WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) O ZRÓNICOWANYM SKŁADZIE OLIGOMERYCZNYM Z WYKORZYSTANIEM ENZYMATYCZNEJ BIOKONWERSJI SACHAROZY

Transkrypt

1 YWNO. Nauka. Technologia. Jako, 25, 2 (43), 5 22 BOGUSŁAW KRÓL, ROBERT KLEWICKI WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) O ZRÓNICOWANYM SKŁADZIE OLIGOMERYCZNYM Z WYKORZYSTANIEM ENZYMATYCZNEJ BIOKONWERSJI SACHAROZY S t r e s z c z e n i e Opisano warunki prowadzenia biokonwersji sacharozy z uyciem komercyjnych preparatów enzymatycznych Fructozyme i Novoferm, zawierajcych fruktozylotransferaz (FT) do wytwarzania trzech typów syropów FOS i dwóch proszkowych preparatów o zawartoci fruktanów odpowiednio 5 6% s.s. i 9% s.s. Wykazano, e przy aktywnoci FT 1 2,5 U/g sacharozy proces transglikozylacji reszty fruktozy przebiega w trzech fazach. W pierwszej blisko 8% utworzonych oligomerów stanowi kestoza, w drugiej kestoza ulega transglikozylacji z utworzeniem ponad 5% udziału nystozy w sumie FOS, a w trzeciej ustala si równowag pomidzy kestoz, nystoz i fruktozylonystoz w proporcji 2 : 4 : 3. Stwierdzono, e roztwory bogate w nystoz, po usuniciu glukozy na drodze enzymatycznego utleniania mog by wysuszone metod rozpyłow w warunkach otrzymywania mleka w proszku. Wykazano, e z syropów nystozowych o zawartoci s.s. powyej 72% (m/m) nystoza krystalizuje z niewielk domieszk kestozy w postaci niehigroskopijnej, drobnokrystalicznej substancji. Słowa kluczowe: fruktooligosacharydy, fruktozydaza, fruktozylotransferaza, transglikozylacja. Wstp Fruktooligosacharydy (FOS) s krótkołacuchowymi fruktanami zbudowanymi z 2 1 reszt fruktofuranozowych połczonych wizaniem β(2 1). FOS wystpuj jako oligosacharydy homogenne, złoone wyłcznie z fruktozy, oraz jako oligosacharydy heterogenne zbudowane z jednej czsteczki sacharozy i 1 8 reszt fruktozy przyłczonych wg wzoru: 1 F (1 β D-fruktofuranozylo) n sacharoza, w którym n = 1 8 [14, 21]. W przyrodzie oraz w produktach otrzymanych w wyniku biokonwersji fruktanów lub sacharozy wystpuj mieszaniny fruktooligosacharydów o stopniu polimeryzacji (DP) od 3 do 7 [2, 21]. Do fruktooligosacharydów zalicza si Dr hab. B. Król, prof. PŁ, dr in. R. Klewicki, Instytut Chemicznej Technologii ywnoci, Politechnika Łódzka, ul. Stefanowskiego 4/ Łód, tel , fax

2 6 Bogusław Król, Robert Klewicki równie inulobioz o DP = 2, której transport w przewodzie pokarmowym jest podobny do oligomerów o DP 3 [1]. FOS, obok inuliny i sacharozy, jako wglowodany zapasowe wystpuj w wielu rolinach. Powstawanie FOS w rolinach akumulujcych inulin jest zwizane z działaniem dwóch enzymów: sacharozo-sacharozo 1-fruktozylotransferazy E.C i fruktano:fruktano 1-fruktozylotransferazy E.C [2, 22]. Tworzenie FOS z sacharozy odbywa si przy udziale enzymów transfruktozylacyjnych, a w szczególnoci fruktozylotransferazy E.C [13] oraz β-d-fruktofuranozydazy E.C z niektórych ródeł biologicznych w cile okrelonym ph [19]. Fruktozylotransferazy wystpuj w rónych anatomicznych czciach rolin z rodziny Compositae (Asteraceae) i Liliaceae, takich jak: cykoria, mniszek, cebula, czosnek [34]. Aktywno transfruktozylacyjn wykazuje równie wiele mikroorganizmów np.: Aspergillus niger [12], Aspergillus japonicus, Aureobasidium pullulans [15], Pichia pastoris [7, 13]. Mechanizmy transglikozylacji sacharozy i fruktanów oraz innych sacharydów s zrónicowane i zale od pochodzenia enzymu, ph, stenia substratu itp. Proces transglikozylacji sacharozy przy udziale fruktozylotransferazy z pleni Aspergillus niger [34] i z bakterii Bacillus macerans EG 6 [5] przebiega zgodnie ze schematem: GF n + GF n GF n-1 + GF n +1 dla n < 4, a w czci według równania GF n + GF GF n+1 +G. W zwizku z tym głównymi produktami transglikozylacji sacharozy s: 1- kestoza, nystoza i fruktozylonystoza [5]. Udział wymienionych sacharydów w mieszaninie reakcyjnej zaley od pochodzenia enzymu i jego aktywnoci, wystpowania innych enzymów w rodowisku oraz ph, dawki i czasu działania. Dziki postpom enzymologii jest moliwe wytwarzanie fruktozylotransferaz o duej aktywnoci w postaci immobilizowanej i preparatów ciekłych do stosowania w procesach biokonwersji sacharozy [11, 13, 28, 29, 3, 34]. Maksymalny udział FOS w mieszaninie po biokonwersji nie przekracza 6 62% w przeliczeniu na s.s. roztworu. Reszt do 1% stanowi: sacharoza, glukoza i fruktoza. Wystpowanie ww. cukrów w mieszaninie FOS nie stanowi istotnego ograniczenia w zastosowaniu syropów oligofruktozy jako składnika ywnoci i ciekłych suplementów diet [34]. Do otrzymania koncentratów FOS pozbawionych sacharozy i cukrów prostych oraz wystpujcych w postaci proszków lub granulatów stosuje si zwykle procesy niskocinieniowej chromatografii przemysłowej [4, 29, 33, 34]. Po chromatograficznym rozdzieleniu i dehydratacji otrzymuje si preparaty proszkowe typu Actilight 95, Meioligo i Nutraflora, które zawieraj 95 ± 2% FOS, w tym stosunek kestozy do nystozy i F-nystozy wynosi zwykle: 4 : 5 : 1. Preparaty FOS w postaci proszków s dogodniejsze do stosowania ni syropy. Preparaty proszkowe mog mie zastosowanie jako rodki niskokaloryczne i wypełniacze do intensywnych rodków słodzcych [8, 32]. Znane s równie złoone preparaty FOS w postaci toników [6] i granulatów [32]. Wiele dowiadcze dotyczcych biologicznej oceny FOS (w szczególnoci wpływu na funkcje jelita grubego) wskazuje na potrzeb optymalnego doboru składu oligomerycznego

3 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS)... 7 fruktooligosacharydów [4]. FOS maj dobrze udokumentowane właciwoci prebiotyczne [2, 25, 26, 27]. Celem bada było opracowanie warunków wytwarzania koncentratów FOS o podanym i przewidywalnym składzie oligomerycznym z sukcesywnym zastosowaniem procesów: transglikozylacji reszty fruktozylowej na sacharoz i oligomery DP 3, enzymatycznego utleniania glukozy, krystalizacji soli kwasu glukonowego oraz odsalania roztworu macierzystego. Materiał i metody bada Do procesu transglikozylacji uyto dwóch handlowych preparatów z Aspergillus niger, z których jeden jest przeznaczony do produkcji syropów fruktozylowych z inuliny, a drugi jest stosowany do przemysłowej produkcji pitnych soków owocowych. Obydwa preparaty zawierały mieszanin fruktozylotransferazy (FT) i β- fruktofuranozydazy (FD) w rónych proporcjach. Do utleniania glukozy zastosowano handlowy preparat zawierajcy mieszanin oksydazy glukozowej EC i katalazy EC W badaniach uyto nastpujcych substancji i preparatów enzymatycznych: Cukier biały kategorii I wg PN [24] w zbuforowanych wodnych roztworach o steniu 2 7% (m/m) i ustalonym ph w zakresie 4,5 7,5. Preparaty enzymatyczne: Fructozyme i Novoferm firmy Novo Nordisk A/S oraz Gammazym 9L o aktywnoci: oksydaza 9 U/ml, katalaza 24 U/ml. Sole do sporzdzania buforów: fosforan dipotasowy cz.d.a firmy POCH i mleczan sodu firmy Polfarmex S.A. Substancje pomocnicze do enzymatycznego utleniania glukozy i odsalania: nadtlenek wodoru wg PN [23], wglan wapnia wg FP IV, wodorotlenek sodowy i 35% kwas solny cz.d.a. firmy POCh S.A. Eluenty do HPLC: woda i acetonitryl o czystoci chromatograficznej firmy T. Baker. W kadym zastosowanym preparacie enzymatycznym oznaczano aktywno fruktozylotransferazy (FT) i fruktofuranozydazy (FD) w ustalonych warunkach biokonwersji. W celu oznaczenia aktywnoci FT i FD w probówkach ze szlifem poj. 15 ml umieszczano dwukrotnie po 1 µl Fructozyme, 1 µl Novoferm lub Gammazym 9L, nastpnie do kadej probówki dodawano po 1 ml 5% roztworu sacharozy w,5 mol/l roztworu mleczanu sodu o ph 6,8. Równolegle wykonano próbki odniesienia bez dodatku enzymu. Roztwory badane wstawiano do łani wodnej o temp. 6 o C i utrzymywano przez 18 godz. Po tym czasie pobierano próbki roztworów i oznaczano skład mieszanin sacharydów metod HPLC z uyciem kolumny Bio-Rad HPX87C i detektora RI, przy elucji wod,5 ml/min w temp. 85 o C. Rozdział chromatograficzny rejestrowano z uyciem programu Knauer Eurochrom 2. Alternatywnie stosowano kolumn Asahipak NH2P-54E z detektorem RI, przy elucji 65% wodnym roztworem acetonitrylu z prdkoci,8 ml/min w temp. 2 o C [16].

4 8 Bogusław Król, Robert Klewicki Jedna jednostka aktywnoci FT (U T ) wyraa liczb µmoli fruktozy przeniesionej w 5% roztworze sacharozy o ph 6,8 i temp. 57 ± 1 o C z utworzeniem kestozy i oligomerów DP 4 w czasie 1 min z udziałem 1 ml ciekłego preparatu. Jedna jednostka aktywnoci FD (U F ) wyraa liczb µmoli fruktozy uwolnionej w 5% roztworze sacharozy o temp. 57 ± 1 o C i ph 6,8, w czasie 1 min z udziałem 1 ml preparatu. W celu okrelenia korzystnych warunków procesu transglikozylacji wykonano dowiadczenia z uyciem roztworów sacharozy o steniu 2 73% (m/m), w zakresie ph 4,5 7,5. Wykonano równie dowiadczenia z mieszanin fruktozy i sacharozy o udziale molowym odpowiednio 1, 67, 44, 34, 18% w roztworze o steniu 69% (m/m) i ph 7,2. Podwójne próby badanych roztworów utrzymywano w temp. 57 ± 1 o C w czasie od 2 do 3 godz. w zalenoci od dawek enzymu. Dowiadczenia prowadzono metod periodyczn. Do wysterylizowanych flakonów poj. 165 ml odmierzano po 15 ml roztworu sacharozy o ustalonym steniu oraz ph i wprowadzano obliczon objto enzymu, zawierajc FT w iloci 1, 2,5 U T /1 g sacharozy, stosownie do jego aktywnoci. Nastpnie pojemniki z próbkami umieszczano w termostacie w temp. 57 ± 1 o C. W odstpie 4, 8 lub 24 godz. pobierano podwójne próbki do analizy metod HPLC z detekcj RI, z uyciem kolumny Aminex HPX87C i Shodex Asahipak NH2. Wyniki podane w tabelach i na wykresach s redni z dwóch prób równoległych. W wybranych warunkach procesu transglikozylacji wykonano dowiadczenia z uyciem wysterylizowanych pojemników zawierajcych od 1 do 3 l roztworu. Roztwory zawierajce wybrane mieszaniny oligomerów FOS i glukozy poddawano działaniu nadtlenku wodoru w obecnoci oksydazy glukozowej i wglanu wapnia w celu utlenienia glukozy do soli kwasu glukonowego. Proces utleniania glukozy do glukonianu wapnia prowadzono według wczeniej opisanego sposobu [17]. Roztwory glukonianu wapnia poddawano krystalizacji, po czym oddzielony roztwór macierzysty odsalano z uyciem kolumny kationitowej w postaci wodorowej i kolumny anionitowej w postaci wodorotlenowej. Roztwór po odsoleniu poddawano zataniu do zawartoci suchej masy 7% (m/m) w przypadku koncentratów w postaci syropu. W celu otrzymania preparatów FOS w postaci proszków, roztwory po odsoleniu zatano do zawartoci 4% s.s. i suszono rozpyłowo w warunkach suszenia mleka do postaci proszku z uyciem wiertechnicznej suszarni rozpyłowej Niro Atomizer. Spektroskopia masowa (oznaczanie dokładnej wartoci m/z) syntetyzowanych oligosacharydów została wykonana w Pracowni Spektrometrii Mas Centrum Bada Molekularnych i Makromolekularnych PAN w Łodzi przy zastosowaniu spektrometru mas Finnigan MAT 95 (Finnigan MAT GmbH, Brema, Niemcy). Parametry spektrometru mas w trakcie pomiaru: Technika jonizacji LSI (Liquid Secondary-Ion) odpowiednik FAB Temperatura ródła jonów ~ 4 o C Energia jonów cezu Cs + 13 kev

5 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS)... 9 Napicie przyspieszajce 4,8 kv Rozdzielczo spektrometru w trakcie pomiaru minimum 1. Pomiarów dokonywano przy zastosowaniu wzorca wewntrznego glikolu etylenowego, który stanowił jednoczenie matryc. Warto redni uzyskiwano z 2 zmierzonych wartoci m/z. Wyniki i dyskusja W tab. 1. przedstawiono aktywno fruktozylotransferazy (FT) i β-fruktozydazy (FD) w preparatach uytych do dowiadczenia. Zwraca uwag znaczco duy udział FD w sumie aktywnoci w przypadku preparatu Fructozyme. T a b e l a 1 Aktywno fruktozylotransferazy (FT) i β-fruktozydazy (FD) preparatów handlowych uytych do biokonwersji sacharozy i utleniania glukozy do kwasu glukonowego. Activity of fructosyltransferase (FT) and β-fructosidase (FD) in commercial preparations used for the bioconversion of saccharose and for the oxidation of glucose to gluconic acid. Aktywno TF Aktywno FD Preparat Activity TF Activity FD Preparation U T /ml U F /ml Fructozyme Novoferm Gammazym Objanienia: / Explanatory notes: U T i U F jednostki aktywnoci enzymów wyznaczone w ustalonych warunkach, opisanych w rozdziale Materiał i metody bada. U T, U F activity units determined under the fixed standard conditions (as described in the Chapter: Materiały i metody bada / Materials and Methods of Investigation ). Na rys. 1. przedstawiono zmian zawartoci utworzonych FOS w roztworze o ph 7,2 i steniu od 5 do 73% (m/m) w zalenoci od czasu biokonwersji w obecnoci Fructozyme w dawce,4 ml/l roztworu. Z przebiegu krzywych wynika, e ilo powstajcych FOS była proporcjonalna do czasu reakcji w pierwszych omiu godzinach, po czym nastpowało wyrane spowolnienie szybkoci syntezy fruktooligosacharydów. Zawarto FOS nie przekroczyła 1 g/l w roztworze o pocztkowym 5% steniu sacharozy. W roztworze o pocztkowym ponad 6% steniu sacharozy, a zwłaszcza bliskim 7% (m/m), zawarto utworzonych FOS osignła warto około 38 g/l i stanowiła około 4% udziału s.s. Zmian składu jakociowego i ilociowego mieszaniny kilku sacharydów w czasie reakcji przedstawiono w tab. 2. Zwraca uwag to, e dominujcym fruktooligosacharydem była kestoza stanowica około 8 9% składu FOS.

6 1 Bogusław Król, Robert Klewicki FOS [g/l] Czas [ godz] / Time [h] 5 Bx 6 Bx 65 Bx 7 Bx 73 Bx Rys. 1. Zmiana zawartoci utworzonych FOS w roztworze o ph 7,2 i steniu 5 73% (m/m) w obecnoci Fructozyme w dawce,4 ml/l zalenoci od czasu biokonwersji. Fig. 1. Change in the contents of FOS produced in the solution, its ph = 7.2 and its concentration rate = 5 73% (m/m) in the presence of Fructozyme the applied amount of which was.4 ml/l. Na rys. 2. zilustrowano zmian molowego stenia kestozy i fruktozy w roztworach o pocztkowej zawartoci s.s. 5, 65 i 73% (m/m) w zalenoci od czasu reakcji. Przebieg krzywej badanego roztworu o steniu s.s. 5% (m/m) wskazuje, e szybko transglikozylacji była wiksza ni szybko hydrolizy sacharydów tylko do około 1. godz. reakcji. Póniej proces hydrolizy stał si dominujcy, przez to udział FOS w hydrolizacie (tab. 2.) był niski, a ponadto udział fruktozy wyranie zwikszał si z upływem czasu reakcji. W nasyconych i przesyconych roztworach sacharozy stenie fruktozy nie przekraczało,3 mol/l, a stenie kestozy wzrosło do,6 mol/l. Udział kestozy w sumie utworzonych FOS przekroczył 8% (tab. 1.), co wskazuje, e dominował proces transglikozylacji według mechanizmu GF + GF = GF 2 + G [5], a nadto konkurencyjny proces hydrolizy β-fruktanów, z udziałem β-fruktozydazy zwikszył w rodowisku stenie glukozy i fruktozy i prowadził do hamowania syntezy kestozy i powstawania nastpnych oligomerów. Na rys. 3. przedstawiono krzywe charakteryzujce zmiany zawartoci sumy FOS w roztworze sacharozy o steniu 69% (m/m) o rónym ph w zakresie 5,8 7,3, w obecnoci Fructozyme w dawce,4 ml/l w zalenoci od czasu reakcji. Przebieg wykresów wskazuje, e ph bliskie 7 miało korzystny wpływ na tworzenie FOS w obecnoci enzymów zawartych w preparacie Fructozyme. W przypadku roztworów o ph 6,9 i 7,3 otrzymano mieszanin kestozy i nystozy o zawartoci do 4 g/l z roztworu o pocztkowym 69% (m/m) steniu.

7 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) K 65 K 73 K 5 F 65 F 73 F Stenie [mol/l] / Concentration [mole/l],7,6,5,4,3,2, Czas [godz] / Time [h] Rys. 2. Fig. 2. Zmiany stenia kestozy i fruktozy w roztworach o steniu 5, 65, 73% (m/m) i ph = 7,2 w obecnoci Fructozyme w dawce,4 ml/l w zalenoci od czasu biokonwersji. Changes in the kestoze and fructose concentration rates in the 5, 65, 73% (m/m) solutions having ph = 7.2, in the presence of Fructozyme (the applied amount of which is.4 ml/l) depending on the duration of the bioconversion reaction. T a b e l a 2 Zmiana udziału sacharydów w s.s. roztworu o steniu 5 73 % (m/m) w zalenoci od czasu biokonwersji w obecnoci preparatu Fructozyme w dawce,4 ml/1l roztworu. Changes in the FOS content in dry matter contained in the hydrolysate solution, its concentration being 5 73%, depending on the time of bioconversion proceeding in the presence of the preparation Fructozyme applied in the amount of.4 ml/l solutions. Stenie sacharozy Concentration of saccharose [%] Zawarto [% s.s.] / Content [% d.m.] Kestoza / Kestose FOS DP4 Fruktoza / Fructose Czas [godz.] / Time [h] ,5 12, 12,2 12,2 1,5,4,8,8,8 1, 2, 4,3 6,9 9,7 1,9 6 16, 23,5 29,8 33,8 34,3,8 3, 5, 6,9 8,3 1,8 3,7 4,4 4,8 5, , 29, 33, 35,3 35,5,8 3,4 5,2 7,2 9,9 1,4 2,7 4,5 5,2 6,2 7 11,5 19,8 25,1 31,7 36,2,5 2, 3, 3,9 5,5 1,2 2,3 2,9 3,7 4,5 73 1,6 16,4 2,3 24,4 27,3,3,9 1,4 1,8 2,8 1,1 2, 2,5 3,2 4,

8 12 Bogusław Król, Robert Klewicki Stenie [g/l]/concentration [g/l] Rys. 3. Fig Czas [ godz] / Time [h] ph 5,8 ph 6,3 ph 6,9 ph 7,3 Zmiana zawartoci sumy FOS w roztworze sacharozy o steniu 69% (m/m) i ph w zakresie 5,8 7,3 w obecnoci Fructozyme w dawce,4 ml/l w zalenoci od czasu reakcji. A reaction-time depending change in the FOS sum in a 69% (m/m) saccharose with a ph value from 5.8 to 7.3 in the presence of Fructozym added in an amount of.4 ml/l fructose. Na podstawie rys. 4. mona stwierdzi rónic w skutkach działania fruktofuranozydazy w roztworach sacharozy o wartociach ph 5,8 i 7,3. Dowiadczenie powysze wykazuje, e β-fruktofuranozydaza z Aspergillus niger zawarta w preparacie Fructozyme zmienia aktywno, podobnie jak fruktofuranozydaza z Aspergillus oryzae [19]. W zwizku z powyszym preparat Fructozyme w cile okrelonych warunkach biokonwersji jest przydatny do otrzymywania syropów zawierajcych FOS w iloci około 4% s.s. i steniu s.s. 7 73% (m/m). Zalet stosowania Fructozyme do otrzymania syropu typu kestozowego jest niska cena enzymu i moliwo wytwarzania syropów bez potrzeby zatania z minimaln obróbk termiczn. Wad stosowania tego preparatu jest wzgldnie wysoki udział fruktozy w mieszaninie sacharydów, który wynika z obecnoci w roztworze β-fruktozydazy o aktywnoci FD 15 U F /1 ml (tab. 1.). Inn wad obecnoci fruktozy w roztworze jest tendencja do jego brzowienia oraz hamowanie trnsglikozylacji. W tab. 3. przedstawiono skład sacharydów na pocztku oraz po 8 godz. transglikozylacji w 69% roztworze wodnym o ph 7,2 i o rónym udziale sacharozy i fruktozy w obecnoci preparatu Fructozyme w dawce 1 ml/l.

9 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) Rys. 4. Fig. 4. Stenie [mol/l] / Concentration [mole/l] 1,8 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4, Czas [godz] / Time [h] F 5,8 F 7,3 Zmiana stenia fruktozy podczas biokonwersji w roztworach sacharozy o steniu 69% (m/m) przy ph 5,8 i 7,3 w zalenoci od czasu reakcji. A change in the fructose concentration during the bioconversion occurring in 69% (m/m) saccharose solutions, at a ph value equalling 5.8 and 7.3 depending on the time of reaction. Z danych tab. 3. wynika, e w miar zmniejszania udziału molowego sacharozy w mieszaninie z fruktoz, od 1% do 18%, proporcjonalnie malała wydajno tworzenia kestozy i nystozy, odpowiednio od 7% do 23%. Wydajno tworzenia inulobiozy wzrosła jedynie do około 3% i przez to sumaryczna wydajno FOS przy ponad 5% udziale molowym w mieszaninie reakcyjnej wyniosła rednio 55%, wobec 7% w roztworze sacharozy i 65% z 33% udziałem molowym fruktozy. Dane zawarte w tab. 3. wiadcz o dwukrotnym wzrocie natenia zabarwienia roztworów zawierajcych 33% udział fruktozy w porównaniu z zabarwieniem roztworu mieszaniny sacharydów otrzymanych wyłcznie z sacharozy. Enzymatyczna modyfikacja sacharozy w mieszaninie z fruktoz przy udziale Fructozyme prowadziła do otrzymania mieszaniny FOS o gorszych cechach fizykochemicznych i składzie FOS. Działanie probifidogenne inulobiozy jest bowiem mniejsze ni oligomerów o DP3. W zwizku z powyszym, wzorujc si na pracach Hanga [9, 1], podjto prób znalezienia handlowych preparatów enzymatycznych otrzymywanych z Aspergillus niger o korzystnych proporcjach aktywnoci FT i FD. Zbadano kilkanacie preparatów pektolitycznych, celulolitycznych i amylolitycznych, z których kilka wykazało podane właciwoci transglikozylacji reszty fruktozy w roztworach sacharozy. Jednym z interesujcych enzymów o wymienionych właciwociach jest Novoferm, uyty w dawce 1 2,5 U T /g sacharozy.

10 14 Bogusław Król, Robert Klewicki T a b e l a 3 Skład mieszaniny sacharydów i zabarwienie hydrolizatów po 8 godz. transglikozylacji w 69% roztworach wodnych o ph 7,2 i o rónym udziale pocztkowym sacharozy i fruktozy w obecnoci preparatu Fructozyme w dawce 1 ml/l. The composition of saccharides mixtures and colour of hydrolysates after the 8-hour transglycosylation proceeding in 69% aqueous solutions (69% of dry matter), their ph = 7.2, in the presence of Fructozyme (its applied dose: 1 ml/l) with various initial content rates between the saccharose and fructose. Stenie pocztkowe Initial concentration S [mol/l] F [mol/l] Stenie sacharydów Concentration of saccharides Udział molowy S [%] Stenie po 8 godz. [mol/l] Concentration after 8 hours [mole/l] Zabarwienie Colour ICUMSA Wydajno transglikozylacji Yield of transglycosylation [%] N K I S G F IU K+N IN 2,7, 1,79,66,9 1,5, ,3 7,3 2,16 1,3 67,51,52,7,77,99, ,7 7 64,7 1,62 2,6 44,24,32,16,57,88 1, , ,35 2,57 34,18,24,19,43,86 2, , 22 52,81 3,6 18,5,1,22,24,66 3, , FOS Objanienia: / Explanatory notes: Wydajno / yield KN = (C nys +C kes )/C gl 1; Wydajno / yield IN = C n /C gl 1; S sacharoza / saccharose, F fruktoza / fructose, N nystoza / nystose, K kestoza / kestose, I inulobioza / inulobiose, G glukoza / glucose; przyrost zabarwienia w stosunku do roztworów sacharozy / increase in the colour intensity if compared with the colour of saccharose solutions. Na rys. 5. przedstawiono redni szybko tworzenia FOS w mg/ugodz. w zalenoci od pocztkowego stenia sacharozy w obecnoci preparatu Novoferm w dawce 1,4 U/ml i T=55 C. Najwiksz szybko powstawania FOS, wynoszc 16 mg/u godz. uzyskano przy steniu roztworu 55 6% (m/m). Zatem było to stenie o 1 jednostek mniejsze od optymalnego stenia s.s. dla enzymów zawartych w preparacie Fructozyme. Jest to porednie potwierdzenie małej aktywnoci β-fruktozydazy w preparacie Novoferm.

11 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) Rys. 5. Fig. 5. Szybko tworzenia FOS [mg/u*h] Rate of formation of FOS [mg/u*h] Stenie sacharozy [% (m/m)] Concentration of saccharose [% (w/w)] rednia szybko tworzenia FOS w roztworach sacharozy o rónym steniu w obecnoci preparatu Novoferm. The average rate of forming FOS in various saccharose solutions with different concentration values in the presence of Novoferm. Na rys. 6. zilustrowano zmian zawartoci sumy FOS w czasie biokonwersji sacharozy o steniu 55% (m/m) w cigu 3 godz. (dawka enzymu 2,.U/g). Maksimum 61% udziału FOS w s.s. wystpiło po ok. 25 godz., po czym ogólna zawarto FOS zmniejszała si stopniowo do 48% po 3 godz. reakcji. Zmiany udziału kestozy, nystozy i fruktozylonystozy w sumie FOS w czasie powyszej biokonwersji przedstawiono na rys. 7. Stenie [%] / Concentration [%] Czas [godz] / Time [h] suma FOS Rys. 6. Zmiana zawartoci sumy FOS [%] w czasie biokonwersji sacharozy w roztworze o steniu 55% (m/m) z uyciem preparatu Novoferm w dawce 2 U/g sacharozy w czasie do 3 godz. Fig. 6. A change in the FOS sum content [%] during the bioconversion of saccharose in a 55% (m/m) solution with a Novoferm preparation added (2 U Novoferm per 1 g of saccharose) during a period not exceeding 3 h. Ponad 82-procentowy udział kestozy uzyskano po około 2 godz. reakcji, a nastpnie zawarto jej zmniejszała si asymptotycznie do około 2% s.s. po 25 godz. Maksymalny 55% udział nystozy wystpił po około 1 godz. reakcji, po czym jej

12 16 Bogusław Król, Robert Klewicki udział zmniejszył si do 4% po blisko 3 godz. Fruktozylonystoza osignła 33% zawartoci w s.s. po około 25 godz. Stenie [%] / Concentration [%] Czas [godz] / Time [h] N/suma FOS FN/suma FOS K/suma FOS Rys. 7. Fig. 7. Zmiany ilociowe w mieszaninie kestosy, nystozy i fruktozylonystozy w czasie biokonwersji sacharozy (pocztkowe stenie 55% m/m) z uyciem preparatu Novoferm (2 U/g sacharozy). Quantitative changes in a mix of kestose, nystose, and fructosylnystose during a saccharoze bioconversion (initial solution concentration: 55% m/m) with a Novoferm preparation (2 U/g saccharose). Wnioskowa mona zatem, e sukcesywne procesy transglikozylacji reszty fruktozy w rodowisku ju powstałych oligomerów przebiegaj konsekwentnie, jednak z coraz mniejsz wydajnoci z uprzywilejowanym udziałem nystozy w składzie s.s. W zwizku z powyszym przerywajc transglikozylacj w okrelonym czasie lub etapie tworzenia FOS mona otrzyma róne typy syropów rónice si składem chemicznym, a w konsekwencji równie właciwociami fizycznymi i biologicznymi. Ze wzgldów praktycznych, a w szczególnoci moliwie krótkiego czasu biokonwersji, mona wyróni dwa zasadnicze typy syropów: kestozowy (K), w którym udział kestozy w sumie FOS jest wikszy ni 6% oraz nystozowo-glukozowy (NG) o przyblionym równym udziale glukozy i nystozy. Na rys. 8. przedstawiono chromatogramy koncentratu FOS typu K z dominujcym udziałem kestozy i koncentratu FOS typu NG. W dotychczasowych publikacjach dotyczcych enzymatycznej modyfikacji sacharozy w celu otrzymania krótkołacuchowych FOS zwracano zasadnicz uwag na optymalizacj warunków otrzymywania ich sumy [4, 1, 29, 34]. Z drugiej strony w skali przemysłowej moliwe jest skrócenie procesu transglikozylacji, zwłaszcza jeeli w dalszym etapie prowadzone jest chromatograficzne rozdzielanie składników z wykorzystaniem zjawiska wykluczania [34].

13 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) [mv] [mv] Fruktoza Fruktoza Glukoza Glukoza Sacharoza Sacharoza Inulotrioza Kestoza Kestoza Czas [min] / Time [min] Nystoza Nystoza Fruktozylonystoza Fruktozylonystoza DP6 A) B) Rys. 8. Chromatogramy sacharydów zawartych w koncentracie FOS typu K (A) i koncentracie FOS typu NG (B) [16]. Fig. 8. HPLC profiles of saccharides in concentrates: FOS type K (A) and FOS type NG (B) [16]. Dowiadczenia przedstawione poniej wskazuj na moliwo ominicia drogiego procesu chromatograficznego rozdzielania składników. W wyniku naleytego doboru preparatu enzymatycznego, jego dawki i warunków biokonwersji oraz ewentualnego zastosowania dodatkowych procesów korzystnych do selektywnego usuwania glukozy ze rodowiska reakcji, mona wytwarza dwa rodzaje syropów bogatych w nystoz. Jeden syrop wraz z glukoz, tj. typ nystozowo-glukozowy (NG) i drugi syrop nystozowy (N) otrzymany po usuniciu glukozy, zawierajcy w suchej masie co najmniej 75% FOS. Roztwory o steniu około 4% s.s. zawierajce blisko 8% FOS w s.s. mona przeprowadzi w posta proszku przez suszenie rozpyłowe. Na rys. 9. przedstawiono przykładowy chromatogram preparatu w proszku otrzymanego według opisu przedstawionego w niniejszej pracy i chromatogram oligosacharydów preparatu standardowego firmy Wako Pure (handlowe preparaty FOS firmy Wako Pure s otrzymywane przez biokonwersj sacharozy, po której nastpuje proces niskocinieniowej chromatografii przemysłowej z otrzymaniem frakcji kestozowonystozowej poddawanej zataniu i suszeniu rozpyłowemu [34]). Zauwaalne jest podobiestwo składu jakociowego obydwu preparatów i nieznaczne rónice w składzie ilociowym. Preparat FOS Wako Pure, oprócz kestozy i nystozy zawartych w równych ilociach, zawierał F-nystoz, niewielkie iloci fruktozy i sacharozy oraz

14 18 Bogusław Król, Robert Klewicki ladowe iloci glukozy, inulobiozy i neoinulobiozy. Preparat własny FOS PL 9 oprócz trzech głównych oligomerów FOS (nystozy, kestozy i Fnystozy) zawierał niewielkie iloci oligomerów homogennych, tj. inulotetraozy, inulotriozy i inulobiozy. [mv] [mv] Rys. 9. Fig Fruktoza B) Fruktoza Glukoza Glukoza Inulobioza Sacharoza Sacharoza Neoinulobioza Inulotrioza Kestoza Kestoza Inulotetraoza Nystoza Nystoza Czas [min] / Time [min] Chromatogramy sacharydów preparatu FOS PŁ-9 (A) i preparatu firmy Wako Pure (B). HPLC profiles of saccharides in an FOS PŁ-9 (A) preparation and in a preparation made by Wako Pure (B) company. Fruktozylonystoza Fruktozylonystoza DP6 A) Zawierał równie fruktoz, glukoz i sacharoz w iloci do 1%. Preparat FOS PL 9 składowany w warunkach typowych dla preparatów sypkich nie ulegał zbryleniu, moe to wynika z duego udziału nystozy i jej małej higroskopijnoci. W preparacie FOS WP i FOS PL 9 w ladowych ilociach wystpował składnik, który jest typowy dla biokonwersji sacharozy w obecnoci β-fruktozydazy [7], jest to β-d-fruktofuranozylo(2 6)-α-D-glukopiranoza (neoinulobioza). Roztwory zawierajce powyej 72% s.s., w których udział FOS w s.s. przekraczał 7%, podczas składowania w temp. 2±2 C ulegały zmtnieniu, a nastpnie pojawiał si w nich krystaliczny osad. Na podstawie oznacze chromatograficznych i analizy MS stwierdzono, e jest to nystoza (M=667,2). Wydaje si dalece prawdopodobne, e nieoczekiwana łatwo krystalizacji nystozy z odpowiednich roztworów po enzymatycznej modyfikacji sacharozy przynosi nowe moliwoci wytwarzania cile zdefiniowanego składu oligomerycznego FOS w postaci bardzo dogodnej do

15 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) stosowania. Na obecnym etapie bada brak jest uzasadnienia łatwoci krystalizacji nystozy ze złoonych roztworów. T a b e la 4 Skład oligomeryczny syropów FOS rónego typu oraz preparatów FOS rónego pochodzenia. Content of oligomers contained in FOS syrups of various types and in commercial FOS preparations of different origins. Produkt Product Zawarto [% s.s.] Content [% d.m.] G i F S I NIN K N FN DP 6 FOS N 1 FOS DP 4 FOS FOS typ K F 31,5 27,5 -,9 32,2 7,7,2 4,1 19,2 19,7 FOS typ K 19,7 28,6 -,6 42,1 8,7,2 51,6 16,9 17,2 FOS typ NG 34, 8,3,8 1,9 17, 29,2 8,5,3 57,7 5,6 65,9 FOS typ N 11,5 9,,5 1,5 27,9 4,3 8,4,3 79,5 5,7 61,6 FOS PL 9 5,8 3,5 1,1 3, 25,9 45,1 13,7 1,9 9,7 49,7 66,9 Nystoza PL,6, ,1 91,8 1,6 98,5 93,2 94,8 FOS WP,9 1, ,9 52, 9,7 97,6 53,3 63,2 Raftilose 2,7,2 3, 29,.7 27,6 3,8 11,8 7,6 13,6 96,1 32,7 1) 68,4 Objanienia / Explanatory notes: S sacharoza / saccharose, F fruktoza / fructose, N nystoza / nystose, K kestoza / kestose, I inulobioza / inulobiose,, NIN neoinulobioza / neoinulobiose, G glukoza / glucose; 1) jako / as IT + N FOS W tab. 4. zestawiono skład oligomeryczny typowych syropów FOS otrzymanych w pracy, dwóch własnych preparatów stałych oraz handlowego preparatu Wako Pure (FOS WP) i Raftilose. Syrop typu kestozowego (FOS K), otrzymany z udziałem preparatu Fructozyme, zawierał najmniejszy udział oligofruktozy w s.s. przy zachowaniu podobnego udziału nystozy do s.s. jak w syropie typu kestozowego, otrzymanego z zastosowaniem preparatu Novoferm. Syropy oligofruktozy typu nystozowego, niezalenie od obecnoci glukozy, zawierały ponad 65% oligomerów DP 4 w s.s., tj. nieco wicej ni w preparatach FOS Wako Pure, otrzymanych z zastosowaniem procesu chromatograficznego. Krystaliczna nystoza, wyizolowana z syropów FOS typu nystozowego, była najbardziej skoncentrowan postaci oligofruktozy o zawartoci 94,8% oligomerów o DP 4. Skład oligomeryczny syropów FOS typu nystozowego i preparatów proszkowych FOS 9 PL był bogatszy ni preparatów Wako Pure o oligomery homogenne: inulotrioz i inulobioz, typowe dla preparatów FOS otrzymanych przez biokonwersj inuliny [3].

16 2 Bogusław Król, Robert Klewicki Wnioski 1. Syropy fruktooligosacharydowe o dominujcym udziale kestozy w s.s. otrzymuje si najłatwiej i najtaniej, nawet z duym udziałem aktywnej fruktozylotransferazy, towarzyszcej fruktofuranozydazie, pod warunkiem uycia roztworu sacharozy o dostatecznie wysokim steniu i ph bliskiego Niektóre preparaty enzymatyczne z Aspergillus niger, przeznaczone do produkcji soków owocowych i piwa, np. Novoferm, zawieraj aktywn fruktozylotransferaz i dziki temu s przydatne do wytwarzania koncentratów FOS o rónym, lecz przewidywalnym udziale kestozy, nystozy i fruktozylonystozy. 3. Roztwory po enzymatycznej modyfikacji sacharozy, zawierajce ponad 5% nystozy w przeliczeniu na sum fruktooligosacharydów, a w szczególnoci pozbawione glukozy przez enzymatyczne jej utlenienie, umoliwiaj otrzymanie preparatów proszkowych zawierajcych co najmniej 8% fruktanów w s.s. 4. Z roztworów mieszaniny sacharydów o steniu 72% i udziale fruktooligosacharydów ponad 7% w s.s. krystalizuje nystoza i dziki temu mona otrzyma bardzo dogodn posta uytkow składnika prebiotycznego. Badania finansowane przez KBN w ramach projektu PBZ-KBN/21/PO6/99/27/B Literatura [1] Anderson H.B., Alleged L.H., Bosses I.G.: Nondigestibility characteristics of inulin and oligofructose in humans. J. Nutr., 1999, 129 (75), [2] Biedrzycka E., Bielecka M.: Prebiotic effectiveness of fructans of diffrent degrees of polymerization. Trends Food Sci. Technol., 24, 15, [3] Booten K., Deleenheer L.: Method for preparing a polydyspersed saccharide composition. Patent USA, 21, (EP ). [4] Bornet F.R.J., Brouns F., Tashiro Y., Duvilier V.: Nutritional aspects of short-chain fructooligosaccharides: natural occurrence, chemistry, physiology and health implications. Digest Liver Dis., 22, (34) Suppl., [5] Byung W.K., Yun J.W.: Selective production of GF 4 -fructooligosaccharide from sucrose by a new transfructosylating enzyme. Biotechnol. Lett., 1998, 2 (11), 131. [6] Cheng Tao: Tonic oligofructose salt as oral liquid. Patent chiski, 21, CN [7] Farine S., Versluis C., Bonnici P.J., Heck A., Peschet J.L., Puigserver A., Biagini A.: Separation and identification of enzymatic sucrose hydrolysis products by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. J. Chromatog. A, 21, 92, [8] Fritz M.: Self-foaming soluble beverage powder. Patent USA, 23, [9] Hang U.D., Woodams E.E., Jang K.Y.: Fructosyltransferase activity of commercial enzyme preparations used in fruit juice processing. Biotechnol. Lett., 1995, 17, [1] Hang Y.D., Woodams E.E.: Optimization of enzymatic production of fructooligosaccharides from sucrose. Lebensmittel-Wirtschaft und Techn., 1996, 29 (5/6), [11] Hayashi S., Tobouchi M., Takasaki Y., Smada K.: Long-term continuous reaction of immobilized β- fructofuranosidase. Biotechnol. Lett., 1994, 16,

17 WYTWARZANIE KONCENTRATÓW FRUKTOOLIGOSACHARYDÓW (FOS) [12] Hidaka H., Hirayame M., Sumi N.: A fructooligosaccharyde producing enzyme from A. niger Agric. Biol. Chem., 1998, 52, [13] Iiang S.: Yeast gene engineeringbacterium and endoinulase preparation and its application method. Patent chiski, 22, [14] IUB IUPAC, Abbreviated terminology of oligosaccharide chains.: J. Biol. Chem., 1982, 257, [15] Jung K.H., Lim J.Y., Yon S/L: Production of fructosyltransferase from Aureobasidium pullulans. Biotechnol. Lett., 1987, 9, [16] Król B., Gałzka I. Grzelak K.: Jakociowy i ilociowy skład β-fruktooligosacharydów w preparatach prebiotycznych rónego pochodzenia. Złoone do druku w yw. Człow i Met. [17] Król B., Klewicki R.: Sposób enzymatyczny wytwarzania glukonianu wapnia. Patent polski, 24, P [18] Król B.: Sposób wytwarzania mieszanin fruktooligosacharydów o podanej zawartoci kestozy i nystozy. Zgłoszenie patentowe, 23, P [19] Kurakake M., Onoue T., Kumaki T.: Effect of ph on transfructosylation and hydrolysis by β- fructofuranosidase from A. oryzae. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, 45, [2] Lüscher M., Erdin Ch., Sprenger N.: Inulin synthesis by a combination of purified fructosyltransferases from tubers of Helianthus tuberosus. FEBS Lett., 1996, 385, [21] Niness K.,R.: Inulin and oligofructose: What a they?. J. Nutr., 1999, 129 (75), [22] Nisher M., Frehner M., Nösberger J.: Purification and some properties of fructan: fructan fructosyltransferase from dendelion (Taraxacum officnale). New Phytologist, 1993, 123, [23] PN-91/L-8412:1991. Nadtlenek wodoru. [24] PN-A-7485:1996. Cukier biały. [25] Rao A.V.: Dose response effects on inulin and oligofructose on intestinal bifidogenic effects. J. Nutr., 1999, 129, [26] Rao A.V.: The probiotic properties of oligofructose and law intake levels. Nutr. Research, 21, 21, [27] Ritseme T., Smeekens S.: Fructans: beneficial for plants and humans. Current Opinion in Plant Biology, 23, 6, [28] Sangette P.T., Ramshur M.N., Prapulla S.G.: Production of Fructo-oligosaccharides by fructosyl transferase from Aspergillus oryzae CFR 22 and Aureobasidium pullulans CFR 77. Process Biochem., 24, 39, [29] Schiweck H., Munir M., Rapp K.M., Schneider B., Vogel M.: New developments in the use of sucrose as an industrial bulk chemical. In: Carbohydrates as organic raw materials, ed. Lichtenthaler F.W., VCV, New York 1991, pp [3] Seike M. Patent japoski [31] Spiegel J.E., Frankos V.H., Schmitt D.F., Rose K., Karabell P.: Safety and benefits of fructooligosaccharides as food ingredients. Food Technol., 1994, 48 (1), [32] Wilson J.: Nutritional formulation containing prebiotic substances. Patent USA, 23, US [33] Yun J.W., Song S.K., Han J.H., Cho Y.C., Lee J.H.: Separation and purification of fructooligosaccharides by ion-exchange resin column. Korean J. Biotechnol. Bioeng., 1993, 9, [34] Yun J.W.: Fructooligosaccharides occurrence, preparation and application. Enzyme and Microbiol. Technology, 1996, 19,

18 22 Bogusław Król, Robert Klewicki PRODUCTION OF FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS) CONCENTRATIONS WITH VARIOUS CONTENTS OF OLIGOMERS USING ENZYMATIC BIOCONVERSION OF SACCHAROSE S u m m a r y In the paper, there are described conditions for bioconversion of saccharose into FOS preparations by commercial enzyme preparations (Fructozyme or Novoferm containing fructosyltransferase). The main objective of this bioconversion was to manufacture 3 FOS syrups and 2 powders containing 5%-6%, and over 9% of fructans respectively. It was proved that the transglycosylation of the fructose moiety was a three-phase process when the enzyme was applied in doses of U/g saccharose. During the first phase, kestose is a major fructan formed (nearly 8% of the synthesized FOS). During the second stage, kestose is transformed into nystose (over 5% of the synthesized FOS). Additionally, during the third stage, a balance state among kestose, nystose and F-nystose (their proportion rates are 2:4:3) is settled. It was proved that after the glucose has been removed by an enzymatic oxidation, the nystose-rich solutions of FOS can be dried off using a spray-drying method; the dry-off process shall occur under the conditions similar to the production of powder milk. Furthermore, it was evidenced that from among all the nystose syrups containing over 72% (w/w) of dry matter, the nystose crystallizes with a little amount of kestose applied in the form of a non-hygroscopic fine-crystal substance. Key words: fructooligosaccharides, fructosyltransferase, fructosidase, transglycosylation