BADANIE CHOROBY RESZTKOWEJ U CHORYCH NA SZPICZAKA MNOGIEGO. CZ. II. ANALIZA MARKERÓW MOLEKULARNYCH

Transkrypt

1 281 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM NR 2 ( ) BADANIE CHOROBY RESZTKOWEJ U CHORYCH NA SZPICZAKA MNOGIEGO. CZ. II. ANALIZA MARKERÓW MOLEKULARNYCH MINIMAL RESIDUAL DISEASE ASSESSMENT IN MULTIPLE MYELOMA PATIENTS. PART II. MOLECULAR MARKERS ANALYSIS Ma³gorzata ROKICKA, Tigran TOROSIAN Katedra i Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnêtrznych AM w Warszawie Streszczenie: Wprowadzenie nowoczesnych metod leczenia chorych na MM wi¹ e siê z koniecznoœci¹ poszukiwania lepszych technik oceny choroby resztkowej (MRD, ang. minimal residual disease) umo - liwiaj¹cych wczesne rozpoznanie i leczenie nawrotu choroby. Najczêœciej stosuje siê metody fenotypowania i cytometrii przep³ywowej oraz ró ne rodzaje iloœciowego i jakoœciowego PCR. W artykule przedstawiono wady i zalety oraz zastosowanie kliniczne ró nych metod badania MRD u chorych na MM. S³owa kluczowe: szpiczak mnogi, choroba resztkowa, PCR, PCR w czasie rzeczywistym. Summary: Introducing of the new methods of treatment of MM patients is connected with necessity of searching for more sophisticated methods of MRD evaluation and earlier diagnosis and treatment of relapse. The most often used methods are the fenotyping with flow cytometry and different types of qualitative and quantitative PCR. The merits and drawbacks of different method MRD evaluation are described. Key words: Multiple myeloma, minimal residual disease, PCR, real time PCR. WPROWADZENIE Szpiczak mnogi (MM, ang. myeloma multiplex) jest nowotworem, charakteryzuj¹cym siê niekontrolowanym rozrostem plazmocytów. Choroba poddaje siê leczeniu standardow¹ chemioterapi¹, jednak niemo liwe jest za pomoc¹ tej metody ca³kowite wyleczenie MM. Po leczeniu konwencjonalnym œredni czas prze ycia chorych wynosi 30 miesiêcy. Zastosowanie wysokodawkowanej chemioterapii wspomaganej przeszcze-

2 282 M. ROKICKA, T. TOROSIAN pieniem autologicznych komórek macierzystych pozyskanych ze szpiku (ABMT z ang. autologous bone marrow transplantation) lub z krwi obwodowej (PBSCT z ang. peripheral blood stem cell transplantation) poprawi³o wyniki leczenia czêœciej udaje siê uzyskaæ ca³kowit¹ remisjê choroby, wyd³u y³ siê czas prze ycia chorych bez objawów choroby oraz czas ich ca³kowitego prze ycia. Jednak nadal nieuchronny jest nawrót choroby. Postêpy terapii MM stwarzaj¹ piln¹ potrzebê opracowania metod badania obecnoœci MRD w celu monitorowania odpowiedzi na ró ne typy leczenia oraz analizy materia³u przeszczepianego pod k¹tem zanieczyszczenia komórkami nowotworowymi. Badanie MRD mo e mieæ równie istotne znaczenie w poznaniu patofizjologii i biologii choroby. ANALIZA MARKERÓW MOLEKULARNYCH. ZASTOSOWANIE JAKOŒCIOWEJ REAKCJI AÑCUCHOWEJ POLIMERAZY (PCR) W BADANIU MRD U CHORYCH NA MM Uk³ad odpornoœci jest zdolny do rozpoznawania i odpowiedzi na szerok¹ gamê antygenów dziêki ogromnej zmiennoœci przeciwcia³ produkowanych przez limfocyty B, a zw³aszcza ró norodnoœci miejsc wi¹ ¹cych antygen w Ig. O swoistym rozpoznawaniu ró nych antygenów decyduj¹ czêœci zmienne ³añcuchów ciê kich i lekkich Ig. Zró nicowanie odpowiedzi immunologicznej jest pochodn¹ rekombinacji genowych oraz ich dodatkowym przegrupowaniom w okresie transkrypcji materia³u genetycznego. Proces generowania zmiennoœci przeciwcia³ jest niezwykle z³o ony. W okresie wczesnych etapów ró nicowania komórek uk³adu odpornoœciowego, ka dy odcinek zmienny Ig jest kodowany przez dwa lub wiêcej segmenty genu, po³¹czone ze sob¹ w procesie przegrupowania DNA koduj¹cego Ig. Domena zmienna ³añcucha Ig jest kodowana przez gen z³o ony z sekwencji dla czêœci zmiennej (V ang. variable), ró norodnoœci (D ang. diversity), i ³¹cz¹cej (J ang. joining). Proces rekombinacji genów dla ³añcucha ciê kiego Ig zaczyna siê od po³¹czenia genu D z J, nastêpnie jest przy³¹czany gen V. Uproszczony schemat organizacji genów dla Ig przedstawiono na rycinie 1. Dodatkowa modyfikacja budowy Ig zwiêkszaj¹ca jej ró norodnoœæ zachodzi miêdzy innymi poprzez: delecje niektórych nukleotydów w ³añcuchu DNA, nieprecyzyjne ³¹czenie siê egzonów oraz dodawaniu na z³¹czach VDJ sekwencji kilkunukleotydowych koduj¹cych dodatkowe aminokwasy. Repertuar swoistoœci Ig mo e byæ dodatkowo zwiêkszony i adaptowany po ekspozycji limfocytów na ró ne antygeny. Proces ten nosi nazwê mutacji somatycznych, kiedy nieliczne geny linii zarodkowej daj¹ pocz¹tek wielu zmutowanym genom w czasie ycia osobnika podczas ciêcia i ³¹czenia nici DNA do wolnych koñców. Ponadto mog¹ przy³¹czaæ siê równie dodatkowe nukleotydy, a wiele ro nych fragmentów genów mo e podlegaæ rekombinacji przed utworzeniem genu V. Mutacjê somatyczne oraz rekombinacje somatyczne s¹ czasem spotykane równie w niektórych nowotworach

3 283 RYCINA 1. Schemat przegrupowania genów dla ludzkiego genu IgH, w tym przypadku DH3 jest w pierwszym etapie przy³¹czony do IH4. Nastêpnie VH4 przy³¹cza siê do DH3-JH4 uk³adu ch³onnego. Odcinek ³¹cz¹cy J w powsta³ym w taki sposób ³añcuchu Ig jest niepowtarzalny, charakterystyczny osobniczo, bywa porównywany do linii papilarnych. Jest on typowy nie tylko dla ka dego limfocytu oraz równie dla nowotworu wywo-dz¹cego siê z uk³adu ch³onnego. Jest on, zatem idealnym celem badania MRD za pomoc¹ technik molekularnych, np. najbardziej popularnej PCR, w których stosuje siê swoiste sondy o budowie komplementarnej do poszukiwanego nieprawid³owego odcinka genu [29]. Technika PCR umo liwia wybiórcz¹ amplifikacjê okreœlonego regionu DNA [32] i polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankuj¹cych okreœlony odcinek DNA. Warunkiem wykonania badania jest znajomoœæ sekwencji nukleotydów ograniczaj¹cych powielany odcinek DNA tak, aby mo na by³o syntetyzowaæ dwa komplementarne startery o d³ugoœci ok. 20 nukleotydów. Typowa reakcja obejmuje 30 powtarzaj¹cych siê cyklicznie etapów: termicznej denaturacji powielanego DNA, wi¹zania starterów z matryc¹ i syntezy DNA (ryc. 2). Analiza produktów PCR polega na ich uwidocznieniu poprzez elektroforezê w elach agarozowych lub poliakrylamidowych oraz ocenie wielkoœci amplifikowanego DNA przez porównanie wzglêdem wzorca. Zwiêkszone iloœci powielanego fragmentu DNA, w którym wystêpuje poszukiwana mutacja lub polimorfizm otrzymane w nastêpstwie reakcji, s³u ¹ do dalszej analizy badanego materia³u genetycznego za pomoc¹ technik, takich jak np. badanie polimorfizmu d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych (PCR RFLP, ang. restriction fragment length polymorphism) lub klonowanie i sekwencjonowanie materia³u genetycznego [27]. Niektóre z nich, znajduj¹ce zastosowanie w badaniu MRD u chorych na MM, bêd¹ przedmiotem dalszego omówienia.

4 284 M. ROKICKA, T. TOROSIAN RYCINA 2. Schemat przebiegu reakcji PCR: A Fazy rekcji PCR przebiegaj¹ w ró nych temperaturach: w 94 C DNA podlega denaturacji, w 60 C przy³¹czenie starterów do nici DNA, 72 C synteza DNA przy udziale Taq polimerazy. W pierwszym cyklu reakcji amplifikacji ulega ca³a niæ DNA i powstaje tak zwany d³ugi produkt. B W nastêpnych cyklach matryc¹ staje siê tzw. d³ugi produkt DNA, po amplifikacji powstaj¹ krótkie produkty PCR. Ka dy cykl podwaja liczbê produktów PCR. C Zale noœæ przebiegu reakcji od temperatury. Ka dy cykl trwa 5 10 min, zale nie od wielkoœci produktu PCR Najlepszym markerem molekularnym dla MM jest odcinek genu zawieraj¹cy informacjê odnoœnie budowy ³añcucha ciê kiego Ig. Charakteryzuje siê on najwiêksz¹ ró norodnoœci¹ w zakresie sekwencji biblioteki egzonów V-D, D-J. Jest to tak zwany odcinek nadzmienny CDR 3 (ang. chain determining region 3) genu dla Ig. Brisco i wsp. opracowali najczêœciej stosowan¹, do dziœ bardzo popularn¹ technikê PCR umo liwiaj¹c¹ amplifikacjê regionu CR 3 o budowie unikalnej dla ka dego indywidual-nego przypadku MM [4]. Badania PCR wykonano na materiale genetycznym uzyska-nym z ró nych nowotworowych linii komórkowych, przy u yciu starterów komple-mentarnych do tzw. uzgodnionych (z ang. consensus) sekwencji odcinków V- i J-genu dla ³añcucha ciê kiego Ig. Billadeau i wsp. udoskonalili tê technikê konstruuj¹c tzw. ASO-PCR (z ang. allele specific oligonucleotide) [2]. Autorzy przeprowadzili badania rearan acji regionu CDR3 w materiale genetycznym uzyskanym z komórek szpiku pobranego od chorych na MM i inne nowotworowy wywodz¹ce siê z uk³adu ch³onnego. Metod¹ ASO-PCR wykryto tak e komórki nowotworowe we krwi obwodowej u chorych na MM [7]. Owen i wsp.[23] zwiêkszyli mo liwoœæ wykrywania MRD w materiale genetycznym z komórek szpiku chorych poprzez zastosowanie zestawów ró nych kombinacji starterów. I tak spektrum poszukiwanych rearan acji genów rozszerzono badaj¹c zarówno odcinki genu CDR3, jak i CDR2 oraz CDR1, a jednoczeœnie poszukiwano nieprawid³owoœci w ró nych czêœciach odcinka J. Zestawienie metod badania MRD u chorych na MM opartych na technikach PCR zawarto w tabeli 1. Technologie molekularne wykrywania MRD u chorych na MM oparte na PCR s¹ swoiste, czu³e i specyficzne jednak nie s¹ pozbawione wad. W 60 70% przypadków

5 285 TABELA 1. Najczêœciej stosowane warianty metody jakoœciowego PCR w badaniu MRD u chorych na MM (PCR s³u y do amplifikacji DNA, potem s¹ stosowane inne sposoby analizy molekularnej) Metoda Opis Rodzaj poszukiwanej rearan acji Literatura PCR Bezpoœrednia amplifikacj a in vitro okreœlonyc h fragmentów DNA, sekwencjonowanie C DR3 Brisco i wsp. [4] PCR-ASO Hybrydyzacja oligonukleotydó w specyficznych dla allelu z produktem PCR, sekwencjonowanie CDR3, Fr 3, Fr1f, Fr2, Fr1 con, JH con, JH3, JH6 Billadeau D. i wsp. Owen R.G i wsp. Cremer FW [2,23] PCR wewnêtrzne ( n ested) DNA finger- printing Zastosowanie dwu par starterów druga para wewnêtrznie do pierwszej Identyfikacja prostych powtórzeñ oligonukleotydowych C DR3, VDJ Voena i wsp.[31] C DR3 Bird i wsp. [3] PCR-GS ( gene s caning) Bezpoœrednia amplifikacja DNA, sekwencjonowanie analiza za pomoc¹ programu Gene Scan CDR3/JH con Galimberti S. i wsp. [13] Heteroduplex PCR Wykrywanie nie w pe³ni komplementarnych nic i DNA (niesparowanych) FR3, FR2 i JH Garcia-Sanz i wsp [14] RT-PCRodwrócone PCR Izolacja RNA, uzyskiwanie c DNA do przeprowadzenia PCR F R 1 Aubin i wsp. [1] nie udaje siê uzyskaæ amplifikacji za pomoc¹ par uzgodnionych starterów odcinka genu dla Ig, który uleg³ rearan acji ze wzglêdu na wysok¹ czêstoœæ wystêpowania somatycznych hypermutacji w komórkach nowotworowych [1,23]. ASO - PCR jest uwa ane za najczulsz¹ metodê molekularn¹ wykrywania MRD, jednak wymaga bardzo du ego wk³adu pracy. Ponadto badanie to nie daje mo liwoœci rozró nienia pomiêdzy komórkami MM a limfocytami B zawieraj¹cymi klonaln¹ rearan acjê genów. Z tego wzglêdu jej przydatnoœæ jest ograniczona. W interpretacji badania PCR nale y liczyæ siê z mo liwoœci¹ otrzymania fa³szywie negatywnych wyników zale nych od niereprezentatywnej próbki materia³u, nierównomiernego rozproszenia komórek nowotworowych w szpiku oraz rzadko spotykan¹, ale jednak mo liw¹ zmianê pierwotnej budowy DNA w przebiegu ewolucji klonalnej choroby. Badanie MRD za pomoc¹ PCR u chorych na MM znalaz³o jednak ró norodne zastosowanie kliniczne. Techniki molekularne mog¹ s³u yæ do badania materia³u przeszczepowego. Vescio i wsp. [30] udowodnili, e komórki krwiotwórcze uzyskane z krwi obwodowej charakteryzuj¹ siê mniejszym zanieczyszczeniem komórkami nowotworowymi w porównaniu z komórkami szpiku chorych na MM, co stanowi

6 286 M. ROKICKA, T. TOROSIAN potwierdzenie za³o eñ teoretycznych. Z tego wzglêdu w praktyce nie wykonuje siê autologicznych zabiegów przeszczepiania komórek szpiku chorych na MM. Preparaty PBSC s¹ jednak zawsze, chocia w ró nym stopniu, zanieczyszczone komórkami MM. W celu wyeliminowania zanieczyszczenia tymi komórkami próbowano izolowaæ czyst¹ populacjê komórek CD34 + odpowiadaj¹c¹ wielopotencjalnym komórkom macierzystym z preparatów PBSC przez sortowanie lub specjalne techniki separacji. Cremer i wsp. [10] wykazali za pomoc¹ techniki ASO-PCR, e w populacji komórek CD34+ uzyskanych z produktów leukaferez od chorych na MM nie stwierdza siê produktów amplifikacji genów dla Ig specyficznych dla MM, natomiast s¹ one obecne we frakcji komórek CD19+. Skrajnie ró ne wyniki przedstawili Martinelli i wsp. Stwierdzili oni bowiem, e izolacja komórek CD34+ z produktów leukaferez prowadzi do istotnego, szacowanego na 3 log, zmniejszenia iloœci komórek MM, natomiast nie jest mo liwe ca³kowite ich usuniêcie [22]. Lemoli i wsp. przedstawili wyniki leczenia wysokodawkowan¹ chemioterapi¹ wspomagan¹ autoprzeszczepieniem selekcjonowanych komórek macierzystych CD34+ u 31 chorych z rozpoznaniem MM. Nie stwierdzono ró nic w czêstoœci uzyskiwania remisji na poziomie klinicznym i molekularnym oraz w czasie trwania remisji w porównaniu z grup¹ chorych leczonych niemodyfikowanym PBSCT [20]. Wstêpne dane wskazuj¹, e zastosowanie jako materia³u przeszczepowego komórek CD34 nie poprawia wyników leczenia MM. Corradini i wsp. opublikowali wyniki terapii za pomoc¹ APSCT chorych na MM, u których monitorowano molekularnie MRD po zabiegu. We wszystkich przypadkach, w których jako Ÿród³o komórek przeszczepowych stosowano materia³ PCR dodatni, wykrywano MRD po zabiegach APBSCT [8]. Badania molekularne MRD przeprowadzano tak e w stosunkowo du ej grupie chorych na MM leczonych za pomoc¹ przeszczepienia allogenicznego szpiku. Bird i wsp. [3] stwierdzili, e negatywizacja PCR nastêpuje w rok po zabiegu i jest trwa³a, co przemawia za mo liwoœci¹ ca³kowitego wyleczenia MM metod¹ przeszczepiania allogenicznych komórek krwiotwórczych. W materiale klinicznym opracowanym przez Cavo i wsp. ca³kowit¹ eliminacjê MRD po alloprzeszczepieniu zanotowano tylko w czêœci przypadków [5,6]. Martinelli i wsp. wykazali z kolei, e mo na osi¹gn¹æ remisjê molekularn¹ u 50% chorych leczonych allotransplantacj¹ komórek krwiotwórczych, wystêpuje ona szybciej u chorych po podaniu PBSCT po oko³o 6 miesi¹cach, natomiast po podaniu komórek szpiku po roku. W piœmiennictwie przewa a pogl¹d, e istnieje prawdopodobnie grupa chorych na MM, u których jest mo liwe ca³kowite zniszczenie klonu komórek nowotworowych [21]. Okreœlenie przydatnoœci jakoœciowego badania MRD za pomoc¹ PCR pozostaje na razie kwesti¹ przysz³oœci. Wykazano, e nawet w przypadkach negatywnego wyniku PCR u chorych na MM mog¹ wyst¹piæ wczesne nawroty choroby, czyli uzyskanie wyniku negatywnego badania MDR za pomoc¹ PCR ma ograniczone znaczenie prognostyczne. Badanie jakoœciowe PCR u chorych na MM nie pozwala te przewidzieæ, jaki bêdzie kliniczny przebieg choroby po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych [25,28]. Ocena iloœciowa MRD za pomoc¹ PCR, ze wzglêdu na wiêksz¹ czu³oœæ budzi wiêksze nadzieje co do przydatnoœci w ustalaniu rokowania i doborze leczenia.

7 287 Zastosowanie techniki pó³iloœciowej ASO - PCR w badaniu chorych na MM opracowa³ Cremer i wsp. [9]. Badanie liczby komórek nowotworowych w seryjnie pobie-ranych próbkach szpiku od chorych na MM pozwala zidentyfikowaæ grupê chorych o z³ym rokowaniu, poniewa po wysokodawkowanej chemioterapii nadal wykrywa siê u nich komórki klonogenne MM w podobnej liczbie jak przed chemioterapi¹ [11]. Mo na tak e wyró niæ grupê chorych o dobrym rokowaniu charakteryzuj¹c¹ siê wyraÿn¹ redukcj¹ masy komórek MM zw³aszcza po pierwszym kursie wysokodawkowanego melfalanu wspomaganego przeszczepienia PBST. Badanie pó³iloœciowe ASO PCR zastosowano do oszacowania wp³ywu chemioterapii na komórki klonogenne MM zawarte w subpopulacji limfocytów o fenotypie CD19+ [18]. Wykazano, e postêp choroby w przypadkach MM œciœle wi¹ e siê z ekspansj¹ klonu komórek nowotworowych identyfikowanych zarówno w subpopulacji komórek CD19 +, jak i CD19. Przetrwa³e, oporne na leczenie komórki MM odpowiedzialne za nawrót i uogólnienie choroby znajduj¹ siê g³ównie w obrêbie frakcji o fenotypie CD19+. Komórki klonogenne MM wykrywa siê równie we frakcji limfocytów CD20+, przetrwa³ych po chemioterapii wysokimi dawkami, co stwarza³oby w przysz³oœci mo liwoœæ stosowania w leczeniu choroby przeciwcia³ anty CD20 [26]. ILOŒCIOWE BADANIE MRD-PCR W CZASIE RZECZYWISTYM Po raz pierwszy opisano metodê iloœciowego badania PCR w czasie rzeczywistym w 1993 r. [17]. Metoda ta polega na pomiarze produktu reakcji amplifikacji w czasie rzeczywistym, tzn. w okresie, w którym amplifikacja DNA w reakcji PCR przebiega wyk³adniczo (faza plateau) [16]. Dokonywanie pomiarów w tym w³aœnie okresie jest istotne, poniewa umo liwia przeprowadzenie wstecznej ekstrapolacji koniecznej dla okreœlenia pocz¹tkowej iloœci DNA matrycowego. Podstawowym parametrem w tym typie badania jest wartoœæ tzw. progu cyklu (Ct, ang. Cycle threshold). Ct oznacza liczbê cyklów PCR konieczn¹ dla wyemitowania sygna³u fluorescencyjnego przekraczaj¹cego tzw. wartoœæ progow¹ oznaczaj¹c¹ generacjê sygna³u wiêkszego ni fluorescencja t³a. Wartoœæ Ct jest wprost proporcjonalna do iloœci pocz¹tkowego DNA matrycowego. S³u y do obliczenia poziomu ekspresji mrna lub pomiaru liczby kopii DNA za pomoc¹ specjalnego oprogramowania komputerowego. Hipotetyczny wykres reakcji wraz z objaœnieniami przedstawiono na rycinie 3. W metodzie PCR w czasie rzeczywistym stosuje siê obecnie ró ne metody generowania sygna³u fluores-cencyjnego. Najczêœciej wykorzystywana jest metoda 5`- nukleazowa, w której œwiat³o fluorescencyjne powstaje po przeciêciu znakowanej fluorescein¹ cz¹steczki na koñcu 5` specyficznego nukleotydu. Opisana reakcja jest w pe³ni zautomatyzowana. Na rynku s¹ dostêpne urz¹dzenia zwane termocyklerami wyposa one w oprogramowanie u³atwiaj¹ce uzyskiwanie i interpretacje wyników. PCR w czasie rzeczywistym zastosowano do badania iloœciowego MRD u chorych na MM w 1998 r. U yto starterów, podobnie jak w klasycznym PCR, swoistych dla genu dla regionu nadzmiennego Ig CDR3 i V IgH. Przeprowadzono badania próbek

8 288 M. ROKICKA, T. TOROSIAN RYCINA 3. Przyk³adowy wykres reakcji PCR w czasie rzeczywistym wprowadzaj¹cy podstawowe pojêcia, zwi¹zane z t¹ technik¹. Wykres reakcji amplifikacji przedstawia zale noœæ natê enia sygna³u fluorescencyjnego w stosunku do liczby cykli. Podstawa jest definiowana jako cykle, w których powstaje sygna³, ale jego natê enie jest poni ej czu³oœci instrumentu wykrywaj¹cego. Pomiar sygna³u jest u ywany dla wyznaczenia progu. Wartoœæ progow¹ oblicza siê jako 10 x odchylenie standardowe œredniego sygna³u podstawowego. Sygna³ fluorescencyjny o natê eniu przekraczaj¹cym próg jest uwa any za rzeczywisty sygna³ konieczny do okreœlenia progu cyklu (Ct) dla badanej próbki. Z definicji Ct jest to kolejny cykl PCR, w którym sygna³ fluorescencyjny przekracza minimalny poziom jego wykrywania. Na wykresie dwie linie: ci¹g³a i kropkowana oznaczaj¹ przebieg reakcji dla dwu ró nych produktów. Przeciêcie ci¹g³ej odpowiada 18 cyklowi PCR, a kropkowanej 20 cyklowi PCR. Stwierdza siê zatem ró nicê dwu cykli pomiêdzy dwoma produktami DCt = 2. Uwzglêdniaj¹c wyk³adniczy typ reakcji PCR DCt mo e byæ przekszta³cony do postaci linearnej 2 (DCt), czyli ró nica syntezy produktów wynosi 4 szpiku i PBSC uzyskanych u chorych na MM przed i seryjnie po leczeniu chemioterapi¹. Wykazano, e metoda jest powtarzalna, czu³a oraz umo liwia iloœciowe badanie MRD [15]. Rasmussen i wsp. opracowali technikê oznaczania iloœciowego MRD za pomoc¹ tzw. technologii TaqMan opartej na badaniu ASO PCR. Zastosowano startery komplementarne do typowego markeru klonalnego w MM regionu nadzmiennego CDR3 oraz VDJ. Badania wykonano u 7 chorych po leczeniu autologicznym PBSCT. Wykazano, e technologia jest czu³a i specyficzna. Autorom uda³o siê wykryæ komórki MM w przypadkach, w których inne badania wskazywa³y na ca³kowit¹ remisjê, co udowadnia jej niezwyk³¹ u ytecznoœæ [24]. W³aœnie przypadki ca³kowitej remisji MM rozpoznawane na podstawie klasycznych kryteriów oraz jakoœciowych badañ molekularnych stanowi¹ docelowo grupê chorych, u której badanie MRD metod¹ PCR iloœciowego wydaje siê mieæ najwiêksze zastosowanie w przysz³oœci w celu ustalenia wskazañ do dalszego leczenia [12]. PCR w czasie rzeczywistym mo e równie s³u yæ do badania zanieczyszczenia komórkami klonogennymi MM materia³u przeszczepowego. Ladetto i wsp. badali obecnoœæ komórek MM w materiale przeszczepowym uzyskanym ze szpiku lub z krwi obwodowej u chorych

9 289 na MM poddanych dwukrotnie mobilizacji. Wykorzystano startery komplementarne dla regionu nadzmiennego CDR3 lub V IgH. Wykazano, e materia³ przeszczepowy uzyskany z krwi obwodowej jest mniej zanieczyszczony komórkami nowotworowymi w porównaniu ze szpikiem po pierwszym kursie mobilizacyjnym chemioterapii. Materia³ pobierany z ró nych leukaferez nie ró ni siê istotnie pod wzglêdem zanieczyszczenia komórkami MM. Stwierdzono, e powtarzanie kursów chemioterapii mobilizacyjnej ma niewielkie znaczenie w uzyskaniu redukcji liczby komórek nowotworowych w materiale przeszczepowym. Stwierdzono tak e, znaczne ró nice w iloœciowej ocenie MRD za pomoc¹ PCR w czasie rzeczywistym i cytometrii przep³ywowej. Nale y przypuszczaæ, e komórki o fenotypie CD38++ uznawane za typowe dla MM tylko w czêœci nale ¹ do klonu nowotworowego, poniewa badanie PCR w czasie rzeczywistym wykazywa³o mniejszy stopieñ MRD ni ocena za pomoc¹ cytometrii [19]. PCR w czasie rzeczywistym jest nowoczesn¹ metod¹ oceny MRD u chorych na MM, której przydatnoœæ zweryfikuje najbli sza przysz³oœæ. Ma ona niew¹tpliwe zalety w postaci wysokiej czu³oœci, powtarzalnoœci oraz wygody w wykonaniu zw³aszcza w porównaniu z metodami pó³iloœciowymi PCR, które wymagaj¹ badania MRD w wielu rozcieñczeniach. Seryjne badanie MRD t¹ metod¹ mo e s³u yæ do ustalenia wskazañ do wczesnego wdro enia leczenia w momencie, kiedy nawrót choroby jest jeszcze niemo liwy do rozpoznania innymi metodami. Wadami s¹ wysoka cena termocyklerów i odczynników, a zw³aszcza sond znakowanych fluorescein¹. UWAGI KOÑCOWE W polskich warunkach nadal najwa niejsze jest przeprowadzanie rzetelnej oceny efektów leczenia za pomoc¹ klasycznych kryteriów EBMT. Nie unikniemy jednak, wprowadzaj¹c nowoczesne metody leczenia MM, koniecznoœci nowoczesnego badania poziomu MRD. Przedstawiony powy ej przegl¹d piœmiennictwa na ten temat pokazuje, jak du o nowoczesnych metod jest do dyspozycji. Najbardziej przydatna wydaje siê technika fenotypowania i cytometrii przep³ywowej, której czu³oœæ mo na zwiêkszyæ prostymi technikami bramkowania. W przysz³oœci konieczne bêdzie zapewne badanie MRD za pomoc¹ PCR w czasie rzeczywistym. Jest to jedyny sposób wczesnego wykrycia progresji MM po PBSCT i ustalenia wskazañ do zastosowania leczenia. PIŒMIENNICTWO [1] AUBIN J, DAVI F, NUGUYEN-SALOMON F, LEBOEUF D, DEBERT C, TAHER M. Description of a novel FR1 IgH PCR strategy and its comparison with three other strategies for the detection of clonality in B cell malignancies. Leukemia 1995; 9: [2] BILLADEAU D, BLACKSTADT M, GREIPP P, KYLE RA, OKEN MM, KAY N, VAN NESS B. Analysis of B-lymphoid malignancies using allele-specific polymerase chain reaction: a technique for sequential quantitation of residual disease. Blood 1991; 78: [3] BIRD JM, RUSSELL NH, SAMSON D. Minimal residual disease after bone marrow transplantation for multiple myeloma: for cure in long - term survivors. Bone Marrow Trans 1993; 12:

10 290 M. ROKICKA, T. TOROSIAN [4] BRISCO MJ, TAN LW, ORSBORN AM, MORLEY AA. Development of highly sensitive assay, based on the polymerase chain reaction, for rare B-lymphocyte clones in a polyclonal population. Br J Haematol 1990; 75: [5] CAVO M, TERRAGANA C, MARTINELLI G, RONCONI S, ZAMAGNI E, TOSI P, LEMOLI RM, BENNI M, PAGLIANI G, BANDINI G, TURA S. Molecular monitoring of minimal residual disease in patients in long-term complete remission after allogeneic stem cell transplantation for multiple myeloma. Blood 2000; 96: [6] CAVO M, TERRAGNA C, MARTNELLI G, RONCONI S, ZAMAGNI E, TOSI E, LEMOLI RM, BENNI M, PAGLIANI G, BANDINI G, TURA S. Molecular monitoring of minimal residual disease in patients in long-term complete remission after allogeneic stem cell transplantation for multiple myeloma. Blood 2000; 96: [7] CORRADINI P, VOENA C, OMEDE P, ASTOLFI M, BOCCADORO M, DALLA-FAVERA R. Detection of circulating tumor cells in multiple myeloma by a PCR-based method. Leukemia 1993; 7: [8] CORRADINI P, VOENA C, TARELLA C, ASTOLFI M, LADETTO M, PALUMBO A, VAN LINT M, BACIGALUPO A, SANTORO A, MUSSO M, MAJOLINO I, BOCCADORO M, PILERI. A. Molecular and clinical remission in multiple myeloma: role of autologous and allogeneic transplantation of hematopoietic cells. J Clin Oncol 1999: 17; [9] CREMER FW, KIEL C, WALLMEIER M, GOLDSMITH H, MOOS M. A quantitative PCR assay for detection of low amounts of malignant cells in multiple myeloma. Ann Oncol 1997; 8: [10] CREMER FW, KIEL K, SUCKER C, WACKER J, ATZBERGER A, HAAS R, GOLDSCHMIDT H, MOOS M. A rationale for positive selection of peripheral blood stem cells in multiple myeloma: highly purified CD34+ cell fractions of leukapheresis products do not contain malignant cells. Leukemia 1997, 11 Suppl. 5: S [11] CREMER FW. EHRBRECHT E, KIEL K, BENNER A, HEGENBART U, HO AD, GOLDSCHMIDT H, MOOS M. Evaluation of the kinetics of the bone marrow tumor load in the course of sequential high-dose therapy assessed by quantitative PCR as a predictive in patients with multiple myeloma. Bone Marrow Transplant 2000; 26: [12] FENK R, AK M, KOBBE G, STEIDL U, ARNOLD C, KORTH HUNERLITURKOGLU A, ROHR UP, KLISZEWSKI S,BERNHAN HAAS R, KRONENWETT R. Levels of minimal residual disease detected by quantitative molecular monitoring herald relapse in patients with multiple with multiple myeloma. Haematologica 2004; [13] GALIMBERTI S, BRIZZI F, MAMELI M, PETRINI M. An advantageous method to evaluate IgH rearrangement and its role in minimal residual disease detection. Leuk Res 1999; 23: [14] GARCIA-SNAZ R, LOPEZ-PEREZ R, LANGERAK AW, GONZALES D, CHILLON MC, BALANZATE- GUI A, MATEOS MV, ALAEJOS I, GONZALES M, VAN DONGEN JJ, SAN MIGUEL JF. Heteroduplex PCR analysis of rearranged immunoglobulin genes for clonality assessment in multiple myeloma. Haematologica 1999; 84: [15] GERARD CJ, OLSSON K, RAMANATHAN R, READING C, HANANIA EG. Improved quantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using real-time polymerase chain reaction and plasmid- DNA complementarity determining region III standards. Canc Res 1998; 58: [16] GIZINGER DG. Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream. Exp Hematol 2002; 30: [17] HOGUCHI R, FOCKLER C, DOLLINGER G, WATSON R. Kinetic PCR analysis: real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 1993; 11; [18] KIEL K, CREMER FW, ROTTENBURGER C, KALLMEYER C, EHRBRECHT E, ATZBERGER A HE- GENBART U, GOLDSCHMIDT H, MOSS M. Analysis of circulating tumor cells in patients with multiple myeloma during the course of high-dose therapy with peripheral stem cell transplantation. Bone Marrow Transpl 1999; 23: [19] LADETTO M, OMEDE P., SAMETTI S., DONOVAN J.W, ASTOLFI M, DRANDI D, VOLPATO F, GIAC- CONE L, GIARETTA F, PALUMBO A, BRUNO B, PILERI A, GRIBBEN JG, BOCCADORO M. Real time polymerase chain reaction in multiple myeloma: Quantitative analysis of tumor contamination of stem cell harvests. Exp Haematol 2002; 30: [20] LEMOLLI RM, MARTINELLI G, ZAMAGNI E, MOTTA MR, RIZZI S, TERRAGNA C, RONDELL RONCONI S, CURTI A, BONIFAZI F, TURA S, CAVO M. Engraftment, clinical, and molecular followup of patients with multiple myeloma who were reinfused with highly purified CD34+ cells to support single or tandem high-dose chemotherapy. Blood 2000; 95:

11 291 [21] MARTINELLI G, TERRAGANA C, ZAMAGNI E, RONCONI S, TOSI P, LEMOLI R.BANDINI G, TESTONI N, AMABILE M, OTTAVIANI E, BUONAMICI S, SOVERINI S, MONTEFUSCO V, DE VIVO A, BONIFAZI F, TURA S, CAVO M. Polymerase chain reaction-based detection of minimal residual disease in multiple myeloma patients receiving allogeneic stem cell transplantation. Haematologica 2000; 85: [22] MARTINELLI G. TERRAGANA C, LEMOLI RM, CAVO M, BENNI M, MOTTA MR, AMABILE M, OTTAVIANI E, TESTONI N, DE VIVO A, TURA S. Clinical and molecular follow-up by amplification of the CDR-III IgH region in multiple myeloma patients after autologous transplantation of hematopoietic CD34+ stem cells. Haematologica 1999; 84: [23] OWEN RG, JOHNSON RJ, RAWSTRON AC, EVANS PA, JACK A, SMITH GM, CHILD JA, MORGAN GJ. Assessment of IgH PCR strategies in multiple myeloma. J Clin Pathol 1996; 49: [24] RASMUSSEN T, POULSEN TS, HONORE L, JOHNSEN HE. Quantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using an allele-specific real-time PCR assay. Exp Haematol 2000; 28: [25] RASMUSSEN T. The presence of circulating clonal CD19 cells in multiple myeloma. Leuk Lymph 2001; 42: [26] ROTTENBURGER CH, KIEL K, BOSING T, CREMER FW, MOLDENHUER G., HO AD, GOLDSCH- MIDT H, MOSS M. Clonotypic CD20+ and CD19+ B cells in peripheral blood of patients with multiple myeloma post high-dose therapy and peripheral blood stem cell transplantation. Br J Haemat 1999; 106: [27] S OMSKI R, NAPIERA A D, KWIATKOWSKA J. Reakcja ³añcuchowej polimerazy (PCR) w badaniach naukowych i diagnostyce molekularnej. Post Biol Kom 1998; 25: [28] SWEDIN A. LENHOFF S, OLOFSSON T, THURESSON B, WESTIN J. Clinical utility of immunoglobulin heavy gene rearrangement identification for tumor cell detection in multiple myeloma. Br J Haematol 1998; 103: [29] VAN DONGEN JM, SZCZEPAÑSKI T, LANGERAK AW, PONGERS-WILLEMSE MJ. Detection of minimal residual disease in lymphoid malignances. W: Degos L, Linch DC. Löwenberg B Martin Dunitz [red.]textbook of malignant haematology. 1999: [30] VESCIO RA, HAN EJ, SCHILLER GJ, LEE JC, WU CH, CAO J, SHIN J, KIM A, LICHTENSTEIN AK, BERENSON JR. Quantitative comparison of multiple myeloma tumor contamination in bone marrow harvest and leukapheresis autografts. Bone Marrow Transpl 1996; 18: [31] VOENA C, LADETTO M, ASTOLFI M, PROVAN D, GRIBBEN JG, BOCCADORO M, PILERI A, COR- RADINI P. A novel nested-pcr strategy for detection of rearranged immunoglobulin heavy-chain genes in B cell tumors. Leukemia 1997; 11: [32] WHITE TJ, ARNHEIM N, ERLICH HA. The polimerase chain reaction. Trends Genet 1989: 5: Otrzymano: r. Przyjêto: r. ul. Banacha 1a, Warszawa Redaktor prowadz¹cy Jan eromski