PROOF INTERNATIONAL SCIENTIFIC LITERATURE. Strzeszczenie

Transkrypt

1 Polish Orthopedics and Traumatology, 2; 77: Original Article Otrzymano: Zaakceptowano: Opublikowano: 2.XX.XX Wprowadzenie: Materiał/Metody: Wyniki: Wnioski: słowa kluczowe: Metabolism and protein transformations in synovial membrane of a knee joint in the course of rheumatoid arthritis and degenerative arthritis Metabolizm i przemiany białkowe w błonie maziowej stawu kolanowego w przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów i choroby zwyrodnieniowej stawów Beata Hapeta, Bogdan Koczy 2, Agnieszka Fitowska, Michał Dobrakowski, Aleksandra Kasperczyk, Alina Ostałowska, Tomasz Stołtny 2, Wojciech Widuchowski 2, Piotr Łukasik 2, Ewa Birkner, Sławomir Kasperczyk Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii, Śląski Uniwersytet Medyczny, Zabrze, Polska 2 Samodzielny Publiczny Wojewódzki Szpital Chirurgii Urazowej im. dr Janusza Daaba w Piekarach Śląskich, Piekary Śląskie, Polska Strzeszczenie W przebiegu chorób układu ruchu, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów czy choroba zwyrodnieniowa stawów dochodzi do rozwoju przewlekłego procesu zapalnego, który uszkadza wszystkie elementy stawowe doprowadzając do upośledzenia sprawności chorego. W przypadku obu tych schorzeń etiologia jest wieloczynnikowa i nadal do końca nie poznana. Sugeruje się, iż w procesie degradacji chrząstki stawowej, biorą udział reaktywne formy tlenu. Ich nadmierna produkcja powoduje zaburzenie równowagi oksydacyjnej komórek i wystąpienie stresu oksydacyjnego. Pod wpływem działania wolnych rodników dochodzi m.in. do aktywacji enzymów proteolitycznych uczestniczących w degradacji kolagenu. Celem niniejszej pracy było porównanie parametrów charakteryzujących metabolizm komórkowy oraz przemiany białkowe zachodzące w przebiegu wymienionych chorób układu ruchu. Materiał badany stanowiły fragmenty błony maziowej stawu kolanowego pobrane od 36 kobiet chorych na reumatoidalne zapalenie stawów oraz 24 kobiet chorych na chorobę zwyrodnieniową stawów podczas zabiegu endoprotezoplastyki stawu kolanowego. Następnie zostały poddane autorskiej metodyce przygotowania błony maziowej do oznaczeń biochemicznych. W grupie chorych na reumatoidalne zapalenie stawów uzyskano znamiennie wyższe stężenie białka oraz grup sulfhydrylowych. Ponadto zaobserwowano wzrost aktywności izoenzymu manganowego dysmutazy ponadtlenkowej, dehydrogenazy glutaminianowej oraz enzymów uczestniczących w procesie degradacji kolagenu prolidazy i fosfatazy kwaśnej. W przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów dochodzi do zwiększenia tempa metabolizmu komórkowego, co wpływa również na nasilenie obrotu białkowego w komórkach. błona maziowa reumatoidalne zapalenie stawów choroba zwyrodnieniowa stawów reaktywne formy tlenu stres oksydacyjny dysmutaza ponadtlenkowa Full-text PDF: Ilość słów: XXXX Tabele: Ryciny: 3 Piśmiennictwo: Adres autora: Beata Hapeta, Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii, Śląski Uniwersytet Medyczny, Zabrze, Polska, beata_hapeta@wp.pl

2 Polish Orthopedics and Traumatology, 2; 77: x-xx Wstęp Reumatoidalne zapalenie stawów (rheumatoid arthritis, RA) jest chorobą zapalną, w przebiegu której dochodzi do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego symetrycznych stawów, występują także zmiany pozastawowe oraz objawy układowe. Charakterystyczne dla tej choroby obrzęki stawowe, bolesność oraz postępująca destrukcja stawów prowadzą do niepełnosprawności, a także przedwczesnej śmierci. Ze względu na możliwość wykrycia we krwi chorych autoprzeciwciał takich jak czynnik reumatoidalny (RF, rheumatoid factor) czy przeciwciał przeciwko cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi (anty-ccp), RA zalicza się do grupy chorób autoimmunologicznych. Schorzenie to dotyczy ok. 2% populacji i występuje trzy razy częściej u kobiet niż u mężczyzn [ 3]. Choroba zwyrodnieniowa stawów (osteoarthritis, OA) jest to najczęściej występująca choroba stawów i jednocześnie najczęstsza przyczyna bólu i niepełnosprawności wśród ludności krajów rozwiniętych. W przebiegu OA dochodzi do zaburzenia równowagi pomiędzy procesami degeneracji i regeneracji chrząstki stawowej. Towarzyszy temu rozwój stanu zapalnego w obrębie błony maziowej oraz sklerotyzacja warstwy podchrzęstnej kości z tworzeniem osteofitów, torbieli zwyrodnieniowych i zwężeniem szpary stawowej [3,4]. Patogeneza obu schorzeń nie jest do końca wyjaśniona. W rozwoju choroby zwyrodnieniowej dużą rolę odgrywają zarówno czynniki metaboliczne, jak i mechaniczne, a ryzyko zachorowania zwiększa: starzenie się, płeć żeńska, nadmierne obciążenie stawów i ich urazy, nadwaga oraz otyłość czy predyspozycje genetyczne []. Natomiast w przypadku RA zapoczątkowanie autoimmunologicznego procesu zapalnego ma związek z odpowiedzią organizmu na nieznany czynnik infekcyjny lub antygen własny [2]. Istnieje również coraz więcej dowodów na udział reaktywnych form tlenu (reactive oxygen species, ROS) w procesie degradacji chrząstki stawowej, a tym samym w patogenezie schorzeń układu ruchu [6]. ROS są wysoce reaktywnymi cząsteczkami, powstającymi w procesach metabolizmu tlenowego w komórkach w warunkach fizjologicznych. Ich źródłem jest przed wszystkim łańcuch oddechowy, ale mogą one powstawać również w reakcjach z udziałem oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej czy cyklooksygenazy. Także granulocyty kwasochłonne i obojętnochłonne, monocyty i makrofagi wydzielają ROS w wyniku wybuchu tlenowego w przebiegu reakcji zapalnej [7]. W warunkach fizjologicznych wolne rodniki biorą udział w procesach wewnątrzkomórkowego przekazywaniu sygnału, indukują różnicowanie się i apoptozę komórek, uczestniczą w eliminacji różnego rodzaju patogenów, a także regulują procesy odpornościowe poprzez nasilanie aktywacji limfocytów T i adhezji leukocytów do śródbłonka. Jednakże w wysokich stężeniach ROS mają działanie toksyczne. Powodują wtedy utlenianie białek z następową utratą ich aktywności enzymatycznej czy regulatorowej. Uszkadzają ponadto DNA oraz utleniają lipidy. Powstałe produkty peroksydacji lipidów zmieniają właściwości fizyczne błon komórkowych, hamując aktywność enzymów błonowych i białek transportujących, a także indukują ekspresję cyklooksygenazy 2 (COX-2) w makrofagach, co aktywuje proces zapalny [8]. pochodne. Wyróżnić można dwa mechanizmy obrony komórek przed rodnikami tlenowymi. Pierwszy z nich to system nieenzymatyczny, w skład którego wchodzą glutation, albuminy, witaminy E, C, A wraz z beta karotenem, koenzym Q, flawonoidy, kreatynina czy hormony płciowe. Z kolei do systemu enzymatycznego zalicza się dysmutazę ponadtlenkową (SOD), która jest głównym enzymem antyoksydacyjnym katalizującym reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru. W następnym etapie nadtlenek wodoru jest rozkładany do wody i tlenu z udziałem katalazy i peroksydazy glutationowej [7 0]. Nadmierna produkcja ROS w warunkach patologicznych zaburza równowagę pomiędzy procesami oksydacyjnymi, a zdolnościami antyoksydacyjnymi organizmu. Stan ten określa się mianem stresu oksydacyjnego. Dowiedziono, iż zjawisko to przyczynia się do rozwoju szeregu zespołów chorobowych, w tym chorób układu ruchu. Pod wpływem działania ROS dochodzi m.in. do aktywacji enzymów proteolitycznych uczestniczących w degradacji kolagenu. Ostatni etap tego procesu katalizowany jest przez prolidazę (E.C ). Enzym ten, zaliczany do grupy cytozolowych egzopeptydaz, pełni ważną rolę w procesie hydrolizy imidopeptydów z C-końcową proliną lub hydroksyproliną. Odzyskana prolina może być wykorzystana ponownie w procesie resyntezy kolagenu, a powstały C-telopeptyd kolagenu typu I wykorzystywany jest jako marker procesu resorpcji kostnej. Uwalnianie ROS w przebiegu procesu zapalnego, jaki rozwija się w przebiegu OA i RA, powoduje nasilenie zmian zapalno-degradacyjnych w obrębie błony maziowej stawu. Błona maziowa stanowi wewnętrzną warstwę torebki stawowej, wyściełając jamę stawową za wyjątkiem powierzchni chrząstek stawowych. Odpowiada ona za produkcję i absorpcję płynu stawowego, odżywianie chrząstki stawowej czy zmniejszanie współczynnika tarcia powierzchni [,2]. Błona maziowa pełni ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu stawów. Procesy, jakie zachodzą w obrębie tej tkanki w przebiegu chorób układu ruchu, nie są jednak dobrze poznane. Dlatego też celem niniejszej pracy było oznaczenie wybranych parametrów biochemicznych pozwalających na ocenę metabolizmu i przemian białkowych zachodzących w obrębie błony maziowej pobranej od pacjentów chorych na OA oraz RA. Materiał i metody Na badanie otrzymano zgodę Komisji Bioetycznej z roku 03 (NN-03-7/03). Materiał badany stanowiły fragmenty błony maziowej pobrane od 36 kobiet (grupa RA) chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (średni wiek:,2±,8 lat; średnia masa ciała: 73,29±, kg) oraz od 24 kobiet (grupa OA) chorych na chorobę zwyrodnieniową stawów (średni wiek: 64,3±6, lat; średnia masa ciała: 76,46±0,9 kg). Skrawki błony maziowej zostały pobrane podczas zabiegu endoprotezoplastyki stawu kolanowego przeprowadzonego w Śląskim Szpitalu Reumatologiczno-Rehabilitacyjnym im. gen. Jerzego Ziętka w Ustroniu oraz w Samodzielnym Publicznym Wojewódzkim Szpitalu Chirurgii Urazowej im. dr Janusza Daaba w Piekarach Śląskich Szkodliwemu działaniu wolnych rodników przeciwdziałają antyoksydanty, które przekształcają ROS w nieaktywne Uzyskane skrawki błony maziowej zostały poddane autorskiej metodzie przygotowania błon maziowych do badań 2

3 Hapeta B. i wsp. Metabolizm i przemiany białkowe w błonie maziowej stawu Tabela. Zestawienie uzyskanych wartości porównywanych parametrów w obu grupach badanych. Parametr OA średnia SD RA średnia SD p Stężenie białka [mg/g tkanki] 3,02 6,9,72 7,92 <0,00 Aktywność izoenzymu manganowego dysmutazy ponadtlenkowej [NU/00 mg tkanki 62,2 37,98 9,38 28,70 <0,00 Aktywność izoenzymu manganowego dysmutazy ponadtlenkowej [NU/mg białka] 49,66 28,27, 0,34 0,074 Stężenie grup sulfhydrylowych [umol/00 g tkanki] 3,72 33,68 64,7 33, <0,00 Stężenie grup sulfhydrylowych [umol/g białka] 29,29 23,97 22,02 2,88 0,4 Aktywność prolidazy[iu/ g tkanki],00 37,00 422,00 28,00 0,006 Aktywność prolidazy [IU/mg białka] 64,00 3,00 39,00 97,2 0,43 Aktywność fosfatazy kwaśnej [IU/ g tkanki] 2,88,8 7,07 4,00 <0,00 Aktywność fosfatazy kwaśnej [IU/g białka] 2,43,3 2,2,07 0,489 Aktywność dehydrogenazy glutaminianowej [IU/ g tkanki] 0,7 3,74,4 2,68 <0,00 Aktywność dehydrogenazy glutaminianowej IU/g białka] 6, 6,98 0,6, 0,03 biochemicznych [3]. W początkowym etapie dokonano makroskopowej oceny morfologii uzyskanych wycinków, odrzucając najbardziej zwłókniałe fragmenty tkanek. Następnie odważone skrawki błony maziowej rozdrobniono mechanicznie i umieszczono w roztworze 0,9% NaCl w stosunku wagowym do 9. Uzyskane w ten sposób 0% zawiesiny poddano homogenizacji z wykorzystaniem homogenizatora obrotowego. Następnie materiał został zamrożony w temperaturze C, a po rozmrożeniu ponownie poddany homogenizacji za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego. Po eksperymentalnym doborze rozcieńczeń w uzyskanych supernatantach dokonano analizy biochemicznej obejmującej: stężenie białka wg Lowry ego, aktywność izoenzymu manganowego dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) wg Oyanagui, aktywność prolidazy wg Myara, aktywność fosfatazy kwaśnej, aktywność dehydrogenazy glutaminianowej (GLDH), stężenie grup sulfhydrylowych wg Kostera [4 8]. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu programu Statistica 0.0 PL. Dla badanych parametrów wyznaczono wskaźniki statystyki opisowej: średnią, odchylenie standardowe SD w tabeli i standardowy błąd średniej SEM na wykresie. Normalność rozkładu sprawdzono testem Shapiro-Wilka, a jednorodność wariancji testem Levene a. Do porównania pomiędzy grupami wykorzystano test t dla prób niezależnych lub test t z niezależną estymacją wariancji, bądź też test U Manna-Whitney a. Do oceny korelacji wykorzystano test Spearmana. Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany przy poziomie istotności p<0,0. Wyniki oraz grup sulfhydrylowych o 8%. Aktywność izoenzymu manganowego dysmutazy ponadtlenkowej (Mn-SOD), prolidazy (PRO), fosfatazy kwaśnej (ACP) oraz dehydrogenazy glutaminianowej (GLDH) były znamiennie wyższe w grupie RA odpowiednio o 92%, 06%, 4% i 83% (Tabela, Ryciny, 2). Po przeliczeniu uzyskanych wartości parametrów na jednostkę masy białka można stwierdzić, że udział grup sulfhydrylowych, Mn-SOD, prolidazy oraz fosfatazy kwaśnej w całkowitej puli białek okazał się nieznamiennie mniejszy w grupie RA. W tej grupie jedynie GLDH można przypisać znamienny wzrost udziału w całkowitej puli białek o 62% (Rycina 3). Dyskusja OA RA Białko 236 *** Rycina. Stężenie białka w grupach badanych RA i OA w przeliczeniu na 00% w odniesieniu do grupy OA (* p<0,0; ** p<0,0; *** p<0,00) Grupy badane nie różniły się znamiennie pod względem wagi, różniły się natomiast co do wieku pacjentki cierpiące na RA były znamiennie młodsze od pacjentek cierpiących na OA. W grupie chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RA) w porównaniu do grupy chorych na chorobę zwyrodnieniową (OA) stwierdzono znamiennie wyższe stężenie białka o 36% Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) to przewlekła choroba wielonarządowa, jednak dominującym jej objawem jest proliferacja błony maziowej oraz destrukcja chrząstki stawowej. Etiopatogeneza tego schorzenia jest wieloczynnikowa i wciąż nie do końca poznana. Jednakże badania przeprowadzone w ostatnich latach sugerują udział wolnych rodników w patogenezie RA jako mediatorów uszkodzenia błony maziowej. 3

4 Polish Orthopedics and Traumatology, 2; 77: x-xx OA RA W warunkach fizjologicznych błona maziowa zbudowana jest z tkanki łącznej właściwej oraz warstwy wewnętrznej (synovial intima) utworzonej z 3 warstw komórek zwanych synowiocytami [3]. W przebiegu RA, komórki błony maziowej produkują szereg czynników powodujących rozwój i nasilenie stanu zapalnego, a w dalszej kolejności także destrukcję stawu. W przebiegu RA błona maziowa ulega hiperplazji. Dochodzi również do jej naciekania przez komórki jednojądrzaste, głównie limfocyty T CD4+ i makrofagi, które wydzielają szereg cytokin oraz autoprzeciwciała, które dodatkowo tworzą kompleksy immunologiczne. Wydzielane cytokiny odpowiadają też za aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków transdukcji sygnałów oraz za transkrypcję czynników takich jak NF-kappa B czy MAP (mitogen-activated protein kinases), co z kolei zwrotnie wpływa na transkrypcję cytokin prozapalnych oraz enzymów inos czy COX-2 [9,]. Naciekające błonę maziową makrofagi odpowiadają nie tylko za produkcję cytokin prozapalnych, ale także poprzez zjawisko wybuchu tlenowego przyczyniają się do generacji ROS. Oprócz komórek fagocytarnych źródłem ROS są również reakcje katalizowane przez oksydazę NADPH, oksydazę ksantynową czy cyklooksygenazy. Obecność oksydazy ksantynowej w błonie maziowej pacjentów cierpiących na chorobę zwyrodnieniową wykazali w swoich badaniach Chen i wsp [2]. Ponadto, do nasilenia produkcji ROS przyczynia się zjawisko niedokrwienie-reperfuzja, jakie zachodzi w przebiegu przewlekłego procesu zapalnego zarówno podczas OA jak i RA [22]. Głównym źródłem wewnątrzkomórkowym ROS jest proces fosforylacji oksydacyjnej zachodzący na mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. Wzmożona produkcja ROS, a zwłaszcza anionorodnika ponadtlenkowego, który jest wyznacznikiem tempa metabolizmu tlenowego komórki, koreluje bezpośrednio z aktywnością izoenzymu manganowego dysmutazy ponadtlenkowej (Mn-SOD). Dlatego też *** *** ** *** *** Mn-SOD Gr. SH PRO Fosfataza GLDH kwaśna OA RA Mn-SOD Gr. SH PRO Fosfataza GLDH kwaśna 62 * Rycina 2. Porównanie wybranych parametrów w grupach OA i RA w przeliczeniu na 00% w odniesieniu do grupy OA, Mn- SOD izoenzym manganowy dysmutazy ponadtlenkowej; Gr. SH grupy sulfhydrylowe; PRO prolidaza; GLDH dehydrogenaza glutaminianowa (* p<0,0; ** p<0,0; *** p<0,00). Rycina 3. Porównanie wybranych parametrów w grupach OA i RA w przeliczeniu na jednostkę masy białka. Wykres w przeliczeniu na 00% w odniesieniu do grupy OA, Mn-SOD izoenzym manganowy dysmutazy ponadtlenkowej; Gr. SH grupy sulfhydrylowe; PRO prolidaza; GLDH dehydrogenaza glutaminianowa (* p<0,0; ** p<0,0; *** p<0,00). poprzez oznaczenie aktywności tego enzymu, można w sposób pośredni określić stopień nasilenia metabolizmu oraz procesów wolnorodnikowych w komórkach [23]. W przeprowadzonym badaniu zaobserwowano znamienny wzrost aktywności Mn-SOD w błonie maziowej w grupie RA w porównaniu do grupy OA, co świadczy o nasileniu wcześniej wspomnianych procesów w przebiegu RZS. Podobnie Tadashi i wsp. odnotowali znamiennie wyższą aktywność SOD w płynie stawowym pobranym od 46 pacjentów chorujących na RA niż w płynie pobranym od 43 pacjentów chorujących na OA. Analogiczne porównanie aktywności SOD we krwi obwodowej tych pacjentów nie wykazało znamiennych różnic. Badania przeprowadzone przez Taysi i wsp. oraz Cimen i wsp. wykazały wzrost aktywności SOD w surowicy krwi obwodowej u pacjentów z RA. Z kolei w badaniach przeprowadzonych przez Fitowską i wsp., wykazano wzrost aktywności SOD w błonie maziowej chorych na OA w porównaniu do aktywności SOD u osób zdrowych [24]. Autorzy przytoczonych powyżej badań stwierdzili, że zaobserwowany wzrost aktywności SOD świadczy o wzmożonej produkcji ROS, potwierdzając ich znaczenie jako czynników patogenetycznych chorób układu ruchu [2 27]. Podczas gdy dysmutaza ponadtlenkowa jest głównym enzymem antyoksydacyjnym, zaliczanym do tzw. pierwszej linii obrony antyoksydacyjnej organizmu, w skład drugiej linii obrony wchodzą antyoksydanty nieenzymatyczne, takie jak witaminy A, C, E czy glutation. Unieszkodliwiają one te wolne rodniki, które nie zostały wychwycone przez SOD czy inne enzymy [8]. Szczególnie ważnym elementem tej grupy są związki zawierające grupy sulfhydrylowe, gdyż wpływają one na równowagę oksydo-redukcyjną komórek, chroniąc je przed działaniem ROS. Zalicza się do nich m.in. cysteinę, metioninę, koenzym Q, glutation czy tioredoksynę (TRX). Hassan i wsp. zaobserwowali znamienny spadek stężenia GSH

5 Hapeta B. i wsp. Metabolizm i przemiany białkowe w błonie maziowej stawu we krwi [28]. Podobne wyniki otrzymali Jaswal i wsp. dla stężenia glutationu oraz stężenia tioli [29]. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych prac, Kiziltunc i wsp. zaobserwowali znamiennie wyższe stężenie GSH w osoczu krwi pacjentów chorych na RA. Wzrost ten tłumaczony jest tym, iż wzmożona produkcja ROS pociąga za sobą także zwiększenie zapotrzebowania na związki antyoksydacyjne, które unieszkodliwiałyby wolne rodniki []. Z kolei Maurice i wsp. poddali badaniu 22 pacjentów z RA, z OA, 3 z dną moczanową oraz 9 z reaktywnym zapaleniem stawów. W grupach badanych oznaczono stężenie tioredoksyny (TRX) we krwi oraz płynie stawowym (synovial fluid, SF), a ponadto dokonano histologicznej oceny skrawków błony maziowej, wybarwiając je w kierunku obecności tioredoksyny w synowiocytach. W grupie RA autorzy zanotowali znamienny wzrost stężenia tioredoksyny w SF w porównaniu do jej stężenia w osoczu krwi. Natomiast w pozostałych grupach badanych różnice w stężeniach tioredoksyny w SF i osoczu były nieznamienne. Potwierdzono także obecność TRX w badaniu histologicznym błony maziowej pochodzącej od chorych na RA. Przedstawione przez Maurice a i wsp. wyniki dowodzą, iż w przebiegu RA, na skutek stresu oksydacyjnego oraz wzmożonej produkcji TNF-alfa, dochodzi do zwiększenia produkcji TRX przez synowiocyty. Biorąc pod uwagę funkcje immunomodulacyjne TRX, wzrost jej stężenia może być czynnikiem sprzyjającym rozwojowi przewlekłego procesu zapalnego [3]. W pracy stwierdzono znamiennie wyższe stężenie grup sulfhydrylowych w błonie maziowej pobranej od pacjentek chorych na RA. Może być to związane z ekspozycją błony maziowej na działanie ROS, co z kolei pobudza synowiocyty do syntezy cząsteczek białkowych zawierających grupy sulfhydrylowe, m.in. metalotionein czy właśnie tioredoksyny. Ponadto w przebiegu RA błona maziowa ulega naciekowi przez szereg immunoglobulin oraz białek o właściwościach antyoksydacyjnych zawierających grupy sulfhydrylowe (np. albuminy). Z drugiej jednak strony nieznamienny spadek stężenia tych grup, gdy przeliczy się je na jednostkę masy białka, świadczy o ich nasilonym utlenianiu przez ROS oraz częściowej niewydolności proponowanych wyżej mechanizmów kompensacyjnych. Ponadto wspomniany wyżej znamienny wzrost zawartości białek w błonie maziowej zmienionej w przebiegu RA (potwierdzony w wykonanym badaniu) skutkuje nieznamiennym spadkiem aktywności Mn-SOD, prolidazy oraz fosfatazy kwaśniej w grupie RA, gdy ich wartości przeliczy się na jednostkę masy białka i porówna uzyskane wyniki w grupach badanych. Jedynie wzrost aktywności GLDH jest na tyle wysoki w grupie RA, że nawet po jej przeliczeniu na jednostkę masy białka trend zostaje zachowany. Jednakże nie tylko ROS, lecz także szereg enzymów z grupy metaloproteinaz przyczyniają się do degradacji kolagenu. Jednym z takich enzymów jest prolidaza, która katalizuje końcowy etap metabolizmu kolagenu czyli proces hydrolizy imidopeptydów z C-końcową proliną lub hydroksyproliną. Aktywność tego enzymu wzrasta w warunkach wzmożonej degradacji kolagenu oraz w przebiegu przewlekłego procesu zapalnego czy chorób przewlekłych [32,33]. W przeprowadzonym badaniu zaobserwowano znamiennie wyższą aktywność prolidazy w przypadku pacjentek z grupy RA. W większości przeprowadzonych dotychczas badań aktywność prolidazy oznaczano we krwi, a następnie porównywano ją pomiędzy grupą chorych na OA i osobami zdrowymi. Altindag i wsp. zaobserwowali spadek aktywności tego enzymu w grupie chorych na OA. Wg autorów przyczyną tego faktu jest zahamowanie procesu resyntezy kolagenu, który ulega degradacji pod wpływem działania ROS [2]. Jedynie w badaniu Fitowskiej i wsp. porównywano aktywność prolidazy w błonie maziowej osób zdrowych i chorujących na OA. W badaniach tych zaobserwowano wzrost aktywności tego enzymu w grupie OA [24]. Z kolei w badaniu przeprowadzonym przez Deberg i wsp. porównywano grupę pacjentów chorych na RA z pacjentami chorymi na OA oraz z osobami zdrowymi. Przedmiotem zainteresowania badaczy były fragmenty peptydów wchodzących w skład kolagenu typu II, który w przebiegu procesu zapalnego zachodzącego w przebiegu OA i RA podlega procesowi nitrowania. Autorzy zaobserwowali wzrost stężenia oznaczanych markerów w obu grupach badanych w porównaniu do osób zdrowych. Jednakże w grupie RA wzrost stężenia nitrowanych peptydów był znacznie większy niż miało to miejsce w grupie OA. Na podstawie uzyskanych wyników wywnioskowano, iż w przebiegu chorób układu ruchu dochodzi do wzmożonej degradacji kolagenu, a proces ten jest znacznie bardziej nasilony w przypadku reumatoidalnego zapalenia stawów niż w przebiegu choroby zwyrodnieniowej []. Prolidaza, uczestnicząc w procesach degradacji kolagenu, stanowi ważny element metabolizmu białkowego. Innym istotnym dla tego zjawiska enzymem jest dehydrogenaza glutaminianowa, GLDH (E.C..4..2). Katalizuje ona odwracalną reakcję oksydacyjnej deaminacji glutaminianu, w wyniku czego powstaje amoniak oraz alfa-ketoglutaran. Ten ostatni jest następnie włączany do cyklu Krebsa, co czyni go ważnym źródłem energii. Reakcja przebiegająca w odwrotnym kierunku, czyli synteza glutaminianu, jest punktem wyjścia do powstania glutaminy, z której w dalszej kolejności powstają inne aminokwasy. Zatem dehydrogenaza glutaminianowa to enzym odgrywający ważną rolę zarówno w procesie syntezy, jak i degradacji białek. W przeprowadzonym badaniu zaobserwowano znamienny wzrost aktywności GLDH w grupie RA w porównaniu do grupy OA. Na tej podstawie można więc wnioskować, iż w przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów dochodzi do nasilenia tempa metabolizmu białkowego na skutek wzmożonej degradacji kolagenu oraz innych składników białkowych przez ROS oraz enzymy proteolityczne [34]. Natomiast zaobserwowany przez Fitowską wsp. wzrost aktywności GLDH u osób chorych na OA w porównaniu do osób zdrowych, potwierdza fakt nasilenia metabolizmu białkowego również w innych chorobach układu ruchu [24]. Oprócz degradacji elementów chrzęstnych stawu, w przebiegu chorób układu ruchu dochodzi również do uszkodzenia elementów kostnych. W procesie tym uczestniczy m.in. winiano-oporna fosfataza kwaśna (fosfataza typu, TRAP EC ), która katalizuje procesy hydrolizy estrów fosforanowych w kwaśnym środowisku. Jej nazwa wywodzi się z faktu, iż jest oporna na działanie wysokich stężeń L-winianu, co wyróżnia ją spomiędzy grupy pozostałych fosfataz. TRAP odgrywa bardzo ważną rolę w procesie resorpcji tkanki kostnej, a wzrost jej aktywności można zaobserwować m.in. u rosnących dzieci, kobiet po menopauzie, w przebiegu choroby Gauchera czy choroby Pageta. Na uwagę zasługuje również fakt, iż fosfataza kwaśna ma zdolność do generowania ROS, co dodatkowo nasila degradację kolagenu i destrukcję elementów chrzęstno-kostnych stawu [3,36]. TRAP występuje w postaci dwóch izoform a oraz b. Izoforma b najlepiej koreluje z aktywnością osteoklastów, czego potwierdzeniem

6 Polish Orthopedics and Traumatology, 2; 77: x-xx jest wzrost jej aktywności w przebiegu chorób związanych z nasiloną resorpcją kostną (choroba zwyrodnieniowa stawów czy końcowe stadium przewlekłej choroby nerek) oraz spadek w trakcie terapii antyosteoklastycznej. Z kolei izoforma a nie jest zaliczana do grupy markerów metabolizmu kostnego [3,37,38]. Obecność TRAP w synowiocytach mających styczność z powierzchnią chrząstki potwierdzili w badaniu histologicznym Tsuboi i wsp. potwierdzając jej rolę w procesie destrukcji chrząstki w przebiegu tej choroby [39]. Z przeprowadzonych do tej pory badań wynika, iż na wzrost aktywności fosfatazy kwaśnej w surowicy krwi pacjentów RA wpływają dwa czynniki. Pierwszym z nich jest wzrost aktywności izoformy a, co jest skutkiem wydzielania tego enzymu przez bardzo liczne makrofagi uczestniczące w rozwoju Piśmiennictwo:. Aletaha D, Neogi T, Silman AJ i wsp.: 0 Rheumatoid Arthritis Classification Criteria. Arthritis & Rheumatism, 0; 62: Taylor PC, Feldmann M: Rheumatoid Arthritis: pathogenic mechanism and therapeutic targets. Drug Discovery Today: Disease Mechanism, 04; : Sarban S, Kocyigit A, Yazar M i wsp.: Plasma total antioxidant capacity, lipid peroxidation, and erythrocyte antioxidant enzyme activities in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis, Clinical Biochemistry, 0; 38: Bijlsma JWJ, Berenbaum F, Lafeber FPJG: Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice. Lancet, ; 377: Burnett BP, Levy R, Cole BJ: Metabolic Mechanism in the Pathogenesis of Ostoarthritis. The Journal of Knee Surgery, 06; 9: Hitchon CA, El-Gabalawy HS: Oxidation in Rheumatoid Arthritis. Arthritis Res Ther, 04; 6: Czajka A: Wolne rodniki tlenowe a mechanizmy obronne organizmu. Nowiny Lekarskie, 06; 7: Zabłocka A, Janusz M: Dwa oblicza wolnych rodników tlenowych. Postepy Hig Med Dosw, 08; 62: Burton GJ, Jauniaux E: Oxidative Stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, ; 2(3): Rahman K: Studies on free radicals, antioxidants, and co-factors. Clin Interv Aging, 07; 2(2): Deberg M, Labasse A, Christgau S i wsp.: New serum biochemical markers (Coll 2- and Coll 2- NO2) for studying oxidative-related type II collagen network degradation in patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Osteoarthritis Cartilage, 0; 3(3): Altindag O, Erel O, Aksoy N i wsp.: Increased oxidative stress and its relation with collagen metabolism in knee osteoarthritis. Rheumatol Int, 07; 27(4): Dobrakowski M, Fitowska A, Hapeta B i wsp.: Metodyka przygotowania błony maziowej do badań biochemicznych. Chirurgia Kolana Artroskopia Traumatologia Sportowa, 09; 6: Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL i wsp.: Protein measurement with the Folin phenol reagent, J Biol Chem, 9; 93: Oyanagui Y: Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity, Anal Biochem, 984; 42: Myara I, Charpentier C, Lemonnier A: Optimal conditions for prolidase assay by proline colorimetric determination: application to imminodipeptiduria. Clin Chim Acta, 982; 2: Krawczynski J: Diagnostyka enzymologiczna w medycynie praktycznej, PZWL, Warszawa, Koster JF, Biemond P, Swaak AJG: Intracellular and extracellular sulphydryl levels in rheumatoid arthritis, Ann Rheum Dis, 986; 4: Sweeney SE, Firestein GS: Rheumatoid arthritis: regulation of synovial inflammation. The Interventional Journal of Biochemistry & Cell Biology, 04; 36: Yamanaka H, Goto K, Miyamoto K: Scoring evaluation for histopathological features of synovial membrane in patients with rheumatoid arthritis during anti-tumor necrosis factor therapy, Rheumatol Int, 0; : Chen BX, Francis MJ, Duthie RB i wsp.: Oxygen free radical in human osteoarthritis, Chin Med J (Engl), 989; 02: przewlekłego procesu zapalnego w przebiegu RA. Z kolei zaobserwowane zwiększenie zarówno aktywności jak i stężenia izoformy b, wynika z nasilonego procesu resorpcji kostnej [37,38,]. Zaobserwowany wzrost aktywności w błonie maziowej potwierdza fakt wzmożonej resorpcji kostnej w przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów. Wnioski Porównując zmiany patogenetyczne zachodzące w obrębie błony maziowej u chorych na RA oraz u chorych na OA, można stwierdzić, że w przebiegu RA tempo przemian metabolicznych synowiocytów jest większe, co wiąże się z nasilonym obrotem białkowym. 22. Henrotin YE, Bruckner P, Pujol J-PL: The role of reactive oxygen species in homeostasis and degradation of cartilage. Osteoarthritis and Cartilage, 03; : Cadenas E, Davies KJA: Mitochondrial free radical generation, oxidative stress and aging, Free Radical Biology & Medicine, 00; 29: Fitowska A, Ostałowska A, Dobrakowski M i wsp.: Gospodarka białkowa błony maziowej w chorobie zwyrodnieniowej stawu biodrowego. Pol Orthop Traumatol, 2; 77: Tadashi I, Kaneda H, Honiuchi S i wsp.: A Remarkable Increase of Superoxide Dismutase Activity in Synovial Fluid of Patients with Rheumatoid Arthitis. Clin Orthop Relat Res, 982; 62: Taysi S, Polat F, Gul M i wsp.: Lipid peroxidation, some extracellular antioxidants, and antioxidant enzymes in serum of patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol Int, 02; 2: Cimen MYB, Cimen OB, Kacmaz M i wsp.: Oxidant/Antioxidant Status of the Erythrocytes from Patients with Rheumatoid Arthritis. Clin Rheumatol, 00; 9: Hassan MQ, Hadi RA, Al-Ravi ZS i wsp.: The Glutathione Defense System in the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. J Appl Toxical, 0; 2: Jaswal Sh, Mehta HCh, Sood AK i wsp.: Antioxidant Status In Rheumatoid Arthritis and role of antioxidant therapy. Clinica Chimica Acta, 03; 338: Kiziltunc A, Cogalgil S, Cerrahoglu L: Carnnitine and Antioxidants Levels in Patients with Rheumatoid Arthritis, Scand J Rheumatol, 998; 27: Maurice MM, Nakamura H, Gringhuis S i wsp.: Expression of the Thioredoxin-Thioredoxin Reductase System in the Inflammed Joints of Patients with Rheumatoid Arthritis. Arthritis and Rheumatism, 999; 42: Surazynski A, Miltyk W, Palka A i wsp.: Prolidase-dependent regulation of collage biosynthesis. Amino Acids, 08; 3: Gencer M, Aksoy N, Dagli EC i wsp.: Prolidase activity dysregulation and its correlation with oxidative-antioxidative status in chronic obstructive pulmonary disease. J Clin Lab Anal, ; 2(): Dawson NJ, Storey KB: An enzymatic bridge between carbohydrate and amino acid metabolism: regulation of glutamate dehydrogenase by reversible phosphorylation in a severe hypoxia-tolerant crayfish. J Comp Physiol B, 2; 82: Janckila AJ, Neustadt DH, Nakasato YR i wsp.: Serum tartrate-resistant acid phosphatase isoforms in rheumatoid arthritis, Clinica Chimica Acta, 02; 3: Oddie GW, Schenk G, Angel NZ i wsp.: Structure, Function and Regulation of Tartrate-Resistant Acid Phosphatase. Bone, 00; 27: Janckila AJ, Neustadt DH, Yam LT: Significance of Serum TRACP in Rheumatoid Arthritis. J Bone Miner Res, 08; 23: Takahashi K, Janckila AJ, Sun SZ i wsp.: Electrophoretic study of tartrate-resistant acid phosphatase isoforms in endstage renal disease and rheumatoid arthritis. Clinica Chimica Acta, 00; : Tsuboi H, Matsui Y, Hayashida K i wsp.: Tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) positive cells in rheumatoid synovial membrane may increase the destruction of articular cartilage. Ann Rheum Dis, 03; 62: Janckila AJ, Takahashi K, Sun SZ i wsp.: Tartrate-resistant Acid Phosphatase Isoform b as Serum Marker of Osteoclastic Activity. Clin Chem, 0; 47: