BD BBL Enterotube II

Transkrypt

1 INSTRUKCJE STOSOWANIA BBL Enterotube II BD BBL Enterotube II IA wer.: Jan PRZEZNACZENIE BBL Enterotube II jest gotowym systemem identyfikacyjnym, przeznaczonym do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae i wielu innych oksydazododatnich pałeczek Gramujemnych. ZASADY I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Metoda mikrobiologiczna. Bakterie z rodziny Enterobacteriaceae są ważnymi czynnikami zakaźnymi. Omawiana grupa bakterii metabolizuje węglowodany głównie na drodze fermentacji i utleniania. Bakterie z rodziny Enterobacteriaceae są katalazododatnie, a niemal wszystkie bakterie z tej rodziny są oksydazoujemne. W oparciu o sekwencjonowanie 16S rrna oraz w związku z tym, że ten gatunek zawiera antygen wspólny dla bakterii jelitowych, zaproponowano niedawno włączenie Plesiomonas shigelloides do rodziny Enterobacteriaceae. 1,2 Uprzednio tę oksydazododatnią bakterię klasyfikowano do rodzaju Vibrionaceae). Identyfikacja Enterobacteriaceae opiera się na reakcjach biochemicznych opisanych przez Ewinga i Farmera. Szczegółowe informacje przedstawiono w piśmiennictwie Wprawdzie w przeszłości opisano bardzo dużo gatunków i rodzajów, jednak drobnoustroje izolowane z próbek klinicznych należą do od 20 do 25 dobrze znanych od wielu lat gatunków. 1 BBL Enterotube II jest samodzielną plastikową probówką z przedziałami, zawierającą dwanaście różnych podłoży umożliwiających przeprowadzenie 15 reakcji biochemicznych (fermentacji glukozy, wytwarzania gazu z glukozy, dekarboksylacji lizyny, dekarboksylacji ornityny, wytwarzania H 2 S, wytwarzania indolu, fermentacji laktozy, arabinozy, sorbitolu, reakcji Vogesa-Proskauera (VP), fermentacji dulcytu, deaminacji fenyloalaniny (PA), rozkładu mocznika i utylizacji cytrynianu). Zawarta w zestawie eza umożliwia wykonanie posiewu jednocześnie we wszystkich przedziałach z jednej lub niewielu pojedynczych kolonii. Interpretacja łącznych wyników przeprowadzonych reakcji, w oparciu o Kartę interpretacji wyników (książkę kodów), pozwala na identyfikację istotnych klinicznie bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Kartę interpretacji wyników (książkę kodową) dla zestawu BBL Enterotube II stworzono w oparciu o dane z piśmiennictwa dotyczącego testów biochemicznych wykonywanych przy zastosowaniu zestawu BBL Enterotube II Broszura wyników i Karta reakcji barwnych umożliwia szybkie sprawdzenie dodatnich wyników reakcji, uzyskanych w zestawie BBL Enterotube II. Drobnoustroje identyfikuje się, sumując liczby odpowiadające reakcjom dodatnim, a następnie lokalizuje się łączny numer w Karcie interpretacji wyników. Jeżeli wymieniono dwa lub więcej drobnoustrojów, podano także testy potwierdzające, których przeprowadzenie jest konieczne do dalszej identyfikacji. Poniższy schemat przedstawia sposób zastosowania testu oksydazowego do różnicowania bakterii z rodziny Enterobacteriaceae od niefermentujących, oksydazododatnich lub oksydazoujemnych oraz od fermentujących, oksydazododatnich bakterii Gram-ujemnych: wskazuje także, kiedy należy stosować zestaw BBL Enterotube II, a kiedy BBL Oxi/Ferm Tube II. IA

2 Czysta hodowla na podłożu niewybiórczym Test oksydazowy dodatni ujemny Wykonać posiew w BBL Oxi/Ferm Tube II Wykonać posiew w BBL Enterotube II Glukoza, warunki beztlenowe Glukoza Dodatni Ujemny Dodatni Ujemny* Aeromonas spp., Plesiomonas shigelloides, Vibrio spp. Achromobacter spp., Alcaligenes spp., Bordetella bronchiseptica, Moraxella spp., Pasteurella spp. itd. Enterobacteriaceae Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia itd. * Możliwa jest identyfikacja oznaczonych gatunków z zastosowaniem systemu BBL Enterotube II. Konieczne może być potwierdzenie w systemie BBL Oxi/Ferm Tube II. ODCZYNNIKI BBL Enterotube II Substraty i inne składniki czynne oraz zabarwienie podłoża przed wykonaniem posiewu: Podłoże 1 (Glukoza): Glukoza (20,0 g/l) zawarta w odpowiednim podłożu podstawowym, z czerwienią krezolową jako wskaźnikiem ph. W celu zapewnienia warunków beztlenowych oraz umożliwienia wykrycia wytwarzania gazu, podłoże pokryte jest woskiem. Przed wykonaniem posiewu: czerwone. Podłoże 2 (Lizyna): Lizyna (10,0 g/l) zawarta w odpowiednim podłożu podstawowym, z purpurą bromokrezolową jako wskaźnikiem ph. W celu zapewnienia warunków beztlenowych podłoże pokryte jest woskiem. Przed wykonaniem posiewu: żółte. Podłoże 3 (Ornityna): Ornityna (10,0 g/l) zawarta w odpowiednim podłożu podstawowym, z purpurą bromokrezolową jako wskaźnikiem ph. W celu zapewnienia warunków beztlenowych podłoże pokryte jest woskiem. Przed wykonaniem posiewu: żółte. Podłoże 4 (H 2 S/Indol): Tiosiarczan sodu (4,7 g/l), cytrynian amonu żelaza (III) (0,6 g/l) i tryptofan (1,2 g/l) w odpowiednim podłożu podstawowym. Przed wykonaniem posiewu: beżowe do jasnobursztynowego. Podłoże 5 (Adonitol): Adonitol (20,0 g/l) zawarty w odpowiednim podłożu podstawowym, z czerwienią krezolową jako wskaźnikiem ph. Przed wykonaniem posiewu: czerwone. Podłoże 6 (Laktoza): Laktoza (20,0 g/l) zawarta w odpowiednim podłożu podstawowym, z czerwienią krezolową jako wskaźnikiem ph. Przed wykonaniem posiewu: czerwone. Podłoże 7 (Arabinoza): Arabinoza (20,0 g/l) zawarta w odpowiednim podłożu podstawowym, z czerwienią krezolową jako wskaźnikiem ph. Przed wykonaniem posiewu: czerwone. Podłoże 8 (Sorbitol): Sorbitol (20,0 g/l) zawarty w odpowiednim podłożu podstawowym, z czerwienią krezolową jako wskaźnikiem ph. Przed wykonaniem posiewu: czerwone. Podłoże 9 (reakcja Vogesa-Proskauera): Glukoza (20,0 g/l) zawarta w odpowiednim podłożu podstawowym. Przed wykonaniem posiewu: bezbarwne do jasnobursztynowego Podłoże 10 (Dulcitol/PA): Dulcyt (20,0 g/l), fenyloalanina (7,0 g/l) i cytrynian amonu żelaza (III) (0,5 g/l) zawarte w odpowiednim podłożu podstawowym, z błękitem bromotymolowym jako wskaźnikiem ph. Przed wykonaniem posiewu: zielone. Podłoże 11 (Mocznik): Mocznik (20,0 g/l) w odpowiednim podłożu, ze wskaźnikiem odczynu ph czerwienią fenolową. Przed wykonaniem posiewu: beżowe do jasnobursztynowego. Podłoże 12 (Cytrynian): Cytrynian sodu (2,0 g/l) zawarty w odpowiednim podłożu podstawowym, z błękitem bromotymolowym jako wskaźnikiem ph. Przed wykonaniem posiewu: zielone. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI. Wyłącznie do zastosowań profesjonalnych. Nie należy używać probówek, jeżeli są na nich widoczne objawy świadczące o skażeniu mikrobiologicznym, nastąpiło oddzielenie powłoki woskowej, wysuszenie, pęknięcia lub inne oznaki pogorszenia jakości. IA

3 Wystąpienie któregokolwiek z czynników może zakłócać dokładność wyników hodowli w systemie BBL Enterotube II: odwodnienie lub skroplenie podłoży, odwarstwienie wosku od powierzchni podłoży, jakiekolwiek zmiany zabarwienia podłoży w porównaniu z przedstawionymi w części ODCZYNNIKI (Przed wykonaniem posiewu), a także wykrycie jakiegokolwiek wzrostu na powierzchniach podłoży. Poniżej wymieniono środki ostrożności dotyczące poszczególnych przedziałów: Glukoza: Dzięki woskowej powierzchni stężenie tlenu w tym przedziale jest odpowiednio niskie, by mogła zachodzić pełna fermentacja charakterystyczna dla Enterobacteriaceae. Utrzymujący się po wykonaniu posiewu i okresie inkubacji kolor czerwony podłoża oznacza, że badany szczep nie należy do rodzaju Enterobacteriaceae. Gatunki z rodzaju Acinetobacter dające wynik ujemny w teście fermentacji glukozy są przykładem bakterii oksydazoujemnych, nienależących do rodziny Enterobacteriaceae, niefermentujących glukozy w warunkach beztlenowych w systemie BBL Enterotube II. Mimo że te drobnoustroje można różnicować z Enterobacteriaceae, stosując system BBL Enterotube II (korzystając z Karty interpretacji wyników, należy stosować bazę danych dla oksydazoujemnych bakterii niefermentujących), do ich dalszej identyfikacji może być konieczne zastosowanie systemu BBL Oxi/Ferm Tube II. Fenyloalanina (PA): Po inkubacji podłoże może przyjąć barwę zieloną o bardziej intensywnym odcieniu. Uważa się to za wynik ujemny. Ostrzeżenie: Przygotowując i pracując z indolem oraz odczynnikami VP, należy przestrzegać odpowiednich instrukcji postępowania oraz Informacji dotyczących zagrożenia i bezpieczeństwa. Procedury aseptycznej techniki pracy z produktem, zagrożenia biologiczne oraz usuwanie zużytego produktu opisano w dokumencie OGÓLNE INSTRUKCJE DOTYCZĄCE STOSOWANIA. WARUNKI I OKRES PRZECHOWYWANIA Dostarczony test BBL Enterotube II należy przechowywać aż do momentu użycia w oryginalnych opakowaniach, w zacienionym pomieszczeniu, w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać i nie przegrzewać. Probówki należy wykorzystać do posiewu bakterii przed upływem daty ważności i inkubować zgodnie z zalecanymi czasami inkubacji. Probówki pochodzące z otwartych opakowań można stosować przed upłynięciem daty ważności. Po otwarciu należy natychmiast zużyć probówki. KONTROLA JAKOŚCI PRZEZ UŻYTKOWNIKA Należy wykonać posiew szczepów bakterii wymienionych poniżej w systemie BBL Enterotube II. Sposób wykonania posiewu, inkubacji i odczytywania wyników opisano w dziale Procedura testowa. ORGANIZMY Proteus mirabilis ATCC Proteus vulgaris ATCC 6380 Providencia alcalifaciens ATCC 9886 Serratia marcescens ATCC Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Glukoza Gaz Lizyna Ornityna H2S Indol Antidol Laktoza Arabinoza Sorbitol Reakcja VP Dulcitol Fenyloala nina Mocznik Cytrynian Dopuszczalne kody biologiczne + +/ / / / /( +/ / ) + +/ / / / / / / / / / / / / / / / / / /(+) + * IA

4 * P. aeruginosa jest baterią oksydazododatnią i jako taka nie została ujęta w bazach danych systemu BBL Enterotube II. Znajduje jednak zastosowanie jako organizm kontrolny do wykrywania ujemnych wyników reakcji w przedziałach glukoza i gaz. Wyniki reakcji: + = dodatni; = ujemny; (+) słabo dodatni; +/- = dodatni lub (rzadko) ujemny; +/(+) = dodatni lub (rzadko) słabo dodatni; -/+= ujemny lub (rzadko) dodatni. PROCEDURA Dostarczane materiały BBL Enterotube II. Sprawdzone pod kątem obecności mikroorganizmów. Karta interpretacji wyników i Karta reakcji barwnych systemu BBL Enterotube II. Materiały niedostarczane Karta interpretacji wyników w systemie BBL Enterotube II (książka kodów, nr dokumentu CM CE składająca się z trzech baz danych: (1) Oksydazoujemne bakterie niefermentujące, (2) Enterobacteriaceae metoda bez reakcji VP i (3) Enterobacteriaceae metoda z reakcją VP. Odczynnik indolowy Kovacsa (Indol Dropper Reagent, 50 ampułek, nr kat ) oraz odczynniki Vogesa-Proskauera (Voges-Proskauer A Dropper Reagent, 50 ampułek, nr kat ; Voges-Proskauer B Dropper Reagent, nr kat ) można nabyć w firmie BD. Materiały i odczynniki potrzebne do przeprowadzenia testów uzupełniających wymieniono w Karcie interpretacji wyników w systemie BBL Enterotube II. System BBL Oxi/Ferm II (nr kat ) do identyfikacji bakterii nienależących do rodziny Enterobacteriaceae. Pomocnicze pożywki hodowlane, odczynniki i sprzęt laboratoryjny, zgodnie z opisem. Odczynnik Kovacsa można przygotować w następujący sposób: Alkohol amylowy lub izoamylowy 75 ml Aldehyd p- 5 g dimetyloaminobenzoesowy Stężony kwas solny 25 ml Rozpuścić aldehyd p-dimetyloaminobenzoesowy (odczynnik powinien mieć barwę jasnożółtą) w alkoholu, a następnie powoli dodać kwas. Tak przygotowany odczynnik powinien być barwy słomkowożółtej. W celu zapewnienia maksymalnej stabilności należy przechowywać go w chłodziarce, w butelce z ciemnego szkła. Nie należy wykorzystywać odczynników o zabarwieniu ciemnobrązowym. Odczynniki do reakcji Vogesa-Proskauera można przygotować w następujący sposób: 5% roztwór α-naftolu α-naftol 5 g Alkohol etylowy (etanol) absolutny 100 ml 20% roztwór wodorotlenku potasu Woda Wodorotlenek potasu (granulki) Kreatyna 100 ml 20 g 300 mg Odczynniki do reakcji Vogesa-Proskauera, przechowywane w mocno zamkniętych butelkach w temperaturze 2 8 C, zachowują stabilność przez dwa tygodnie od momentu przygotowania. Typy próbek BBL Enterotube II jest biochemicznym systemem identyfikacyjnym i nie nadaje się do bezpośredniej diagnostyki próbek pochodzących od pacjentów. Należy stosować izolowane szczepy pochodzące z odpowiednich podłoży (patrz część Procedura testowa). System BBL Enterotube II może być wykorzystywany do identyfikacji tlenowych, fakultatywnie beztlenowych pałeczek Gram-ujemnych (Enterobacteriaceae), izolowanych z wszystkich rodzajów próbek. Procedura testowa Do wykonania posiewu w systemie BBL Enterotube II można wykorzystać wzrost pochodzący z podłoży MacConkey (MAC), Eosin Methylene Blue (EMB), Salmonella Shigella (SS) lub Hektoen Enteric (HE),jak również z niewybiórczych krwawych podłoży agarowych. Hodowle stosowane do wykonywania posiewów należy prowadzić przez co najmniej 18 godzin, ale generalnie nie IA

5 dłużej niż 48 godzin. Należy upewnić się, że izolowana hodowla poddana identyfikacji w systemie BBL Enterotube II stanowi czystą hodowlę pałeczek Gram-ujemnych. System BBL Enterotube II powinien być stosowany jedynie w przypadku kolonii bakterii oksydazoujemnych. Wykrycie organizmów oksydazododatnich (nie-enterobacteriaceae) wymaga zastosowania identyfikacji przy użyciu systemu BBL Oxi/Ferm Tube II. 1. Przygotować dla izolowanej hodowli jeden arkusz karty kodowej, wpisując nazwisko pacjenta, numer próbki i datę. Uwaga: Decyzję o zastosowaniu bazy danych z lub bez reakcji VP podejmuje użytkownik. W zależności od wybranej opcji wykorzystuje się przednią lub tylną stronę karty kodowej. Jeżeli wybrano bazę danych bez reakcji VP, w przypadku wybranych organizmów konieczne może być przeprowadzenie reakcji VP jako testu uzupełniającego. 2. Wziąć jedną probówkę BBL Enterotube II i wpisać na etykiecie nazwisko pacjenta, numer próbki oraz datę. 3. Zdjąć obie nakrętki. Końcówka ezy znajduje się pod białą nakrętką. Nie podgrzewać ezy nad płomieniem palnika. 4. Bezpośrednio pobrać wyraźnie odgraniczoną kolonię na końcówkę ezy systemu BBL Enterotube (rys. 1). Na końcówce i bocznych częściach ezy powinna znajdować się widoczna ilość inokulum. Nie należy dotykać agaru ezą Jeżeli konieczne jest pobranie dodatkowych kolonii, zastosować dodatkowe systemy BBL Enterotube II. 5. Zaszczepić system BBL Mycotube obracając ezę, a następnie wycofując ją przez wszystkie dwanaście przedziałów i obracając wokół osi długiej (rys. 2). 6. Nie sterylizować ezy. Ponownie wprowadzić ezę do systemu BBL Enterotube II, przeprowadzając ezę przez wszystkie dwanaście przedziałów, aż ogranicznik ezy osiągnie otwór probówki (rys. 3). Końcówka ezy powinna być widoczna w przedziale z cytrynianem. Zgiąć i złamać ezę na poziomie ogranicznika. Część ezy pozostająca w probówce powoduje, że utrzymane są warunki beztlenowe konieczne do pełnej fermentacji glukozy, wytwarzania gazu i dekarboksylacji lizany i ornityny. 7. Używając odłamanej części ezy, wykonać nakłucia w folii pokrywającej otwory ośmiu ostatnich przedziałów (antidolu, laktozy, arabinozy, sorbitolu, reakcji Vogesa-Proskauera, dulcytu/pa, mocznika i cytrynianu), w celu zapewnienia w tych przedziałach wzrostu w warunkach tlenowych (rys. 4). Nałożyć obie zatyczki. 8. Inkubować w temperaturze 35 C lub 37 C przez godzin. Probówka BBL Enterotube II powinna spoczywać na płaskiej powierzchni lub w pozycji pionowej. Podczas inkubacji należy zapewnić cyrkulację powietrza pomiędzy probówkami. 9. Zinterpretować i zanotować wyniki wszystkich reakcji, z wyjątkiem reakcji indolowej i Vogesa-Proskauera (szczegółowe informacje dotyczące odczytywania wyników w systemie BBL Enterotube II znajdują się w części Wyniki). Należy odczytać wyniki pozostałych testów przed wykonaniem testu indolowego i Vogesa-Proskauera, ponieważ odczynniki dodawane w tych testach mogą wpływać na wyniki pozostałych reakcji przeprowadzanych w systemie BBL Enterotube II. Sposób dodania odczynników do reakcji wydzielania indolu i reakcji Vogesa-Proskauera: 1. Probówkę BBL Enterotube II ułożyć poziomo na ławie lub wstawić pionowo do stojaka skierowaną przedziałem glukozy ku dołowi. Za pomocą igły, odłamanej końcówki ezy probówki BBL Enterotube II lub za pomocą rozgrzanej ezy przekłuć lub wytopić otwór o średnicy około 3 4 mm w plastikowej folii nad przedziałami Indol/H 2 S oraz VP. 2. W celu przeprowadzenia testu indolowego należy: Nanieść 3-4 krople odczynnika Kovacsa (nr kat lub przygotowanego w laboratorium; zobacz rozdział Materiały niedostarczone) do przedziału H 2 S/indol. Odczekać, aby nastąpił kontakt odczynnika z powierzchnią podłoża. Pojawianie się czerwonej barwy w dodanym odczynniku w ciągu 10 sekund oznacza dodatni wynik testu. 3. W celu przeprowadzenia testu Vogesa-Proskauera należy: W przypadku wybrania bazy danych z reakcją VP wykonanie testu jest obowiązkowe. Przy stosowaniu bazy danych bez reakcji VP konieczne może się okazać przeprowadzenie tego testu jako testu potwierdzającego. IA

6 Jeżeli stosowane są odczynniki przygotowywane w laboratorium (zobacz rozdział Materiały niedostarczone), dodać dwie krople 20% roztworu wodorotlenku potasu, zawierającego 0,3% kreatyniny oraz trzy krople 5% alfa-naftolu w alkoholu etylowym absolutnym. Pojawienie się w ciągu 20 minut barwy czerwonej wskazuje na dodatni wynik testu. Wyniki należy odczytywać nie później niż po 20 minutach! Przy zastosowaniu odczynników Dropper Reagents, dodać 3 do 5 kropel odczynnika Vogesa- Proskauera A (nr kat ) oraz 1 do 2 kropel odczynnika Vogesa-Proskauera B (nr kat ). Pojawienie się wiśniowej barwy w ciągu 5 do 15 minut wskazuje na dodatni wynik reakcji. Przebarwienie miedziane lub brązowawe należy odczytać jako wynik ujemny. Wyniki odczytywać nie później niż po 15 minutach! Wyniki W celu identyfikacji izolatu należy postępować zgodnie z instrukcjami przedstawionymi poniżej. W tabeli 1. przedstawiono informacje dotyczące wyglądu reakcji dodatnich i ujemnych. Uwaga: W przypadku braku zmiany zabarwienia lub obecności barwy pomarańczowej w przedziale glukozy, a także stwierdzenia (na podstawie zmian zabarwienia) wzrostu w innych przedziałach, uznaje się, że badany organizm nie należy do rodziny Enterobacteriaceae (zobacz część ŚRODKI OSTROŻNOŚCI). 1. Interpretować wyniki wszystkich reakcji po upływie godzin. Wyjąwszy reakcje indolową i VP, wszystkie pozostałe należy odczytywać po kolei, porównując zabarwienia podłoży w probówce po inkubacji z przedstawionymi na kolorowym schemacie, na okładce bloku kart kodów. Ewentualnie porównać z barwą podłoży probówki BBL Enterotube II umieszczonej uprzednio w temperaturze pokojowej, w której nie wykonano posiewu (rysunek 5). Intensywności zabarwienia podłoży oznaczające reakcje dodatnie mogą być równe, większe lub mniejsze, w porównaniu z barwami przedstawionymi na Karcie odczytu reakcji barwnych. Zaznaczyć każdy dodatni wynik testu zakreślając na Karcie interpretacji wyników liczbę znajdującą się pod odpowiednim przedziałem (rysunek 6). 2. Na koniec wykonać testy indolowy i VP. W przypadku wyników dodatnich, zakreślić na przygotowanej karcie odpowiednie liczby. Wykonanie testu VP jest obowiązkowe tylko w przypadku stosowania bazy danych z reakcją VP. 3. Zsumować zakreślone liczby w poszczególnych grupach przedziałów i wpisać wyniki do ramek umieszczonych pod strzałkami (rysunek 6). 4. Zlokalizować pięciocyfrowy numer w Karcie interpretacji wyników (książce kodów) i wyszukać najlepsze rozwiązania w kolumnie zatytułowanej Znaczenie numeru identyfikacyjnego. Upewnić się, czy w użyciu jest właściwa baza danych [(1) Oksydazoujemne bakterie niefermentujące, (2) Enterobacteriaceae metoda bez reakcji VP i (3) Enterobacteriaceae metoda z reakcją VP]. W przykładzie przedstawionym na rys. 6 zidentyfikowano gatunek Klebsiella pneumoniae. Rysunek 1 Rysunek 2 Rysunek 3 IA

7 Rysunek 4 Rysunek 5 (A) (B) Rysunek 6 Karta interpretacji wyników systemu BBL Enterotube II (A = baza danych z reakcją VP; B baza danych bez reakcji VP) IA

8 Tabela 1: Wygląd reakcji dodatnich i ujemnych w systemie BBL Enterotube II REAKCJE UWAGI Odczynniki Wynik ujemny Wynik dodatni Glukoza Wytwarzanie gazu czerwony (do pomarańczo wego) brak uniesienia wosku żółty (do złocistego) uniesienie wosku PRZEDZIAŁ 1 Glukoza (GLU): Końcowymi produktami bakteryjnej fermentacji glukozy są kwas lub kwas i gaz. Zmiana barwy wskaźnika zawartego w podłożu z czerwonej (odczyn zasadowy) na żółtą (odczyn kwaśny) świadczy o zmianie ph, wywołanej wytwarzaniem kwasu. Jakikolwiek stopień zabarwienia żółtego należy interpretować jako dodatni wynik reakcji; zabarwienie pomarańczowe oznacza wynik ujemny. Wytwarzanie gazu (GAS): Dowodem na wytwarzanie gazu jest wyraźne i całkowite oddzielenie pokrywy woskowej od powierzchni podłoża glukozowego, natomiast obecność pęcherzyków w podłożu nie stanowi takiego dowodu. W związku z tym, że występują różnice w ilości gazu wytwarzanego przez różne bakterie, także stopień oddzielenia podłoża i powłoki będzie różny w zależności od badanego szczepu. PRZEDZIAŁ 2 Lizyna żółty purpurowy Dekarboksylaza lizynowa (LYS): Zmiana barwy wskaźnika zawartego w podłożu z bladożółtej (odczyn kwaśny) na purpurową (odczyn zasadowy) świadczy o bakteryjnej dekarboksylacji lizyny, prowadzącej do wytwarzania kadaweryny, zasadowego produktu końcowego. Jeżeli nie zachodzi dekarboksylacja lizyny, podłoże pozostaje żółte. PRZEDZIAŁ 3 Ornityna żółty purpurowy Dekarboksylaza ornityny (ORN): Zmiana barwy wskaźnika zawartego w podłożu z bladożółtej (odczyn kwaśny) na purpurową (odczyn zasadowy) świadczy o dekarboksylacji ornityny, prowadzącej do wytwarzania putrescyny, zasadowego produktu końcowego.. Jeżeli nie zachodzi dekarboksylacja ornityny, podłoże pozostaje żółte. PRZEDZIAŁ 4 H 2S Wytwarzanie indolu Antidol, Laktoza, Arabinoza, Sorbitol Reakcja Vogesa- Proskauera beżowy do jasnoburszt ynowego bezbarwny czerwony (do pomarańczo wego) bezbarwny do jasnoburszt ynowego czarny różowoczer wony żółty (do złocistego) czerwony Wytwarzanie siarkowodoru (H 2S): Siarkowodór jest wytwarzany przez bakterie posiadające zdolność redukowania związków zawierających siarkę, np. peptonów i tiosiarczanu sodu obecnych w podłożu. Siarkowodór wchodzi w reakcję z również obecnymi w podłożu solami żelaza, co prowadzi do powstawania czarnego osadu, zazwyczaj wzdłuż linii posiewu. Niektóre szczepy Providencia mogą wytwarzać na tym podłożu rozlane brązowe zabarwienie, którego nie należy mylić z autentycznym wytwarzaniem H 2S, tj. obecnością czarnego zabarwienia. Uwaga: Jeżeli odczytu wyników w systemie BBL Enterotube II dokonuje się po 24 godzinach inkubacji, może nastąpić blaknięcie czarnego koloru osadu lub powrót do wyglądu odpowiadającego wynikowi ujemnemu. Wytwarzanie indolu (IND): Wytwarzanie indolu na drodze metabolizowania tryptofanu przez bakteryjną tryptofanazę wykrywa się na podstawie pojawiania się różowego lub czerwonego zabarwienia po dodaniu odczynnika indolowego Kovacsa, który wstrzykuje się do odpowiedniego przedziału probówki po godzinach inkubacji (zobacz rozdział Procedura testowa). PRZEDZIAŁY 5,6,7,8 Adonitol (ADON), Laktoza (LAC), Arabinoza (ARAB), Sorbitol (SORB): Zmiana barwy wskaźnika zawartego w podłożu z czerwonej (odczyn zasadowy) na żółtą (odczyn kwaśny) świadczy o bakteryjnej fermentacji adonitolu, laktozy, arabinozy i sorbitolu, prowadzącej do wytwarzania kwaśnych produktów końcowych. Jakikolwiek ślad żółtego zabarwienia należy interpretować jako dodatni wynik reakcji; zabarwienie pomarańczowe oznacza wynik ujemny. PRZEDZIAŁ 9 Reakcja Vogesa-Proskauera (VP): Acetylometylokarbinol (acetoina) jest produktem pośrednim na drodze wytwarzania glikolu butylenowego podczas fermentacji glukozy. Wytwarzanie acetoiny wykrywa się po dodaniu odczynników VP po zakończeniu inkubacji (zobacz rozdział Procedura testowa). Pojawienie się w ciągu 5 do 20 minut czerwonego zabarwienia wskazuje na obecność acetoiny. IA

9 Odczynniki REAKCJE Wynik ujemny Wynik dodatni Dulcyt zielony żółty (do złocistego) PA Mocznik każdy odcień zieleni beżowy do jasnoburszt ynowego czarny- przydymion y -szary jasnoróżow y do różowego IA UWAGI PRZEDZIAŁ 10 Dulcyt (DUL): Zmiana barwy wskaźnika zawartego w podłożu z zielonej (odczyn zasadowy) na żółtą lub bladożółtą (odczyn kwaśny) świadczy o bakteryjnej fermentacji dulcytu, prowadzącej do wytwarzania kwaśnych produktów końcowych. Deaminaza fenyloalaniny (PA): W tym teście wykrywa się wytwarzanie kwasu pirogronowego z deaminowanej fenyloalaniny. Powstały kwas pirogronowy wchodzi w reakcję z obecną w podłożu solą żelaza, powodując powstawanie charakterystycznego czarnego do przydymionego szarego zabarwienia. Podłoże zawiera sól żelaza, dlatego dodanie chlorku żelaza nie jest konieczne. PRZEDZIAŁ 11 Mocznik (UREA): Zmiana barwy wskaźnika zawartego w podłożu z żółtej (odczyn kwaśny) na czerwonopurpurową (odczyn zasadowy) świadczy o hydrolizie mocznika do amoniaku, prowadzonej przez ureazę, enzym obecny u różnych drobnoustrojów. Test ureazowy daje wyniki silnie dodatnie w przypadku gatunków Proteus, które mogą się już uwidaczniać po od 4 do 6 godzinach inkubacji. W przypadku gatunków Klebsiella i Enterobacter daje wyniki słabo dodatnie (zabarwienie jasnoróżowe), po godzinach inkubacji. PRZEDZIAŁ 12 Cytrynian zielony niebieski Cytrynian (CIT): W tym teście wykrywa się organizmy zdolne do wykorzystywania soli sodowej cytrynianu, stanowiącej jedyne źródło węgla. Drobnoustroje zdolne do utylizacji cytrynianu wytwarzają metabolity zasadowe, zmieniające zabarwienie wskaźnika z zielonego (odczyn kwaśny) na intensywnie niebieski (odczyn zasadowy). Jakiekolwiek niebieskie zabarwienie należy traktować jako wynik dodatni. UWAGA: Pewne drobnoustroje nie zawsze powodują idealnie silnie dodatnią zmianę zabarwienia. Jaśniejsze odcienie tego samego koloru podstawowego należy zatem również jako wyniki dodatnie. CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA I OGRANICZENIA DOTYCZĄCE PROCEDURY System BBL Enterotube II jest przede wszystkim przeznaczony do identyfikacji oksydazoujemnych pałeczek Gram-ujemnych i powinien być stosowany wyłącznie do różnicowania pomiędzy członkami rodziny Enterobacteriaceae. System wykorzystuje się również do identyfikacji ograniczonej liczby niefermentujących bakterii oksydazoujemnych. W przypadku tych drobnoustrojów zaleca się jednak zastosowanie systemu BBL Oxi/Ferm Tube II. Charakterystyka wydajnościowa System BBL Enterotube II oceniano w kilku niezależnych badaniach. Zgodnie z opublikowanymi danymi, dokładność testu mieściła się w zakresie od 87 do 99% Odtwarzalność: Całkowitą liczbę dziesięciu gatunków drobnoustrojów testowano podwójnie przez okres trzech dni z zastosowaniem systemów BBL Enterotube II, w trzech niezależnych laboratoriach. W przypadku trzech badanych (30%) drobnoustrojów w każdym laboratorium wykazano identyczne kody biologiczne we wszystkich powtórzeniach. W przypadku pięciu (50%) drobnoustrojów, wykazano niewielką zmienność kodów biologicznych, otrzymując jednak identyczne wyniki identyfikacji w obrębie wszystkich powtórzeń. W przypadku dwóch gatunków (20%) drobnoustrojów, wykazano niewielkie zmienności kodów biologicznych, dające identyczną identyfikację w 2 spośród 18 powtórzeń dla tych organizmów, i prowadzące do otrzymania niezdefiniowanych kodów biologicznych. W obrębie wszystkich powtórzeń zgodność identyfikacji wynosiła 98,9%. Stosując BBL Enterotube II Identification System, wykonano badanie 247 uprzednio zidentyfikowanych szczepów (w tym znanych hodowli ATCC). Dziewięć gatunków drobnoustrojów wykazywało sprzeczności biochemiczne przy pierwszym posiewie. W przypadku ośmiu gatunków, wątpliwości wyjaśniono wykonaniu drugiego posiewu. W pięciu przypadkach wyjaśnione wyniki odpowiadały początkowym wynikom otrzymanym metodą referencyjną. W trzech przypadkach wyniki testu odpowiadały początkowym wynikom otrzymanym z

10 zastosowaniem systemu BBL Enterotube II. W jednym przypadku wynik różnił się od obu wyników początkowych. Sprzeczny wynik testu biochemicznego wyjaśniono stosując trzecią metodę i otrzymując wynik podobny jak w systemie BBL Enterotube II. Wyniki badania zebrano w tabeli 2, zawierającej wykaz rodzajów, gatunków, liczbę badanych szczepów oraz odsetek drobnoustrojów, w przypadku których otrzymano dodatnie wyniki reakcji biochemicznych. Ograniczenia dotyczące procedury System BBL Enterotube II przeznaczony jest dla określonych taksonów bakterii. System nie jest przeznaczony dla taksonów niewymienionych w tabeli 3. Nie należy stosować kodów biologicznych systemu BBL Enterotube II w celu ustalania identyczności fenotypowej izolatów pochodzących z tej samej lub z różnych próbek. Wyniki biochemiczne uzyskane w systemie BBL Enterotube II mogą odbiegać od uzyskanych innymi metodami i opisanych w piśmiennictwie. Potwierdzenie izolacji Salmonella i Shigella spp. wymaga wykonania testów serologicznych. Izolaty tych bakterii należy wysyłać do właściwych laboratoriów referencyjnych, w celu określenia pełnego serotypu i nadzoru epidemiologicznego. Identyfikacji bakterii Gram-ujemnych należy dokonywać z uwzględnieniem dodatkowych czynników, takich jak źródło pochodzenia próbki, wywiad lekarski, morfologia kolonii i w obserwacji pod mikroskopem, wzorzec serologiczny i wzorzec wrażliwości na leki przeciwbakteryjne. Identyfikacja rzadkich izolatów wymaga weryfikacji poprzez powtórzenie procedury identyfikacji lub wykonanie testów dodatkowych. W przypadku niektórych szczepów drobnoustrojów mogą występować nietypowe reakcje biochemiczne stwarzające trudności identyfikacyjne, spowodowane niezwykłymi wymaganiami odżywczymi lub pojawieniem się mutacji. Właściwa identyfikacja niektórych drobnoustrojów wymaga inkubacji trwającej dłużej niż 24 godziny. Chociaż sugerowano ostatnio włącznie Plesiomonas shigelloides do rodziny Enterobacteriaceae, ten gatunek nie został ujęty w bazie danych BBL Enterotube II. 1,2 Dlatego identyfikacji tego organizmu dokonywać należy z wykorzystaniem systemu i bazy danych BBL Oxi/Ferm Tube II. Tabela 2: Wyniki oceny wydajnościowej Drobnoustroje Liczba testowany GLU GAS LYS ORN H2S IND ADO LAC ARA SOR DUL PA URE CIT ACINETOBACTER A. anitratus A. Iwoffii* BURKHOLDERIA B. cepacia CEDECEA C. davisae C. lapagei* CITROBACTER C. amalonaticus C. freundii ESCHERICHIA E. coli GRUPY PAŁECZEK JELITOWYCH Grupa pałeczek jelitowych 60* ENTEROBACTER E. aerogenes E. amnigenus grupa biologiczna 1 E. cloacae IA

11 EWINGELLA E. americana HAFNIA H. alvei* KLEBSIELLA K. oxytoca* K. ozaenae K. pneumoniae KLUYVERA K. ascorbata* MORGANELLA M. morganii PROTEUS P. mirabilis* PROVIDENCIA P. rettgeri* P. stuartii* SALMONELLA Salmonella species Salmonella (arizonae) IIIa SERRATIA S. liquefaciens S. marcescens* S. plymuthica SHIGELLA Shigella grupy serologiczne A,B,C S. sonnei YERSINIA Y. enterocolitica Y. frederiksenii Y. ruckeri * Jeden drobnoustrój z tej grupy pochodził z American Type Culture Collection (ATCC). Tabela 3: Taksony rodziny Enterobacteriaceae ujęte w bazach danych Enterotube II. Buttiauxella agrestis Hafnia alvei Salmonella serotype Pullorum Cedecea davisae Hafnia alvei biogroup 1 Salmonella (arizonae) IIIa Cedecea lapagei Klebsiella pneumoniae Salmonella (diarizonae) IIIb Cedecea neteri Klebsiella oxytoca Serratia marcescens Cedecea species 3 Raoultella (Klebsiella) ornithinolytica Serratia marcescens biogroup 1 (group 47) Cedecea species 5 Klebsiella ozaenae Serratia liquefaciens Citrobacter freundii Klebsiella rhinoscleromatis Serratia rubidaea Citrobacter koseri (diversus) Kluyvera ascorbata Serratia odorifera biogroup 1 Citrobacter amalonaticus Kluyvera cryocrescens Serratia odorifera biogroup 2 Citrobacter farmeri Leclercia adecarboxylata Serratia plymuthica Edwardsiella tarda Leminorella sp. Serratia ficaria Edwardsiella tarda biogroup 1 Moellerella wisconsensis Serratia fonticola Edwardsiella hoshinae Morganella morganii Shigella serogroups A, B, C Edwardsiella ictaluri Morganella morganii biogroup 1 Shigella sonnei Enterobacter aerogenes Obesumbacterium proteus biogroup 2 Tatumella ptyseos Enterobacter asburiae Pantoea agglomerans (Enterobacter Yersinia enterocolitica agglomerans complex) Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Yersinia frederiksenii Enterobacter gergoviae Proteus vulgaris Yersinia intermedia Enterobacter sakazakii Proteus penneri Yersinia kristensenii Enterobacter cancerogenus (taylorae) Proteus myxofaciens Yersinia pestis Enterobacter amnigenus biogroup 1 Providencia rettgeri Yersinia pseudotuberculosis Enterobacter amnigenus biogroup 2 Providencia stuartii Yersinia ruckeri Escherichia coli Providencia alcalifaciens Yokenella regensburgeri Escherichia coli (AD), inactive Providencia rustiganii Enteric group 58 Escherichia fergusonii Salmonella species Enteric group 59 Escherichia hermanii Salmonella serotype Typhi Enteric group 60 Escherichia vulneris Escherichia blattae Ewingella americana Salmonella serotype Choleraesuis Salmonella serotype Paratyphi A Salmonella serotype Gallinarum IA

12 PIŚMIENNICTWO 1. Farmer, J.J. III Enterobacteriaceae: introduction and identification. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2. Abbott, S.L Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Farmer, J.J, III., et al Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21: Ewing, W.H Differentation of Enterobacteriaceae by biochemical reactions, U.S. Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 5. Ewing, W.H Biochemical characterization of Citrobacter freundii and Citrobacter diversus. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 6. Ewing, W.H., and M.A. Fife Enterobacter agglomerans and the Herbicola-Lathyri bacteria. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 7. Darland, G., and B.R. Davis Biochemical and serological characterization of hydrogen sulfide producing variants of Escherichia coli. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 8. Ewing, W.H Isolation and identification of Salmonella and Shigella. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 9. Ewing, W.H., B.R. Davis, and M.A. Five Biochemical characterization of Serratia liquefaciens and Serratia rubidaea. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 10. Brenner, D.J., et al Taxonomic and nomenclature changes in Enterobacteriaceae. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control.:, Oct Ewing, W.H Edwards and Ewing s identification of Enterobacteriaceae. Elsevier Science Publishing Co., New York, N.Y. 12. Holmes, B Comparative evaluation of the Roche Cobas IDA and Enterotube II systems for identifying members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 27: Mastroeni, P. et al Comparison of six systems for the identification of Enterobacteriaceae. G. Batteriol. Virol. Immunol. 76: Chiaradia, V. et al Comparative evaluation of 3 miniaturized systems (API 20E, Enterotube II, Sensititre AP60) commonly used in clinical microbiology laboratories. Quad. Sclavo Diagn. 19: [in Italian]. PAKOWANIE/DOSTĘPNOŚĆ BBL Enterotube II Nr kat probówek DODATKOWE INFORMACJE W celu uzyskania dodatkowych informacji należy się skontaktować z lokalnym przedstawicielem firmy BD. Becton Dickinson GmbH BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: , Fax: Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès Le Pont de Claix/France Tel: Fax: IA

13 BD, BD logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Enterotube and Oxi/Ferm are trademarks of Becton Dickinson GmbH. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection Becton, Dickinson and Company IA