Reproducibility of Fim2 and Fim3 antigens determination in Bordetella pertussis by serotyping method

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: Ocena porównywalności oznaczeń obecności antygenów Fim2 i Fim3 Bordetella pertussis metodą serotypowania Reproducibility of Fim2 and Fim3 antigens determination in Bordetella pertussis by serotyping method Monika Zawadka 1, Bożena Moskała 2, Iwona Łętowska 3, Maciej Polak 1, Ewa Mosiej 1, Katarzyna Krysztopa-Grzybowska 1, Anna Lutyńska 1, * 1 Zakład Badania Surowic i Szczepionek, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie 2 Instytut Biotechnologii Surowic i Szczepionek BIOMED S.A. w Krakowie 3 Narodowy Instytut Leków w Warszawie W pracy poddano ocenie wiarygodność wyników serotypowania izolatów Bordetella pertussis metodą aglutynacji na mikropłytkach z użyciem przeciwciał monoklonalnych otrzymanych w trzech laboratoriach. Brak pełnej zgodności wyników serotypowania może być związany z rodzajem stosowanych podłoży, subiektywnym odczytem wyników, różnicami warunków hodowli lub niewystarczającą swoistością przeciwciał. Dalsza standaryzacja zaleceń serotypowania powinna uwzględnić typ podłoża oraz warunki hodowli, co może wpłynąć na poprawę porównywalności wyników badań międzylaboratoryjnych. Słowa kluczowe: Bordetella pertussis, fimbrie, serotypowanie ABSTRACT Introduction: Serotyping is a commonly used method to characterize the presence of Fimbriae 2 and 3 in Bordetella pertussis strains for epidemiological purposes and optimal choice of strain composition of the pertussis whole-cell vaccine. Monoclonal antisera against Fim2 and Fim3 are recommended to be used for microplate serotyping instead of polyclonal. Reliable evaluation of fimbriae expressed by B. pertussis strains influence interpretation of vaccine-driven strain evolution. Methods: To evaluate the impact of tests conditions on the reproducibility of serotyping, results of serotyping based on a standardized protocol for microplate agglutination with monoclonal antisera performed in three different accredited laboratories were compared. For the study isolates of three vaccine strains of B. pertussis deposited within seed lot system originating from different liofilization lots were compared.

2 172 M. Zawadka i inni Nr 3 Results: Lack of the complete agreement on serotyping results among three labs might relates to the differences of media used, subjective reading, test conditions, and specificity of the reagents. Conclusions: Serotyping results should be interpreted with caution and the type of media and culture conditions used should be precisely recommended after validation studies. Inconsistent results should be confirmed using an alternative technique, eg. ELISA or by reference laboratory. Key words: Bordetella pertussis, fimbriae, serotyping WSTĘP Krztusiec jest chorobą zakaźną, której można zapobiegać drogą szczepień. W krajach, w których zastosowano powszechne szczepienia przeciw krztuścowi z udziałem szczepionek całokomórkowych (wp whole-cell pertussis) w sposób znaczący obniżono liczbę zachorowań oraz zgonów (14). Od połowy lat 80-tych wiele krajów rozwiniętych (obecnie wszystkie kraje Unii Europejskiej poza Polską) do podstawowych szczepień dzieci do lat 2 w miejsce szczepionek całokomórkowych wprowadziło mniej reaktogenne szczepionki bezkomórkowe (ap acellular pertussis), zawierające oczyszczone antygeny pałeczek krztuśca. Pomimo wysokiego poziomu zaszczepienia przeciw krztuścowi, od połowy lat 90- tych liczba zachorowań na krztusiec na świecie zaczęła wzrastać. Pomimo prób wyjaśnienia tego zjawiska oraz opracowania strategii poprawy kontroli zachorowań nadal nie doszło do znaczącej poprawy epidemiologicznych wskaźników zachorowań (3, 5, 24). W Polsce całokomórkowa szczepionka przeciw krztuścowi podawana jest dzieciom w 2, 3-4, 5-6 oraz miesiącu życia. Analizy mocy szczepionki wp potwierdziły jej laboratoryjną skuteczność, która koreluje ze skutecznością oznaczoną w badaniach klinicznych (22). Jednym z podstawowych wymogów jakościowych szczepionki wp jest zapewnienie właściwego doboru szczepów szczepionkowych wytwarzających aglutynogeny (AGG) 2 i 3 (26). B. pertussis wytwarza do ośmiu AGG: 1-7, 13. Aglutynogen 1 jest gatunkowo swoisty dla B. pertussis (1), aglutynogen 7 jest wspólny dla B. pertussis, Bordetella parapertussis i Bordetella bronchiseptica, a sześć pozostałych AGG występuje zmiennie w różnych szczepach (12). Z chorobą u ludzi związane są aglutynogeny 1,2; 1,3; 1,2,3, które u części osób indukują serotypowo swoistą odpowiedź immunologiczną powiązaną z ochroną przed zachorowaniem (12). Ten fakt był przyczyną włączenia danych antygenów do składu niektórych szczepionek bezkomórkowych (18). Wiedza na temat fimbrialnej struktury AGG2 i AGG3 była powodem zmiany ich nazewnictwa na Fim2 i Fim3 (17). Fimbrie są odpowiedzialne za przyleganie bakterii do komórek układu oddechowego i jego kolonizację, a w konsekwencji skuteczne zakażanie (20). Adhezyny Fim2 i Fim3 wspólnie z hemaglutyniną włókienkową (FHA), obok toksyn oraz lipooligosacharydu, zaliczane są do podstawowych czynników zjadliwości B. pertussis (14). Ze względu na różnice wyników serotypowania z użyciem poliklonalnych przeciwciał, Europejska Grupa Ekspertów Eupert zaleca stosowanie procedury serotypowania metodą aglutynacji na mikropłytkach (15).

3 Nr 3 Wiarygodność oznaczania antygenów Fim2 i Fim3 B. pertussis metodą serotypowania 173 W pracy poddano ocenie wiarygodność wyników serotypowania metodą aglutynacji na mikropłytkach otrzymanych w trzech laboratoriach stosujących odmienne podłoża do namnażania szczepów B. pertussis. MATERIAŁ I METODY Szczepy i warunki hodowli. Do badań zastosowano szczepy szczepionkowe B. pertussis otrzymane z Instytutu Biotechnologii Surowic i Szczepionek (IBSS) BIOMED S.A. (629/97m, 629/07m, 606/00m, 186/00m) oraz zdeponowane w latach tych w Zakładzie Badania Surowic i Szczepionek Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny (NIZP-PZH) (186/85, 186/86, 186/97, 629/70, 629/78, 629/83, 629/97a, 629/97b, 629/99, 606/96). Wszystkie szczepy podlegały zasadom przechowywania w systemie banku serii siewnych - w głębokim zamrożeniu (-70 C), zapewniającym ich stosowanie na poziomie nie więcej niż 5 pasaży. Ponadto, w badaniach przeprowadzonych przez IBSS BIOMED S.A. zostały użyte robocze serie siewne nr 186/11m i 606/11m. Hodowlę szczepów prowadzono na podłożach: H3, Bordetella Selective Medium (BSM, Oxoid) oraz Charcoal Agar (CA, Oxoid), o składzie podanym w Tabeli I, w temp. 37 C przez 2-3 dni. Tabela I. Skład stosowanych podłóż do hodowli B. pertussis H3 Bordetella Selective Medium (BSM) Charcoal Agar (CA) Hydrolizat kazeiny Wyciąg mięsny Wyciąg mięsny Dializat drożdżowy Pepton Pepton Skrobia Skrobia Skrobia Węgiel drzewny Węgiel drzewny Węgiel drzewny KH 2 PO 4 NaCl NaCl CuSO 4 5H 2 O Kwas nikotynowy Kwas nikotynowy Agar Agar Agar MgCl 2 6H 2 O Odwłókniona krew końska Krew barania FeSO 4 7H 2 O Cefaleksyna - CaCl 2 6H 2 O - - Chlorowodorek L-Cysteiny - - Serotypowanie. Serotypowanie metodą aglutynacji na mikropłytkach (MA) wykonano w 3 ośrodkach: NIZP-PZH, IBSS BIOMED S.A. oraz Narodowym Instytucie Leków (NIL). W NIZP-PZH doświadczenia przeprowadzono na podłożach bakteriologicznych BSM i H3, w IBSS BIOMED S.A. - na podłożu produkcyjnym H3, a w NIL - na podłożu CA. Badanie stereotypowania wykonano z użyciem monoklonalnych przeciwciał przeciw antygenom fimbrii typu 2 (Fim2; NIBSC, 04/154) i typu 3 (Fim3; NIBSC, 04/156, Wielka Brytania) na mikropłytkach zgodnie z zaleceniami Europejskiej Grupy Ekspertów Eupert (15). Ze szczepów bakteryjnych przygotowano zawiesiny o gęstości 0,5 i 1 przy OD 650 nm. Jako negatywną kontrolę zastosowano roztwór PBS. Kontrolą wewnętrzną testu był szczep Tohama I, a kontrolą dodatnią szczep 606/67. Na płytkę ze stożkowym dnem dołków, dodano w duplikacie po 50 µl odpowiednich gęstości zawiesin bakteryjnych oraz 50 µl przeciwciał przeciw Fim2/Fim3 lub roztworu PBS. Płytkę inkubowano przez noc w 37 C,

4 174 M. Zawadka i inni Nr 3 w wilgotnej komorze. Wynik badania oceniono wizualnie, na podstawie obecności lub nieobecności agregatów bakteryjnych. W IBSS BIOMED S.A., badania serotypowania przeprowadzono również metodą aglutynacji szkiełkowej (AS), przy użyciu surowic przeciw odpowiednim aglutynogenom, stanowiącej procedurę badawczą wchodzącą w skład specyfikacji procesu wytwarzania całokomórkowej szczepionki przeciw krztuścowi. WYNIKI Serotypowanie metodą aglutynacji szkiełkowej oraz aglutynacji na mikropłytkach. W 10/12 oraz 9/12 badanych serii siewnych szczepów uzyskano zgodność wyników serotypowania odpowiednio Fim2 i Fim3 metodami aglutynacji szkiełkowej oraz aglutynacji na mikropłytkach (Tabela II). Tabela II. Zestawienie wyników serotypowania B. pertussis wykonanych w IBSS BIOMED S.A. metodami aglutynacji szkiełkowej oraz aglutynacji na mikropłytkach Nr Fim2 Fim3 AS AM AS AM 186 / /00m /11m / / /97a /97b / / /07m /00m /11m AS aglutynacja szkiełkowa AM aglutynacja na mikropłytkach Serotypowanie metodą aglutynacji na mikropłytkach. Większą zgodność wyników serotypowania uzyskano w przypadku antygenu Fim2 dla 2/9 serii siewnych szczepów szczepionkowych (186/97 i 629/83) uzyskano odmienne wyniki w różnych ośrodkach (Tabela III). W przypadku antygenu Fim3, wyniki zgodne uzyskano w 4 na 9 badanych serii siewnych szczepów. Porównując zgodność wyników w dwóch ośrodkach wykazano, że była ona najwyższa dla badań przeprowadzonych w IBSS BIOMED S.A. oraz NIZP - PZH z zastosowaniem tego samego podłoża H3 (7/8 badanych serii). Niższą porównywalność wyników między ośrodkami wykazały badania przeprowadzone z wykorzystaniem różnych podłoży. Zgodność wyników serotypowania dla całego układu Fim2 + Fim3 w obrębie 9 serii siewnych szczepów we wszystkich ośrodkach wynosiła 30% (Tabela III).

5 Nr 3 Wiarygodność oznaczania antygenów Fim2 i Fim3 B. pertussis metodą serotypowania 175 Tabela III. Zestawienie wyników serotypowania na mikropłytkach AGG Fim2 Fim3 Ośrodek IBSS IBSS NIL NIZP-PZH BIOMED S.A. BIOMED S.A. NIL NIZP-PZH Podłoże H3 CA BSM H3 H3 CA BSM H3 186/ /00m / / /97a /97b / / nb nb 606/00m nb nie badano Wpływ pasażowania izolatów B. pertussis na różnych podłożach na wyniki serotypowania metodą aglutynacji na mikropłytkach. Ożywienie szczepów ze stanu głębokiego zamrożenia i namnożenie przy zastosowaniu odmiennych podłoży, tj. ożywionych na H3 i namnożonych do testu na BSM (H3 BSM) lub ożywionych na BSM i namnożonych do testu na H3 (BSM H3), wykonane w laboratorium NIZP-PZH, nie wpłynęło na otrzymane wyniki serotypowania, z wyjątkiem serii siewnej szczepu 186/97 (Tabela IV). Pozostałe 8 serii siewnych B. pertussis wykazywało zgodność wyników obecności/braku Fim2 i Fim3. Tabela IV. Zestawienie wyników serotypowania szczepów B. pertussis pasażowanych na różnych podłożach Szczep H3 BSM BSM H3 Fim2 Fim3 Fim2 Fim3 186/ /00m / /83 629/97 a /97 b / / /00m H3 BSM szczepy ożywione na podłożu H3 i namnożone na podłożu BSM BSM H3 szczepy ożywione na podłożu BSM i namnożone na podłożu H3

6 176 M. Zawadka i inni Nr 3 DYSKUSJA Oznaczenie obecności aglutynogenów stanowi jedno z podstawowych badań B. pertussis, stosowanych w celu charakterystyki szczepów na potrzeby analiz epidemiologicznych, optymalnego doboru szczepów szczepionkowych, a także kontroli powtarzalności procesu wytwarzania szczepionki przeciw krztuścowi. Większość opublikowanych wyników badań na temat zmienności krążących szczepów B. pertussis, przedstawia dane na temat wytwarzania antygenów Fim2 oraz Fim3 w odniesieniu do aktualnego wzrostu zachorowań na krztusiec, składu szczepów szczepionkowych lub w kontekście poziomu zaszczepienia populacji przeciw krztuścowi (16). Najstarszą metodą serotypowania, choć do dzisiaj bardzo często stosowaną, jest ocena aglutynacji zawiesiny szczepu B. pertussis pod wpływem dodanych przeciwciał przeciw aglutynogenom B. pertussis (6). Badanie polega na identyfikacji serotypu 1 - stanowiącego część gatunkowo-swoistego lipoligosacharydu oraz serotypów 2 i 3, zmiennie występujących wśród różnych szczepów B. pertussis. Do identyfikacji tych antygenów, oprócz konwencjonalnej metody serotypowania wykonywanej na szkiełkach, wykorzystywane są także oznaczenia alternatywne z użyciem mikropłytek lub testu ELISA. Pomimo prób standaryzacji, każda z tych odmian serotypowania narażona jest na pewien stopień braku porównywalności wyników, który wynika z niepełnego obiektywizmu operatora, możliwości przygotowania odpowiednio homogennej zawiesiny szczepu, zmienności ekspresji fimbrii w zależności od warunków badania - szczególnie w zakresie podłoży stosowanych do hodowli szczepów B. pertussis oraz pochodzenia przeciwciał poli- i monoklonalnych. W pracy podjęto próbę porównania wyników serotypowania wykonanych w 3 ośrodkach badawczych posiadających akredytację PCA: NIL - gdzie w przeszłości rutynowo wykonywano oznaczenia aglutynogenów na potrzeby kontroli szczepionkowych roboczych serii siewnych; NIZP-PZH prowadzącym państwową kontrolę jakości produktów leczniczych immunologicznych oraz badania zmienności antygenowej szczepów B. pertussis oraz IBSS BIOMED S.A. - rutynowo stosującym serotypowanie na potrzeby procesu wytwarzania szczepionki przeciw krztuścowi. Do badań zastosowano różne pasaże serii siewnych 3 szczepów szczepionkowych B. pertussis. Oznaczenia obecności aglutynogenów wykonano stosując identyczną procedurę badawczą oraz podłoża stosowane rutynowo do namnażania szczepów B. pertussis. Wyniki serotypowania wykonane w IBSS BIOMED S.A. metodami aglutynacji szkiełkowej oraz aglutynacji na mikropłytkach charakteryzowały się 80% zgodnością. Wyniki badań przeprowadzonych w 3 różnych ośrodkach, przy użyciu tej samej metody charakteryzowały się około 30% zgodnością. Dodatkowo, zastosowanie tego samego podłoża H3 w IBSS BIOMED S.A. oraz NIZP-PZH nie gwarantowało pełnej zgodności wyników serotypowania. Serotypowanie Fim3 generowało więcej wyników nieporównywalnych niż serotypowanie Fim2, co może wynikać z większej, w porównaniu do genu fim2, wrażliwości ekspresji genu fim3 na czynniki środowiskowe tj. podłoże oraz nawet niewielkie zmienne warunków hodowli. Ostatnie badania wskazują, że transkrypcja czynników zjadliwości może być uzależniona od hodowli szczepów w obecności 5% CO 2 (11). Ponadto, można przypuszczać, że stosowane w badaniach przeciwciała monoklonalne przeciw-fim3 mogą charakteryzować się niedostateczną swoistością, utrudniając precyzyjną ocenę wyniku jako dodatni czy ujemny. O wpływie zastosowanych podłoży na wyniki serotypowania świadczą uzyskane przez nas wyniki. Dane z piśmiennictwa wskazują, że

7 Nr 3 Wiarygodność oznaczania antygenów Fim2 i Fim3 B. pertussis metodą serotypowania 177 alternatywna metoda serotypowania z wykorzystaniem metody ELISA charakteryzuje się podobną swoistością do aglutynacji wykonywanej na mikropłytkach, przy czym do jej zalet zalicza się niższe zużycie odczynników oraz możliwość jednoczasowego wykonania badania z udziałem większej liczby szczepów (21). Ekspresja fimbrii nie jest stałą właściwością szczepu B. pertussis, ponieważ może, choć z niską częstością, zmieniać się, np. pod wpływem pasażowania (27). Pomimo, że w laboratoriach uczestniczących w przedstawianych badaniach doświadczenia wykonywano z zastosowaniem szczepów identycznego pasażu, możliwe jest, że w przypadku szczepu 186/97, dla którego osiągnięto najwięcej wyników nieporównywalnych, mogło dojść do spontanicznej zmiany fenotypu Fim2 + na Fim2, zidentyfikowanej w teście aglutynacji na mikropłytkach w IBSS BIOMED S.A. Jest także prawdopodobne, że w/w. izolat, zdeponowany i zliofilizowany wyjściowo w 1997 r. w NIZP-PZH, był poddany przed liofilizacją większej i niezarchiwizowanej liczbie pasaży. Jego niestabilność ekspresji fimbrii została także zidentyfikowana w NIZP-PZH, podczas stosowania różnych podłoży do ożywienia i namnażania. O poziomie ekspresji większości czynników zjadliwości B. pertussis, w tym fimbrii, decyduje aktywność operonu bvg, indukowana określonymi warunkami środowiskowymi, których fluktuacje mogą decydować o różnicach fenotypowych. Poza tym, ekspresja fimbrii jest dodatkowo uzależniona od zmienności fazowej, polegającej na przełączaniu wysokiej ekspresji na niską (oraz odwrotnie) po delecji lub insercji pojedynczego nukleotydu C w obszarze krótkiej sekwencji powtórzonej promotora (21). Ponadto, ostatnie wyniki badań sugerują, że regulacja wytwarzania Fim2 i Fim3 może być w pewnych określonych warunkach jeszcze bardziej odmienna przez aktywowanie ekspresji fim2 ale nie fim3 przez operon bvg (4). Pomimo standaryzacji wytwarzania przeciwciał, część dostępnych przeciwciał monoklonalnych, może wykazywać pewien stopień krzyżowych reakcji z innymi gatunkami Bordetella lub innymi typami serologicznymi B. pertussis (13) lub epitopami fimbrii, które nie mają charakteru ochronnego (19). Dostępne wyniki badań wskazują, że w zależności od źródła pochodzenia, przeciwciała poliklonalne czy monoklonalne mogą być przyczyną nieporównywalnych wyników (7). Brak porównywalności wyników serotypowania, w tym uzyskiwanych metodą ELISA, wiązano także ze stosowaniem różnych podłoży do namnażania badanych szczepów. Wyniki naszych badań mogą potwierdzać spostrzeżenia Tsang i wsp. (21) o zwiększonej ekspresji fim3 i obniżonej ekspresji fim2 z zastosowaniem podłoża CA. Rzetelna ocena serotypu B. pertussis stanowi nadal istotny element charakterystyki szczepów szczepionkowych a także szczepów krążących w populacji w odniesieniu do ich adaptacji i ewolucji (9, 23). Większość opublikowanych badań wskazuje, że w populacjach nieszczepionych dominują szczepy Fim2, które wraz ze stosowaniem szczepień wp, zawierających szczepy o fenotypie Fim2,3, zostały sukcesywnie wyparte przez szczepy Fim3 (2, 8, 25). Nie mniej jednak ta korelacja nie jest stuprocentowa ponieważ, w Finlandii pomimo długiego okresu stosowania szczepionki wytwarzanej z udziałem szczepów szczepionkowych o fenotypie Fim2, w populacji nieustannie krążyły szczepy Fim2. Pojawienie się i wzrost częstości szczepów o fenotypie Fim3 w tym kraju, nastąpił dopiero wraz z epidemią krztuśca, która rozpoczęła się w 1999 (10). Badania Heikkinen i wsp. (10) wskazują, że szczepy o fenotypie oznaczonym in vitro jako Fim2, mogą in vivo przyjmować fenotyp Fim2,3. Dalsze badania określające warunki in vivo i in vitro, w jakich dochodzi do zmiennej ekspresji genów fim2 i fim3 mogą pozwolić na ocenę roli adaptacji szczepów w zakresie fimbrii.

8 178 M. Zawadka i inni Nr 3 Rutynowe stosowanie serotypowania wymaga ścisłej optymalizacji warunków badania oraz opracowania rekomendacji odnośnie podłoży oraz warunków hodowli zalecanych do przygotowania zawiesin szczepów w celu wyeliminowania możliwych różnic wyników istotnych dla wiarygodnej oceny fenotypów B. pertussis. WNIOSKI Europejskie zalecenia odnośnie wykonania procedury serotypowania szczepów B. pertussis na mikropłytkach z użyciem przeciwciał monoklonalnych powinny zostać uszczegółowione w zakresie podłoży oraz warunków hodowli. Wyniki nieporównywalne powinny zostać zweryfikowane z zastosowaniem innej techniki serotypowania, np. ELISA lub w europejskim laboratorium referencyjnym. PIŚMIENNICTWO 1. Ashworth LA, Robinson A, Funnell S i inni. Agglutinogens and fimbriae of Bordetella pertussis. Tokai J Exp Clin Med 1988; 13: Borisova O, Kombarova SY, Zakharova NS i inni. Antigenic Divergence between Bordetella pertussis Clinical Isolates from Moscow, Russia, and Vaccine Strains. Clin Vaccine Immunol 2007; 14: Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Pertussis epidemic--washington, MMWR 2012; 61: Cummings CA, Bootsma HJ, Relman DA, Miller JF. Species- and strain-specific control of a complex, flexible regulon by Bordetella BvgAS. J Bacteriol 2006; 188: De Greeff SC, de Melker HE, van Gageldonk PGM i inni. Seroprevalence of pertussis in The Netherlands: evidence for increased circulation of Bordetella pertussis. PloS One 2010; 5: e Eldering G, Hornbeck C, Baker J. Serological study of Bordetella pertussis and related species. J Bacteriol 1957; 74: Guiso N, von Konig CH, Becker C, Hallander H. Fimbrial typing of Bordetella pertussis isolates: agglutination with polyclonal and monoclonal antisera. J Clin Microbiol 2001; 39: Hallander HO, Advani A, Donnelly D i inni. Shifts of Bordetella pertussis variants in Sweden from 1970 to 2003, during three periods marked by different vaccination programs. J Clin Microbiol 2005; 43: Heikkinen E, Kallonen T, Saarinen L i inni. Comparative genomics of Bordetella pertussis reveals progressive gene loss in Finnish strains. PloS One 2007; 2: e Heikkinen E, Xing DK, Olander R-M i inni. Bordetella pertussis isolates in Finland: serotype and fimbrial expression. BMC Microbiol 2008; 8: Hester SE, Lui M, Nicholson T i inni. Identification of a CO2 Responsive Regulon in Bordetella. PLoS ONE 2012; 7: e Kerr JR, Matthews RC. Bordetella pertussis infection: pathogenesis, diagnosis, management, and the role of protective immunity. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19: Li ZM, Brennan MJ, David JL, Carter PH i inni. Comparison of type 2 and type 6 fimbriae of Bordetella pertussis by using agglutinating monoclonal antibodies. Infect Immun 1988; 56: Mattoo S, Cherry JD. Molecular pathogenesis, epidemiology, and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetella pertussis and other Bordetella subspecies. Clin Microbiol Rev 2005; 18:

9 Nr 3 Wiarygodność oznaczania antygenów Fim2 i Fim3 B. pertussis metodą serotypowania Mooi FR, Hallander H, Wirsing von König CH i inni. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: recommendations for a standard methodology. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19: Mooi FR. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen. Infect Genet Evol 2010; 10: Mooi FR. Genes for the filamentous hemagglutinin and fimbriae of Bordetella pertussis: colocation, coregulation and cooperation? Mol. Genet. Bact. Pathog., Massachusetts Avenue: American Society for Microbiology; 1994, Olin P, Rasmussen F, Gustafsson L i inni. Randomised controlled trial of two-component, three- -component, and five-component acellular pertussis vaccines compared with whole-cell pertussis vaccine. Ad Hoc Group for the Study of Pertussis Vaccines. Lancet 1997; 350: Robinson A, Ashworth LA, Irons LI. Serotyping Bordetella pertussis strains. Vaccine 1989; 7: Smith AM, Guzmán CA, Walker MJ. The virulence factors of Bordetella pertussis: a matter of control. FEMS Microbiol Rev 2001; 25: Tsang RSW, Sill ML, Advani A i inni. Use of monoclonal antibodies to serotype Bordetella pertussis isolates: comparison of results obtained by indirect whole-cell enzyme-linked immunosorbent assay and bacterial microagglutination methods. J Clin Microbiol 2005; 43: Vaccination against whooping-cough; relation between protection in children and results of laboratory tests; a report to the Whooping-cough Immunization Committee of the Medical Research Council and to the medical officers of health for Cardiff, Leeds, Leyton, Manchester, Middlesex, Oxford, Poole, Tottenham, Walthamstow, and Wembley. Br Med J 1956; 2: Van Amersfoorth SCM, Schouls LM, van der Heide HGJ i inni. Analysis of Bordetella pertussis populations in European countries with different vaccination policies. J Clin Microbiol 2005; 43: Van Hoek AJ, Campbell H, Amirthalingam G i inni. The number of deaths among infants under one year of age in England with pertussis: results of a capture/recapture analysis for the period 2001 to Euro Surveill 2013; Van Loo IHM, Heuvelman KJ, King AJ, Mooi FR. Multilocus sequence typing of Bordetella pertussis based on surface protein genes. J Clin Microbiol 2002; 40: WHO. Requirements for diphteria, tetanus, and pertussis and combined vaccines. Technical Report Series no ; Willems R, Paul A, van der Heide HG i inni. Fimbrial phase variation in Bordetella pertussis: a novel mechanism for transcriptional regulation. EMBO J 1990; 9: Otrzymano: 27 VIII 2013 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Badania Surowic i Szczepionek, NIZP-PZH, tel , fax , alutynska@pzh.gov.pl

10