Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit

Transkrypt

1 Sierpień 2016 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 24 Wersja 2 Do wykorzystania w diagnostyce in vitro Do wykorzystania z aparatami Rotor-Gene Q MDx instruments QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, UK R PL Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN technologie dla próbek i testów Firma QIAGEN jest wiodącym dostawcą innowacyjnych technologii dla próbek i testów, umożliwiających izolację i wykrywanie zawartości dowolnych próbek biologicznych. Nasze zaawansowane, wysokiej jakości produkty i usługi zapewniają osiągnięcie sukcesu od etapu próbki aż po wynik. QIAGEN wyznacza standardy w: Oczyszczaniu DNA, RNA i białek Testach kwasów nukleinowych i białek Badaniach microrna i RNAi Automatyzacji technologii próbek i testów Naszym celem jest umożliwienie użytkownikowi osiągania wyróżniających sukcesów i przełomowych wyników. Więcej informacji zamieszczono na stronie

3 Spis treści Przeznaczenie 5 Streszczenie i objaśnienia 5 Zasada postępowania 7 Dostarczone materiały 11 Zawartość zestawu (kit u) 11 Wymagane materiały, które nie zostały dostarczone 12 Ostrzeżenia i środki ostrożności 13 Informacje dotyczące bezpieczeństwa 13 Ogólne środki ostrożności 13 Magazynowanie odczynników i sposób postępowania z nimi 15 Postępowanie z próbką biologiczną i jej magazynowanie 16 Procedura 17 Ekstrakcja DNA i przygotowanie 17 Protokoły Ocena próbki 18 Wykrywanie mutacji EGFR 29 Interpretacja wyników (zautomatyzowana) 39 Komunikaty Rotor-Gene Q therascreen EFGR Assay Package 40 Przewodnik rozwiązywania problemów 48 Kontrola jakości 49 Ograniczenia 49 Charakterystyka wydajności 51 Wydajność analityczna 51 Granica próbki zerowej (limit of blank - LOB), zakres roboczy i wartości odcięcia 51 Wpływ ilości DNA na wartości CT 52 Reaktywność krzyżowa 52 Dokładność: Porównanie z analityczną metodą referencyjną 52 Wartości granicy wykrywalności (limit of detection - LOD) 53 Zakłócenia (interferencje) 55 Powtarzalność 56 Wydajność kliniczna 58 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016 3

4 Dane wyników klinicznych GIOTRIF 58 Dane wyników klinicznych IRESSA 60 Literatura 62 Symbole 63 Dodatek A: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit Protokół ręczny 65 Informacje ogólne 65 Protokół Tworzenie profilu temperaturowego 65 Procedura (ręczna) 73 Protokoły Ocena próbki (ręcznie) 73 Wykrywanie mutacji EGFR (ręczne) 73 Konfigurowanie therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q 74 Interpretacja wyników (ręczna) 78 Ustawienia dla analizy przy pomocy programu 78 Analiza danych oceny próbki 79 Analiza danych wykrywania mutacji EGFR 80 Załącznik B Instalacja therascreen EGFR CE Assay Package 86 Informacje kontaktowe 88 Informacje dotyczące zamówień 89 4 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

5 Przeznaczenie Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit jest testem diagnostycznym in vitro służącym do wykrywania 29 somatycznych mutacji w genie EGFR. Zapewnia on jakościową ocenę statusu mutacji w próbkach nowotworu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (non-small cell lung cancer - NSCLC). Wyniki mają [w zamierzeniu] pomóc klinicyście w identyfikacji pacjentów z NSCLC, którzy mogliby odnieść korzyść z leczenia z zastosowaniem inhibitorów kinazy tyrozynowej EGFR. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit będzie testował próbki DNA ekstrahowane z utrwalonych w formalinie, zalanych parafiną (formalin-fixed, paraffin embedded (FFPE)) tkanek guza nowotworowego od pacjentów z NSCLC, i poddawał analizie w aparacie Rotor-Gene Q MDx. Przewidziany jest do używania przez przeszkolony personel w warunkach profesjonalnego laboratorium. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit przeznaczony jest do wykorzystania w diagnostyce in vitro. Streszczenie i objaśnienia Mutacje onkogenu EGFR stwierdzono w nowotworach ludzkich (1, 2). Obecność tych mutacji koreluje z odpowiedzią na terapie z określonym inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI) u pacjentów z z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (non-small cell lung cancer - NSCLC) (3 8). Takie mutacje onkogenu EGFR są obecne u ogólnej populacji pacjentów z NSCLC z częstością występowania rzędu 10% u pacjentów z USA, Europy lub Australii i do 30% u pacjentów z Japonii i Tajwanu (1, 2, 9). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit jest gotowym do użycia zestawem do wykrywania 29 mutacji w genie EGFR powiązanych z nowotworem przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w aparatach Rotor-Gene Q MDx. Stosując techniki Scorpions (10) oraz ARMS (Amplification Refractory Mutation System) (11) zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit umożliwia wykrycie 29 mutacji w eksonach 18, 19, 20 i 21 onkogenu EGFR na tle dzikiego genomowego DNA (Tabela 1). Podsumowując, 19 delecji w eksonie 19 (wykrywa obecność każdej z 19 delecji, ale ich nie rozróżnia) 3 insercje w eksonie 20 (wykrywa obecność każdej z 3 insercji, ale ich nie rozróżnia) G719X (wykrywa obecność G719S, G719A lub G719C, ale ich nie rozróżnia) S768I T790M Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016 5

6 L858R L861Q Zastosowane metody są wysoce selektywne i, w zależności od całkowitej ilości obecnego DNA, umożliwiają wykrywanie niskiego odsetka mutacji DNA na tle dzikiego genomowego DNA. Granice selektywności i wykrywalności przewyższają techniki takie jak sekwencjonowanie metodą "dye terminator sequencing". Tabela 1. Lista mutacji i identyfikatory COSMIC Ekson Mutacja COSMIC* ID Zmiana zasady 18 G719A G>C G719S G>A G719C G>T 19 Delecje _2255>T _2258>CA _2252>GCA _2248>GC _2252>AAT _2251del _2247del _2253del _2254del _2251del _2255del _2249del _2250del _2253del _2256del18 * COSMIC: Katalog somatycznych mutacji nowotworu: ac.uk/ Ciąg dalszy tabeli na następnej stronie 6 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

7 Tabela 1. Kontynuacja Ekson Mutacja COSMIC* ID Zmiana zasady 19 Delecje _2254del _2257del _2248TTAAGAGAAG>C _2251>C 20 S768I G>T Insercje _2308insGCCAGCGTG _2311insGGT _2320insCAC T790M C>T 21 L858R T>G L861Q T>A * COSMIC: Katalog somatycznych mutacji nowotworu: Zasada postępowania Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit zawiera 8 oddzielnych mieszanin reakcyjnych PCR do amplifikacji: 7 specyficznych dla mutacji reakcji w eksonach 18, 19, 20 i 21 onkogenu EGFR oraz kontrolę dzikiego typu (wild type) w eksonie 2. Główne komponenty zestawu zostały objaśnione poniżej. ARMS Amplifikacja specyficzna dla alleli lub mutacji uzyskiwana jest przy zastosowaniu ARMS (Amplification Refractory Mutation System - amplifikacja wieloalleliczna). Polimeraza Taq DNA (Taq) jest skuteczna w rozróżnianiu między dopasowaniem i niedopasowaniem na końcu 3-ciego końca startera (primera) PCR. Specyficzne zmutowane sekwencje są wybiórczo amplifikowane, nawet w przypadku próbek, w których większość z sekwencji nie posiada mutacji. Gdy starter jest całkowicie dopasowany to amplifikacja przebiega z pełną wydajnością. Gdy zasada 3 jest niedopasowana, to występuje tylko niskopoziomowa amplifikacja tła. Scorpions Detekcja (wykrywanie) amplifikacji jest przeprowadzana z wykorzystaniem techniki Scorpions. Molekuły "Skorpions" są dwu-funkcyjnymi cząsteczkami zawierającymi starter (primer) PCR kowalencyjnie związany z sondą. Fluorofor Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016 7

8 w tej sondzie współdziała z wygaszaczem (quencher), również włączonym do sondy, który ogranicza fluorescencję. Podczas reakcji PCR, gdy sonda wiąże się z amplikonem, fluorofor i wygaszacz (quencher) ulegają rozdzieleniu, co prowadzi do wykrywalnego wzrostu poziomu fluorescencji. Format zestawu (kitu) W zestawie therascreen EGFR RGQ PCR Kit dostarczonych jest osiem testów: 1 test kontrolny (CTRL) 7 testów mutacji Wszystkie mieszaniny reakcyjne zawierają odczynniki do wykrywania sekwencji (targets), które są znakowane karboksyfluoresceiną (carboxyfluorescein (FAM )), a w teście kontroli wewnętrznej są znakowane heksachlorofluoresceiną (hexachlorofluorescein (HEX )). Test kontroli wewnętrznej może wykryć obecność inhibitorów, co może prowadzić do fałszywych wyników ujemnych. Amplifikacja FAM może usunąć konkurencję (out-compete) amplifikacji kontroli wewnętrznej, a celem kontroli wewnętrznej jest po prostu pokazanie, że tam gdzie nie występuje amplifikacja FAM, tam jest prawdziwy wynik ujemny, a nie nieudana reakcja PCR. Testy Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit obejmuje dwuetapową procedurę. W pierwszym kroku przeprowadzany jest test kontrolny w celu określenia całkowitego amplifikowalnego EGFR DNA w próbce. W drugim kroku przeprowadzany jest zarówno test mutacji jak i test kontroli w celu określenia obecności lub nieobecności zmutowanego DNA. Test kontrolny Test kontrolny, znakowany FAM, jest stosowany do oceny całkowitego amplifikowalnego EGFR DNA w próbce. Test kontrolny amplifikuje obszar eksonu 2 genu EGFR. Primer (starter) i sonda Scorpion zostały zaprojektowane tak, aby uniknąć wszelkich znanych polimorfizmów EGFR. Testy mutacji Każdy test mutacji zawiera sondę Scorpion znakowaną FAM oraz primer (starter) ARMS do rozróżnienia (dyskryminacji) między "dzikim" DNA i specyficznie zmutowanym DNA. Kontrole Uwaga: Wszystkie cykle eksperymentalne muszą zawierać dodatnie i ujemne kontrole. Kontrola dodatnia: 8 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

9 Każdy cykl musi zawierać kontrolę dodatnią w probówkach 1-8. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit zawiera EGFR Positive Control (PC) (kontrolę dodatnią EGFR) przeznaczoną do wykorzystania jako matrycy (template) w reakcji kontroli dodatniej. Wyniki kontroli dodatniej będą oceniane w celu zagwarantowania, że zestaw działa w obrębie podanych kryteriów akceptowalności. Kontrola ujemna Każdy cykl musi zawierać kontrolę ujemną ( no template control : NTC) w probówkach Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit zawiera wodę dla NTC przeznaczoną do wykorzystania jako matryca ( template ) dla kontroli no template. Kontrola "no template" (bez matrycy) jest używana do oceny potencjalnego zanieczyszczenia podczas konfigurowania cyklu oraz do oceny wydajności reakcji kontroli wewnętrznej. Ocena reakcji kontroli wewnętrznej Każda mieszanina reakcyjna zawiera, dodatkowo do reakcji docelowej, również kontrolę wewnętrzną (IC). Niepowodzenie oznacza, że albo mogą tam być obecne inhibitory, które mogłyby prowadzić do niedokładnych wyników, albo że w przypadku tej probówki wystąpił błąd konfiguracji ze strony operatora. Kontrola wewnętrzna (IC) używa sekwencję docelową oligonukleotydu nie związaną z EGFR, nieoznakowany primer oraz primer Scorpions oznakowany HEX w celu rozróżnienia go od Scorpions oznakowanego FAM w mieszaninach reakcyjnych kontroli i mutacji. Amplifikacja FAM może zdominować (out-compete) kontrolę wewnętrzną, tak że generowana wartość IC CT (HEX) może wykraczać poza podany zakres. Wyniki FAM zachowują jednak ważność dla tych próbek. Ocena próbki Stanowczo zaleca się użycie mieszaniny reakcyjnej kontroli (Control Reaction Mix) (probówka CTRL) dostarczonej wraz z zestawem therascreen EGFR RGQ PCR Kit w celu określenia całkowitego amplifikowalnego EGFR DNA w próbce. Test kontrolny amplifikuje region eksonu 2 genu EGFR. Zalecane jest konfigurowanie próbek tylko z testem kontrolnym przy zastosowaniu EGFR PC jako kontroli dodatniej i wody dla matrycy ( template ) jako kontroli no template. Uwaga: Ocena DNA powinna być oparta na PCR i może różnić się od oznaczenia ilościowego opartego na odczytach absorbancji. Dostarczona jest dodatkowa kontrolna mieszanina reakcyjna (Additional Control Reaction Mix) (probówka CTRL), aby umożliwić ocenę jakości i ilości DNA w probówkach przed analizą z wykorzystaniem zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016 9

10 Platforma i oprogramowanie Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit został specjalnie zaprojektowany do użycia z aparatami Rotor-Gene Q MDx instruments. Aparat Rotor-Gene Q MDx instrument jest zaprogramowany dla różnych parametrów cyklu lub cykli ( runs ) przy użyciu pakietu therascreen EGFR CE Assay Package. Pakiet therascreen EGFR CE Assay Package składa się z dwóch szablonów: szablonu therascreen EGFR CE Control Run Locked Template (do oceny próbki) oraz therascreen EGFR CE Locked Template (do wykrywania mutacji EGFR). Szablony te zawierają parametry cyklu PCR i obliczają wyniki. Możliwe jest również użycie zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit z programem Rotor-Gene Q w wersji 2.3 w trybie otwartym (tj. bez użycia pakietu Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Assay Package). Szczegóły na ten temat zamieszczono w Dodatek A: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit Protokół ręczny, strona Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

11 Dostarczone materiały Zawartość zestawu (kit u) therascreen EGFR RGQ PCR Kit (24) Nr katalogowy Liczba reakcji 24 Kolor Czerwony Purpurowy Pomarańczowy Różowy Zielony Żółty Szary Niebieski Beżowy Miętowy Biały Identyfikator Control Reaction Mix (Mieszanina reakcyjna kontroli) T790M Reaction Mix (mieszanina reakcyjna) Deletions Reaction Mix (Mieszanina reakcji delecji) L858R Reaction Mix (mieszanina reakcyjna) L861Q Reaction Mix (mieszanina reakcyjna) G719X Reaction Mix (mieszanina reakcyjna) S768I Reaction Mix (mieszanina reakcyjna) Insertions Reaction Mix (mieszanina reakcji insercji) EGFR Positive Control (Kontrola dodatnia EGFR) Taq DNA Polymerase (Polimeraza Taq DNA) Nuclease-Free Water for No Template Control (Woda wolna od nukleazy dla No Template Control) Identyfikator (ID) probówki 1 CTRL 2 T790M 3 Del 4 L858R 5 L861Q 6 G719X 7 S768I 8 Ins 9 PC Objętość 2 x 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 600 µl 300 µl Taq 2 x 80 µl NTC 1.9 ml Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

12 Biały Nuclease-Free Water for Dilution (Woda wolna od nukleazy do rozcieńczeń) Dil. Podręcznik therascreen EGFR RGQ PCR Kit Handbook (język angielski) 1.9 ml 1 Wymagane materiały, które nie zostały dostarczone Podczas pracy ze środkami chemicznymi zawsze należy nosić odpowiednią odzież laboratoryjną, jednorazowe rękawice i okulary ochronne (gogle). Aby uzyskać więcej informacji, należy zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyk substancji niebezpiecznych (SDS) dostępnymi u dostawców produktu. Odczynniki Zestaw do ekstrakcji DNA (patrz Ekstrakcja DNA i przygotowanie, strona 17) Materiały zużywalne i ogólny sprzęt laboratoryjny Dedykowane pipety* (regulowane) do przygotowania próbki Dedykowane pipety* (regulowane) do przygotowania mieszaniny master PCR Dedykowane pipety* (regulowane) do dozowania matrycy (template) DNA Końcówki pipet z filtrami nie zanieczyszczone dezoksyrybonukleazą, rybonukleazą i DNA (aby uniknąć zakażenia krzyżowego, zalecamy końcówki pipet z barierami aerozolowymi) Paski probówek (Strip Tubes) i wieczka (Caps), 0,1 ml przystosowane do używania z rotorem 72-well rotor (nr katalog lub ) Mikroprobówki wirówkowe do przygotowania mieszanin master mix nie zanieczyszczone dezoksyrybonukleazą, rybonukleazą i DNA. Blok załadowczy 72 x probówki 0,1 ml, aluminiowy blok do ręcznego przygotowania reakcji z pipetą jednokanałową (nr kat ) Thermomixer,* ogrzewany inkubator orbitalny,* blok grzewczy,* lub łaźnia wodna* zdolne do inkubowania w temperaturze 90 C Wirówka nastołowa* z rotorem dla probówek reakcyjnych 2ml Mieszadło typu vortex* 12 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

13 Wyposażenie do PCR Aparat Rotor-Gene Q MDx instrument z kanałami fluorescencyjnymi dla Cycling Green (zielony) i Cycling Yellow (żółty) (wykrywanie FAM i HEX, odpowiednio)* Program Rotor-Gene Q software, wersja 2.3 Płyta CD pakietu Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Assay Package CD, wersja (nr kat ) Uwaga: Program Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Assay Package wymaga programu Rotor-Gene Q software w wersji 2.3. * Należy się upewnić, że aparaty zostały sprawdzone i skalibrowane zgodnie z zaleceniami producenta. W niektórych krajach, jeśli ma to zastosowanie, może zostać użyty aparat Rotor-Gene Q 5plex HRM z datą produkcji maj 2011 lub późniejszą. Datę produkcji można ustalić na podstawie numeru seryjnego z tyłu urządzenia. Numer seryjny jest podany w formacie "mmyy nnn", gdzie "mm" oznacza miesiąc produkcji w cyfrach, "yy" oznacza dwie ostatnie cyfry roku produkcji, a "nnn" oznacza unikalny identyfikator aparatu Ostrzeżenia i środki ostrożności Do wykorzystania w diagnostyce in vitro Informacje dotyczące bezpieczeństwa Podczas pracy ze środkami chemicznymi zawsze należy nosić odpowiednią odzież laboratoryjną, jednorazowe rękawice i okulary ochronne (gogle). Więcej informacji na ten temat zamieszczono w odpowiednich kartach charakterystyki substancji niebezpiecznych (SDS). Są one dostępne online w wygodnym i kompaktowym formacie PDF pod adresem gdzie użytkownik może znaleźć, obejrzeć i wydrukować karty charakterystyk substancji niebezpiecznych (SDS) dla każdego zestawu (kitu) QIAGEN oraz komponentów zestawu. Więcej informacji dotyczących bezpieczeństwa odniesionych do aparatu Rotor-Gene Q instrument zamieszczono w instrukcji obsługi dostarczonej wraz z aparatem. Próbki i odpady testów należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa. Ogólne środki ostrożności Użytkownik powinien zawsze zwracać uwagę na następujące [zalecenia]: Test ten jest przeznaczony dla próbek biologicznych tkanki FFPE NSCLC. Należy przechowywać i ekstrahować materiały pozytywne (próbki i kontrole dodatnie) oddzielnie od wszystkich pozostałych odczynników i Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

14 dodawać je do mieszaniny reakcyjnej w przestrzennie oddzielonym obiekcie. Należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec skażeniu PCR syntetycznym materiałem kontrolnym. Zalecamy stosowanie oddzielnych, dedykowanych pipet do przygotowywania mieszanin reakcyjnych i dodawania matrycy DNA (DNA template). Przygotowanie i dozowanie mieszanin reakcyjnych musi być przeprowadzane w obszarze odseparowanym od dodawania matrycy (template). Probówki Rotor-Gene Q tubes nie mogą być otwierane po zakończonym cyklu PCR. Ma to na celu zapobieżenie skażeniu laboratorium produktami po reakcji PCR. Wszystkie środki chemiczne i materiały biologiczne są potencjalnie niebezpieczne. Preparaty i próbki są potencjalnie zakaźne i muszą być traktowane jako materiały biologicznie niebezpieczne. Odczynniki dla zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit zostały optymalnie rozcieńczone. Nie należy bardziej rozcieńczać odczynników, ponieważ może to doprowadzić do utraty wydajności. Nie należy używać objętości reakcji (mieszanina reakcyjna plus próbka) poniżej 25 ul, ponieważ zwiększy to ryzyko wystąpienia wyników fałszywie ujemnych. Wszystkie odczynniki dostarczone w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR Kit są przeznaczone do używania wyłącznie z innymi odczynnikami z tego samego zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Nie należy zastępować odczynników w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR Kit lub między zestawami therascreen EGFR RGQ PCR Kits, ponieważ może to mieć wpływ na wydajność. Należy używać wyłącznie polimerazę Taq DNA polymerase (probówka Taq), która została dostarczona w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Nie należy zastępować jej polimerazą Taq DNA polymerase z innych zestawów tego samego lub dowolnego innego rodzaju lub polimerazą Taq DNA od innego dostawcy. Nie należy używać komponentów z przekroczoną datą ważności lub niewłaściwie przechowywanych. Uwaga: Należy zachować ostrożność, aby zapewnić prawidłowe badanie próbki ze zwróceniem szczególnej uwagi na wyeliminowanie błędnych danych próbek, błędów załadunku oraz błędów pipetowania. Uwaga: Odczynniki są zatwierdzone (zwalidowane) do ręcznego przygotowania reakcji. Jeżeli używana jest metoda zautomatyzowana, to może to zmniejszyć ilość możliwych reakcji ze względu na ilość odczynnika niezbędnego do wypełnienia "martwych objętości" w tych aparatach. 14 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

15 Magazynowanie odczynników i sposób postępowania z nimi Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit jest dostarczany w suchym lodzie i musi pozostać zamrożony po dostarczeniu. Jeśli zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit nie jest zamrożony w momencie dostarczenia, jeśli zostało otwarte zewnętrzne opakowanie w trakcie transportu lub jeśli dostawa nie zawiera listu przewozowego, instrukcji używania lub odczynników, to należy skontaktować się z Działem Serwisu Technicznego firmy QIAGEN lub lokalnym dystrybutorem (patrz tylna okładka lub strona Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit powinien natychmiast po dostarczeniu zostać umieszczony w temperaturze 30 do 15 C w zamrażarce utrzymującej stałą temperaturę i być chroniony przed światłem. Scorpions (tak jak w przypadku wszystkich znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek) musi być chroniony przed światłem, aby uniknąć foto-wyświecania i utraty wydajności. Jeśli zestaw jest przechowywany w zalecanych warunkach magazynowania w oryginalnym opakowaniu, to zachowuje stabilność aż do daty ważności umieszczonej na etykiecie. Należy unikać powtarzanego rozmrażania i zamrażania. Zalecanych jest maksymalnie 8 cykli zamrażania i rozmrażania. Odczynniki muszą być rozmrażane w temperaturze otoczenia (15 25 C) przez minimum 1 godzinę, a maksymalnie przez 4,5 godziny. Gdy odczynniki są gotowe do użycia, to można przygotować reakcje PCR. Probówki Rotor-Gene Q zawierające mieszaniny master mix i próbki DNA mogą być wstawiane do [aparatu] Rotor-Gene Q MDx instrument natychmiast. Całkowity czas przed uruchomieniem (cyklem), gdy już reakcje PCR są przygotowane, nie powinien przekraczać: 7 godzin przy przechowywaniu w temperaturze otoczenia (15 25 C) Uwaga: Czas ten obejmuje zarówno przygotowanie PCR jak i przechowywanie. 18 godzin, jeśli jest przechowywany w lodówce (2 8 C) Uwaga: Czas ten obejmuje zarówno przygotowanie PCR jak i przechowywanie. Uwaga: Aby zapewnić optymalną aktywność i wydajność Scorpions (tak jak w przypadku wszystkich znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek) musi być chroniony przed światłem, aby uniknąć foto-wyświecania. Uwaga: Aby uzyskać optymalne wykorzystanie odczynników w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR próbki powinny być grupowane w partiach (wsadach). Jeśli próbki są testowane indywidualnie, to powoduje to zużycie większej ilości odczynników i zmniejsza liczbę próbek, które mogą zostać przetestowane przy użyciu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

16 Postępowanie z próbką biologiczną i jej magazynowanie Uwaga: Wszystkie próbki muszą być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiał próbki musi być ludzkim genomowym DNA wyekstrahowanym z tkanki FFPE. Próbki biologiczne muszą być transportowane zgodnie ze standardami przyjętymi w patologii, aby zapewnić jakość próbki biologicznej. Próbki nowotworowe nie są homogeniczne i dane z próbki nowotworu mogą nie być zgodne z innymi skrawkami tego samego nowotworu. Próbki nowotworowe mogą również zawierać tkanki nie-nowotworowe. Nie należy oczekiwać, że DNA z tkanki nie-nowotworowej zawiera mutacje wykrywane przez zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Aby przygotować próbki tkanki do ekstrakcji DNA, należy: Używając standardowych materiałów i metod należy utrwalić próbkę tkanki w 10% obojętnej buforowanej formalinie (NBF) i zatopić próbkę tkanki w parafinie. Posługując się mikrotomem należy ciąć kolejne skrawki o grubości 5 µm z bloku parafinowego i nakładać je na szkiełka. Skorzystać z pomocy wyszkolonej osoby (np. patologa), aby ocenić zabarwione hematoksyliną i eozyną (H & E) skrawki i aby potwierdzić, że jest tam obecny nowotwór. Zabarwione skrawki nie mogą zostać użyte do ekstrakcji DNA. Wszystkie preparaty (slides) FFPE należy przechowywać w temperaturze pokojowej (15 25 C). Preparaty (slides) mogą być przechowywane w temperaturze otoczenia do około 1 miesiąca przed ekstrakcją DNA. 16 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

17 Procedura Ekstrakcja DNA i przygotowanie Charakterystyka wydajności dla tego zestawu została wygenerowana przy użyciu DNA ekstrahowanego za pomocą zestawu QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit. W przypadku używania funkcjonalnie równoważnego zestawu QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (nr kat ) należy przeprowadzać ekstrakcję DNA zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku, zwracając uwagę na następujące elementy: Nie należy używać roztworu do usuwania parafiny QIAGEN Deparaffinization Solution. Do usuwania parafiny należy stosować wyłącznie metodę ksylen / etanol (xylene/ethanol method) opisaną w podręczniku QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook. Należy zadbać, aby używać etanolu* o stopniu czystości wymaganym w biologii molekularnej do wszystkich wymaganych etapów. Należy zeskrobać cały obszar tkanki z dwóch skrawków do oznaczonej probówki mikrowirówkowej przy użyciu nowego (świeżego) skalpela do każdej próbki. Trawienie proteinazą K (krok 11 w podręczniku QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook) musi być prowadzone przez 1 godzinę ± 5 minut w temperaturze 56 C ± 3 C. Trawienie proteinazą K (krok 12 w podręczniku QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook) musi być prowadzone przez 1 godzinę ± 5 minut w temperaturze 90 C ± 3 C. Nie należy stosować kroku trawienia RNazą opisanego w podręczniku QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook. Próbki muszą być eluowane przy użyciu 120 µl buforu elucyjnego (ATE) z zestawu QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (krok 20 w podręczniku QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook). Genomowe DNA może być przechowywane w temperaturze 2-8 C przez 1 tydzień po ekstrakcji lub przy -15 do -25 C przez okres do 8 tygodni przed użyciem. Uwaga: Wszystkie testy w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR Kit generują krótkie produkty PCR. Jednakże zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit nie będzie pracował z mocno pofragmentowanym DNA. * Nie należy używać alkoholu denaturowanego, który zawiera inne substancje takie jak metanol lub metyloetyloketony. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

18 Protokół: Ocena próbki Protokół ten służy do oceny całkowitego amplifikowalnego DNA w próbkach przy użyciu therascreen EGFR CE Control Run Locked Template z pakietu Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Assay Package do automatycznej oceny próbki. Uwaga: Informacje na temat ręcznej oceny próbki DNA zamieszczono w Dodatek A: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit Protokół ręczny, strona 65. Ważne punkty przed rozpoczęciem Przed rozpoczęciem procedury należy przeczytać Ogólne środki ostrożności, strona 13. Należy poświęcić czas na zapoznanie się z aparatem Rotor-Gene Q MDx instrument przed rozpoczęciem protokołu. Patrz instrukcja obsługi urządzenia. Nie należy worteksować Taq ani żadnej mieszaniny zawierającej Taq, ponieważ może to spowodować inaktywację enzymu. Należy pipetować Taq umieszczając końcówkę pipety tuż pod powierzchnią cieczy, aby uniknąć pokrycia końcówki nadmiarem enzymu. Stosując dostępną mieszaninę reakcyjną kontroli możliwe jest ocenienie do 24 próbek. Czynności, jakie należy wykonać przed rozpoczęciem Należy się upewnić, że program therascreen EGFR CE Assay Package software został zainstalowany przed pierwszym użyciem aparatu Rotor- Gene Q MDx instrument (patrz Załącznik B: Instalacja therascreen EGFR CE Assay Package, strona 87). Przed każdym użyciem wszystkie odczynniki muszą zostać całkowicie rozmrożone przez co najmniej 1 godzinę, a maksymalnie 4,5 godziny, w temperaturze pokojowej (15 25 C), wymieszane poprzez 10-krotne obracanie i krótko wirowane w celu zebrania zawartości na dnie probówki. Wszystkie próbki należy mieszać poprzez 10-krotne obracanie i krótko wirować w celu zebrania zawartości na dnie probówki. Należy upewnić się, że przed każdym użyciem Taq jest w temperaturze pokojowej (15 25 C). Probówkę należy krótko wirować, aby zebrać enzym na dnie probówki. Procedura 1. Mieszaninę reakcyjną kontroli (Control Reaction Mix (CTRL)), wodę wolną od nukleazy (nuclease-free water) dla kontroli No Template Control (NTC), oraz EGFR Positive Control (PC) należy rozmrażać w 18 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

19 temperaturze otoczenia (15 25 C) przez co najmniej 1 godzinę, a maksymalnie 4,5 godziny. Czasy rozmrażania odczynników, przygotowania PCR i przechowywania przed uruchomieniem cyklu zostały wskazane w tabeli 2. Tabela 2. Czasy rozmrażania, czasy przygotowania PCR i temperatury przechowywania Czas rozmrażania Minimum Maksimum 1 godz. 4,5 godz. Temperatura przechowywania po konfiguracji PCR Temperatura otoczenia (15 25 C) Maksymalny czas PCR i przechowywania 7 godz. 1 godz. 4,5 godz. 2 8 C 18 godz. Uwaga: Konfigurowanie PCR jest przeprowadzane w temperaturze otoczenia (15 25 C). Termin "przechowywanie" ( storage ) odnosi się do czasu między zakończeniem konfigurowania PCR i uruchomieniem cyklu PCR w [aparacie] Rotor-Gene Q MDx instrument. Uwaga: Należy doprowadzić Taq do temperatury otoczenia (15 25 C) w tym samym czasie co pozostałe odczynniki (patrz Magazynowanie odczynników i sposób postępowania z nimi, strona 15). Probówkę należy krótko wirować, aby zebrać enzym na dnie probówki. 2. Po rozmrożeniu odczynników należy je wymieszać poprzez 10 krotne obracanie każdej probówki, aby uniknąć zlokalizowanego (miejscowego) stężenia soli i następnie krótko wirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki. 3. Należy przygotować wystarczającą ilość mieszaniny Control master mix (Control Reaction Mix [CTRL] plus Taq) dla próbek DNA, reakcji EGFR PC oraz reakcji NTC zgodnie z objętościami podanymi w tabeli 3. Należy dołączyć odczynniki dla jednej dodatkowej próbki, aby umożliwić wystarczające pokrycie (zapewnić nadwyżkę) dla konfigurowania PCR. Mieszanina master mix zawiera wszystkie elementy niezbędne dla PCR, z wyjątkiem próbki. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

20 Tabela 3. Przygotowanie mieszaniny Control assay master mix Komponent Objętość Control Reaction Mix (CTRL) (mieszanina reakcyjna kontroli) 19,5 µl x (n + 1)* Taq DNA polymerase (Taq) 0,5 µl x (n + 1) Objętość całkowita 20 µl/reakcję * n = ilość reakcji (próbki plus kontrole). Należy przygotować wystarczającą ilość master mix dla jednej dodatkowej próbki (n + 1), aby umożliwić wystarczające pokrycie (zapewnić nadwyżkę) dla przygotowania PCR. Wartość n nie powinna przekroczyć 26 (24 próbki plus 2 kontrole). Uwaga: Podczas przygotowywania mieszaniny master mix najpierw jest dodawana wymagana objętość mieszaniny reakcji kontroli Control Reaction Mix do odpowiedniej probówki, a Taq jest dodawana jako ostatnia. 4. Należy gruntownie wymieszać master mix poprzez delikatne 10 krotne pipetowanie. Należy umieścić odpowiednią liczbę pasków probówek w statywie zgodnie z układem (layout) w tabeli 4. Natychmiast dodać 20 µl mieszaniny master mix do każdego paska probówek PCR. Wieczka pozostają w plastikowym pojemniku do czasu, aż będą potrzebne. Dla oceny próbki DNA mieszanina Control assay master mix jest dodawana do jednej probówki PC, jednej probówki NTC i jednej probówki dla każdej próbki badanej. 20 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

21 Tabela 4. Układ testów oceny próbki DNA w statywie. Numery oznaczają położenia w statywie i wskazują końcową pozycję rotora. Test Pozycja Kontrola 1[PC] Kontrola 2[NTC] Kontrola Kontrola Kontrola Kontrola Kontrola Kontrola Należy natychmiast dodać 5 µl wody dla NTC do probówki w pozycji 2 i zamknąć probówkę wieczkiem. 6. Dodać 5 µl każdej z próbek do probówek próbek (pozycje probówek 3 26) i zamknąć probówki wieczkiem. 7. Dodać 5 µl EGFR PC do probówki w pozycji 1 i zamknąć probówkę wieczkiem. Należy zwrócić uwagę, aby unikać błędów ładowania lub pipetowania, żeby zapewnić prawidłowe dodawanie NTC, próbek oraz PC do odpowiednich probówek. Należy oznakować wieczka probówek tak, aby wskazywały kierunek ładowania probówek do aparatu Rotor Gene Q MDx instrument. 8. Po zamknięciu wszystkich probówek PCR wieczkami należy przeprowadzić wizualną kontrolę poziomów napełnienia probówek z próbkami, aby zapewnić, że próbka została dodana do wszystkich probówek. 9. Należy odwracać wszystkie probówki PCR 4 razy, aby wymieszać próbki i mieszaniny reakcyjne. 10. Umieścić paski probówek PCR w odpowiednich pozycjach w rotorze 72-dołkowym zgodnie z układem (layout) w tabeli 4. Jeśli rotor nie jest całkowicie wypełniony, to należy wypełnić puste pozycje rotora zamkniętymi pustymi probówkami. 11. Natychmiast umieścić 72-dołkowy rotor w [aparacie] Rotor-Gene Q MDx instrument. Należy upewnić się, że pierścień blokujący (wyposażenie aparatu Rotor-Gene Q MDx) jest umieszczony w górnej części rotora, aby zabezpieczyć probówki podczas pracy. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

22 Uwaga: W przypadku stosowania ręcznej oceny próbek należy zapoznać się z Dodatek A: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit Protokół ręczny, strona Należy uruchomić program Rotor-Gene Q software klikając dwukrotnie na ikonę therascreen EGFR CE Control Run Locked Template na pulpicie komputera podłączonego do aparatu Rotor- Gene Q MDx instrument (rysunek 1). Rysunek 1. Ikona EGFR CE Locked Template dla cyklu kontroli (ocena próbki). 13. Otwiera się zakładka Setup jako domyślna (rysunek 2). Należy upewnić się, że pierścień blokujący jest prawidłowo zamontowany i następnie zaznaczyć okienko Locking Ring Attached (pierścień blokujący jest zamontowany). Zamknąć pokrywę aparatu Rotor-Gene Q MDx instrument. 1 2 Rysunek 2. Zakładka Setup (1) i okienko Locking Ring Attached (2). 14. Należy wpisać identyfikator (ID) analizy w polu dialogowym Run ID (ID cyklu) zgodnie z własną przyjętą konwencją. Wpisać nazwę próbki w polu dialogowym Sample Name (nazwa próbki) zgodnie z własną przyjętą konwencją i nacisnąć klawisz enter. Spowoduje to dodanie nazwy próbki do listy próbek poniżej i przypisze próbce identyfikator Sample ID (1, 2, 3, etc.). Ponadto panel Layout of 22 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

23 the pipetting adaptor (układ adaptera pipetowania) po prawej stronie uaktualnia się tak, aby zawierał nazwę próbki (rysunek 3). Uwaga: Alternatywnie nazwy próbek zapamiętane w formatach *.smp (pliki próbek Rotor-Gene Q ) lub *.csv (wartości oddzielone przecinkami) mogą być importowane przy użyciu przycisku Import Samples (importuj próbki). Przy użyciu tej metody nazwy próbek są wypełniane automatycznie. Uwaga: W panelu Layout of the pipetting adaptor należy się upewnić, że dodanie nazwy próbki jest wyróżnione poprzez zmianę koloru i że nazwa próbki znajduje się na pozycji próbki (rysunek 3). Uwaga: Nazwy próbek dłuższe niż 8 znaków nie mogą być w całości wyświetlone w panelu Layout of the pipetting adaptor Rysunek 3. Wpisanie Run ID oraz Sample Name (1 = pole dialogowe Run ID ; 2 = pole dialogowe Sample Name ; 3 = Sample List ; 4 = panel Layout of the pipetting adaptor ; 5 = panel Sample Import ). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

24 15. Należy powtórzyć krok, 14 aby wpisać nazwy wszystkich dodatkowych próbek (rysunek 4). Uwaga: Aby edytować nazwę próbki należy kliknąć na Sample Name (nazwa próbki) na liście próbek i wybrana próbka pojawi się w oknie dialogowym Sample Name powyżej. Należy edytować nazwę próbki zgodnie z lokalną konwencją nazewnictwa i kliknąć na klawisz enter, aby zaktualizować nazwę Rysunek 4. Wpisanie dodatkowych nazw próbek w polu dialogowym Sample Name (1 = okno dialogowe Sample Name ; 2 = Sample List ; 3 = panel Layout of the pipetting adaptor ). 16. Po wpisaniu wszystkich nazw próbek należy sprawdzić, czy są one poprawne. Należy dodać wszelkie dodatkowe informacje w polu dialogowym Notes, jeśli to niezbędne, i następnie kliknąć na Start Run (uruchom cykl) (rysunek 5). Uwaga: Jeśli którakolwiek z pozycji rotora pozostaje nieużywana to pojawi się Warning (ostrzeżenie) (rysunek 5) aby przypomnieć użytkownikowi, że wszystkie nieużywane pozycje na rotorze muszą zostać wypełnione zamkniętymi pustymi probówkami. Należy upewnić się, że wszystkie nieużywane pozycje rotora są wypełnione zamkniętymi pustymi probówkami i kliknąć na OK aby kontynuować postępowanie. 24 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

25 1 3 2 Rysunek 5. Pole dialogowe Notes (1), przycisk Start Run (2) oraz Warning (ostrzeżenie) dotyczące niewykorzystanych pozycji rotora (3). 17. Otwiera się okno Save As (zapamiętaj jako). Należy wybrać odpowiednią nazwę pliku i zapamiętać cykl PCR jako plik cyklu *.rex w wybranej lokalizacji. Kliknąć na Save (zapisz) (rysunek 6). 1 3 Rysunek 6. Okno Save As (1) (2 = pola File Name oraz Save as type ; 3 = przycisk Save ). 18. Zostaje uruchomiony cykl PCR. Uwaga: W momencie uruchomienia cyklu otwiera się zakładka Run Progress, aby wyświetlać wykres temperaturowy i pozostały czas cyklu (rysunek 7). 2 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

26 1 Rysunek 7. Zakładka Run Progress (1). 19. Gdy cykl zostanie zakończony otwiera się zakładka Analysis (analiza). Uwaga: Jeśli zakładka Analysis nie otworzy się, to należy kliknąć na zakładkę Analysis (rysunek 8). Uwaga: Wyjaśnienie metody obliczeń zostało zaprezentowane w rozdziale Interpretacja wyników (zautomatyzowana), strona Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

27 1 2 Rysunek 8. Zakładka Analysis (1) i sprawozdanie z wyników (2 = Sample QC Result Table ). 20. Wyniki kontroli są podawane w sposób przedstawiony poniżej w tabeli Sample QC Result Table (rysunek 8). Kontrole cyklu (PC i NTC, pozycje probówek 1 i 2 odpowiednio). Jeśli wyniki mieszczą się w obrębie akceptowalnych zakresów, to każdy jest wyświetlany jako Valid (ważny). W przeciwnym razie wynik zostanie wyświetlony jako Invalid (nieważny). Reakcja kontroli próbki CT >31,10; zostaje wyświetlona jako Invalid (nieważna). Ilość DNA nie jest wystarczająca do analizy mutacji. Należy ponownie przetestować próbkę. Jeśli ciągle jeszcze ilość DNA jest niewystarczająca to należy ekstrahować więcej tkanki nowotworowej, o ile jest dostępna. Reakcja kontroli próbki CT <23,70; zostaje wyświetlona jako Invalid (nieważna). Stężenie DNA jest zbyt wysokie dla analizy mutacji. Należy rozcieńczyć wodą wolną od nukleazy przeznaczoną do rozcieńczeń (Nuclease- Free Water for Dilution (Dil.)) i ponownie przetestować. Rozcieńczyć tak, aby CT mieściło się w zakresie 23,70 31,10. Rozcieńczenie 1:1 zwiększa wartość CT o około 1,0. Reakcja kontroli próbki CT w zakresie 23,70 31,10 (23,70 Control CT 31,10); zostaje wyświetlona jako Valid (ważna). Stężenie DNA jest odpowiednie dla analizy mutacji. Uwaga: Jeśli wymagana jest ponowna ekstrakcja lub rozcieńczenie, to należy powtórzyć reakcję kontroli aby potwierdzić, że stężenie DNA jest odpowiednie do wykorzystania. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

28 21. Należy kliknąć na Report aby sporządzić plik raportu. Otwiera się okno przeglądarki "Report Browser". Należy wybrać EGFR CE Analysis Report pod Templates i następnie kliknąć na Show (rysunek 9). Uwaga: Aby zapamiętać raporty w alternatywnej lokalizacji w formacie Web Archives należy kliknąć na Save As w górnym lewym rogu każdego raportu Rysunek 9. Wybieranie EGFR CE Analysis Report (1 = przycisk Report ; 2 = okno Report Browser ; 3 = wybranie EGFR Analysis Report ; 4 = przycisk Show ). 28 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

29 Protokół: Wykrywanie mutacji EGFR Protokół ten służy do wykrywania mutacji EGFR. Jeśli próbka przeszła pomyślnie ocenę próbki DNA, to może być testowana testem mutacji EGFR przy zastosowaniu zautomatyzowanego programu. Uwaga: Informacje na temat ręcznej metody wykrywania mutacji zamieszczono w Dodatek A: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit Protokół ręczny, strona 65. Ważne punkty przed rozpoczęciem Przed rozpoczęciem procedury należy przeczytać Ogólne środki ostrożności, strona 13. Należy poświęcić czas na zapoznanie się z aparatem Rotor-Gene Q MDx instrument przed rozpoczęciem protokołu. Patrz instrukcja obsługi urządzenia. Próbka może zostać przetestowana przy użyciu testu mutacji EGFR, jeśli przejdzie pomyślnie ocenę próbki DNA. Aby wykorzystać w sposób efektywny zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit, próbki muszą być pogrupowane w partie (wsady) po 7. Mniejszy rozmiar partii (wsadu) oznacza, że mniej próbek może zostać przetestowanych przy użyciu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Próbka musi zostać przetestowana przy użyciu wszystkich mieszanin reakcyjnych dostarczonych w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Nie należy worteksować Taq ani żadnej mieszaniny zawierającej Taq, ponieważ może to spowodować inaktywację enzymu. Należy pipetować Taq umieszczając końcówkę pipety tuż pod powierzchnią cieczy, aby uniknąć pokrycia końcówki nadmiarem enzymu. Czynności, jakie należy wykonać przed rozpoczęciem Należy się upewnić, że program therascreen EGFR CE Assay Package software został zainstalowany przed pierwszym użyciem aparatu Rotor- Gene Q MDx instrument (patrz Załącznik B: Instalacja therascreen EGFR CE Assay Package, strona 87). Przed każdym użyciem wszystkie odczynniki muszą zostać całkowicie rozmrożone przez co najmniej 1 godzinę, a maksymalnie 4,5 godziny, w temperaturze pokojowej (15 25 C), wymieszane poprzez 10-krotne obracanie i krótko wirowane w celu zebrania zawartości na dnie probówki. Wszystkie próbki należy mieszać poprzez 10-krotne obracanie i krótko wirować w celu zebrania zawartości na dnie probówki. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

30 Należy upewnić się, że przed każdym użyciem Taq jest w temperaturze otoczenia (15 25 C). Probówkę należy krótko wirować, aby zebrać enzym na dnie probówki. Procedura 1. Należy rozmrażać wszystkie probówki z mieszaninami reakcyjnymi, wodę dla NTC oraz EGFR PC w temperaturze otoczenia (15 25 C) przez co najmniej 1 godzinę i maksymalnie 4.5 godziny. Czasy rozmrażania odczynników, konfigurowania PCR i przechowywania przed uruchomieniem cyklu zostały wskazane w tabeli 5. Tabela 5. Czasy rozmrażania, czasy konfigurowania PCR i temperatury przechowywania Czas rozmrażania Minimum Maksimum 1 godz. 4,5 godz. Przechowywanie przechowywania po konfiguracji PCR Temperatura otoczenia (15 25 C) Maksymalny czas konfigurowania i przechowywania PCR 7 godz. 1dodz. 4,5 godz. 2 8 C 18 godz. Uwaga: Konfigurowanie PCR jest przeprowadzane w temperaturze otoczenia (15 25 C). Termin "przechowywanie" ( storage ) odnosi się do czasu między zakończeniem konfigurowania PCR i uruchomieniem cyklu PCR w [aparacie] Rotor-Gene Q MDx instrument. Uwaga: Należy doprowadzić Taq (probówka Taq) do temperatury otoczenia (15 25 C) w tym samym czasie co pozostałe odczynniki (patrz Magazynowanie odczynników i sposób postępowania z nimi, strona 15). Probówkę należy krótko wirować, aby zebrać enzym na dnie probówki. 2. Po rozmrożeniu odczynników należy je wymieszać poprzez 10 krotne obracanie każdej probówki, aby uniknąć zlokalizowanego (miejscowego) stężenia soli i następnie krótko wirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki. 3. Należy przygotować wystarczającą ilość mieszanin master testu (assay reaction mix plus Taq) dla próbek DNA, EGFR PC oraz reakcji NTC zgodnie z objętościami podanymi w tabeli 6. Należy dołączyć odczynniki dla jednej dodatkowej próbki, aby umożliwić wystarczające pokrycie (zapewnić nadwyżkę) dla konfigurowania PCR. Mieszaniny master mix zawierają wszystkie elementy niezbędne dla PCR, z wyjątkiem próbki. 30 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

31 Tabela 6. Przygotowanie mieszanin master dla testu Test Probówka mieszaniny reakcyjnej Objętość mieszaniny reakcyjnej Objętość polimerazy Taq DNA (probówka Taq) Kontrola CTRL 19,5 µl x (n+1)* 0,5 µl x (n+1)* T790M T790M 19,5 µl x (n+1) 0,5 µl x (n+1) Delecje Del 19,5 µl x (n+1) 0,5 µl x (n+1) L858R L85R 19,5 µl x (n+1) 0,5 µl x (n+1) L861Q L861Q 19,5 µl x (n+1) 0,5 µl x (n+1) G719X G719X 19,5 µl x (n+1) 0,5 µl x (n+1) S768I S768I 19,5 µl x (n+1) 0,5 µl x (n+1) Insercje Ins 19,5 µl x (n+1) 0,5 µl x (n+1) * n = ilość reakcji (próbki plus kontrole). Należy przygotować wystarczającą ilość master mix dla jednej dodatkowej próbki (n + 1), aby umożliwić wystarczające pokrycie (zapewnić nadwyżkę) dla konfigurowania PCR. Wartość n nie powinna przekroczyć 7 (plus kontrole), ponieważ 7 jest maksymalną liczbą próbek, które mieszczą się w analizie. 4. Należy gruntownie wymieszać mieszaniny master mix poprzez delikatne 10 krotne pipetowanie. Należy umieścić odpowiednią liczbę pasków probówek w statywie zgodnie z układem (layout) w tabeli 7. Natychmiast dodać 20 µl właściwej mieszaniny master mix do każdego paska probówek PCR. Wieczka pozostają w plastikowym pojemniku do czasu, aż będą potrzebne. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

32 Tabela 7. Układ testów kontrolnych i mutacji w statywie. Numery oznaczają położenia w statywie i wskazują końcową pozycję rotora. Test Kontrole PC Pozycja Numer próbki NT C Kontrola T790M Delecje L858R L861Q G719X S768I Insercje Należy natychmiast dodać 5 µl wody dla NTC do probówek w pozycjach 9 16 i zamknąć probówki wieczkiem. 6. Dodać 5 µl każdej z próbek do probówek próbek (pozycje probówek 17 24, 25 32, 33 40, 41 48, 49 56, oraz 65 72) i zamknąć je wieczkiem. 7. Dodać 5 µl EGFR PC do probówek w pozycji 1 8 i zamknąć je wieczkiem. Należy zwrócić uwagę aby unikać błędów ładowania lub pipetowania, żeby zapewnić prawidłowe dodawanie NTC, próbek oraz EGFR PC do odpowiednich probówek. Każda probówka powinna zawierać całkowitą objętość reakcyjną równą 25 µl (20 µl mieszaniny testowej master mix przygotowanej w kroku 3 (tabela 6), plus 5 µl NTC/próbka/PC). Numery oznaczają położenia w statywie i wskazują końcową pozycję rotora. Należy oznakować wieczka probówek tak, aby wskazywały kierunek ładowania probówek do aparatu Rotor Gene Q MDx instrument. 8. Po zamknięciu wszystkich probówek PCR wieczkami należy przeprowadzić wizualną kontrolę poziomów napełnienia probówek z próbkami, aby upewnić się, że próbka została dodana do wszystkich probówek. 9. Należy odwracać wszystkie probówki PCR 4 razy, aby wymieszać próbki i mieszaniny reakcyjne. 32 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

33 10. Umieścić paski probówek PCR w odpowiednich pozycjach w rotorze 72-dołkowym zgodnie z układem (layout) w tabeli 7. Każda analiza PCR może zawierać maksymalnie 7 próbek. Jeśli rotor nie jest całkowicie wypełniony, to należy wypełnić puste pozycje rotora zamkniętymi pustymi probówkami. 11. Natychmiast umieścić 72-dołkowy rotor w [aparacie] Rotor-Gene Q MDx instrument. Należy upewnić się, że pierścień blokujący (wyposażenie aparatu Rotor-Gene Q MDx) jest umieszczony w górnej części rotora, aby zabezpieczyć probówki podczas pracy. Uwaga: W przypadku używania ręcznego sposobu wykrywania mutacji EGFR należy zapoznać się z Dodatek A: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit Protokół ręczny, strona Należy uruchomić program Rotor-Gene Q software klikając dwukrotnie ma ikonę therascreen EGFR CE Control Run Locked Template na pulpicie laptopa podłączonego do aparatu Rotor-Gene Q MDx instrument (rysunek 10). therascreen EGFR CE Locked Template Rysunek 10. Ikona EGFR CE Locked Template (wykrywanie mutacji EGFR). 13. Otwiera się zakładka Setup jako domyślna (rysunek 11). Należy upewnić się, że pierścień blokujący jest prawidłowo zamontowany i następnie zaznaczyć okienko Locking Ring Attached (pierścień blokujący jest zamontowany). Zamknąć pokrywę aparatu Rotor-Gene Q MDx instrument. 1 2 Rysunek 11. Zakładka Setup (1) i okienko Locking Ring Attached (2). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

34 14. Należy wpisać identyfikator (ID) dla cyklu w polu dialogowym Run ID (ID cyklu) zgodnie z własną przyjętą konwencją. Wpisać nazwę próbki w polu dialogowym Sample Name (nazwa próbki) zgodnie z własną przyjętą konwencją i nacisnąć klawisz enter. Spowoduje to dodanie nazwy próbki do listy próbek poniżej i przypisze próbce identyfikator Sample ID (1, 2, 3, etc.). Ponadto panel Layout of the pipetting adaptor (układ adaptera pipetowania) po prawej stronie uaktualnia się tak, aby zawierał nazwę próbki (rysunek 12). Uwaga: Alternatywnie nazwy próbek zapamiętane w formatach *.smp (pliki próbek Rotor-Gene Q ) lub *.csv (wartości oddzielone przecinkami) mogą być importowane przy użyciu przycisku Import Samples (importuj próbki). Przy użyciu tej metody nazwy próbek są wypełniane automatycznie. Uwaga: W panelu Layout of the pipetting adaptor należy się upewnić, że dodanie nazwy próbki jest wyróżnione poprzez zmianę koloru i że nazwa próbki znajduje się na pozycji próbki (rysunek 12). Uwaga: Możliwe jest dodanie maksymalnie 7 próbek. Identyfikatory (ID) próbek (w kółkach próbek) są przypisywane automatycznie numerom 1-7. Uwaga: Nazwy próbek dłuższe niż 8 znaków mogą nie być w całości wyświetlone w panelu Layout of the pipetting adaptor Rysunek 12. Wpisanie Run ID oraz Sample Name (1 = pole dialogowe Run ID ; 2 = przycisk Sample Import ; 3 = pole dialogowe Sample Name ; 4 = Sample List ; 5 = panel Layout of the pipetting adapter ; 6 = wyróżnione (podświetlone) kółko próbki i kolumna 8 testów pod spodem). 34 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

35 15. Należy powtórzyć krok 14, aby wpisać nazwy wszystkich dodatkowych próbek (rysunek 13). Uwaga: Aby edytować nazwę próbki należy kliknąć na Sample Name (nazwa próbki) na liście próbek i wybrana próbka pojawi się w polu dialogowym Sample Name powyżej. Należy edytować nazwę próbki zgodnie z lokalną konwencją nazewnictwa i kliknąć na klawisz enter, aby zaktualizować nazwę Rysunek 13. Wpisanie dodatkowych nazw próbek w polu dialogowym Sample Name (1 = okno dialogowe Sample Name ; 2 = Sample List ; 3 = panel Layout of the pipetting adaptor ). 16. Po wpisaniu wszystkich nazw próbek należy sprawdzić, czy są one poprawne. Należy dodać wszelkie dodatkowe informacje w polu dialogowym Notes, jeśli to niezbędne, i następnie kliknąć na Start Run (uruchom cykl) (rysunek 14). Uwaga: Jeśli którakolwiek z pozycji rotora pozostaje nieużywana to pojawi się Warning (ostrzeżenie) (rysunek 14), aby przypomnieć użytkownikowi, że wszystkie nieużywane pozycje na rotorze muszą zostać wypełnione zamkniętymi pustymi probówkami. Należy upewnić się, że wszystkie nieużywane pozycje rotora są wypełnione zamkniętymi pustymi probówkami i kliknąć na OK, aby kontynuować postępowanie. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

36 3 1 2 Rysunek 14. Pole dialogowe Notes (1), przycisk Start Run (2) oraz Warning (ostrzeżenie) dotyczące niewykorzystanych pozycji rotora (3). 17. Otwiera się okno Save As (zapamiętaj jako). Należy wybrać odpowiednią nazwę pliku i zapamiętać cykl PCR jako plik cyklu *.rex w wybranej lokalizacji. Kliknąć na Save (zapamiętaj) (rysunek 15). 1 3 Rysunek 15. Okno Save As (1) (2 = pola File Name oraz Save as type ; 3 = przycisk Save ). 18. Zostaje uruchomiony cykl PCR. Uwaga: W momencie uruchomienia cyklu otwiera się zakładka Run Progress aby wyświetlać wykres graficzny temperatury i pozostały czas cyklu (rysunek 16) Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

37 1 Rysunek 16. Zakładka Run Progress. 19. Gdy cykl zostanie zakończony otwiera się zakładka Analysis (analiza). Uwaga: Jeśli zakładka Analysis nie otworzy się, to należy kliknąć na zakładkę Analysis (rysunek 17). Uwaga: Wyjaśnienie metody obliczeń zostało zaprezentowane w rozdziale Interpretacja wyników (zautomatyzowana), strona Rysunek 17. Zakładka Analysis (1) i raport wyników (2 = panel Run Controls, Positive Control ; 3 = panel Run Controls, Negative Control ; 4 = tabela Sample Result Table ; 5 = panel Mutation Status ). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

38 20. Wyniki testów są przedstawione w sposób następujący (Rysunek 18). Run Controls, Positive Control Jeśli wyniki mieszczą się w dopuszczalnym zakresie, to Positive Control Status wyświetli Valid (ważny), w przeciwnym razie pojawi się wynik Invalid (nieważny). Run Controls, Negative Control Jeśli wyniki NTC i Internal Control (kontroli wewnętrznej) mieszczą się w dopuszczalnych zakresach, to Negative Control Status wyświetli Valid (ważny), w przeciwnym razie pojawi się wynik Invalid (nieważny). Sample Result Table (tabela wyników próbki) Specyficzne mutacje są zgłaszane dla próbek Mutation Positive (z mutacją pozytywną) w kolumnie EGFR Mutation Status (status mutacji EGFR). 21. Należy kliknąć na Report, aby sporządzić plik raportu. Otwiera się okno przeglądarki "Report Browser". Należy wybrać EGFR CE Analysis Report pod Templates i następnie kliknąć na Show (rysunek 18). Uwaga: Aby zapamiętać raporty w alternatywnej lokalizacji w formacie Web Archives należy kliknąć na Save As w górnym lewym rogu każdego raportu Rysunek 18. Wybieranie EGFR CE Analysis Report (1 = przycisk Report ; 2 = panel Report Browser ; 3 = przycisk EGFR CE Analysis Report ; 4 = przycisk Show ). 38 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

39 Interpretacja wyników (zautomatyzowana) Analizy i wykrycie mutacji (mutation calls) są wykonywane przez therascreen EGFR Assay Package automatycznie po zakończeniu cyklu. Poniższe informacje wyjaśniają, w jaki sposób therascreen EGFR Assay Package przeprowadza analizy i wykrycie mutacji (mutation calls). Uwaga: Informacje na temat ręcznej analizy wyników zamieszczono w Interpretacja wyników (ręczna), strona 78. Cykl PCR, w którym fluorescencja z określonej reakcji przekracza wartość progową, została zdefiniowana jako wartość CT. Wartość CT wskazuje ilość specyficznego wejściowego DNA. Niskie wartości CT wskazują na wyższe poziomy wejściowego DNA, natomiast wysokie wartości CT wskazują na niższe poziomy wejściowego DNA. Reakcje z wartościami CT są klasyfikowane jako amplifikacje dodatnie. Program Rotor-Gene Q software interpoluje sygnały fluorescencyjne między jakimikolwiek dwoma zapisanymi wartościami. Dlatego też wartość CT może być liczbą rzeczywistą (nie ograniczoną do liczb całkowitych) w obrębie zakresu 0 do 40. W przypadku zestawu therascreen EGFR RGQ PCR wartość progowa jest ustawiona na 0,075 względnych jednostek fluorescencji dla kanału zielonego (FAM) oraz 0,02 dla kanału żółtego (HEX). Wartości te są konfigurowane w sposób automatyczny w therascreen EGFR Assay Package. Kontrole cyklu (PC i NTC oraz IC) są oceniane w celu zapewnienia, że uzyskano akceptowalne wartości CT i że reakcje przebiegają prawidłowo. Wartości CT próbki są obliczane dla każdego testu mutacji przy zastosowaniu równania: CT = [wartość CT testu mutacji] [wartość CT testu kontroli] Próbki są klasyfikowane jako mutacjo-pozytywne, jeśli dały wartość CT mniejszą niż lub równą wartości odcięcia CT dla danego testu. Powyżej tej wartości próbka może zawierać niedostateczny odsetek mutacji, które mogą zostać wykryte przez zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit (poza limitem testu), lub próbka jest mutacjo-ujemna i w obu przypadkach jest zgłoszona jako No Mutation Detected (nie wykryto mutacji). Brak amplifikacji w reakcjach mutacji jest odnotowywany jako No Mutation Detected (nie wykryto mutacji). Oczekuje się, że wartości CT liczone z amplifikacji tła są większe niż wartości odcięcia CT i próbka jest klasyfikowana jako No Mutation Detected (nie wykryto mutacji). Wyniki testu są wyświetlane jako Mutation Detected (wykryto mutację), No Mutation Detected (nie wykryto mutacji), Invalid (nieważne) oraz, jeśli kontrola analizy zakończy się niepowodzeniem, Run Control Failed (kontrola analizy zakończona niepowodzeniem). Dla próbek mutacjo-dodatnich zostaną zgłoszone (podane) specyficzne mutacje. Nowotwór może zawierać więcej niż jedną mutację. W takich przypadkach zostanie zgłoszonych więcej niż jedna mutacja. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

40 Komunikaty Rotor-Gene Q therascreen EFGR Assay Package Komunikty, które mogą być generowane przez Rotor-Gene Q therascreen EGFR Assay Package, ich znaczenie oraz zalecane czynności zostały podane w formie listy w tabeli 8. Nazwy komunikatów są skonstruowane tak, aby zapewnić informację co do komponentu zestawu, którego dotyczą, odnośnej próbki lub kontroli oraz rodzaju awarii. Na przykład: PC_CTRL_ASSAY_FAIL = Positive Control (PC) (kontrola dodatnia), Control Assay (CTRL_ASSAY) (test kontrolny) (FAIL) (zakończony niepowodzeniem) NTC_INT_CTRL_FAIL = No Template Control (NTC) (kontrola no template ), Internal Control (INT_CTRL) (kontrola wewnętrzna) (FAIL) (zakończona niepowodzeniem) SAMPLE_CTRL_HIGH_CONC = (SAMPLE) (próbka), Control Assay (CTRL) (test kontrolny) ma wysokie stężenie (HIGH_CONC) Tabela 8. Komunikaty, znaczenie i działania, które należy podjąć Komunikat Znaczenie Działanie PC_CTRL_ASSAY_FAIL PC_MUTATION_ ASSAY_FAIL PC_CTRL_INVALID_ DATA Analiza PCR nieważna FAM CT poza zakresem kontroli dodatniej w reakcji kontrolnej. Analiza PCR nieważna FAM CT poza zakresem dla jednej lub więcej reakcji kontrolnej mutacji. Analiza PCR nieważna dane z fluorescencji w kontroli dodatniej (mieszanina Control Reaction Mix) nie mogą zostać zinterpretowane. Należy powtórzyć całą analizę PCR. Należy powtórzyć całą analizę PCR. Należy powtórzyć całą analizę PCR. 40 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

41 Komunikat Znaczenie Działanie PC_MUTATION_ INVALID_DATA NTC_INT_CTRL_FAIL NTC_INT_CTRL_ EARLY_CT NTC_INVALID_CT NTC_INVALID_DATA SAMPLE_CTRL_ INVALID_DATA Analiza PCR nieważna dane z fluorescencji w kontroli dodatniej (mieszanina mutation reaction mix) nie mogą zostać zinterpretowane. Analiza PCR nieważna kontrola wewnętrzna powyżej zakresu dla kontroli ujemnej. Analiza PCR nieważna kontrola wewnętrzna jest poniżej zakresu dla kontroli ujemnej. Analiza PCR nieważna nieważne FAM (mniejsze niż wartość graniczna) dla kontroli ujemnej. Analiza PCR nieważna dane z fluorescencji w kontroli ujemnej nie mogą zostać zinterpretowane. Próbka nieważna dane z fluorescencji w kontroli próbki nie mogą zostać zinterpretowane. Należy powtórzyć całą analizę PCR. Należy powtórzyć całą analizę PCR. Należy powtórzyć całą analizę PCR. Należy powtórzyć całą analizę PCR. Należy powtórzyć całą analizę PCR. Należy przygotować nową analizę PCR, aby powtórzyć odnośną próbkę (próbki) Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

42 Komunikat Znaczenie Działanie SAMPLE_CTRL_ HIGH_CONC Próbka nieważna FAM CT zbyt niskie w kontroli próbki. Należy rozcieńczyć próbkę, aby zwiększyć wartość CT kontroli. Rozcieńczenie to powinno być kalkulowane przy założeniu, że rozcieńczenie 1:1 z wodą dostarczoną w zestawie zwiększa CT o [wartość] 1,0; gdy próbka zostanie rozcieńczona to należy przygotować nową analizę PCR, aby powtórzyć próbkę. Natomiast jeśli próbka została rozcieńczona po przeprowadzonej analizie próbki DNA, to należy przejść z rozcieńczoną próbką bezpośrednio do analizy wykrywającej mutację EGFR. 42 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

43 Komunikat Znaczenie Działanie SAMPLE_CTRL_FAIL SAMPLE_INT_CTRL_ FAIL Próbka nieważna FAM CT zbyt wysokie w reakcji kontroli próbki. CT zbyt wysokie (lub brak CT) dla kontroli wewnętrznej (HEX), kanał FAM mutacjonegatywny. Należy przygotować nową analizę PCR, aby powtórzyć próbkę. Jeśli próbka jest nadal nieważna po powtórzeniu analizy PCR, oraz gdy ilość DNA ciągle jeszcze jest niewystarczająca, to należy ekstrahować dwa dalsze skrawki tkanki FFPE jeśli jest dostępna. Należy przygotować nową analizę PCR, aby przetestować tę ekstrakcję. Jeśli próbka jest nieważna, to należy powtórzyć analizę PCR z drugą ekstrakcją. Jeśli ta próbka nie da ważnego wyniku po tej analizie, to próbce tej zostanie przypisany status nieokreślonej mutacji i nie powinno być przeprowadzane dalsze testowanie. W przypadku próbek, które generują komunikat SAMPLE POSITIVE AND INVALID przy wykrytej mutacji (lub też nie wykrytej) w klinicznie korespondujących wynikach raportu dotyczącego mieszaniny reakcyjnej mutacji, nie jest wymagane dalsze testowanie. Jeśli próbce dano status nieważnej: Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

44 Komunikat Znaczenie Działanie Należy rozcieńczyć próbkę wodą dostarczoną w zestawie, zakładając że rozcieńczenie 1:1 zwiększy CT reakcji kontroli o 1,0., zwracając uwagę aby objętość finalna była >40µl (np. 40 µl DNA i 40 µl wody z probówki oznaczonej jako DIL). Należy przygotować nową analizę PCR aby powtórzyć próbkę. Jeśli próbka jest nadal nieważna po powtórzeniu analizy PCR, to należy ekstrahować próbkę z dwóch kolejnych skrawków FFPE. Należy przygotować nową analizę PCR, aby przetestować tę ekstrakcję. Jeśli druga ekstrakcja jest nieważna, to należy rozcieńczyć w sposób opisany powyżej. Jeśli ta próbka nie da ważnego wyniku po tej analizie, to próbce tej zostanie przypisany status nieokreślonej mutacji i nie powinno być przeprowadzane dalsze testowanie. 44 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

45 Komunikat Znaczenie Działanie SAMPLE_INT_CTRL_ EARLY_CT Nieważna probówka mutacji CT HEX zbyt niskie dla próbki (kontrola wewnętrzna) W przypadku próbek, które generują komunikat SAMPLE POSITIVE AND INVALID przy wykrytej mutacji (lub też nie wykrytej) w klinicznie korespondujących wynikach raportu dotyczącego mieszaniny reakcyjnej mutacji, nie jest wymagane dalsze testowanie. Jeśli próbce dano status nieważnej: Należy przygotować nową analizę PCR, aby powtórzyć próbkę. Jeśli jest ona nadal nieważna po powtórzeniu analizy PCR, to należy ekstrahować dwa dalsze skrawki tkanki FFPE, jeśli są dostępne. Należy przygotować nową analizę PCR, aby przetestować tę ekstrakcję. Jeśli będzie nieważna, to należy powtórzyć analizę PCR z drugą ekstrakcją. Jeśli ta próbka nie da ważnego wyniku po tej analizie, to próbce tej zostanie przypisany status nieokreślonej mutacji i nie powinno być przeprowadzane dalsze testowanie. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

46 Komunikat Znaczenie Działanie SAMPLE_INVALID_ DATA SAMPLE_POSITIVE_ AND_INVALID Nieważna probówka mutacji dane z fluorescencji w kontroli wewnętrznej nie mogą zostać zinterpretowane. W przypadku próbek, które generują komunikat SAMPLE POSITIVE AND INVALID przy wykrytej mutacji (lub też nie wykrytej) w klinicznie korespondujących wynikach raportu dotyczącego mieszaniny reakcyjnej mutacji, nie jest wymagane dalsze testowanie. Jeśli próbce dano status nieważnej: Należy przygotować nową analizę PCR aby powtórzyć próbkę. Jeśli w dalszym ciągu nieważna po powtórzeniu analizy PCR, to należy ekstrahować dwa kolejne skrawki tkanki FFPE jeśli jest dostępna. Należy przygotować nową analizę PCR aby przetestować tę ekstrakcję. Jeśli będzie nieważna, to należy powtórzyć analizę PCR z drugą ekstrakcją. Jeśli ta próbka nie da ważnego wyniku po tej analizie, to próbce tej zostanie przypisany status nieokreślonej mutacji i nie powinno być przeprowadzane dalsze testowanie. Jedna lub więcej mutacji dla próbki jest dodatnia; w tym samym czasie jedna lub więcej mutacji dla tej samej próbki jest nieważna. W przypadku próbek, które generują komunikat SAMPLE POSITIVE AND INVALID przy wykrytej mutacji (lub też niewykrytej) w klinicznie korespondujących wynikach raportu dotyczącego mieszaniny reakcyjnej mutacji, nie jest wymagane dalsze testowanie. 46 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

47 Komunikat Znaczenie Działanie W przypadku próbek które generują komunikat SAMPLE POSITIVE AND INVALID przy wyniku INVALID (nieważna) uzyskanym w klinicznie istotnej mieszaninie reakcyjnej mutacji (mutation reaction mix) należy powtórzyć próbkę ze wszystkimi mieszaninami reakcyjnymi postępując zgodnie z działaniami odpowiadającymi określonemu komunikatowi o nieważności. Jeśli komunikat SAMPLE_INT_CTRL_FAIL jest generowany w połączeniu z innym komunikatem dla odnośnej próbki, to musi zostać przeprowadzona czynność rozcieńczenia próbki z komunikatu SAMPLE_INT_CTRL_FAIL. Należy przygotować nową analizę PCR i ponownie przetestować próbkę. W przypadku próbek które generują komunikat SAMPLE POSITIVE AND INVALID z nieważnym (INVALID) wynikiem uzyskanym dla klinicznie istotnej mieszaniny reakcyjnej przy powtórzonej analizie PCR należy ekstrahować próbkę z dwóch kolejnych skrawków FFPE. Należy przygotować nową analizę PCR ze wszystkimi mieszaninami dla testowania tej ekstrakcji. Jeśli próbka ta ponownie wygeneruje wynik nieważny dla klinicznie korespondującej mieszaniny reakcyjnej mutacji, to należy powtórzyć próbkę ze wszystkimi mieszaninami reakcyjnymi zgodnie z określonym komunikatem dotyczącym nieważności. Jeśli [komunikat] SAMPLE_INT_CTRL_FAIL jest generowany w połączeniu z innym komunikatem dla odnośnej próbki, to należy przeprowadzić rozcieńczanie próbki związanej z komunikatem SAMPLE_INT_CTRL_FAIL. Należy przygotować nową analizę PCR i ponownie przetestować tę próbkę. Jeśli po tym powtórzeniu pojawi się komunikat SAMPLE_POS_AND_INVALID, to próbce tej zostaje przypisany status mutacji nieokreślonej. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

48 Przewodnik rozwiązywania problemów Niniejszy przewodnik rozwiązywania problemów może być pomocny w rozwiązywaniu wszelkich problemów, jakie mogą się pojawić. Aby uzyskać więcej informacji należy także zapoznać się ze stroną Często Zadawane Pytania (Frequently Asked Questions) w naszym Centrum Pomocy Technicznej: Naukowcy działu Usług Technicznych w QIAGEN są zawsze gotowi odpowiedzieć na wszelkie pytania, jakie użytkownik może mieć w odniesieniu do informacji i protokołów w tym podręczniku lub do technik dotyczących próbek i testu (informacje kontaktowe znajdują się z tyłu na okładce lub na stronie Komentarze i sugestie Próbki NTC wykazują pozytywne wyniki w zielonym kanale Green FAM Nastąpiło zanieczyszczenie podczas przygotowywania PCR Brak sygnału w dodatniej kontroli EGFR a) Wybrany kanał fluorescencyjny dla analizy danych PCR nie odpowiada protokołowi b) Nieprawidłowe programowanie profilu temperaturowego aparatu Rotor-Gene Q MDx instrument c) Nieprawidłowa analiza PCR Należy powtórzyć PCR z nowymi odczynnikami w powtórzeniach. Jeśli to możliwe zamknąć probówki PCR bezpośrednio po dodaniu próbki przewidzianej do testowania (badanej). Zadbać, aby przestrzeń robocza i aparaty były dekontaminowane w regularnych odstępach czasu. Dla analizy danych należy wybrać kanał fluorescencyjny Cycling Green (zielony) dla analitycznego EGFR PCR i kanał fluorescencyjny Cycling Yellow (żółty) dla kontroli wewnętrznej PCR. Należy porównać profil temperaturowy z protokołem. Jeśli nieprawidłowy, to należy powtórzyć cykl. Sprawdzić własne kroki pracy w oparciu o schemat pipetowania i powtórzyć PCR, jeśli jest to konieczne. 48 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

49 d) Warunki przechowywania jednego lub więcej komponentów zestawu nie są zgodne z instrukcjami podanymi w Magazynowanie odczynników i sposób postępowania z nimi (strona 15) e) Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit przekroczył datę ważności Komentarze i sugestie Sprawdzić warunki przechowywania i datę ważności (patrz etykieta zestawu) odczynników i użyć nowy zestaw, jeśli niezbędne. Sprawdzić warunki przechowywania i datę ważności (patrz etykieta zestawu) odczynników i użyć nowy zestaw, jeśli niezbędne. Kontrola jakości Zgodnie z poświadczonym certyfikatem ISO systemem zarządzania jakością firmy QIAGEN każda partia zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit jest testowana pod kątem zgodności z wcześniej określonymi specyfikacjami, aby zapewnić stałą jakość produktu. Ograniczenia Wyniki z produktu muszą być interpretowane w kontekście wszystkich istotnych objawów klinicznych i wyników laboratoryjnych i nie mogą być stosowane samodzielnie do diagnozy. Produkt ten może być użyty wyłącznie przez personel specjalnie poinstruowany i przeszkolony w procedurach diagnostycznych in vitro i [obsłudze] aparatu Rotor-Gene Q MDx instrument. Produkt przeznaczony jest do stosowania wyłącznie na cyklerze PCR czasu rzeczywistego Rotor-Gene Q MDX. Dla uzyskania optymalnych wyników niezbędne jest postępowanie dokładnie zgodne z podręcznikiem [dla zestawu] therascreen EGFR RGQ PCR Kit Handbook. Rozcieńczenie odczynników inne niż opisane w niniejszym podręczniku nie jest zalecane, ponieważ spowoduje utratę wydajności. Jest ważnym żeby określić ilość i jakość DNA w próbce przed przeprowadzeniem analizy przy użyciu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Dostarczona jest dodatkowa mieszanina kontrolna (Additional Control Reaction Mix) dla upewnienia się, czy wartość CT jest akceptowalna dla danego testu. Odczyty absorbancji nie mogą być stosowane, gdyż nie korelują z wartościami CT w pofragmentowanych próbkach DNA Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

50 Należy zwracać uwagę na daty wygaśnięcia ważności i warunki przechowywania wydrukowane na pudełku i etykietach wszystkich komponentów. Nie należy używać komponentów z przekroczoną datą ważności lub niewłaściwie przechowywanych. 50 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

51 Charakterystyka wydajności Wydajność analityczna Specyficzne charakterystyki wydajności zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit zostały określone w oparciu o badania z użyciem próbek biologicznych tkanek FFPE pobranych od pacjentów z NSCLC oraz linii komórek ludzkich FFPE (linie komórkowe FFPE). Linie komórkowe FFPE zostały wygenerowane przy użyciu linii komórek raka płuc (A549), w celu wytworzenia linii komórkowych, zawierających pożądane specyficzne mutacje EGFR. Gdy próbki biologiczne tkanki lub linie komórkowe nie były dostępne to użyto plazmid DNA. Granica próbki zerowej (limit of blank - LOB), zakres roboczy i wartości odcięcia W sumie przetestowano 417 próbek FFPE w trakcie badań zgodnych z zaleceniami w NCCLS EP17-A (2004) (12) w celu określenia LOB i wartości odcięcia (cutoff) dla każdego testu mutacji. Ponadto określano zakres roboczy. Wartości odcięcia zostały ustalone i są podane w tabeli 9. Tabela 9. Wartości odcięcia określone dla każdego testu mutacji Test T790M 7,40 Delecje 8,00 L858R 8,90 L861Q 8,90 G719X 8,90 S768I 8,90 Insercje 8,00 Odcięcie ( CT) Zakres CT reakcji kontroli został określony jako 23,70 do 31,10 CT. Odcięcia testu i zakresy robocze zostały zweryfikowane przy użyciu standardów i dodatkowych próbek FFPE. Podczas weryfikacji odcięcia (cutoffs) zostały określone pod kątem zdolności rozróżniania prawidłowych mutacji w tle dzikiego DNA w drodze oceny każdego testu z wysokim wejściowym genomowym DNA i wysoką wejściową mutacją DNA (patrz Reaktywność krzyżowa, strona 52). Został również określony wpływ wejściowego DNA na zmutowane połączenia (mutation call) (patrz Wpływ ilości DNA na wartości CT, strona 52). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

52 Aby ocenić wydajność zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit przy braku matrycy (template) i zapewnić, że próbka zerowa (blank sample) lub próbka z "dzikim" DNA nie generuje sygnału analitycznego, który mógłby wskazywać na niskie stężenie mutacji, poddano ewaluacji próbki z no template i NSCLC EGFR dzikiego typu DNA. Wyniki wykazały brak dodatnich połączeń mutacji (mutation calls) dla próbek NTC i dla dzikiego rodzaju próbek FFPE. Wpływ ilości DNA na wartości CT Poziom ilości DNA jest definiowany jako całkowita ilość amplifikowalnego EGFR DNA w próbce, jak jest to określone przez wartości CT z reakcji kontroli. Aby wykazać, że wydajność zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit jest stała w zakresie CT reakcji kontroli (23,70 31,10), wszystkie 7 testów mutacji EGFR zostało poddanych testowi pod kątem zgodności z 6-punktową serią rozcieńczeń 1:3 (6-point, 1-in-3 dilution series) (DNA extrahowane z linii komórkowych FFPE). Docelowe CT dla rozcieńczenia 1, dla każdej mutacji, wynosiło około Rozcieńczenie końcowe, które dało CT równe około 32 33, było poza zakresem CT reakcji kontroli. Ogólnie, wartości CT mierzone przy różnych poziomach wejściowych całkowitego DNA były stałe w obrębie zakresu roboczego zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Reaktywność krzyżowa Badano dzikie EGFR DNA przy wysokim wejściowym DNA, aby określić amplifikację niespecyficzną. Wyniki pokazały, że najniższe wartości ΔCT przekraczały ustalone odcięcia (cutoffs), wykazując brak niespecyficznej amplifikacji. Linie komórek FFPE przy wysokim stężeniu DNA były badane w odniesieniu do wszystkich mieszanin reakcyjnych, aby określić potencjalną reaktywność krzyżową. Wyniki pokazały brak wpływu z powodu reakcji-krzyżowej między reakcjami mutantów. Wszystkie minimalne wartości ΔCT były wyższe niż odpowiadające wartości odcięcia testu dla wszystkich niedopasowanych mieszanin reakcyjnych i próbek DNA. Dokładność: Porównanie z analityczną metodą referencyjną Badanie pokazało zgodność w wykrywaniu mutacji przez zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit i dwukierunkowe sekwencjonowanie Sanger (bidirectional Sanger sequencing). W badaniu tym przetestowano 360 próbek FFPE. Próbki z ważnymi wynikami uzyskanymi metodą Sanger i za pomocą zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit były analizowane w celu określenia odsetka zgodności wyników dodatnich (Positive Percent Agreement - PPA), odsetka zgodności wyników ujemnych (Negative Percent Agreement - NPA) i procentu zgodności ogólnej (Overall Percent Agreement (OPA)). Procenty te, wraz z 52 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

53 odpowiadającymi obustronnymi 95% przedziałami ufności (two-sided 95% confidence intervals - CI), zostały zebrane w tabeli 10. Tabela 10. Analiza zgodności Miara Odsetek zgodności wyników dodatnich Odsetek zgodności wyników ujemnych Procent zgodności ogólnej Zgodność procentowa (N) 95% CI 99,4% (157/158) 96,5% 100,0% 86,6% (175/202) 81,2%-91,0% 92,2% (332/360) 89,0%-94,8% W przypadku 28 wyników z niezgodnymi wynikami procentu zgodności ogólnej (Overall Percentage Agreement): 1 (3,6%) próbka była dzikiego rodzaju (tzn. nie wykryto mutacji) za pomocą zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit, natomiast wyniki wykrytej mutacji [uzyskano] za pomocą sekwencjonowania metodą Sanger. 27 (96,4%) próbek było z wykrytą mutacją za pomocą zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit, natomiast z wynikami odpowiadającymi dzikiemu typowi w metodzie sekwencjonowania Sanger. Wartości granicy wykrywalności (limit of detection - LOD) Przeprowadzono badania w celu określenia LOD dla każdej z 29 mutacji EGFR. LOD została zdefiniowana jako najmniejsza ilość zmutowanego DNA w tle dzikiego DNA, przy której zmutowana próbka zapewni dodatnie wyniki mutacji w 95% wyników testu (C95). Aby określić LOD dla każdej mutacji przygotowano próbki o różnej procentowości mutacji przy wysokich i niskich stężeniach wejściowego DNA i testowano za pomocą zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit (tabela 11). Granica LOD dla każdego testu byłą liczona metodą regresji logistycznej. W celu zweryfikowania LOD zmutowane próbki były testowane przy określonym LOD i weryfikowano pozytywne wyniki testu. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

54 Tabela 11. LOD ustalona przy użyciu niskiego i wysokiego stężenia DNA próbek klinicznych FFPE, linii komórek FFPE lub plazmidów LOD (% zmutowanych) Ekson Mutacja COSMIC* ID Zmiana zasady Niski Wysoki 18 G719A G>C 7,41 1,57 G719S G>A 5,08 7,75 ~ G719C G>T 10,30-19 Delecje _2255>T 1,58 ~ 0,49 ~ _2258>CA 4,91 1, _2252>GCA 16,87 12, _2248>GC 3,24 1, _2252>AAT 4,24 1, _2251del15 0,55 ~ 0,24 ~ _2247del9 8, _2253del18 2, _2254del18 2, _2251del12 4, _2255del18 2,70 0, _2249del15 6,40 1, _2250del15 2,80 1, _2253del15 0,86 ~ 0,47 ~ _2256del18 0,14 ~ 0,05 ~ _2254del15 4,94 ~ 1,56 ~ _2257del18 8,10 ~ 2,08 ~ * COSMIC: Katalog somatycznych mutacji nowotworu: Wartości LOD zostały określone przy użyciu plazmidów Wartości LOD zostały określone przy użyciu linii komórkowych ~ Wartości LOD zostały określone przy użyciu próbek klinicznych Nie określono Ciąg dalszy tabeli na następnej stronie 54 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

55 Tabela 11. Kontynuacja Ekson Mutacja COSMIC* ID 19 Delecje LOD (% zmutowanych) Zmiana zasady Niski Wysoki 2239_2248TTAAGA GAAG>C 0,25 ~ 0,10 ~ _2251>C 4,58 ~ 1,74 ~ 20 S768I G>T 7,66 2,18 Insercje _2308ins GCCAGCGTG 11, _2311ins GGT 2319_2320ins CAC 4,91 1,31 2,40 0,65 T790M C>T 9,72 5,09 21 L858R T>G 5,94 1,13 L861Q T>A 2,22 0,66 * COSMIC: Katalog somatycznych mutacji nowotworu: Wartości LOD zostały określone przy użyciu plazmidów Wartości LOD zostały określone przy użyciu linii komórkowych ~ Wartości LOD zostały określone przy użyciu próbek klinicznych Nie określono Zakłócenia (interferencje) Efekt tkanki nekrotycznej Kliniczne próbki NSCLC FFPE z zawartością tkanki nekrotycznej nie większą niż 50% zarówno w próbkach zmutowanych EGFR jak i próbkach dzikiego typu nie interferowały z wynikami zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Egzogenne substancje Potencjalnie interferujące substancje obecne w procesie ekstrakcji DNA były testowane w próbkach zmutowanych i dzikiego typu przy 10x stężeniu: wosku parafinowego, ksylenu, etanolu i proteinazy K. Wyniki pokazały, że substancje te nie interferują z wynikami połączeń (call results) zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

56 Powtarzalność Powtarzalność między partiami System testowy therascreen EGFR RGQ PCR Kit wykorzystuje 2 oddzielne zestawy: zestaw QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (funkcjonalnie równoważny z zestawem QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit) do izolowania DNA oraz zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit do amplifikacji DNA i wykrywania statusu mutacji EGFR. Powtarzalność i wymienność miedzy partiami wykazano przy zastosowaniu 3 partii zestawu QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit oraz 3 partii zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Całkowity procent prawidłowych połączeń (correct calls) w obrębie partii testu mutacji EGFR wyniósł 97,8% (317/324), a w przypadku próbek dzikiego typu wyniósł 100% (379/379). Postępowanie z próbkami biologicznymi Powtarzalność zestawu QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit była badana przy użyciu skrawków branych z 3 bloków próbki FFPE, konkretnie mutacja delecji w eksonie 19 ( del15), mutacja L858R w eksonie 21 i jeden typ dziki. W przypadku każdej próbki biologicznej przeprowadzano zdublowaną ekstrakcję w 3 ośrodkach (instytucjach) i testowano przez 3 nie-kolejne dni w okresie 6 dni, uzyskując w sumie 18 punktów danych na jedną próbkę. W każdym ośrodku (instytucji) 2 operatorów przeprowadzało testowanie przy użyciu jednej partii zestawu QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit (jedna partia na ośrodek, w sumie 3 partie) w połączeniu z tą samą partią odczynników therascreen EGFR RGQ PCR Kit w obrębie ośrodków. Wszystkie wyniki zmutowanych i dzikiego typu próbek były ważne i dały oczekiwany wynik (prawidłowe wyniki = 100%, 18/18 dla każdej próbki biologicznej), potwierdzając odtwarzalność i powtarzalność zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit w kroku przed-analitycznym izolacji DNA. Precyzja i odtwarzalność (powtarzalność) Precyzja i odtwarzalność zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit badano w oparciu o testowanie DNA ekstrahowanego z próbek klinicznych NSCLC FFPE lub linii komórkowych FFPE reprezentujących wszystkie 7 testów mutacji w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR Kit. W badania włączono również próbki biologiczne dzikiego typu NSCLC FFPE (tabela 12). W celu oceny powtarzalności (odtwarzalności) zastosowano analizę macierzową testując próbki w 3 laboratoriach (ośrodkach) przy wykorzystaniu 3 partii zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit (3 partie w obrębie 3 ośrodków), wykorzystując 2 operatorów na jeden ośrodek, na 2 aparatach na jeden ośrodek, każda próbka (przygotowana na poziomie bliskim LOD) była testowana podwójnie, w sumie przez 16 dni. Powtarzalność każdej indywidualnej mutacji była prowadzona przez niekolejne dni w każdym z 56 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

57 ośrodków. Odsetek prawidłowych połączeń (correct calls) przedstawiono w tabeli 12. Tabela 12. Powtarzalność testu odsetek prawidłowych połączeń (correct calls) dla testowanych mutacji EGFR Ekson Mutacja COSMIC* ID Prawidłowe/ wszystkie Połączenia (calls) % prawidłowych 18 G719A /78 98,72 94,06 19 Delecje / , / , / , / , / , / , / , /95 95,79 90, / , /96 97,92 93, /95 97,92 93, /63 98,41 92, /95 96,84 92, / ,83 20 S768I / ,41 Insercje / , / ,83 T790M / ,86 21 L858R / ,80 L861Q /84 98,81 94,48 Typ dziki 84/ ,50 * COSMIC: Katalog somatycznych mutacji nowotworu: % prawidłowych Niższy jednostronny 95% CI Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

58 Zastosowano analizę wariancji komponentów dla oceny odchylenia standardowego i 95% przedziałów ufności dla zmienności wewnątrz cyklu, między cyklami, między dniami, między partiami i między ośrodkami. W obrębie wszystkich komponentów wariancyjnych badano całkowity współczynnik zmienności (CV) był 14,11% dla wszystkich testowanych mutacji EGFR. W obrębie wszystkich członków panelu mutacji procentowe CV było 8,33% między partiami, między dniami i między analizami. Procentowe CV dla zmienności wewnątrz-cyklu (powtarzalność/precyzja) mieściło się w zakresie od 5,99% do 13,49%. Wydajność kliniczna Dane wyników klinicznych GIOTRIF Badanie kliniczne LUX-Lung 3 była międzynarodową, wieloośrodkową, otwartą (open label), randomizowaną próbą Fazy 3 leczenia afatinib w porównaniu z chemoterapią jako leczenie pierwszego rzutu pacjentów w stadium IIIB lub IV gruczolakoraka (adenocarcinoma) płuc zawierającego mutację aktywującą EGFR (ClinicalTrials.gov number NCT ). Kwalifikowanie pacjenta do włączenia do tej próby było determinowane poprzez testowanie statusu mutacji EGFR pacjenta w oparciu o testowe badania kliniczne (Clinical Trial Assay - CTA). Retrospektywne badanie próbek tkanek było przeprowadzane przy użyciu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Badania mostkujące były przeprowadzone w celu określenia zgodności między zestawem therascreen EGFR RGQ PCR Kit i CTA. W oparciu o wyniki testu CTA 345 pacjentów znalazło się w grupie dobranej losowo (afatinib: 230 pacjentów; chemoterapia: 115 pacjentów). Głównym kryterium skuteczności był czas przeżycia wolny od progresji (PFS) oceniany przez niezależną komisję oceniającą (independent review committee - IRC). Wśród wybranych losowo 345 pacjentów próbki nowotworów od 264 pacjentów (afatinib: 178 pacjentów; chemoterapia: 86 pacjentów) były testowane przy użyciu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Statystycznie istotna poprawa w PFS zgodnie z ustaleniami IRC była widoczna u pacjentów wybranych losowo do afatinib w porównaniu z pacjentami wybranymi losowo do chemoterapii, w całkowitej populacji CTA+ oraz populacji therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+. Ogólne wyniki skuteczności zebrano w tabeli 13 i na rysunku Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

59 Tabela 13. Korzyści kliniczne pacjentów testowanych przy zastosowaniu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit w populacji próby klinicznej LUX-Lung 3 Parametr Populacja therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+ n = 264 Chemoterapia n = 86 Przeżycie bez progresji (PFS) Liczba zgonów lub progresji, N (%) Afatinib n = 178 Populacja CTA+ n = 345 Chemoterapia n = 115 Afatinib n = (61,6%) 120 (67,4%) 69 (60.0%) 152 (66.1%) Mediana PFS (miesiące) Mediana PFS 95% CI Współczynnik ryzyka Współczynnik ryzyka 95% CI Wartość P (stratified logrank test)* (stratyfikowany test logarytmiczny rang) 6,9 11, [5,3; 8,2] [9,7; 13,7] [5,4; 8,2] [9,6; 13,6] 0,49 0,58 [0,35; 0,69] [0,43; 0,78] <0,0001 <0,001 * Stratyfikowany według statusu mutacji EGFR i rasy. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

60 Rysunek 19. Krzywa Kaplana-Meiera przeżycia bez progresji (PFS) na podstawie niezależnej oceny według grup leczenia (populacja therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+ ). Analiza podzbioru therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+ (n = 264) wykazała, że pacjenci leczeni afatinibem mają znaczący wzrost czasu PFS (mediana PFS 11,2 versus 6,9 miesięcy) i mają mniejsze prawdopodobieństwo zdarzenia z rozwojem choroby lub śmierci (HR = 0,49, 95 % CI [0,35; 0,69], p<0.0001) niż pacjenci leczeni chemoterapią. Obserwowane korzyści kliniczne w podgrupie pacjentów badanych z użyciem zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit były porównywalne z korzyściami obserwowanymi w pełnej badanej populacji (n = 345). Dane wyników klinicznych IRESSA Badanie uzupełniające IRESSA (IRESSA Follow-up Measure - IFUM) było badaniem fazy 4, otwartym (open-label), bez grupy kontrolnej (single arm) (NCT ) w celu określenia efektywności i bezpieczeństwa /tolerowalności pierwszej linii gefitinib u pacjentów rasy kaukaskiej w stadium IIIA/B/IV pozytywnych dla mutacji EGFR lokalnie zaawansowanego lub metastatycznego (przerzutowego) NSCLC (niedrobnokomórkowego raka płuca). Studium IFUM zostało przygotowane w celu uzyskania oceny odsetka obiektywnej odpowiedzi w oparciu o kryterium RECIST u prospektywnie wybranych pacjentów rasy kaukaskiej ze zmutowanym EGFR NSCLC. Wymaganiem było aby zakwalifikowani pacjenci mieli delecje w eksonie 19 EGFR, mutację substytucji L858R, L861Q lub G719X i brak mutacji T790M lub S768I lub insercje w eksonie 20 w tkankach nowotworowych prospektywnie ustalonych w oparciu o testowe badania kliniczne (Clinical Trial Assay - CTA). Retrospektywne badanie próbek biologicznych pochodzących od pacjentów 60 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

61 wytypowanych testem przesiewowym do badania klinicznego IFUM przeprowadzono przy zastosowaniu zestawu do diagnostyki towarzyszącej therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Badanie pomostowe przeprowadzono w celu oceny zgodności zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit z CTA zastosowanym do wybrania pacjentów do badania klinicznego IFUM. Ogólna zgodność między tymi dwoma testami służącymi do wykrywania delecji w eksonie 19 EGFR oraz mutacji L858R wynosiła 98,2% (n = 700/713; 95% CI: 96,9%, 99,0%) przy PPA (zgodności wyników dodatnich) równej 88,2% (n = 90/102; 95%CI: 80,4%, 93,8%) przy the NPA (zgodności wyników ujemnych) równej 99,8% (n = 610/611; 95%CI: 99,1% 100,0% Wyniki testu CTA zostały uzyskane dla 859 poddanych badaniu przesiewowemu pacjentów, z których 106 pacjentów zostało zakwalifikowanych do leczenia z zastosowaniem gefitinib. Z 859 próbek z wynikiem CTA, 765 próbek było udostępnionych do retrospektywnego testowania z wykorzystaniem zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit, wliczając w to 87 próbek które były pozytywne jeśli chodzi o mutację EGFR zarówno w przypadku CTA jak i zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Głównym kryterium skuteczności był obiektywny odsetek odpowiedzi (objective response rate - ORR) oceniony przez niezależną komisję centralną (Blinded Independent Central Review - BICR) i badaczy. Obserwowane korzyści kliniczne w podgrupie pacjentów badanych z użyciem zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit były porównywalne z korzyściami obserwowanymi w pełnej badanej populacji. Ogólne wyniki skuteczności zebrano w tabeli 14. Tabela 14. Korzyści kliniczne pacjentów testowanych przy użyciu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit w populacji próby klinicznej IFUM Parametr therascreen EGFR RGQ PCR Kit+ populacja n = 87 CTA+ populacja n = 106 Obiektywny odsetek odpowiedzi (ORR) wg BICR Liczba odpowiedzi (N) ORR, % (95% CI) 48,3 (38,1-58,6) 50,0 (40,6-59,4) Mediana czasu trwania (miesiące) 6,9 (5,6-11,4) 6,0 (5,6-11,1) Obiektywny odsetek odpowiedzi (ORR) wg badaczy Liczba odpowiedzi (N) ORR, % (95% CI) 71,3 (61,0-79,7) 69,8 (60,5-77,7) Mediana czasu trwania (miesiące) 8,3 (7,2-11,3) 8,3 (7,6-11,3) BICR: Niezależna centralna ocena (Blinded independent central review); CI: Przedział ufności (Confidence interval); CTA: Analiza badania klinicznego (Clinical trial assay). Uwaga: Kit + są wynikami pozytywnymi dla delecji w eksonie 19 /L8585R/L861Q/G719X. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

62 Przy założeniu, że zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit nie był stosowany do kwalifikowania pacjentów do próby klinicznej IFUM, przeprowadzono dodatkowe analizy efektywności aby uwzględnić pacjentów którzy nie zostali uwzględnieni w próbie ponieważ wyniki ich testów były negatywne przy zastosowaniu CTA, ale wyniki ich testów mogłyby być pozytywne przy zastosowaniu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit (tzn. therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA ), jak również pacjentów którzy zostali włączeni do próby, ale nie posiadali ważnych wyników z powtórzonego testu z użyciem zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit (tzn. nieznane therascreen EGFR RGQ PCR Kit /CTA+). Wyniki wszystkich hipotetycznych analiz były generalnie zbliżone do wyników z pierwotnej analizy efektywności. Literatura Literatura cytowana 1. Pao, W. and Miller, V.A. (2005) Epidermal growth factor receptor mutations, small molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions. J. Clin. Oncol. 23, Johnson, B.E. and Jaenne, P.A. (2005) Epidermal growth factor receptor mutations in patients with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 65, Inoue, A., Suzuki. T., Fukuhara, T., Maemondo, M., and Kimura, Y. (2006) Prospective Phase II study of gefitinib for chemotherapy-naive patients with advanced non-small cell lung cancer with epidermal growth factor receptor gene mutations. J. Clin. Oncol. 24, Asahina, H., et al. (2006) A Phase II study of gefitinib as a first-line therapy for advanced non-small cell lung cancers with epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutations. 42nd Ann Mtg of the American Society of Clinical Oncology (ASCO), Atlanta 2-6 June J. Clin. Oncol. 24 (18S) (Suppl), Abstr Paz-Ares, L. et al. A prospective phase II trial of erlotinib in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients (p) with mutations in the tyrosine kinase (TK) domain of the epidermal growth factor receptor (EGFR). 42nd Ann Mtg of the American Society of Clinical Oncology (ASCO), Atlanta 2-6 June J. Clin. Oncol. 24 (18S) (Suppl), Abstr Kobayashi, K., et al. (2008) First-line gefitinib for poor PS patients with EGFR mutations. 44th Ann Mtg of the American Society of Clinical Oncology (ASCO), Chicago 31 May-3 June J. Clin. Oncol. 26 (15S) (Suppl), Abstr Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

63 7. Sequist, L.V., et al. (2008) First-line gefitinib in patients with advanced non-small cell lung cancer harbouring somatic EGFR mutations. J. Clin. Oncol. 15, Porta, R. et al. (2008) Erlotinib customization based on epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in stage IV non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients (p). J. Clin. Oncol. 26 (May 20 suppl), abstr Jaene, P.A. and Johnson, B.E. (2006) Effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain mutation on the outcome of patients with non-small cell lung cancer treated with epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. rd Cambridge Con on Novel Agents in the Treatment of Lung Cancer: Advances in EGFR-Targeted Agents, Cambridge, Sep Clin. Cancer Res. 12 (Suppl.14), Whitcombe, D. et al. (1999) Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17, Thelwell, N. et al. (2000) Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2004). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation: Approved Guideline, 1st ed. CLSI Document EP-17A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Symbole Następujące symbole i oznaczenia mogą pojawić się na opakowaniach i etykietach: <N> Zawiera odczynniki wystarczające dla <N> reakcji Termin ważności Wyrób medyczny do diagnozy in vitro Numer katalogowy Numer serii Numer materiału Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

64 Należy chronić przed światłem słonecznym Globalny Numer Jednostek Handlowych Rn R jest dla oznaczenia wznowienia podręcznika, natomiast n jest numerem wznowienia Ograniczenia temperaturowe Producent Informacje na temat użytkowania zamieszczono w instrukcji obsługi Przestroga 64 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

65 Dodatek A: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit Protokół ręczny Rozdział ten zawiera instrukcje użycia zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit z programem Rotor-Gene Q w wersji 2.3 w trybie otwartym (tj. bez użycia pakietu Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Assay Package). Informacje ogólne Informacje na temat listy wymaganych materiałów zamieszczono w Wymagane materiały, które nie zostały dostarczone, strona 12. Pełne instrukcje dotyczące przygotowania próbki i układu (layout) próbki zamieszczono w Protokół: Ocena próbki, strona 18 oraz Protokół: Wykrywanie mutacji EGFR, strona 29. Należy się upewnić przed rozpoczęciem każdej analizy każdego cyklu, że stosowane parametry są prawidłowe. Protokół: Tworzenie profilu temperaturowego Przed rozpoczęciem należy utworzyć profil temperaturowy dla analizy zestawem therascreen EGFR RGQ PCR Kit. Parametry analizy są takie same dla oceny próbki DNA i wykrywania mutacji EGFR. Procedura Podsumowanie parametrów analizy zostało przedstawione w tabeli 15. Tabela 15. Profil temperaturowy Cykle Temperatura Czas Akwizycja danych 1 95 C 15 minut Nie dotyczy C 60 C 30 sekund 60 sekund Nie dotyczy Zielony i żółty 1. Należy kliknąć dwukrotnie na ikonę programu Rotor-Gene Q Series Software 2.3 na pulpicie komputera podłączonego do [aparatu] Rotor-Gene Q MDx instrument. 2. Aby utworzyć nowy szablon (template) należy wybrać Empty Run (pusty cykl), a następnie kliknąć na New (nowy), aby wejść do New Run Wizard (kreatora nowego cyklu). 3. Jako rodzaj rotora należy wybrać rotor 72-dołkowy (72-Well Rotor). Należy potwierdzić, że pierścień blokujący jest zamontowany i Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

66 zaznaczyć okienko Locking Ring Attached (pierścień blokujący jest zamontowany). Kliknąć na Next (dalej) (rysunek 20). 1 2 Rysunek 20. Okno dialogowe New Run Wizard (kreator nowego cyklu) (1 = Rotor type (rodzaj rotora); 2 = okienko Locking Ring Attached (pierścień blokujący zamocowany); 3 = przycisk Next (dalej). 4. Należy wprowadzić nazwisko operatora. Dodać wszelkie notatki i wpisać objętość reakcji jako 25. Należy upewnić się, że odczyt Sample Layout (layout próbki) ma postać 1, 2, 3. Kliknąć na Next (dalej) (rysunek 21) Rysunek 21. Wpisywanie nazwiska operatora i objętości reakcyjnych (1 = pole dialogowe Operator oraz pole dialogowe Notes (notatki); 2 = pole Reaction 3 66 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

67 Volume (objętość reakcyjna) oraz pole Sample Layout (układ próbki); 3 = przycisk Next (dalej)). 5. Należy kliknąć na przycisk Edit Profile (edytuj profil) w oknie dialogowym New Run Wizard (kreator nowego cyklu) (rysunek 22) i sprawdzić parametry cyklu zgodnie z podanymi niżej krokami. Rysunek 22. Edit Profile (edytuj profil) w New Run Wizard (kreator nowego cyklu). 6. Należy kliknąć na przycisk Insert after (wprowadź po) i wybrać New Hold at Temperature (nowe trzymanie temperatury) (rysunek 23). 1 2 Rysunek 23. Wprowadzenie początkowego kroku inkubacji (1 = przycisk Insert after (wprowadź po); 2 = New Hold at Temperature (nowe trzymanie temperatury). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

68 7. Zmienić Hold Temperature (trzymanie temperatury) na 95 C i Hold Time (czas trzymania) na 15 min 0 sek. Należy kliknąć na Insert after (wprowadź po) i następnie wybrać New Cycling (nowe cykle) (rysunek 24) Rysunek 24. Początkowy krok inkubacji przy 95 C (1 = przyciski Hold Temperature and Hold Time (trzymaj temperaturę i czas trzymania); 2 = przycisk Insert after *wprowadź po); 3 = New Cycling (nowy cykl)). 8. Zmienić ilość powtórzeń cyklu na 40. Wybrać pierwszy krok i ustawić na 95 C przez 30 sekund (rysunek 25) Rysunek 25. Krok cyklu przy 95 C (1 = okienko Cycle repeats (powtórzenia cyklu); 2 = Krok pierwszy: ustawienie temperatury; 3 = Krok pierwszy: ustawienie czasu). 68 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

69 9. Należy wyróżnić (podświetlić) drugi krok i ustawić na 60 C przez 60 sekund. Należy umożliwić odczyt danych w tym kroku wybierając przycisk Not Acquiring (bez odczytu) (rysunek 26). 2 1 Rysunek 26. Krok cyklu przy 60 C (1 = Krok drugi: ustawienie temperatury i czasu; 2 = przycisk Not Acquiring (bez odczytu)). 10. Należy ustawić Green (zielony) i Yellow (żółty) jako kanały pobierające wybierając przycisk > aby przenieść te kanały z listy Available Channels (dostępne kanały). Kliknąć na OK (rysunek 27). 1 2 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

70 Rysunek 27. Pobieranie przy kroku cyklu 60 C (1 = Wybrane kanały; 2 = przycisk OK ). 11. Należy zaznaczyć (podświetlić) trzeci krok i usunąć poprzez kliknięcie na przycisk -. Kliknąć na OK (rysunek 28). 2 1 Rysunek 28. Usuwanie kroku wydłużania (1 = Krok trzeci; 2 = Przycisk usuwania; 3 = przycisk OK ). 12. W następnym oknie dialogowym należy kliknąć na przycisk Gain Optimisation (rysunek 29). 3 1 Rysunek 29. Gain Optimisation (1). 70 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

71 13. Należy kliknąć na przycisk Optimise Acquiring (optymalizuj odczyt). Ustawienia kanału zostają wyświetlone dla każdego kanału. Należy zaakceptować wartości domyślne klikając na OK dla obydwu kanałów (rysunek 30) Rysunek 30. Auto Gain Optimisation dla kanału zielonego (1 = przycisk Optimise Acquiring (optymalizacja odczytu);2 = przycisk OK ). 14. Należy zaznaczyć okienko Perform Optimisation before 1st Acquisition (przeprowadź optymalizację przed pierwszym odczytem), na następnie kliknąć na przycisk Close (zamknij), aby powrócić do kreatora (rysunek 31). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

72 1 2 Rysunek 31. Wybór kanału zielonego (Green) i żółtego (Yellow) (1 = okienko Perform Optimisation Before 1st Acquisition (przeprowadź optymalizację przed pierwszym odczytem); 2 = przycisk Close (zamknij)). 15. Należy kliknąć na Next (rysunek, 32) aby zapamiętać szablon therascreen EGFR RGQ PCR Kit (*.ret file) w odpowiedniej lokalizacji wybierając Save Template (zapamiętaj szablon). 1 Rysunek 32. Przycisk Next (1). 72 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

73 Procedura (ręczna) Protokół: Ocena próbki (ręcznie) Protokół ten jest używany do oceny całkowitego amplifikowalnego DNA w próbkach i powinien zostać przeprowadzony przed analizą mutacji EGFR. Należy przygotować próbki jak to zostało opisane w rozdziale Protokół: Ocena próbki na stronie 18, aż do kroku 11. Należy skonfigurować analizę PCR w aparacie Rotor-Gene Q MDx instrument jak to zostało opisane w rozdziale Protokół: Konfigurowanie therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q na stronie 74. Gdy cykl zostanie zakończony należy analizować dane zgodnie z instrukcjami w rozdziale Analiza danych oceny próbki na stronie 79. Protokół: Wykrywanie mutacji EGFR (ręczne) Gdy próbka przejdzie pomyślnie ocenę próbki, to może zostać przetestowana w celu wykrycia mutacji EGFR. Należy przygotować próbki jak to zostało opisane w rozdziale Protokół: Wykrywanie mutacji EGFR na stronie 29, aż do kroku 11. Należy skonfigurować analizę PCR w aparacie Rotor-Gene Q MDx instrument jak to zostało opisane w rozdziale Protokół: Konfigurowanie therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q na stronie 74 Gdy cykl zostanie zakończony należy analizować dane zgodnie z instrukcjami w rozdziale Analiza danych wykrywania mutacji EGFR na stronie 80. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

74 Protokół: Konfigurowanie therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q Procedura 1. Należy otworzyć program Rotor-Gene Q series w wersji 2.3 i otworzyć odpowiedni profil temperaturowy therascreen EGFR RGQ PCR Kit (plik *.ret). Instrukcje na temat tworzenia profilu temperaturowego i sprawdzania parametrów cyklu zamieszczono w Protokół: Tworzenie profilu temperaturowego na stronie Należy się upewnić, że został wybrany prawidłowy rotor i zaznaczyć okienko, aby potwierdzić że pierścień blokujący jest założony. Kliknąć na Next (dalej) (rysunek 33) Rysunek 33. Okno dialogowe New Run Wizard (kreator nowego cyklu) i ekran powitalny (1 = Rotor type (rodzaj rotora); 2 = okienko Locking Ring Attached (pierścień blokujący zamocowany); 3 = przycisk Next (dalej). 3. Należy wprowadzić nazwisko operatora. Należy dodać wszelkie notatki, upewnić się że objętość reakcyjna jest ustawiona na 25 i że odczyt Sample Layout (układ próbek) ma postać 1, 2, 3. Kliknąć na Next (dalej) (rysunek 34). 74 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

75 Rysunek 34. Okno opcji New Run Wizard (kreator nowego cyklu) (1 = Operator ; 2 = pole Notes (notatki, uwagi); 3 = Reaction Volume (objętość reakcyjna); 4 = pole Sample Layout (układ próbki); 5 = przycisk Next ). 4. Poniższe okno umożliwia edytowanie profilu temperaturowego. (Nie jest wymagane edytowanie, ponieważ profil temperaturowy został utworzony zgodnie z instrukcjami w Protokół: Tworzenie profilu temperaturowego, strona 65.) Kliknąć na Next (dalej) (rysunek 35). 5 Rysunek 35. Okno dialogowe New Run Wizard (kreator nowej analizy) i ekran edycji temperatury (1 = przycisk Next (dalej)). 1 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

76 5. Należy sprawdzić zestawienie i kliknąć na Start Run (uruchom analizę), aby zapamiętać plik analizy i uruchomić analizę (rysunek 36). 1 Rysunek 36. Okno dialogowe New Run Wizard (kreator nowego cyklu) i ekran zestawienia (1 = Start Run (uruchom cykl)). 6. Po uruchomieniu cyklu (analizy) otwiera się nowe okno. Użytkownik może teraz wpisać nazwy próbki lub kliknąć na Finish i wpisać je później wybierając przycisk Sample (próbka) w trakcie cyklu lub po zakończeniu cyklu. Kliknięcie na Finish and Lock Samples (zakończ i zablokuj próbki) zabezpieczy użytkownika przed edytowaniem nazw próbek. Użytkownik powinien zachować szczególną staranność podczas wpisywania nazw próbek, aby zapewnić prawidłowe testowanie i analizę próbek. Uwaga: Podczas wpisywania nazw próbek pola dla pustych probówek powinny pozostać niewypełnione w kolumnie Name (nazwa). 7. Po zakończeniu cyklu należy analizować dane zgodnie z rozdziałem Analiza danych oceny próbki, strona 79, lub Analiza danych wykrywania mutacji EGFR, strona 80, odpowiednio. 8. Jeśli wymagane są raporty określające ilości, to należy kliknąć na ikonę Reports na pasku narzędzi w pliku Rotor-Gene Q run. 76 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

77 9. W przeglądarce raportów należy kliknąć na Cycling A Green (page 1) pod Report Categories (rysunek 37). 1 Rysunek 37. Przeglądarka raportów (1 = przycisk Cycling A. Green (Page 1) ). 10. Należy wybrać Quantitation (Full Report) pod Templates (rysunek 38). 1 Rysunek 38. Raport ilościowy (raport pełny) (1). 11. Należy kliknąć na Show, aby wygenerować raport. 12. Należy kliknąć na Save As (zapisz jako), aby zapamiętać wersję elektroniczną. 13. Należy powtórzyć dla Cycling A Yellow (Page 1). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

78 Interpretacja wyników (ręczna) Gdy cykl zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit (dla oceny próbki DNA lub analizy mutacji EGFR) jest zakończony należy analizować dane zgodnie z następującymi procedurami: Ustawienia programu dla analizy Analiza oceny próbki DNA (ręczna) Uwaga: Informacje na temat układu (layout) probówek zamieszczono w Tabela 4, strona 21 Analiza wykrywania mutacji EGFR (ręcznie) Uwaga: Informacje na temat układu (layout) probówek zamieszczono w Tabela 7, strona 32. Ustawienia dla analizy przy pomocy programu 1. Należy otworzyć odpowiedni plik cyklu (run file) (*.rex) przy użyciu programu Rotor-Gene Q Series Software Jeśli próbki nie zostały już nazwane przed przeprowadzeniem cyklu, to należy kliknąć na Edit Samples (edytuj próbki). 3. Wprowadzić nazwy próbek w kolumnie Name (nazwa). Uwaga: Należy pozostawić nazwy wszystkich pustych probówek niewypełnione (puste). 4. Kliknąć na Analysis (analiza). Na stronie analiz należy kliknąć na Cycling A Yellow, aby zaznaczyć kanał Yellow (HEX). 5. Kliknąć na Named On. Uwaga: To zapewni, że puste probówki nie będą uwzględniane w analizie. 6. Należy wybrać Dynamic tube. 7. Wybrać Slope correct. 8. Wybrać Linear scale (skala liniowa). 9. Należy wybrać Take Off Adj i wprowadzić wartość 15,01 w okienku górnym ( If take off point was calculated before cycle ) i 20,01 w okienku dolnym ( then use the following cycle and take off point ). 10. Należy ustawić próg na wartość 0,02 i zaznaczyć wartości CT kanału Yellow (HEX). 11. Na stronie analiz należy kliknąć na Cycling A, Green, aby wyświetlić kanał Green (FAM). 12. Wybrać Named On. 13. Należy wybrać Dynamic tube. 14. Wybrać Slope correct. 15. Wybrać Linear scale (skala liniowa). 78 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

79 16. Należy wybrać Take Off Adj i wprowadzić wartość 15,01 w okienku górnym ( If take off point was calculated before cycle ) i 20,01 w okienku dolnym ( then use the following cycle and take off point ). 17. Należy ustawić próg na wartość 0,075 i zaznaczyć wartości CT kanału Green (FAM). Analiza danych oceny próbki Gdy zakończy się cykl oceny próbki DNA należy zapoznać się z rozdziałem Analiza wykrywania mutacji EGFR (ręcznie) Uwaga: Informacje na temat układu (layout) probówek zamieszczono w Tabela 7, strona 32. Ustawienia dla analizy przy pomocy programu, strona 78, i analizować dane jak podano poniżej. (Informacje na temat układu (layout) probówki zamieszczono w Tabela 4, strona 21. Ocena analizy kontrolnej Kontrola ujemna Aby upewnić się, że nie występuje zanieczyszczenie matrycy (template), NTC nie może generować wartości CT poniżej 40 w kanale zielonym (FAM). Aby upewnić się, że cykl został prawidłowo skonfigurowany, NTC musi wykazywać amplifikację w zakresie 29,85 do 35,84 w kanale żółtym (HEX). Podane wartości mieszczą się w obrębie i zawierają te wartości. Kontrola dodatnia: EGFR PC musi dać wartość CT w kanale Green (FAM) w obrębie zakresu 28,13 do 34,59. Wartości poza tym zakresem wskazują na problem z konfiguracją testu. Cykl zakończył się niepowodzeniem. Uwaga: Dane próbek nie mogą używane, jeśli kontrola ujemna lub dodatnia zawiodła. Analiza próbki Jeśli kontrole cyklu oceny próbki DNA są ważne, to analiza może być kontynuowana. Wartość kontrolna CT dla próbki musi mieścić się w zakresie 23,70 do 31,10 w kanale Green (FAM). Jeśli CT próbki jest poza tym zakresem, to podane są następujące zalecenia. CT testu kontroli próbki <23,70 Próbki z CT kontroli <23,70 (wysokie stężenie DNA) spowodują przeładowanie (overload) testów mutacji i muszą zostać rozcieńczone. Aby wykryć każdą mutację przy niskim poziomie, zbyt stężone próbki są rozcieńczane tak, aby mieściły się w zakresie CT od 23,70 do 31,10. Rozcieńczenie próbki DNA zwiększa wartość CT (rozcieńczenie 1:1 zwiększa wartość CT o około 1,0). Należy rozcieńczać próbki przy użyciu wody dostarczonej w zestawie (Water for Dilution [Dil.]). Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

80 CT testu kontroli próbki >31,10 Zalecana jest ponowna ekstrakcja dla próbek z CT kontroli >31,10 w kanale zielonym (Green (FAM)). Obecna jest niewystarczająca startowa matryca DNA do wykrycia wszystkich mutacji EGFR przy podanych wartościach odcięcia dla testu. Analiza danych wykrywania mutacji EGFR Próbka musi pozytywnie przejść ocenę próbki DNA zanim będzie mogła być testowana w celu wykrycia mutacji EGFR (patrz Analiza danych oceny próbki, strona 79). Gdy zakończy się cykl wykrywania mutacji EGFR to należy zapoznać się z rozdziałem Analiza wykrywania mutacji EGFR (ręcznie) Uwaga: Informacje na temat układu (layout) probówek zamieszczono w Tabela 7, strona 32. Ustawienia dla analizy przy pomocy programu, strona 78, i analizować dane jak podano poniżej. (Informacje na temat układu (layout) probówek zamieszczono w Tabela 7, strona 32). 80 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

81 Analiza kontroli cyklu Należy zapoznać się ze schematem analizy kontroli cyklu na rysunku 39. Rysunek 39. Analiza kontroli cyklu dla mutacji EGFR. Kontrola ujemna Aby mieć pewność, że nie występuje zanieczyszczenie matrycy (template), NTC dla każdej mutacji EGFR nie może generować wartości CT w kanale zielonym (FAM) poniżej 40. Aby upewnić się, że analiza została prawidłowo skonfigurowana, NTC musi wykazywać amplifikację w zakresie do w kanale żółtym (HEX). Podane wartości mieszczą się w obrębie i zawierają te wartości. Kontrola dodatnia: Dla każdego testu mutacji EGFR, EGFR PC musi dać wartość CT w kanale zielonym (Green (FAM)) mieszczącą się w zakresie pokazanym w tabeli 16. Wartości poza tym zakresem wskazują na problem z konfiguracją testu. Cykl zakończył się niepowodzeniem. Uwaga: Dane próbek nie mogą zostać użyte, jeśli kontrola ujemna lub dodatnia zawiodła. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

82 Tabela 16. Akceptowalne zakresy CT dla kontroli dodatnich reakcji (test wykrywania mutacji EGFR) Mieszanina reakcyjna Próbka Kanał Zakres CT Kontrola PC Zielony 28,13 do 34,59 T790M PC Zielony 30,22 do 34,98 Delecje PC Zielony 28,90 do 34,90 L858R PC Zielony 29,97 do 34,81 L861Q PC Zielony 28,49 do 34,02 G719X PC Zielony 29,42 do 34,19 S768I PC Zielony 28,98 do 35,19 Insercje PC Zielony 27,92 do 34,09 Analiza próbki - Wartość CT dla kanału zielonego (Green (FAM)) kontroli próbki Jeśli kontrole dodatnie i ujemne dla cyklu wykrywania mutacji EGFR są ważne, to wykrywanie mutacji EGFR może być kontynuowane. Wartość CT kontroli w kanale Green (FAM) musi się mieścić w obrębie zakresu 23,70 do 31,10. (Informacje na temat układu (layout) probówki zamieszczono w Tabela 7, strona 32). Jeśli CT kontroli próbki jest poza tym zakresem, to podane są następujące zalecenia. CT testu kontroli próbki <23,70 Próbki z CT kontroli <23,70 (wysokie stężenie DNA) spowodują przeładowanie (overload) testów mutacji i muszą zostać rozcieńczone. Aby wykryć każdą mutację przy niskim poziomie, zbyt stężone próbki są rozcieńczane tak, aby mieściły się w zakresie CT od 23,70 do 31,10. Rozcieńczenie próbki DNA zwiększa wartość CT (rozcieńczenie 1:1 zwiększa wartość CT o około 1.0). Należy rozcieńczać próbki przy użyciu wody dostarczonej w zestawie (Water for Dilution [Dil.]). CT testu kontroli próbki >31,10 Zalecana jest ponowna ekstrakcja dla próbek z CT kontroli >31,10 w kanale zielonym (Green (FAM)). Obecna jest niewystarczająca ilość matrycy DNA do wykrycia wszystkich mutacji EGFR przy podanych wartościach odcięcia dla testu. Należy zapoznać się ze schematem analizy próbki dotyczącym wykrywania mutacji EGFR na rysunku Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

83 Rysunek 40. Schemat analizy próbki dla wykrywania mutacji EGFR. Analiza próbki - Wartość CT dla kanału żółtego (Yellow (HEX)) kontroli próbki Należy zapoznać się ze schematem analizy próbki dotyczącym wykrywania mutacji EGFR na rysunku 40. Muszą być analizowane wszystkie probówki dla każdej z próbek. Należy się upewnić, że każda probówka generuje sygnał HEX w zakresie 29,85 do 35,84 z kontroli wewnętrznej w kanale żółtym (Yellow (HEX)). Możliwe są trzy wyniki. Jeśli CT kontroli wewnętrznej jest poniżej podanego zakresu (< 29,85) dla dowolnego testu mutacji, to wynik jest nieważny dla amplifikacji w kanale Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

84 żółtym (Yellow (HEX)). Amplifikacja dla kanału żółtego (Yellow (HEX)) w tej próbówce jest nieważna. Jeśli CT kontroli wewnętrznej mieści się w podanym zakresie (29,85 do 35,84), to wynik jest dodatni dla amplifikacji w kanale żółtym (Yellow (HEX)). Amplifikacja dla kanału żółtego (Yellow (HEX)) w tej próbówce jest ważna. Jeśli CT kontroli wewnętrznej jest powyżej podanego zakresu (>35,84), to wynik jest ujemny dla amplifikacji w kanale żółtym (Yellow (HEX)). Jeśli występuje amplifikacja w kanale zielonym (Green (FAM)) i CT dla tej reakcji jest niższa lub równa wartości odcięcia dla tej probówki, to amplifikacja dla kanału żółtego (Yellow (HEX)) jest ważna. Jeśli nie występuje amplifikacja w kanale zielonym (Green (FAM)) dla tej probówki lub wartość CT jest wyższa niż wartość odcięcia dla testu, to amplifikacja dla kanału żółtego (Yellow (HEX)) jest nieważna. Możliwą przyczyną niepowodzenia amplifikacji kontroli wewnętrznej w kanale żółtym (Yellow (HEX)) mogła być inhibicja PCR. Rozcieńczenie próbki może spowodować zredukowanie wpływu inhibitorów. Należy zwrócić uwagę, że działanie to powoduje również rozcieńczenie docelowego DNA (target DNA) w próbce. Należy rozcieńczać próbki przy użyciu wody dostarczonej w zestawie (Water for Dilution [Dil.]). Analiza próbki - Wartość CT dla kanału zielonego (Green (FAM)) testów mutacji próbki Wartości kanału zielonego (Green (FAM)) dla wszystkich 7 mieszanin reakcyjnych dla mutacji EGFR powinny zostać porównane z wartościami wymienionymi w tabeli 17. Podane wartości mieszczą się w obrębie i zawierają te wartości. (Informacje na temat układu (layout) probówki zamieszczono w Tabela 7, strona 32). 84 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

85 Tabela 17. Wartości akceptowalne dla reakcji mutacji EGFR próbek w kanale zielonym (Green (FAM)) (test wykrywania mutacji EGFR) Test Zakres CT Odcięcie ( CT) T790M 0,00 do 40,00 7,40 Delecje 0,00 do 40,00 8,00 L858R 0,00 do 40,00 8,90 L861Q 0,00 do 40,00 8,90 G719X 0,00 do 40,00 8,90 S768I 0,00 do 40,00 8,90 Insercje 0,00 do 40,00 8,00 Jeśli CT dla kanału zielonego (Green (FAM)) dla próbki jest w obrębie podanego zakresu, to amplifikacja FAM jest dodatnia. Jeśli CT dla kanału zielonego (Green (FAM)) dla próbki jest powyżej podanego zakresu, lub nie ma amplifikacji, to amplifikacja FAM jest ujemna. Należy obliczyć wartość CT dla każdej probówki wykrywania mutacji EGFR, która wykazuje dodatnią amplifikację FAM, w sposób podany poniżej, pamiętając aby wartości CT dla mutacji i kontroli były z tej samej próbki. (Informacje na temat układu (layout) probówki zamieszczono w Tabela 7, strona 32). CT = [wartość CT testu mutacji] [wartość CT testu kontroli] Należy porównać wartości CT dla próbki z punktem odcięcia dla testu, o którym mowa (tabela 17). Należy się upewnić, że zastosowano prawidłowy punkt odcięcia. Punkt odcięcia jest punktem, powyżej którego sygnał dodatni dla testu mógłby być potencjalnie spowodowany sygnałem tła primera (startera) ARMS "dzikiego" DNA. Jeśli wartość CT próbki jest wyższa niż punkt odcięcia dla testu, to próbka jest klasyfikowana jako ujemna albo poza granicami wykrywalności zestawu (kitu) dla tego testu. Status każdej reakcji mutacji dla każdej próbki może być jednym z następujących: Stwierdzono (wykryto) mutację Mutacji nie wykryto (nie stwierdzono) Nieważna Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

86 Stwierdzono (wykryto) mutację Amplifikacja kanału zielonego (Green (FAM)) jest dodatnia i wartość CT jest na poziomie lub poniżej wartości odcięcia. Jeśli zostały wykryte wielokrotne mutacje dla próbki, to wszystkie mogą zostać zgłoszone. Mutacji nie wykryto (nie stwierdzono) Amplifikacja kanału zielonego (Green (FAM)) jest dodatnia i wartość CT jest powyżej wartości odcięcia. Amplifikacja kanału zielonego (Green (FAM)) jest ujemna i amplifikacja kanału żółtego (Yellow (HEX)) (kontrola wewnętrzna) jest dodatnia. Nieważna Amplifikacja kanału żółtego (Yellow (HEX)) (kontrola wewnętrzna) jest nieważna. Amplifikacja kanału zielonego (Green (FAM)) jest ujemna i amplifikacja kanału żółtego (Yellow (HEX)) (kontrola wewnętrzna) jest ujemna. Uwaga: Próbka może być ujemna w żółtym kanale amplifikacji (Yellow (HEX)) w jednej probówce, natomiast dodatnia w zielonym kanale amplifikacji (Green (FAM)) w drugiej probówce. W tym przypadku wynik mutacja wykryta w drugiej probówce może być traktowany jako ważny, ale ta szczególna zidentyfikowana mutacja może nie być jedyną możliwą mutacją w tej próbce. 86 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

87 Załącznik B: Instalacja therascreen EGFR CE Assay Package Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit jest zaprojektowany do użycia z aparatem Rotor-Gene Q MDx instrument i 72-dołkowym rotorem (72-well rotor). Pakiet therascreen EGFR CE Assay Package jest dostępny oddzielnie na płycie CD (nr kat ). Pakiet testu zawiera therascreen EGFR CE Control Run Locked Template oraz therascreen EGFR CE Locked Template. Uwaga: Pakiet therascreen EGFR CE Assay Package jest kompatybilny wyłącznie z programem Rotor-Gene Q software w wersji 2.3. Należy się upewnić, że została zainstalowana prawidłowa wersja programu Rotor-Gene Q software przed przejściem do instalowania pakietu therascreen EGFR CE Assay Package. Jeśli posiadany aparat Rotor-Gene Q MDx instrument został dostarczony z wcześniejszą wersją programu, to należy go aktualizować pobierając program Rotor-Gene Q software wersja 2.3 ze strony produktów Rotor-Gene Q MDx w sekcji Product Resources pod Operating Software na stronie Procedura 1. Należy zamówić płytę CD therascreen EGFR CE Assay Package CD (nr kat ). 2. Włożyć CD do napędu CD komputera podłączonego do aparatu Rotor-Gene Q MDx instrument. 3. Jeśli CD załaduje się automatycznie, to należy uruchomić instalację klikając dwukrotnie na plik therascreen_egfr_ce_assay_package_3.0.5.exe. Alternatywnie należy zlokalizować i uruchomić ten wykonywalny plik przy użyciu przeglądarki plików podłączonego komputera. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

88 4. Otwiera się kreator konfiguracji pakietu therascreen EGFR CE Assay Package. Kliknąć na Next (dalej), aby kontynuować (rysunek 41). 1 Rysunek 41. Okno dialogowe Setup Wizard (kreatora konfiguracji) (1 = przycisk Next ). 5. Należy przeczytać umowę licencyjną w oknie dialogowym i zaakceptować umowę, zaznaczając oświadczenie "I accept the agreement (akceptuję umowę). Kliknąć na Next (dalej), aby kontynuować (rysunek 42). 1 2 Rysunek 42. Okno dialogowe License Agreement (mowa licencyjna) (1 = I accept the agreement (akceptuję umowę); 2 = przycisk Next (dalej)). 88 Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

89 6. Program instalacyjny zostaje uruchomiony automatycznie. Po zakończeniu instalacji otwiera się finalizujące okno dialogowe "Setup Wizard" (kreatora konfiguracji). Należy kliknąć na Finish (zakończ), aby zakończyć (rysunek 43). Rysunek 43. Kończenie pracy kreatora konfiguracji (1 = przycisk "Finish"). 7. Należy ponownie uruchomić komputer. Klawisze skrótów dla therascreen EGFR CE Control Run Locked Template oraz therascreen EGFR CE Locked Template są generowane w sposób automatyczny i pojawiają się na pulpicie. 1 therascreen EGFR CE Locked Template Informacje kontaktowe Aby uzyskać pomoc techniczną i więcej informacji należy zapoznać się z naszym Centrum Pomocy Technicznej na stronie zadzwonić pod albo skontaktować się z jednym z Działów Serwisu Technicznego firmy QIAGEN lub miejscowym dystrybutorem (należy zapoznać się z tylną okładką lub zajrzeć na stronę Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

90 Informacje dotyczące zamówień Produkt Spis treści Nr kat. therascreen EGFR RGQ PCR Kit (24) Dla 24 reakcji: Control Assay, 7 Mutation Assays, Positive Control, Taq DNA Polymerase, Water for NTC, oraz Water for Sample Dilution (test kontroli, 7 testów mutacji, kontrola dodatnia, polimeraza Taq DNA, woda dla NTC oraz woda do rozcieńczenia próbki) therascreen EGFR Assay Package CD QIAamp DNA FFPE Tissue Kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) Rotor-Gene Q Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Platforma Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Pakiet protokołów programu (software protocol package) do wykorzystania z zestawem therascreen EGFR RGQ PCR Kit oraz aparatem QIAGEN Rotor-Gene Q MDx Dla 50 przygotowań próbki: 50 QIAamp MinElute Columns, Proteinase K, Buffers, and Collection Tubes (2 ml) (50 kolumn QIAamp MinElute, proteinaza K, bufory i probówki zbierające (2 ml)) Cykler PCR czasu rzeczywistego i wysoko rozdzielczy analizator topnienia (High Resolution Melt analyzer) z 5 kanałami (zielony, żółty, pomarańczowy, czerwony, purpurowy) plus kanał HRM, laptop, program, akcesoria, 1 rok gwarancji na części i robociznę, instalacja i szkolenie Cykler PCR czasu rzeczywistego i wysoko rozdzielczy analizator topnienia (High Resolution Melt analyzer) z 5 kanałami (zielony, żółty, pomarańczowy, czerwony, purpurowy) plus kanał HRM, laptop, program, akcesoria: obejmuje 1 rok gwarancji na części i robociznę, nie obejmuje instalacji i szkolenia Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/2016

91 Produkt Spis treści Nr kat. Akcesoria do Rotor-Gene Q Blok załadowczy 72 x 0,1 ml probówki Paski probówek i wieczka, 0,1 ml (250) Paski probówek i wieczka, 0,1 ml (2500) Aluminiowy blok do ręcznego konfigurowania reakcji z pipetą jednokanałową w 72 x 0.1 ml probówkach 250 pasków po 4 probówki i wieczka dla 1000 reakcji 10 x 250 pasków po 4 probówki i wieczka dla reakcji Aktualnych informacji dotyczących licencji i wyłączeń dla specyficznych produktów należy poszukiwać w odpowiednim podręczniku zestawu QIAGEN kit lub instrukcji obsługi. Podręczniki do zestawów (kit ów) QIAGEN i instrukcje obsługi są dostępne pod lub można je zamówić w serwisie technicznym QIAGEN lub u lokalnego dystrybutora. Podręcznik do zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit 08/

92

93 Zakup tego produktu pozwala nabywcy na wykorzystanie go do świadczenia usług diagnostycznych dla człowieka w diagnostyce in vitro. Niniejszym nie udziela się praw patentowych ani innych licencji żadnego typu poza powyższym prawem użytkowania wynikającym z nabycia produktu. Znaki towarowe: QIAGEN, Sample to Insight, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene, Scorpions, therascreen (QIAGEN Group); FAM, HEX (Thermo Fisher Scientific Inc.); GIOTRIF (Boehringer Ingelheim), IRESSA (AstraZeneca Group) Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Kit jest zestawem (kit em) diagnostycznym oznakowanym znakiem CE zgodnie z Europejską dyrektywą 98/79/EC dotycząca diagnostyki in vitro (European In Vitro Diagnostic Directive 98/79/EC). Dostępne nie we wszystkich krajach. Ograniczona umowa licencyjna dla zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Kit Używanie tego produktu oznacza zgodę dowolnego nabywcy lub użytkownika tego produktu na następujące warunki: 1. Produkt może zostać użyty wyłącznie zgodnie z protokołami dostarczonymi z produktem i zgodnie z niniejszym podręcznikiem i zostać wykorzystany wyłącznie z komponentami zawartymi w zestawie (kit). Firma QIAGEN nie udziela żadnej licencji na swoją własność intelektualną do wykorzystania lub włączenia dołączonych komponentów tego zestawu do innych komponentów nie zawartych w tym zestawie, z wyjątkiem opisanych w protokołach dostarczonych wraz produktem, niniejszym podręcznikiem i dodatkowych protokołów dostępnych na stronie Niektóre z tych dodatkowymi protokołów zostały dostarczone przez użytkowników QIAGEN dla [innych] użytkowników QIAGEN. Protokoły te nie zostały gruntownie przetestowane ani zoptymalizowane przez firmę QIAGEN. Firma QIAGEN nie daje na nie gwarancji ani też nie ręczy, że nie naruszają one praw strony trzeciej. 2. Za wyjątkiem wyraźnie określonych licencji, firma QIAGEN nie udziela żadnych gwarancji, że ten zestaw i / lub jego zastosowanie (-a) nie narusza praw stron trzecich. 3. Ten zestaw i jego składniki posiadają licencję wyłącznie na jednorazowe użycie i nie mogą być ponownie wykorzystane, regenerowane lub odsprzedane. 4. Firma QIAGEN w szczególności odrzuca wszystkie inne licencje, wyrażone lub domniemane, za wyjątkiem licencji wyraźnie podanych w dokumentacji. 5. Nabywca i użytkownik tego zestawu wyrażają zgodę na niepodejmowanie ani niepozwalanie stronom trzecim na podejmowanie kroków, które mogłyby prowadzić do czynności zabronionych powyżej lub ułatwiać takie czynności. Firma QIAGEN może egzekwować zakazy niniejszej Ograniczonej umowy licencyjnej w sądzie i będzie dochodzić odzyskania wszystkich kosztów sądowych i procesowych, włącznie z kosztami prawników, przy wszystkich działaniach, które będą miały na celu egzekucję postanowień niniejszej Ograniczonej umowy licencyjnej lub praw do własności intelektualnej związanych z tym zestawem i/ lub jego składnikami. Zaktualizowane warunki licencji znajdują się pod Aug-16 HB QIAGEN, wszystkie prawa zastrzeżone.

94 Zamawianie Wsparcie techniczne support.qiagen.com Website Sample & Assay