POZIOM WYBRANYCH WSKAŹNIKÓW BIOCHEMICZNYCH WE KRWI SZCZURÓW EKSPONOWANYCH NA OZON I OTRZYMUJĄCYCH INIEKCJE WITAMIN A I D 3

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Medicina Veterinaria 3(1) 2004, POZIOM WYBRANYCH WSKAŹNIKÓW BIOCHEMICZNYCH WE KRWI SZCZURÓW EKSPONOWANYCH NA OZON I OTRZYMUJĄCYCH INIEKCJE WITAMIN A I D 3 Maria Jedlińska-Krakowska, Karol Jakubowski, Andrzej Kowalski Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie Streszczenie. U szczurów otrzymujących róŝne dawki witaminy A i D 3 i przebywających w atmosferze zwiększonej koncentracji ozonu w powietrzu, badano w osoczu krwi stęŝenie glukozy, białka całkowitego, lipidów całkowitych, triglicerydów oraz aktywność alkalicznej fosfatazy. Badania wykazały, Ŝe stosowane witaminy nie zapobiegały szkodliwym skutkom długotrwałej ekspozycji na ozon, a w wyŝszych dawkach jeszcze bardziej obni- Ŝały poziom białka całkowitego i aktywność fosfatazy alkalicznej oraz podwyŝszały koncentrację lipidów całkowitych. Słowa kluczowe: szczury, ozon, witamina A, witamina D, glukoza, białko całkowite, lipidy całkowite, triglicerydy, fosfataza alkaliczna WSTĘP Oprócz źródeł zewnętrznych, reaktywne formy tlenowe mogą być równieŝ generowane w samym organizmie podczas procesów metabolicznych bądź stanów chorobowych. Dla prawidłowego funkcjonowania ustroju niezbędne jest więc utrzymanie stanu równowagi pomiędzy procesami oksydacyjnymi i antyoksydacyjnymi. Odpowiedzialny za to jest szereg mechanizmów obronnych, takich jak m.in. układy enzymatyczne, zmiatacze wolnych rodników, jony metali przejściowych oraz przeciwutleniacze, jak np. witaminy E i C. Wcześniejsze badania własne wykazały, Ŝe witaminy te, stosowane w niskich dawkach, podwyŝszają wartość niektórych wskaźników biochemicznych i immunologicznych, obniŝonych u zwierząt eksponowanych na ozon. Natomiast wysokie dawki tych witamin, zwłaszcza witaminy C, wyraŝnie zwiększają nasilenie niekorzyst- Adres do korespondencji Corresponding author: Maria Jedlińska-Krakowska, Katedra Patologii i Farmakologii, Zespół Patofizjologii, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, ul. Oczapowskiego 13, Olsztyn,.

2 80 M. Jedlińska-Krakowska i in. nych zmian spowodowanych wywołanym przez ozon stresem oksydacyjnym [Jedlińska-Krakowska i in a, b]. W dostępnym piśmiennictwie jest zdecydowanie mniej prac na temat wpływu innych witamin na przebieg i skutki stresu oksydacyjnego, aczkolwiek wiadomo jest, iŝ beta-karoten, będący prowitaminą A, jak równieŝ sama witamina A wykazuje działanie antyoksydacyjne w środowisku hydrofobowym ustroju. Zapobiega ona peroksydacji lipidów, wygaszając aktywność wzbudzonych cząsteczek pełni funkcję zmiatacza wolnych rodników w szeregu naturalnych i modelowych układach błon [Livera i in. 1995]. Jednocześnie wykazano, Ŝe sama witamina A moŝe indukować stres oksydacyjny w komórkach Sertoliego poprzez modulację aktywności enzymów antyoksydacyjnych [Dal Pizzol i in. 2001]. Zwiększa ona równieŝ ryzyko wystąpienia nowotworów płuc, gdyŝ na skutek autooksydacji retinoidów w obecności endogennych metali powstaje H 2 O 2, powodujący uszkodzenia DNA (Murata i Kawanishi 2000). Wiadomo równieŝ, Ŝe witamina D 3 (cholekalciferol) i jej metabolit 1,25- -dihydroksycholekalciferol hamują proces peroksydacji lipidów [Floriańczyk 2000]. Witamina D wpływa teŝ na potencjał oksydoredukcyjny komórki, co moduluje aktywność redox-wraŝliwych enzymów i jest związane z jej działaniem przeciwnowotworowym [Koren i in. 2001]. Uwzględniając powyŝsze informacje, postanowiono zbadać, czy zwiększona podaŝ witamin A i D 3, wykazujących działanie ochronne w stosunku do lipidów, jak równieŝ posiadających bardzo szerokie spektrum działania w Ŝywym organizmie, jest w stanie zapobiec ewentualnym negatywnym skutkom zwiększonej koncentracji ozonu w powietrzu. MATERIAŁ I METODY Doświadczenie przeprowadzono na 50 klinicznie zdrowych, 5-miesięcznych szczurach, samcach rasy Wistar/Hannover o średniej masie ciała 300 ± 10 g, pochodzących z hodowli własnej (Zakład Patofizjologii UWM w Olsztynie). Szczury utrzymywane były w warunkach naturalnego oświetlenia w pomieszczeniach z wentylacją grawitacyjną i Ŝywione ad libitum standardową paszą granulowaną dla gryzoni Murigran (Wytwórnia Pasz w Motyczu k. Lublina). Wszystkie zwierzęta podzielono losowo na 5 grup (w kaŝdej n=10), oznaczonych niŝej podanymi skrótami: Grupa I (K) zwierzęta kontrolne; Grupy II V (doświadczalne) eksponowano na 0.5 ± 0.2 ppm ozonu przez okres 30 dni. Czas ekspozycji 5 godzin dziennie ( ). Ponadto, zwierzęta z grup II IV otrzymywały co 7 dni i.m. iniekcje witamin A i D 3 (Vitaminum A+D 3 Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne Polfa) w następujących dawkach (j.m./szczura): Grupa II (A+D 3 ) j.m. witaminy A j.m. witaminy D 3 Grupa III (A+D 3 ) j.m. witaminy A j.m. witaminy D 3 Grupa IV (A+D 3 ) j.m. witaminy A j.m. witaminy D 3 Grupa V (KO) ekspozycja na ozon bez osłony witaminowej. Ozon wytwarzano ze spręŝonego powietrza w ozonatorze typu IMPOZ-4 (Instytut Mechaniki Precyzyjnej, Warszawa) i dostarczano go do komory ekspozycyjnej, czyli Acta Sci. Pol.

3 Poziom wybranych wskaźników biochemicznych uszczelnionego chemicznie neutralną i nieszkodliwą dla Ŝywych organizmów folią polietylenową pomieszczenia (o objętości 42,6 m 3 ), za pomocą przewodu polietylenowego. W pomieszczeniu tym ozon ulegał samoistnemu wymieszaniu z obecnym tam powietrzem. StęŜenie ozonu w komorze ekspozycyjnej kontrolowano metodą jodometryczną Saltzmana [1959]. Uwzględniając dane dotyczące zuŝycia tlenu przez szczura [Cosnier 1967], w połowie czasu ekspozycji powietrze w komorze wymieniano w celu zapobieŝenia nagromadzeniu się nadmiernej ilości CO 2, po czym stęŝenie ozonu doprowadzano do pierwotnego poziomu. Wszystkie szczury, zarówno doświadczalne, jak i kontrolne, trzymane były w klatkach, po 5 sztuk w kaŝdej. Podczas ozonowania zwierzęta miały swobodny dostęp tylko do wody, natomiast pasza, ze względu na utleniający wpływ ozonu, była odstawiana. Poza pięcioma godzinami eskpozycji wszystkie szczury przebywały w identycznych warunkach uwzględniających skład powietrza, temperaturę i sposób Ŝywienia. Po zakończeniu doświadczenia od wszystkich zwierząt będących w narkozie halotanowej (Narcotan, Leciva Czech Republic) metodą punkcji serca pobierano maksymalną ilość krwi, aŝ do całkowitego skrawienia zwierzęcia. Uzyskaną krew wirowano w temp. 4 C przez 10 min przy 3000 obr./min, po czym oddzielone osocze do czasu przeprowadzenia oznaczeń zamroŝono w temp. 22 C. W osoczu krwi oznaczono: aktywność fosfatazy alkalicznej (AP) metodą Bessey i wsp. [1946] poziom glukozy metodą o-toluidynową Hultmana (1959), poziom lipidów całkowitych metodą z sulfowaniliną [Chromy i in. 1975], poziom triglicerydów zmodyfikowaną metodą Fletchera [Fletcher 1968, Foster i Dunn 1973] przy uŝyciu zestawów diagnostycznych produkcji LACHEMA-Brno (triglicerydy) i ZPOCH-Gliwice (fosfataza alkaliczna, glukoza, białko całkowite, lipidy całowite). Wyniki badań opracowano testem t. (program Statgraphic - Statistical Graphic System), wyliczając średnie arytmetyczne, błąd standardowy średniej oraz istotność róŝnic w stosunku do grupy kontrolnej (I K) i eksponowanej na ozon (V KO). OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA U zwierząt ozonowanych, jak równieŝ otrzymujących wysokie dawki witaminy A i D 3, nie zaobserwowano istotnych zmian poziomu glukozy we krwi w stosunku do grupy kontrolnej. Widoczna jest jedynie niewielka tendencja wzrostowa, najwyŝsza u szczurów eksponowanych na ozon, bez osłony witaminowej. Natomiast w grupie zwierząt otrzymujących niskie dawki obu witamin nastąpił istotny statystycznie wzrost jej koncentracji. Wzrost poziomu glukozy we krwi jest charakterystyczny dla reakcji stresowej i świadczy o uczynnieniu układu współczulno-rdzeniowo-nadnerczowego, a następnie przysadkowo-korowo-nadnerczowego. Fakt, Ŝe u szczurów dostających średnie i wysokie dawki witamin A i D 3 koncentracja glukozy jest porównywalna z grupą kontrolną, co moŝe być związane z regulacyjną rolą kalcytriolu w sekrecji insuliny. Zmniejszając w dawkozaleŝny sposób wydzielanie tego hormonu witamina D wywiera działanie hypoglikemiczne [Maestro i in. 2000, Harbans i in. 1999] (tab. 1). Poziom białka całkowitego uległ obniŝeniu we wszystkich grupach doświadczalnych. Spadek koncentracji był tym większy, im wyŝsza była dawka witamin. Jednocześnie, u wszystkich ozonowanych zwierząt wzrosło we krwi stęŝenie lipidów całkowitych. Podobnie jak w przypadku glukozy, spadek poziomu białka i wzrost lipidów cał- Medicina Veterinaria 3(1) 2004

4 82 M. Jedlińska-Krakowska i in. kowitych jest odzwierciedleniem reakcji stresowej, ze zwiększonym wydzielaniem ACTH (hormon adrekokortykotropowy) i hormonów kory nadnerczy, czemu towarzyszy wzmoŝona degradacja białek i uwalnianie do krwi wolnych kwasów tłuszczowych z tłuszczu zapasowego. Podobne zmiany wartości obu ww. wskaźników biochemicznych miały miejsce u zwierząt eksponowanych na ozon i nieotrzymujących Ŝadnych witamin. Najsilniejsze, istotne statystycznie zmiany koncentracji białka całkowitego i lipidów całkowitych wykazano u zwierząt ozonowanych (grupa V) i otrzymujących wysokie dawki witamin A i D 3 (grupa III i IV). MoŜe być to związane z faktem, iŝ witamina D uczestniczy w przemianach lipidów, m.in. poprzez regulację metabolizmu adipocytów i aktywności lipazy proteinowej [Querfeld i in. 1997], jak równieŝ z zaburzeniami czynnościowymi wątroby. Z kolei wysokie dawki witaminy A powodują ogólny spadek syntezy białek [Hough i in. 1988]. Tabela 1. Poziom wybranych wskaźników biochemicznych (± SEM) w osoczu krwi szczurów (n=10) Table 1. Blood plasma concentrations of the selected biochemical indices (± SEM) in the rats (n=10) Grupa / Oznaczenie Group/Determination Glukoza Glucose [mmol/l] Białko całkowite Total protein [g. dm -3 ] Lipidy całkowite Total lipids [g. dm -3 ] Triglicerydy Triglicerydes [mmol/l] AP [U/l] I K II A+D 3 III A+D 3 IV AD 3 V KO 7.17 ± ± ± ± ± a ± B ± a B ± B ± ± ± a b ± B ± B ± ± ± a ± A ± B ± a ± ± A A ± a ± ± 3.32 A p 0.01 a p 0.05 róŝnice statystycznie istotne w stosunku do grupy kontrolnej (I K) B p 0.01 b p 0.05 róŝnice statystycznie istotne w stosunku do grupy kontrolnej eksponowanej na ozon (V KO) A p 0.01 a p 0.05 significance in relation to the control group (I K) B p 0.01 b p 0.05 significance in relation to the contol group exposed to ozone (V KO) W grupie zwierząt otrzymujących najniŝsze dawki witamin zaobserwowano niewielki, nieistotny statystycznie, wzrost aktywności alkalicznej fosfatazy (AP), natomiast w grupach otrzymujących wyŝsze dawki wyraźne jej obniŝenie, przy niezmienionej aktywności enzymu u szczurów eksponowanych tylko na ozon. Z kolei poziom triglicerydów, obniŝony w grupie KO, wykazywał wartości porównywalne z grupą kontrolną u zwierząt otrzymujących witaminy A i D 3. Takie kształtowanie się aktywności AP moŝe wskazywać na zaburzenia czynnościowe wątroby. NajniŜsza natomiast, s.i. aktywność enzymu u zwierząt otrzymujących najwyŝsze dawki tych witamin, moŝe być spowodowana stanem hyperwitaminozy D i zaburzeniami gospodarki wapniowo-fosforanowej [Harbans i in. 1999]. Acta Sci. Pol.

5 Poziom wybranych wskaźników biochemicznych Uzyskane wyniki wykazały, Ŝe witaminy A i D 3, pomimo swoich właściwości antyoksydacyjnych, nie zapobiegały szkodliwym skutkom długotrwałej ekspozycji na zwiększoną koncentrację ozonu w powietrzu. Z kolei stosowane w wyŝszych dawkach, jeszcze bardziej obniŝały poziom białka całkowitego i aktywność fosfatazy alkalicznej oraz podwyŝszały koncentrację lipidów całkowitych. WNIOSKI 1. Witaminy A i D 3, pomimo swoich właściwości antyoksydacyjnych, nie zapobiegły szkodliwym skutkom długotrwałej ekspozycji na zwiększoną koncentrację ozonu w powietrzu. 2. Stosowane w wyŝszych dawkach powodowały obniŝenie poziomu białka całkowitego i aktywności alkalicznej fosfatazy oraz wzrost koncentracji lipidów całkowitych. PIŚMIENNICTWO Bessey O.H., Lowry O.H., Brock M.J., A method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic milimeters of serum. J. Biol. Chem., 164, Chromy V., Kukla R., Hornakova M., Malimankova A., Belusa J., Oznaczanie lipidów całkowitych metodą sulfosfo-wanilinową. Ustalenie optymalnych parametrów metody. Diagn. Lab. XI, (3), Cosnier J., The role of certain early environmental conditions on the psychophysiological development of animals. Husbandry of laboratory animals, Ed ML, Academic Press, London and New York, Dal-Pizzol F., Benfato M.S., Bernard E.A., Moreira J.C., Retinol supplementation induces oxidative stress and modulates antioxidant enzyme activites in rat Sertoli Cells. Free Radic. Res., 34(4), Fletcher M.J., A colorimetric method for estimating serum triglicerides. Clin. Chim., 22(3), Floriańczyk B., Pierwiastki śladowe i witaminy w systemie antyoksydacyjnym ustroju. Annales Universitatis Mariae Curie-Skłodowska Lublin Polonia, XII/XIII (17): Foster L.B., Dunn R.C., Stable reagents for determination of serum triglicerydes by a colorimetric Hantzsch condensation method. Clin. Chem., 19(3), Harbans L., Rajesh P., Aggarwal S.K., Vitamin D: non skeletal actions and effects on growth. Nutr. Res., 19(11), Hough S., Avioli L.V., Muir H., Gelderblom D., Jenkins G., Kurasi H., Slatopolsky E., Bergfeld M.A., Teitelbaum S.L., Effects of hypervitaminosis A on the bone and mineral metabolism of the rat. Endocrinology, 122(6), Hultman E., Rapid specific method for determination of aldosaccharides in body fluids. Nature, 183, Jedlińska-Krakowska M., Jakubowski K., Kowalski A., 2002a. Effect of increased ozone concentration in the air on the level of some immunological indices in rats given vitamin E and vitamin C. Acta Poloniae Toxicologica, 10(1), Jedlińska-Krakowska M., Jakubowski K., Kowalski A., 2002b. Poziom wybranych wskaźników biochemicznych w osoczu krwi szczurów iniekowanych witaminami E i C w warunkach zwiększonej koncentracji ozonu w powietrzu. Bromat. Chem. Toksykol., 2, Medicina Veterinaria 3(1) 2004

6 84 M. Jedlińska-Krakowska i in. Koren R., Hadari-Naor I., Zuck E., Rotem C., Liberman U.A., Ravid A., Vitamin D is prooxidant in breast cancer cells. Cancer Res., 61(4), Krawczyński J., Osiński T., Laboratoryjne metody diagnostyczne, PZWL, Warszawa. Livera M.A., Tesoriere L., Bongiorno A., Pintaudi A.M., Ciaccio M., Riccio A., Contribution of vitamin A to the oxidation resistance of human low density lipoproteins. Free Radic. Biol. Med., 18(3), Maestro B., Campion J., Davila N., Calle C., Stimulation by 1,25-dihydroxyvitamin D 3 of insulin receptor expression and insulin responsiveness for glucose transport in U-937 human promonocytic cells. Endocr. J., 47(4), Murata M., Kawanishi S., Oxidative DNA damage by vitamin A and its derivative via superoxide generation. J. Biol. Chem., 275(3), Querfeld U., Klaus G., Hoffmann M.M., Vitamin D and parathormone have antagonistic effects on lipoprotein lipase in adipocytes. Atherosclerosis, 134 (1 2), 27. Saltzman B.E., Gilbert N., Iodometric microdetermination of organic oxidants and ozone. Anal. Chem., 31: THE LEVELS OF SELECTED BIOCHEMICAL INDICES IN BLOOD OF THE RATS INJECTED WITH VITAMINS A AND D 3 AND EXPOSED TO OZONE Abstract. The levels of glucose, total protein, total lipids, triglicerides and activity of alkaline phosphatase were measured in rats injected with different doses of vitamins A and D 3 and kept in atmosphere of elevated level of ozone in air. Investigations showed that mentioned vitamins did not protect the animals against long term exposition of ozone. However, vitamines used in higher doses caused decreased the levels of total proteins and activity of alkaline phosphatase and increased the concentration of total lipids. Key words: rats, ozone, vitamin A, vitamin D, glucose, total protein, total lipids, triglycerides, alkaline phosphatase Zaakceptowano do druku Accepted for print: Acta Sci. Pol.