1N1) Wirus Varicella Zoster Influenza A (H3N2) 9

10 Substancje zak³ócaj¹ce Badaj¹c test Directigen EZ RSV przeanalizowano ró ne substancje zak³ócaj¹ce, miêdzy innymi pe³n¹ krew 2%, leki sprzedawane bez recepty i na receptê. Nie wykazano, by któraœ z badanych substancji w badanych stê eniach powodowa³a zak³ócenia testu. Leki sprzedawane bez recepty Trzy p³yny do p³ukania jamy ustnej sprzedawane bez recepty w stê eniu 25% Trzy rodzaje kropli na ból gard³a sprzedawane bez recepty w stê eniu 25% Trzy spraye do nosa sprzedawane bez recepty w stê eniu 10% 4-Acetamidofenol w dawce 10 mg/ml Kwas acetylosalicylowy w dawce 20 mg/ml Maleinian chlorfeniraminy w stê eniu 5 mg/ml Dekstrometorfan w stê eniu 10 mg/ml Chlorowodorek difenhydraminy w stê eniu 5 mg/ml Chlorowodorek pseudoefedryny w stê eniu 20 mg/ml Gwajakol Gliceryl Eter w stê eniu 20 mg/ml Ibuprofen w dawce 10 mg/ml Oksymetazolina w dawce 0,05 mg/ml Fenylefryna w stê eniu 1 mg/ml Leki sprzedawane na receptê Zanamawir w stê eniu 1 mg/ml Amantadyna w stê eniu 500 ng/ml Rimantadyna w stê eniu 500 ng/ml Rybawiryna w stê eniu 500 ng/ml Synagis w stê eniu 0,1 mg/ml Siarczan albuterolu w stê eniu 0,083 mg/ml DOSTÊPNOŒÆ Numer kat. Opis Zestaw 30 testów Directigen EZ RSV BBL CultureSwab Sterile Single Swab (pojedyncze wymazówki sterylne), pakowane po BBL CultureSwab Liquid Amies (p³yn Amies), z giêtkiego drutu aluminiowego, pakowane po BBL CultureSwab Liquid Stuart (p³yn Stuart), z giêtkiego drutu aluminiowego, pakowane po Uniwersalna fiolka transportowa 3 ml BD Universal Viral Transport, pude³ko zawiera 50 sztuk Regular Flocked Swab (zwyk³e wymazówki k³aczkowate), sterylnie pakowane pojedynczo, pude³ko zawiera 100 sztuk Minitip Flocked Swab (wymazówki k³aczkowate Minitip), sterylnie pakowane pojedynczo, pude³ko zawiera 100 sztuk Flexible Minitip Flocked Swab (elastyczne wymazówki k³aczkowate Minitip), sterylnie pakowane pojedynczo, pude³ko zawiera 100 sztuk PIŒMIENNICTWO 1. CDC Update: respiratory syncytial virus activity United States, season. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 48: Falsey, A.R. and E. E. Walsh Respiratory syncytial virus infection in adults. Clin. Microbiol. Rev. 13: Englund. J.A., P. A. Peidra, A. Jewell, K. Patel, B. B. Baxter and E. Whimbey Rapid diagnosis of respiratory syncytial virus infections in immunocompromised adults. J. Clin. Microbiol. 34: Crowcroft, N.S., F. Cutts and M.C. Zambon Respiratory syncytial virus: an underestimated cause of respiratory infection, with prospects for a vaccine. Commun Dis Public Health. 2: Hughes, J.D., D. A. Mann and V. V. Hamparian Detection of respiratory syncytial virus in clinical specimens by viral culture, direct and indirect immunofluorescence, and enzyme immunoassay. J.Clin. Microbiol. 226: Ahluwalia, G.J., J. Embree, P. McNicol, B. Law and G. W. Hammond Comparison of nasopharyngeal aspirate and nasopharyngeal swab specimens for respiratory syncytial virus 10

11 diagnosis by cell culture, indirect immunofluorescence assay, and enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 25: Waner, J.L., N. J. Whitehurst, S. J. Todd, H. Shalaby and L. V. Wall Comparison of Directigen RSV with viral isolation and direct immunofluorescence for the identification of respiratory syncytial virus. J. Clin. Microbiol. 25: Kehl, S.C., K. J. Henrickson, W. Hua and F. Jiang Evaluation of the hexaplex assay for detection of respiratory viruses in children. J. Clin. Microbiol. 39: Barenfanger, J., C. Drake, N. Leon, T. Mueller and T. Troutt Clinical and financial benefits of rapid detection of respiratory viruses: an outcomes study. J. Clin. Microbiol. 38: Heikkinen, T., J. Marttila, A. Salmi, and O. Ruuskanen Nasal Swab versus Nasopharyngeal Aspirate for Isolation of Respiratory Viruses. J. Clin. Microbiol. 40: Clinical and Laboratory Standards Institute Approved Guideline M29-A3. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections. CLSI, Wayne, PA. 12. Garner, J. S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U. S. Department of Health and Human Services, Center for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 5th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 14. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Data on file, BD Diagnostics. 16 Smith, T.F Specimen requirements; selection, collection, transport, and processing In S. Spector, R.L. Hodinka, and S.A. Young (eds.), Clinical virology manual, 3rd ed., ASM Press, Washington, D.C. 17. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Approved guideline: EP12-A. User protocol for evaluation of qualitative test performance, CLSI, Wayne, PA. 18. Federal Register Quality control for tests of moderate complexity (including the subcategory), high complexity, or any combination of these tests. Code of Federal Regulations 42(3):

12 12

13 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, MD USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel.: Faks: ViraTrans is a trademark of Trinity Biotech, PLC. Multitrans is a trademark of Starplex Scientific, Inc. BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD. Made in China by BD.