Rola genu RB1 i klonalnych delecji w obszarze 13q w powstawaniu i przebiegu białaczek

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2010, 41, Nr 1, str EWA STUDNIAK, STANISŁAW ZAJĄCZEK Rola genu RB1 i klonalnych delecji w obszarze 13q w powstawaniu i przebiegu białaczek The role of the RB1 gene and clonal 13q region deletions in the pathogenesis and course of leukemia Samodzielna Pracownia Cytogenetyczna Zakład Patologii; Pomorska Akademia Medyczna Kierownik: Prof. dr hab. Stanisław Zajączek STRESZCZENIE Gen RB1 o uznanej aktywności supresjonującej nowotwory, jest znanym regulatorem cyklu komórkowego: utrata jego aktywności odgrywa inicjującą rolę w przebiegu siatkówczaka i niektórych innych guzów litych. Natomiast w niektórych białaczkach zaburzenia genu RB1 odgrywają być moŝe rolę wtórną o niezdefiniowanym ostatecznie znaczeniu w przebiegu klinicznym. Zmiany genu RB1, obserwowane w pewnych typach białaczek to delecje, stwierdzane w kariotypie i/lub badaniu FISH jak i zmiany subtelniejsze, powodujące zaburzenia ekspresji białka RB1. W tych samych typach białaczek, ale u róŝnych pacjentów, obserwowano częściej brak lub obniŝenie ekspresji jak i niekiedy nadekspresję tego białka. Wszystkie te zmiany obserwowano najczęściej w CLL; w innych białaczkach są one rzadsze, a ich badania są bardziej fragmentaryczne. PoniewaŜ niekiedy delecje obejmują region znacznie większy niŝ sam gen RB1 (13q14), dlatego równie istotnym czynnikiem w przebiegu białaczek mogą okazać się zaburzenia w blisko, ale niŝej połoŝonych sekwencjach, wskazujące na moŝliwość istnienia dalszych genów supresjonujących nowotwory. SŁOWA KLUCZOWE: Gen RB1 Białaczki Delecje Zmiany Ekspresji SUMMARY The gene RB1 is a well-known tumor suppressor and cell cycle regulator: its loss of activity is an initiating factor in retinoblastoma and some other solid tumors. However, in leukemia, its abnormalities probably play a secondary role in the progress of the disease. The changes observed in the RB1 gene include deletions identified in karyotype and/or FISH analysis as well as more subtle changes causing alterations of the protein RB1 expression. In patients diagnosed with the same type of leukemia, more frequent was lack or a lower level of expression, and only occasionally overexpression of this protein was observed. All these alterations in structure or function were observed predominantly in CLL. They are not so frequent in other types of leukemias, and so the data are less complete. Since in some cases deletions in the RB1 gene region are broader than the gene sequence itself, it is possible that other sequences contiguous to the RB1 gene may also play a crucial role in the leukemogenic process. KEY WORDS: RB1 Gene Leukemias Deletions Alterations of Expression Czynnikiem inicjującym białaczki jest aktywacja onkogenów, zwykle poprzez powstanie zawierających je genów fuzyjnych. W dalszym przebiegu i progresji choroby znaczącą rolę mogą odgrywać takŝe zmiany innych genów, wpływające na ewolucję kształtujących się klonów. Genami takimi mogą być m.in. niektóre tzw. geny supresjonujące nowotwory, jak gen RB1, P53, P16, WT1 i in. [1].

2 6 E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK Gen RB1 i jego mutacje Gen RB1 (Retinoblastoma Susceptibility Gene), warunkujący siatkówczaka, jest modelowym genem supresjonującym nowotwory a jego zmiany wywierają prawdopodobnie istotny wpływ na ewolucję niektórych białaczek [2]. Gen RB1- zlokalizowany jest w chromosomie 13, w prąŝku q14. NaleŜy on do genów średnich rozmiarów (~180kB), składa się z promotora i 27 eksonów i kodując mrna rozmiarów 4,7 kb, z czego pozostałe 2,7 kb, po alternatywnym składaniu (splicing) stanowi otwartą ramkę odczytu ostatecznie kodującą białko [3, 4]. Białko RB1, (p110 RB ) składa się z trzech domen strukturalnych, odpowiednio obejmujących rejon N-terminalny, tzw. motyw R i tzw. kieszeń złoŝoną z fragmentów A i B; kieszeń stanowi najwaŝniejszą strukturę dla jego regulacyjnych funkcji [5]. Pełni rolę głównego regulatora cyklu komórkowego, poprzez blokadę przejścia fazy G1 w fazę S cyklu. W prawidłowej komórce zwolnienie blokady cyklu następuje poprzez przejściowe unieczynnienie białka RB1, wynikające z jego fosforylacji. Patologiczne unieczynnienie białka przez delecje czy mutacje typu stop genu RB1, powoduje niekontrolowaną proliferację komórek, która jest uwaŝana za moment inicjacji procesu nowotworowego. Natomiast nadekspresja białka RB1, powoduje, Ŝe kompleks regulacyjny powstający z jego udziałem skraca fazę G1 [6]. Mutacje genu RB1 inicjują siatkówczaka i inne charakterystyczne dla uszkodzeń tego genu nowotwory; wśród nich rozróŝniamy mutacje konstytucyjne i somatyczne. W przypadku mutacji konstytucyjnych są one odziedziczone, a druga mutacja jest mutacją somatyczną i jest nią zazwyczaj duŝa delecja, prowadząca do utraty heterozygotyczności; dopiero unieczynnienie obu kopii genu znosi jego funkcję. Rozpoznano w siatkówczaku i w obszarze genu RB1 praktycznie wszystkie molekularne rodzaje mutacji, udało się zidentyfikować niektóre prawidłowości ich lokalizacji, brak natomiast dotąd precyzyjnej charakterystyki molekularnej zmian tego genu obserwowanych w białaczkach [7]. Zwraca jednak uwagę, Ŝe niektóre białaczki częściej mogą pojawiać się jako tzw. drugi pierwotny nowotwór u nosicieli mutacji genu RB1 [8]. Nieprawidłowości chromosomu 13 obejmujące region genu RB1, utrata heterozygotyczności tego genu i inne formy inaktywacji o charakterze klonalnej mutacji somatycznej są często wykrywane w przebiegu róŝnych chorób rozrostowych krwi i szpiku. Odnalezienie tych zmian w komórkach z poszczególnych faz progresji białaczek sugeruje moŝliwość udziału genu RB1 w kształtowaniu się ich przebiegu klinicznego, a weryfikacja tych zdarzeń moŝe mieć znaczenie prognostyczne. Pierwszymi, którzy zwrócili uwagę na pojawianie się delecji w obszarze genu RB1 w komórkach białaczkowych byli Kohno i wsp. W 1979 r. technikami przedprąŝkowymi stwierdzili oni podcentromerową delecję ramienia długiego chromosomu grupy D w obszarze obejmującym m. in. lokalizację genu RB1 u 9 z 17 chorych z róŝnymi typami białaczek [9]. W latach opisano zmiany obszaru genu RB1 w róŝnych typach chorób rozrostowych szpiku i układu limfatycznego, jednak juŝ uwidocznione technikami prąŝkowymi, w analizach FISH i metodami molekularnymi [10, 11]. Poszukiwania rozszerzono takŝe na obszar przyległy do genu RB1. Z tych powodów zmianom w obszarze genu RB1 w przebiegu białaczek postanowiliśmy poświęcić odrębne opracowanie przeglądowe. Zmiany genu RB1 w przewlekłej białaczce limfatycznej (CLL) Zmiany w obszarze 13q14 badano najczęściej u pacjentów z CLL. Juliusson i wsp. stwierdzili u 51 z 391 badanych pacjentów z B-CLL, występowanie delecji 13q14 jako jedynej zmiany [12]. Wśród 15 innych badanych z podejrzeniem choroby proliferacyjnej krwi i klonalną delecją w obszarze prąŝka 13q14, u 11 rozpoznano CLL [13]. Wprowadzenie technik FISH dostarczyło dalszych informacji o częstości i charakterze delecji 13q14 u pacjentów z CLL; w grupie 31 chorych wykazano w standardowym kariotypie klonalną delecję obejmującą prąŝek 13q14 u 16% badanych, natomiast analizą FISH z uŝyciem sondy dla genu RB1 wykryto w tej samej grupie chorych delecję u dalszych 31% [14]. Aberracje chromosomu 13 były równieŝ najczęstszymi anomaliami klonalnymi u 82 chorych z B-CLL, przedstawianych przez Petersona i wsp. [15]. Większą ciągłą grupę 100 nieleczonych chorych z rozpoznaniem

3 Rola genu RB1 7 B-CLL opisano w 1996 roku; zmiany w 13q14, obejmujące gen RB1, znaleziono u 31 z nich, w indywidualnie zmiennym odsetku komórek (31 90%, średnio 71% blastów) [16]. W roku 2001 Doneda i wsp. w szpiku kostnym u 30 chorych z B-CLL, wykryli delecję genu RB1 techniką FISH u wszystkich pacjentów w 21% do 57% (śr. 39%) ocenianych komórek. Delecję obu sygnałów stwierdzono u 24/30 chorych (80%) [17]. ZbliŜone dane uzyskano równieŝ u 18 chorych z białaczką prolimfocytarną z komórek B u 10/18 (55%) pacjentów wystąpiła delecja genu RB1 [18]. Delecja RB1 wykrywana przez FISH jest najczęstszą aberracją w B-CLL, a u 17,5% pacjentów współwystępuje z trisomią chromosomu 12 i moŝe pojawiać się w tym samym klonie. Trisomia 12 moŝe takŝe występować jako aberracja izolowana [19]. JuŜ cytowany wcześniej Juliusson i wsp. stwierdzili, Ŝe chorzy z izolowaną delecją 13q14 mają dłuŝszy czas przeŝycia aniŝeli chorzy z trisomią 12, zmianami obszaru 14q, jak i pacjenci bez zmian klonalnych [12]. RównieŜ czas wolny od leczenia był dłuŝszy u pacjentów z izolowaną delecją genu RB1 [20]. Współwystępowanie trisomii chromosomu 12 stwierdzono jednak o wiele rzadziej, bo zaledwie u 4/30 pacjentów w 6 11% (śr. 8,5%) jąder interfazowych w materiale Donedy i wsp. [17]. Charakterystyka delecji 13q Opisywane wyŝej obserwacje występowania del(13)(q14) w CLL interpretowano początkowo w kategoriach zjawisk odnoszących się wyłącznie do samego genu RB1. JednakŜe delecja ta moŝe mieć bardzo roŝne rozmiary: od widocznych w klasycznym kariotypie (patrz. Fot. 1) i obejmujących więcej niŝ jeden prąŝek, poprzez rozmiary moŝliwe do uwidocznienia tylko techniką FISH (patrz Fot. 2, 3), aŝ do najmniejszych moŝliwych do wykazania tylko metodami molekularnymi. Jak się równieŝ okazało, delecja ta nie zawsze obejmuje sam gen RB1. Hogan i wsp. przebadali w obrębie chromosomu 13q dwa przypuszczalnie róŝne regiony delecyjne wyŝej połoŝoną okolicę właściwego genu RB1 i niŝej poło- Ŝony fragment, określany jako DBM (deleted in B-cell malignancy, prąŝek 13q14), którego markerami są sekwencje D13S319 i D13S25. Obserwacje te mogą sugerować, Ŝe delecja w niŝej połoŝonej części chromosomu 13q, jest zdarzeniem niezaleŝnym i moŝe, ale nie zawsze musi obejmować sam gen RB1. Fot. 1. Częściowy kariotyp (chromosomy grupy D) pacjentki z podejrzeniem CLL i delecją 13q14. Lokalizacja delecji wskazana strzałką na prawidłowym chromosomie. Photo 1. Partial kargotype (group D chromosomem) of a patent with suspicion of CLL and 13q14 deletion. Site of deletion marked with the arrow on the normal chromosome.

4 8 E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK Fot. 2. Hybrydyzacja in situ z uŝyciem sondy RB1 (Vysis) prawidłowy układ sygnałów (zaznaczono strzałkami) Photo 2. Hybridization in situ using probe RB1 (Vysis) normal signal arrangement (marked with arrows) Fot. 3. Hybrydyzacja in situ z sondą RB1(Vysis). Delecja w obszarze genu RB1 drugi z 13 pary chromosomów (wskazany strzałką) nie wykazuje hybrydyzacji. Photo 3. Hybridization in situ with probe RB1 (Vysis). Deletion in the RB1 gene region the other of pair 13 chromosomes (marked with arrow) does not show hybridization.

5 Rola genu RB1 9 Monosomię wyłącznie genu RB1 stwierdzono u 24/54 pacjentów (10 97,8%, śr. 67,4% blastów krwi obwodowej), podczas gdy delecja regionu DBM pojawiła się u 26/54 chorych i zawsze współistniała z delecją RB1 [20]. Obszar wyznakowany markerem D13S25, jak równieŝ pobliską okolicę genu BRCA2 badali równieŝ Lens i wsp. w ich materiale hemizygotyczna delecja D13S25 wystąpiła u 6/18 pacjentów (33%) i czterej utracili równieŝ gen RB1. Delecja jeszcze niŝej połoŝonego genu BRCA2 wystąpiła u 22% badanych. Oprócz regionu DBM inną niezaleŝną delecję 13q moŝe obejmować region połoŝony wyŝej i wyznakowany markerem D13S218 [18]. Mapę opisywanych regionów pokazuje Rycina 1. Zasięg mikrodelecji bywał jednak rozmaicie definiowany w opracowaniach róŝnych grup badaczy. I tak Rowntree i wsp. określając minimalny wspólny utracony region na 230 kb, połoŝony pomiędzy markerami D13S319 i D13S25, stwierdzili występowanie delecji u 51,5% badanych pacjentów z B-CLL, przy czym u 14% byłą ona homozygotyczna, u 37,5% hemizygotyczna [21]. Ryc. 1. Chromosom 13. Zaznaczono najczęściej badane markery róŝnych obszarów delecji w obrębie ramienia długiego. BRCA2 (Breast Cancer 2), RB1 (Retinoblastoma Susceptibility Gene), DBM (deleted in B-cell malignancy), markery molekularne: D13S218, D13S319, D13S25. Fig. 1. Chromosome 13. Marked are the most often studiem marker sof various regions of deletion in the long arm. BRCA2 (Breast Cancer 2), RB1 (Retinoblastoma Susceptibility Gene), DBM (deleted in B-cell malignancy), molecular markers: D13S218, D13S319, D13S25. Nieco wyŝej od prąŝka 13q14, leŝą równieŝ geny LATS1 i LATS2 (Large Tumor Suppressor) o aktywności kinazy serynowej, których mutacje lub zmniejszoną ekspresję odnotowano w wielu guzach litych i białaczkach. Ich molekularne mechanizmy oddziaływania nie zostały jeszcze rozpoznane [22]. Dalsze badania molekularne prowadzone w obszarze delecji pozwoliły na wyodrębnienie szeregu le- Ŝących w niej genów (w kierunku od centromeru do telomerów), począwszy od genu RB1, poprzez CHC1L, CLLD8 i CLLD7, KPNA3, CLLD6, RFP2, BCMSUN z nakładającym się częściowo na nie genem BCMS. Delecje w tym obszarze z reguły powodują obniŝenie ekspresji genu RB1 (p. niŝej). Najmniejszy region delecyjny wywołujący taki skutek połoŝony jest ok. 1 2 Mbp, ma rozmiar 400 kbp i składa się z genów RFP2, BCMSUN i BCMS [23]. Ponadto w obszarze delecji mogą się takŝe znaleźć sekwencje genów: ARLTS1/ARL11; sekwencje mir15a/mir16 kodujące micro-rna, znajdujące się powyŝej znanego miejsca hybrydyzacji sondy FISH D13S319 i oddziałujące na ekspresję innych genów oraz znacznie niŝej połoŝone geny DLEU7, FLJ11712 i GUCY 1B2. Wszystkie te geny mogą odgrywać znaczący udział w patomechanizmie oddziaływań delecji 13q o róŝnych rozmiarach [24]. Innymi ostatnio badanymi genami o moŝliwej aktywności supresorowej, leŝącymi w pobliŝu obszaru delecji, są sekwencje LEU1 i LEU2, a być moŝe takŝe LEU5. Znajdują się one częściowo poza obszarem najmniejszego wspólnego regionu delecji opisywanego przez roŝne grupy badaczy i nie stanowią

6 10 E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK równieŝ matrycy do produkcji specyficznych białek. Przypuszcza się jednak, Ŝe mogą one mieć wpływ regulacyjny na wyŝej połoŝone geny. Zwrócono równieŝ uwagę, Ŝe produkty tych sekwencji podlegają alternatywnemu składaniu, a ich RNA naleŝy do grupy tzw. RNA niekodujących, które zwykle uczestniczą w rozmaitych mechanizmach regulacji aktywności innych genów [21]. Skąpe, fragmentaryczne i sprzeczne dane dotyczą znaczenia rokowniczego delecji w obszarze 13q. Niektórzy autorzy nie stwierdzili wyraźnej korelacji pojawiania się delecji z parametrami klinicznymi ani hematologicznymi [16], inni natomiast zaobserwowali w znacznie liczniejszej serii chorych dłuŝszy czas przeŝycia pacjentów z delecją aniŝeli bez niej [25]. Zmiany ekspresji genów obszaru 13q w przebiegu CLL Zmiany obejmujące obszar genu RB1 i pozostałe fragmenty 13q, mogą równieŝ modyfikować w róŝny sposób ekspresję zawartych tam genów. Sam gen RB1 jest ekspresjonowany we wszystkich typach komórek hematopoetycznych, takŝe o wysokim stopniu zróŝnicowania, a poziom ekspresji moŝna ocenić badając wydajność produkcji RNA (np. techniki Northern blotting, RT-PCR) lub poziom i lokalizację kodowanego białka (Western blotting, immunocytochemia). Uzyskane tymi technikami wyniki nie pozwalają jednak na wyciągnięcie jednoznacznych wniosków; w obrębie takich samych klinicznie grup pacjentów obserwowano zarówno wzrost jak i obniŝenie ekspresji genu RB1. Brak ekspresji lub znaczny spadek poziomu mrna RB1 obserwowano przy uŝyciu technik PCR i/lub technik immunocytochemicznych u 13% chorych z CLL i dotyczyło to pacjentów we wczesnym fazach choroby [26]. Wśród 11 pacjentów z B-CLL i jednoczesnymi klonalnymi defektami w obszarze genu RB1, u których wykorzystano wszystkie techniki oceny ekspresji w wyizolowanych liniach komórek B, więcej niŝ połowa manifestowała obniŝenie ekspresji. Stopień obniŝenia ekspresji nie zawsze był zbieŝny z utratą allela lub zaawansowania klinicznego CLL, jednocześnie obniŝoną ekspresją RB1 obserwowano mimo obecności prawidłowego cytogenetycznie regionu 13q14 [27]. W materiale Koczkodaj i wsp. poziom ekspresji białka RB1 prawdopodobnie nie ma związku z istnieniem lub brakiem delecji genu, natomiast wykazuje zaleŝność od ekspresji P16. Chorzy, którzy ekspresjonowali P16, nie ekspresjonowali RB1 i vice versa [28]. Zmiany dotyczyć mogą równieŝ ekspresji innych genów zawartych w obszarze szeroko rozumianej delecji 13q; i tak np.: ekspresję genu LEU1 wykrywaną reakcją RT-PCR, wykazano zarówno w normalnych jak i białaczkowych komórkach pacjentów z CLL, jednakŝe technika Northern blotting wykazała w tych przypadkach tylko ekspresjonowanie pierwszych dwóch egzonów tego genu [21]. Jednocześnie wykazano, Ŝe delecja sekwencji połoŝonych poniŝej genu RB1, obniŝa poziom ekspresji RB1 takŝe w sytuacjach gdy sam ten gen wydaje się być prawidłowy [23]. Delecje w obszarze 13q14 w białaczkach innych niŝ CLL TakŜe w innych niŝ omówiona wcześniej CLL typach białaczek, rozmiary delecji zwykle wykraczają poza obszar genu RB1. Ostre białaczki cechuje znacznie agresywniejszy przebieg i przewaŝnie gorsze rokowanie. Tym samym weryfikacja stanu genu RB1 i jego okolicy moŝe dostarczyć cennych informacji dotyczących progresji choroby czy doboru leczenia. Wyniki zmian w regionie 13q14 w ALL opisano szerzej w 2000 roku. Oceniono hodowlę niestymulowanego szpiku kostnego u 1946 dzieci, i w przeciwieństwie do CLL rearanŝacje w obszarze 13q14 stwierdzono tylko u 2% chorych, w tym u 0,5% były to aberracje zrównowaŝone. U 1,3% była to częściowa utrata 13q, a jedno dziecko miało kariotyp z jednoczesnym naddatkiem i ubytkiem 13q. Pomimo Ŝe całkowity czas przeŝycia był podobny zarówno u pacjentów bez aberracji okolicy RB1 jak i z tymi aberracjami; nosiciele aberracji wykazywali znacząco krótszy czas wolny od zdarzeń [29]. Następna podobna analiza materiału 138 dzieci z ALL (116 typu B i 22 typu T), oparta była o badanie 12 róŝnych sekwencji wielokrotnych regionu 13q14. LOH tego regionu zaobserwowano tylko u 6 pacjentów (4,3%), przy czym u dwojga z nich delecja nie obejmowała samego genu RB1. Poszczególni pacjenci wykazywali róŝnice zarówno w wielkości delecji, jak i jej

7 Rola genu RB1 11 odległości od telomeru. PowyŜsze obserwacje ponownie sugerują, zdaniem autorów, istnienie w regionie delecyjnym innego, aniŝeli gen RB1, genu supresjonujacego nowotwory [30]. Znacznie większy odsetek zmian w obszarze 13q14, obserwowali w 2004 roku u 278 dzieci z ALL, Kovacs i wsp. Aberracje dotyczące regionu 13q14 występowały w ich materiale trzykrotnie częściej- u 7,2% dzieci, w tym u 6,1% w chwili rozpoznania i aŝ u 13% w trakcie wznowy. Wykazali oni Ŝe przynajmniej u jednego dziecka delecja 13q14 nie obejmowała samego genu RB1 [31]. Zmiany strukturalne w obszarze RB1 w małej grupie 20 pacjentów z ALL. Liu i wsp. znaleźli tylko u jednej pacjentki, u której dodatkowo współwystępowała heksasomia chromosomu 21. Dzięki analizie RLFP ujawniono u niej duŝą delecję regionu 3 obu alleli genu RB1 [32]. Wszystkie powyŝsze obserwacje sugerują, Ŝe del(13)(q14) jest w przebiegu ALL zmianą wtórną, pojawiającą się znacznie częściej w okresie zaostrzenia; nie jest natomiast jasna wzajemna kolejność wystąpienia zaostrzenia choroby i delecji. Delecje obszaru 13q14 opisywano równieŝ w mieszanych grupach chorych obciąŝonych róŝnymi typami białaczek; mimo oczywistych niedostatków takiej rekrutacji pacjentów; i tak: del(13)(q12 14) jaki i del(13)(q14 22) znaleziono w kariotypach 2% chorych z MDS, AML M2, AML M4 [33]. Natomiast w publikacji Hansena i wsp., opisującej del(13)(q14) u 5 chorych z ALL, AML, CML i MDS, po raz pierwszy wykazano techniką Southern w blastach krwi obwodowej inaktywację obu alleli genu RB1 jednocześnie z delecją wykrywalną cytogenetycznie [34]. PowyŜsze dość fragmentaryczne i niespójne obserwacje pozwalają przypuszczać, Ŝe delecja 13q w odróŝnieniu od wcześniej omówionej CLL, w innych białaczkach wydaje się zjawiskiem mniej stałym i znaczącym dla diagnostyki i prognozy. Zmiany ekspresji genów obszaru 13q w białaczkach innych niŝ CLL Hangaishi i wsp. na podstawie oceny 230 pacjentów z róŝnymi białaczkami zauwaŝyli, Ŝe stosunkowo częstym zmianom ekspresji RB1 nie zawsze towarzyszy delecja tego genu. Przynajmniej u części pacjentów wzajemna sekwencja czasowa utraty funkcji poszczególnych genów supresjonujacych (P15, P16, RB1 i P53) moŝe nie być przypadkowa i wynikać z ich współdziałania w kaskadzie cyklinowej [35]. Stosując technikę RT - PCR u 56 chorych z ALL wykazano, Ŝe zmiany poziomu mrna mogą róŝnicować podgrupę chorych z obniŝoną jak i podwyŝszoną ekspresją RB1. PodwyŜszenie ekspresji towarzyszyło zwłaszcza początkowym stadiom choroby, natomiast z jej postępem poziom spadał. U pacjentów z obniŝoną ekspresją prawdopodobieństwo długotrwałej pierwszej remisji było mniejsze, średnie przeŝycie krótsze a nawrotom towarzyszyło dalsze obniŝanie się ekspresji [36]. Wyniki te róŝnią się od opisanych przez Tsai i wsp., którzy w grupach z wczesnymi i późnymi etapami ALL obserwowali zbli- Ŝone odsetki chorych z obniŝeniem ekspresji. Autorzy ci uwaŝają, Ŝe utrata ekspresji białka RB1 jest zjawiskiem powszechnym w ALL u dorosłych, jej zmiany nie są istotnym czynnikiem rokowniczym, natomiast mogą świadczyć o złej odpowiedzi na leczenie [37]. Cheng i wsp. stwierdzili, Ŝe w ALL, utracie ekspresji białka RB1 towarzyszą zawsze duŝe delecje genu RB1 [38]. Analizując ekspresję białek cyklinozaleŝnych m.in. P16 i RB1, Kustanovic i wsp. zaobserwowali, Ŝe w ALL typu B obniŝenie ekspresji któregoś z nich jest znacznie częstsze, aniŝeli w ALL typu T. Podkreślają takŝe, Ŝe zmiana ekspresji zarówno białka P16 jaki i RB1, występuje u 1/3 chorych z B-ALL i T-ALL w przeciwieństwie do o wiele rzadszej inaktywacji P53 i P14, która pojawia się tylko u 3% takich chorych [1]. Zmiany ekspresji genu RB1 towarzyszą równieŝ AML. Zostały one po raz pierwszy zaobserwowane przez Furukawę i wsp. w 1991 oraz Kornblau a w 1992 r. [cyt. wg Kornblau -39] a ekspresja, oceniana jako poziom białka RB1, ulegała podwyŝszeniu aŝ u 81% pacjentów. Natomiast o wiele rzadziej obserwowano obniŝony poziom białka (~6% pacjentów). Ta ostatnia grupa pacjentów miała znacząco niŝszy czas przeŝycia i znacząco rzadsze remisje aniŝeli chorzy z nadekspresją; obniŝony poziom białka RB1 jest interpretowany jako czynnik złego rokowania [40]. Znacznie niŝszy odsetek pacjentów z obniŝoną

8 12 E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK ekspresją białka RB1 (rzędu 28-50%), obserwowali jednak inni autorzy [41]. Całkowity brak ekspresji białka RB1 wykazano równieŝ u 55% pacjentów z białaczką mielomonocytową i mieloblastyczną, a u dalszych 20% poziom białka był znacząco obniŝony [42]. W eksperymencie ze stymulacją blastów in vitro (IL-3, GM-CSF) u 22 pacjentów z AML i wyjściowo niską ekspresją białka RB1, Zhang i wsp. zaobserwowali u większości odpowiedź proliferacyjną, której u niektórych pacjentów towarzyszył wzrost poziomu formy ufosforylowanej białka RB1 [43]. Stwierdzone w róŝnych białaczkach zmiany ekspresji RB1 rozumiane jako zmiany poziomu białka obserwowano równieŝ w sytuacjach, kiedy nie znaleziono ani nieprawidłowości genu ani zmian poziomu jego RNA. Mogą więc być skutkiem oddziaływania, jeszcze innych, niŝ znane dotąd, regulatorów [44]. Wszystkie cytowane wyŝej obserwacje pozwoliły na potwierdzenie przypuszczenia, Ŝe gen RB1 pełni znaczącą, choć być moŝe nie bezpośrednią rolę, w patogenezie i/lub progresji B-CLL. Zmiany w obszarze 13q14 ujawniają równieŝ heterogenność klonów CLL. Utrata obu kopii genu RB1 u pacjentów z zaawansowaną postacią choroby sugeruje prawdopodobną korelację tego zjawiska z przebiegiem białaczki. Delecja w obszarze prąŝka 13q14 nie zawsze dotyczy wyłącznie genu RB1; duŝe znaczenie, w tym wpływ na stan kliniczny, mogą mieć równieŝ zmiany w innych sekwencjach tej okolicy. PODSUMOWANIE Delecja w obszarze 13q14 początkowo odnoszona przede wszystkim do genu RB1, wydaje się mieć znacznie szerszy zasięg i obejmować przynajmniej kilkanaście genów, których udział w patomechanizmie białaczek jest moŝliwy. Mechanizmy działania większości z nich wydają się być bardziej wyrafinowane niŝ prosty mechanizm dwóch trafień opisany przez Knudsona. Dotyczy to zwłaszcza moŝliwości wielu równoczesnych oddziaływań regulacyjnych, jakimi geny te potencjalnie dysponują. Opisane wpływy wydają się mieć stałe znaczenie kliniczne przede wszystkim w CLL. NaleŜy jednak podkreślić, Ŝe pomimo przeniesienia punktu cięŝkości w ostatnich latach zainteresowań grup badawczych na geny inne niŝ RB1 w obszarze 13q14, do chwili obecnej nie wykluczono definitywnie jego udziału w patomechanizmie białaczek; zwłaszcza Ŝe, w wyniku zaburzeń innych połoŝonych w pobliŝu genów, obserwuje się obniŝenie jego aktywności. PIŚMIENNICTWO 1. Kustanovich A.M, Savitskaja T.V, Bydanov O.I, Belevtsev M,V, Potapnev M.P.: Aberrant expression of tumor suppressor genes and their association with chimeric oncogenes in pediatric acute lymphoblastic leukemia; Leuk Res 2005; 29: Knudson A.G.: Mutation and cancer. Statistical study of retinoblastoma. Proc Natl Acod Sci USA 1971; 68: DiCiommo D, Gallie B.L, Brenner R.: Retinoblastoma: the disease, gene and protein provide critical leads to understand cancer. Cancer Biology 2000; 10: Sellers W.R., Kaelin W.G.: Role of the retinoblastoma protein in the pathogenesis of human cancer. J Clin Oncol 1997; 15: Xiao B, Spencer J, Clements A. Crystal structure of the retinoblastoma tumor suppressor protein bound to E2F and the molecular basis of its regulation. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: Zajączek S.: Siatkówczak. Post Nauk Med 2008; 8: Abramson D.H.: Second nonocular cancers in retinoblastoma: a unified hypothesis, Ophth Genet 1999; 20: Kohno S, Van Den Berghe H, Sandberg A.A.: Chromosomes and causation of human cancer and leukemia: XXXI. Dqdeletions and their significance in proliferative disorders. Cancer 1979; 43: Borgström G.H, Knuutila S, Ruutu T.: Abnormalities of chromosome 13 in myelofibrosis. Scand J Haematol 1984; 33: Johnson D.D, Dewald G. W, Pierre R.V.: Deletions of chromosome 13 in malignant hematologic disorders. Cancer Genet Cytogenet 1985; 18: Juliusson G, Oscier D.G, Fitchett M.: Prognostic subgroups in B- cell chronic lymphocytic leukemia defined by specific chromosomal abnormalities. N Engl J Med 1990; 323:

9 Rola genu RB Fitchett M., Griffiths M.J, Oscier DG, Johnson S, Seabright M.: Chromosome abnormalities involving band 13q14 in hematologic malignancies. Cancer Genet Cytogenet 1987; 24: Stilgenbauer S, Döhner H, Bulgay-Mörschel M, Weitz S, Bentz M, Lichter P.: High frequency of monoallelic retinoblastoma gene deletion in B-cell chronic lymphoid leukemia shown by interphase cytogenetics. Blood 1993; 81: Peterson L.C., Lindquist L.L., Church S., Kay N.E.: Frequent clonal abnormalities of chromosome band 13q14 in B-CLL chronic lymphocytic leukemia: multiple clones, subclones and nonclonal alterations in 82 midwestern patients. Genes Chromosomes Cancer 1992; 4: Avet-Loiseau H., Devilder M.C., Garand R.: 13q14 deletions are not primary events in B-CLL chronic lymphocytic leukemia: a study of 100 patients rusing fluorescence in situ hybridization. Clin Cancer Res 1996; 2: Doneda L., Castorina P., Tedeschi A., Intropido L., Morra E., Montillo M.: Multicolor FISH in chronic lymphocytic leukemia. An interphase study of patients with early-onset disease. Cancer Genet Cytogenet 2001; 125: Lens D., Matutes E., Catovsky D., Coignet L.J.: Frequent deletions at 11q23 and 13q14 in B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL). Leukemia 2000; 14: Chena C., Arrossagaray G., Scolnik M., Palcios M., Slavutsky I.: Interphase cytogenetic analysis in Argentinean B-cell chronic lymphocytic leukemia patients: association of trisomy 12 and del(13q14). Cancer Genet Cytogenet 2003; 146: Hogan W.J., Tefferi A., Borell T.J., Jenkins R., Li C.Y., Witzing T.E.: Prognostic relevance of monosomy at the 13q14 locus detected by fluorescence in situ hybridization in B-CLL chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 1999; 110: Rowntree C., Duke V., Panayiotidis P., Kotsi P., Palmisano GL., Hoffbrand AV.: Deletion analysis of chromosome 13q14.3 and characterization of an alternative splice form of LEU1 in B cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2002; 16: Visser S., Xiaolong Y.: Identification of LATS transcriptional targets in HeLa cells using whole human genome oligonucleotide microarray. Gene 2010; 449: (w druku). 23. Mertens D., Wolf S. Schroeter P.: Down-regulation of candidate tumor suppressor genes within chromosome band 13q14.3 is independent of the DNA methylation pattern in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002; 99: Quillette P., Erba H., Kujawski L., Kaminski M., Shedden K., Malek S.: Integrated Genomic Profiling of Chronic Lymphocytic Leukemia Identifies Subtypes of Deletion 13q14. Cancer Res 2008; 68: Döhner H., Stilgenbauer M., Benner A.: Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. NEJM 2000; 343: Neubauer A., Kant E., Rochlitz C.: Altered expression of retinoblastoma susceptibility gene in chronic lymphocytic leukemia. Br J Haematol 1993; 85: Kay E.N., Suen R., Ranheim E.,. Peterson L.C.: Confirmation of RB gene defects in B-CLL clones and evidence for variable predominance of the RB defective cells within the CLL clone. Br J Haematol 1993; 84: Koczkodaj D., Marzec-Kotarska B., Filip A., Wąsik-Szczepanek E., Wojcierowski J.: Badania wybranych markerów u nieleczonych pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową B- komórkową. Acta Haematol Pol 2008; 39: Heerema N.A., Sather H.N., Sensel M.G.: Abnormalities of chromosome bands 13q12 to 13q14 in childhood acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 2000; 18: Cave H., Avet- Loiseau H., Devaux I.: Deletion of chromosomal region 13q14.3 in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2001; 15: Kovacs B.Z., Niggli F.K., Betts D.R.: Aberrations involving 13q12-q14 are frequent secondary events in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2004; 151: Liu Y., Söderhäll S., Heyman M., Grandér D., Bröndum-Nielsen K., Einhorn S.: Multiple genetic events involving RB1 gene deletion and amplification of chromosome 21 in case of acute lymphocytic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1994; 9: Morgan R., Hecht F.: Deletion chromosome band 13q14: a primary event in preleukemia and leukemia. Cancer Genet Cytogenet 1985; 18: Hansen M.F., Morgan R., Sandberg A.A., Cavenee W.K.: Structural alterations at the putative retinoblastoma locus in some human leukemia and preleukemias. Cancer Genet Cytogenet 1990; 49: Hangaishi A., Ogawa S., Imamura N.: Inactivation of multiple tumor-suppressor genes involved in negative regulation of the cell cycle, MTS/p16 INK4A /CDKN2, MTS2/p15 INK4B, p53 and Rb genes in primary lymphoid malignancies. Blood 1996; 87: Sauerbrey A., Stammler G., Zintl F., Volm M.: Expression and prognostic value of the retinoblastoma tumor suppressor gene (RB-1) in childhood acute lymphoblastic leukemia. Br J Haematol 1996; 94:

10 14 E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK 37. Tsai T., Davalath S., Rankin C.: Tumor suppressor gene alteration in adult acute lymphoblastic leukemia (ALL). Analysis of retinoblastoma (Rb) and p53 gene expression in lymphoblast of patients with de novo, relapsed, or refractory ALL treated in Southwest Oncology Group. Leukemia 1996; 10: Cheng J., Scilly P., Shew J.Y., Lee W.H., Vila W., Haas M.: Homozygous deletion of the retinoblastoma gene in an acute lymphoblastic leukemia (T) cell line. Blood 1990; 75: Kornblau S.M, Ji Xu H., Zhang W.: Levels of retinoblastoma protein expression in newly diagnosed acute myelogenous leukemia. Blood 1994; 1: Ahuja H.G., Jat P.S., Foti A., Bar-Eli M., Cline M.J.: Abnormalities of the retinoblastoma gene in the pathogenesis of acute leukemia. Blood 1991; 78: Zhu M.Y., Bradbury D., Russell N.: Decreased retinoblastoma protein expression in acute myeloblastic leukemia is associated with the autonomous proliferation of clonogenic blasts. Br J Haematol 1994; 86: Weide R., Parviz B., Pflϋger K.H., Havemann K.: Altered expression of the human retinoblastoma gene in monocytic leukaemias. Br J Haematol 1993; 83: Zhang W., Xu H.J., Kornblau S.M.: Growth -factor stimulation reveals two mechanisms of retinoblastoma gene inactivation in human myelogenous leukemia cells. Leuk Lymphoma 1995; 16: Tang J.L., Yeh S.H., Chen P.J., Lin M.T., Tien H.F., Chen Y.C.: Inactivation of the retinoblastoma gene in acute myelogenous leukaemia. Br J Haematol 1992; 82: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autorów: Ewa Studniak Samodzielna Pracownia Cytogenetyki Zakład Patologii Pomorskiej Akademii Medycznej Ul. Połabska Szczecin Tel./fax ewa.studniak@gmail.com