Badanie oporności osmotycznej krwinek czerwonych przegląd metod diagnostycznych

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(3): Praca poglądowa Review Article Badanie oporności osmotycznej krwinek czerwonych przegląd metod diagnostycznych Osmotic fragility of red blood cells a review of diagnostic methods Agata Zgodzińska 1, Olga Ciepiela 2 1 Studenckie Koło Naukowe przy Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny Streszczenie Oporność osmotyczna jest badaniem powszechnie uważanym za czuły wskaźnik wrażliwości komórek krwinek czerwonych na działanie środowiska hipotonicznego. Tradycyjny test oporności osmotycznej (Test Dacie go i Lewisa) ze względu na pracochłonność, długi czas analizy próbki (minimum 30 minut) oraz dość dużą minimalną objętość materiału wymaganego do prawidłowego wykonania testu nie należy do najchętniej wykorzystywanych testów w praktyce laboratoryjnej. Celem tego artykułu jest ponowne zwrócenie uwagi na wartość diagnostyczną testu oporności osmotycznej erytrocytów oraz zaprezentowanie najnowszych metod stanowiących udoskonalenie techniki tradycyjnej, od testu hemolizy w zakwaszonym glicerolu (AGLT50), poprzez Pink Test, do ocenę oporności z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Być może nowe, świeże spojrzenie na to zagadnienie przyczyni się w przyszłości do powrotu testu oporności osmotycznej do rutynowej diagnostyki przesiewowej zaburzeń czerwonokrwinkowych u dzieci i dorosłych. Summary Osmotic Fragility Test (OFT) is widely considered as a sensitive indicator of red blood cells sensitivity to the hypotonic solution. Traditional osmotic fragility test (Dacie and Lewis) is time and work-consuming, and need relatively large minimum volume of peripheral blood for proper test performance. It does not belong to the most popular tests in a daily laboratory practice. The purpose of this article is to underline the diagnostic value of the Osmotic Fragility Test as well as present the latest methods that improves the traditional technique, such as Acidified Glycerol Lysis Test (AGLT 50), Pink Test, or Flow Cytometric Osmotic Fragility Test (FCM OF Test). Perhaps a new, fresh view at the issue in the nearest future will contribute to reconsider the osmotic fragility test for routine diagnostic screening of red blood cell disorders in children and adults. Słowa kluczowe: Key words: cytometria przepływowa, oporność osmotyczna, Pink Test, sferocytoza wrodzona, test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT 50) Acidified Glycerol Lysis Test (AGLT 50), Flow Cytometric Osmotic Fragility Test, hereditary spherocytosis, osmotic fragility, Pink Test Wstęp Oporność osmotyczna erytrocytów (ang. osmotic fragility) jest powszechnie uznawana za czuły wskaźnik wrażliwości krwinek czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych. Na oporność osmotyczną erytrocytów ma wpływ wiele czynników: skład i integralność błony komórkowej, stosunek powierzchni do objętości komórki, czynniki zewnętrzne takie jak mechaniczna hemoliza [1, 2], temperatura [1, 3] ultradźwięki [1], leki [1, 2] lub czas ich przechowywania po pobraniu od pacjenta [4]. Po umieszczeniu prawidłowej krwinki czerwonej w środowisku izotonicznym (ok. 0,3 M NaCl), obserwuje się niewielki ruch osmotyczny wody przez jej błonę komórkową, a zatem jej kształt i objętość pozostają bez zmian. Umieszczenie tej samej komórki w środowisku hipotonicznym przyczynia się do napływu wody do wnętrza komórki, a tym samym wzrostu jej objętości i utraty charakterystycznego kształtu dwuwklęsłego dysku. Zarówno kształt komórki jak i budowa błony komórkowej pozwalają na maksymalne zwiększenie objętości o 70%. Dalszy jej wzrost skutkuje utratą integralności ich błony komórkowej na drodze lizy osmotycznej [5, 6]. Test oporności osmotycznej (Metoda Daciego i Lewisa) Podstawą testu oporności osmotycznej (ang. osmotic fragility test) jest ocena wrażliwości krwinek czerwonych na lizę następującą 229

2 w wyniku zmian stężenia NaCl w środowisku. W swej tradycyjnej postaci (Test Dacie go i Lewisa) opiera się na ocenie oporności krwinek czerwonych w hipotonicznych roztworach NaCl (norma: początek hemolizy 0,45%, natomiast koniec 0,35%) [7]. W tym celu należy przygotować serię roztworów NaCl o stężeniach od 0,1% do 0,9%, następnie dodać niewielką objętość krwinek czerwonych (krew obwodowa pobrana do probówek zawierających wersenian potasu K 3 -EDTA) oraz wykonać spektrofotometryczny pomiar absorbancji zawiesiny. Oporność osmotyczna erytrocytów określana jest poprzez pomiar hemoglobiny uwolnionej z erytrocytów, które w wyniku umieszczenia w środowisku hipotonicznym ulegają lizie osmotycznej. Długość fali świetlnej, przy której wykonywany jest pomiar intensywności światła przechodzącego przez roztwór wynosi 540 nm. Oporność osmotyczna oceniana jest na podstawie przesunięcia krzywej hemolizy, na wykresie zależności absorbancji od stężenia NaCl, często określane jako stężenie NaCl wywołujące 50% hemolizę [1, 6, 8]. Test oporności osmotycznej (Osmotic Fragility Test, OFT) stosuje się głównie w diagnostyce chorób związanych z zaburzeniami budowy i/lub składu błony komórkowej erytrocytów. Wykorzystywany jest przede wszystkim w diagnostyce sferocytozy wrodzonej (ang. hereditary spherocytosis, HS), która jest najpowszechniej występującą wrodzoną niedokrwistością hemolityczną w populacji północno-europejskiej oraz Ameryki Północnej. Schorzenie to występuje z częstotliwością 1 na 5000 żywych urodzeń, jednakże biorąc pod uwagę badania prowadzone nad opornością osmotyczną u dawców krwi, które sugerują obecność form łagodnych oraz subklinicznych schorzenia, częstotliwość ta może być wyższa i wynosić nawet do 1 do 2000 [9, 10, 11, 12]. Sferocytoza wrodzona jest chorobą genetyczną i w około 80% przekazywana rodzinnie. W typowej postaci dziedziczona jest w sposób autosomalny dominujący, choć w sporadycznych przypadkach pojawiają się inne typy przekazywania wadliwego genu (autosomalnie recesywnie lub jako wynik mutacji powstałych de novo) [9, 13]. Rozpoznanie choroby zazwyczaj następuje w wieku niemowlęcym lub wczesnodziecięcym, choć pojawienie się jej w późniejszych latach nie jest wykluczone [9]. Sferocyty powstałe w wyniku zaburzenia składu białek cytoszkieletu wykazują się zwiększoną wrażliwością na hemolizę w warunkach hipotonicznych. Ich kulisty kształt powoduje, że mają zmniejszoną rezerwę powierzchniową (stosunek powierzchni do objętości krwinki) i nie mają możliwości powiększenia swojej objętości, stąd ulegają szybkiemu rozpadowi pod wpływem hipotonicznych roztworów. Wykorzystanie tej prostej zależności jest podstawą odróżnienia komórek o prawidłowej budowie cytoszkieletu od komórek patologicznych [11]. Badanie oporności osmotycznej erytrocytów metodą Dacie go, jest metodą powszechnie uznawaną za złoty standard w diagnostyce sferocytozy wrodzonej u pacjentów z Coombs -ujemną anemią hemolityczną [7, 14]. Należy jednak pamiętać, iż zmniejszona oporność osmotyczna nie jest wynikiem swoistym dla HS, a badanie oporności jest jedynie testem przesiewowym, wymagającym, przy wyniku dodatnim, dodatkowej diagnostyki. Sferocyty mogą się bowiem pojawiać w przebiegu innych niedokrwistości np. anemii autoimmunohemolitycznej lub niedokrwistości spowodowanej konfliktem serologicznym w układzie AB0, czy niekiedy w przewlekłej niewydolności nerek [9, 10, 11]. Niektóre schorzenia i stany metaboliczne charakteryzuje obniżona oporność osmotyczna (głównie sferocytozę wrodzoną [5, 6, 7, 9], niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej [1] oraz hipernatremię), inne zaś podwyższona (choroby przewlekłe wątroby, niedobory żelaza, hiponatremię, talasemię postać homo i heterozygotyczna [13], anemię sierpowatokrwinkową [1] lub stan po splenektomii) [5]. W literaturze pojawiają się również przesłanki o zastosowaniu tego testu w diagnostyce schorzeń czerwonokrwinkowych pacjentów mocznicowych oraz cukrzyków [1]. Jest to również test przesiewowy w kierunku beta-talasemii w krajach mniej zamożnych, gdzie automatyczne analizatory hematologiczne są mniej dostępne [6, 8]. Do wykonania testu metodą Daciego wymagane jest pobranie aż 0,5 ml krwi pełnej do probówki zawierającej antykoagulant [2]. Szybko postępujący rozwój nauk medycznych pozwolił na opracowanie nowych metod oznaczania oporności osmotycznej w celu ułatwienia jej zastosowania w badaniach przesiewowych osób podejrzanych o HS. Niejednokrotnie są to metody mniej czasochłonne, prostsze w wykonaniu, a przede wszystkim wymagające o wiele mniejszej objętości materiału niezbędnego do wykonania badania. Biorąc pod uwagę fakt, iż test oporności osmotycznej wykonywany jest przede wszystkim u dzieci i noworodków, objętość pobieranej próbki może mieć kluczowe znaczenie. Test hemolizy w zakwaszonym glicerolu (AGLT 50) Efektem jednej z pierwszych prób udoskonalenia testu oporności osmotycznej był test szybkości hemolizy w zakwaszonym glicerolu (AGLT 50) według A. Zanelli i współpracowników [5, 9, 14]. Zasada testu AGLT 50 opiera się na pomiarze czasu, jaki upływa od początku analizy do momentu zhemolizowania 50% krwinek czerwonych uprzednio zawieszonych w zbuforowanym kwaśnym hipotonicznym roztworze NaCl/PBS z glicerolem. Do kuwety, w której umieszczono próbę badaną, dodaje się odpowiednią objętość odczynnika glicerolowego i natychmiast rozpoczyna pomiar spektrofotometryczny. Odczyt czasu, po którym następuje 50% hemoliza, jest wspomagany równocześnie wykonywanymi pomiarami absorbancji przy długości fali 620 nm, a wynikiem jest określenie czasu, po upływie którego wyjściowa absorbancja zmniejszyła się o połowę. Prawidłowy wynik testu AGLT50 wynosi powyżej 1800 sekund, podczas gdy u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną lub inną niedokrwistość hemolityczną wynik ten jest znacznie skrócony i wynosi od 25 do 150 sekund [9]. W związku z tym, że czułość testu AGLT50 utrzymuje się na poziomie bliskim 100%, a jego swoistość wynosi jedynie 66,6%, test ten nie pozwala na różnicowanie poszczególnych typów niedokrwistości hemolitycznych. Pink Test Modyfikacją testu AGLT 50, wykazującą zbliżoną [6] lub według niektórych źródeł nieco większą [16] czułość diagnostyczną, jest metoda umownie zwana,,pink Test. Po raz pierwszy została opisana przez Vettore i wsp, a następnie zmodyfikowana przez Judkiewicz i wsp. Polega na określeniu hemolizy w roztworze 230

3 Diagn Lab 2015; 51(3): zawierającym glicerol zbuforowany do ph 6,66 buforem Bis-Tris (70 mmol/l).,,pink Test jest metodą punktu końcowego opartą na ocenie hemolizy półilościowo lub ilościowo w próbkach zawierających niewielkie objętości krwi zawieszone w roztworze zawierającym 135 mmol/l glicerolu, 25 mmol/l NaCl i HCl. Bez wątpienia zaletą tej uproszczonej metody są niewielkie objętości wykorzystywanego materiału biologicznego, a brak konieczności wcześniejszego pobrania krwi do probówek zawierających antykoagulant stwarza możliwość przeprowadzenia badania również u noworodków i niemowląt oraz bezpośrednio po pobraniu krwi.,,pink Test daje dodatni wynik nie tylko u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną, ale również u osób z przewlekłą niewydolnością nerek, niedokrwistością immunohemolityczną, czy przewlekłymi chorobami hemoproliferacyjnymi. Ponadto pozytywne wyniki zanotowano również u kobiet ciężarnych. Ujemne wyniki testu obserwowano natomiast w innych niedokrwistościach mikrocytowych (beta-talasemia, niedokrwistość z niedoboru żelaza) [6, 16, 17]. Ocena oporności osmotycznej z wykorzystaniem cytometrii przepływowej (FCM OF Test) Prostota procedury, brak konieczności stosowania drogich odczynników oraz krótki czas analizy próbki stanowią największe zalety badania oporności osmotycznej erytrocytów z wykorzystaniem cytometrii przepływowej (FCM OF Test). Metoda ta została opisana przez Won i Suh [18], a polega na ocenie liczby komórek krwinek czerwonych pozostałych w zawiesinie po dodaniu do niej wody dejonizowanej. Jest to test służący do przesiewowej diagnostyki sferocytozy wrodzonej [18, 19]. Dzięki łatwości wykonania i interpretacji wyników być może wkrótce zostanie wprowadzony do rutynowej diagnostyki laboratoryjnej. Zasada testu jest taka sama jak w przypadku metody konwencjonalnej. Pierwszym krokiem testu jest dwuetapowe przygotowanie próbki krwi pacjenta do analizy: Etap 1. Ustaloną objętość krwi pełnej pobranej do probówki z wersenianem potasu (K3-EDTA) dodaje się do 1,1 ml roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Objętość materiału wykorzystanego do badania jest obliczana według niżej przedstawionego wzoru, tak aby każda z badanych próbek zawierała zbliżoną liczbę erytrocytów: V (µl) = x RBC gdzie: V objętość próbki krwi pobieranej do analizy, RBC liczba krwinek czerwonych w µl x106 Rycina 1. Cytogramy przedstawiające proces analizy w przebiegu cytometrycznego testu oporności osmotycznej. A cytogram zależności wielkości od objętości komórek, w bramce K zaznaczony jest obszar zliczania erytrocytów; B cytogram zależności liczby komórek od czasu analizy, który, w poszczególnych bramkach, wynosi 30 sekund. Przerwa w analizie, zaznaczona strzałką, wskazuje na moment dodania do zawiesiny wody dejonizowanej (czas, w trakcie którego cytometr jest wstrzymywany, do próbki dodawana jest woda i cytometr wznawia zliczanie komórek zależny od analizatora); C tabela statystyki analizy dla cytogramu B, podkreślono liczby komórek w pierwszej, przedostatniej i ostatniej bramce analizy. 231

4 Etap 2. Tak przygotowane erytrocyty ponownie się rozcieńcza, dodając 10 µl zawiesiny do 1,1 ml 0,9% NaCl. Drugim krokiem testu jest cytometryczna analiza przygotowanej zawiesiny. W trakcie badania w czasie rzeczywistym określana jest liczba krwinek czerwonych w zawiesinie przed, a następnie po dodaniu wody dejonizowanej. Czas analizy jednej próbki nie przekracza 300 s. Zbieranie sygnałów erytrocytów odbywa się na wykresie zależności wielkości komórki (FS ang. forward scatter) od czasu, który podzielony jest na bramki równej wielkości (obszary kolejno pokonywane w czasie przez komórki w trakcie analizy). Po rozpoczęciu analizy, w trybie ciągłym cytometr zlicza komórki w wyjściowej zawiesinie krwinek czerwonych i po dodaniu do niej 0,9 ml wody dejonizowanej. Stopień hemolizy w badanej próbce wyrażany jest jako %PKKC (% pozostałych komórek krwinek czerwonych). stanowiący stosunek średniej liczby komórek z dwóch ostatnich bramek pozostałych w zawiesinie po dodaniu wody dejonizowej, do liczby komórek obecnych w próbce pierwotnie, obliczany ze wzoru: % PKKC = x 100% (y+z) / 2 1,1 A. 2 gdzie: PKKC pozostałe komórki krwinek czerwonych, Y liczba komórek w przedostatniej bramce analizy, Z liczba komórek w ostatniej bramce analizy, A liczba komórek w pierwszej bramce analizy Współczynnik korekcji 1, 1/2, 0 został uwzględniony w równaniu, w celu wyrównania objętości płynów w próbce pierwotnej i po dodaniu wody dejonizowanej. Przykładowy odczyt cytometryczny został przedstawiony na rycinie 1. Znaczące zmniejszenie liczby krwinek czerwonych pozostałych po ekspozycji na wodę dejonizowaną, jest wskaźnikiem obniżonej oporności osmotycznej. Każde laboratorium stosujące tę metodę powinno ustalić własny zakres referencyjny %PKKC [18]. Oporność osmotyczna mierzona przy pomocy cytometru przepływowego może stać się cennym, alternatywnym narzędziem wykorzystywanym w diagnostyce przesiewowej zaburzeń błonowych krwinek czerwonych, głównie ze względu na prostotę wykonania badania oraz skuteczność porównywalną nawet z testem wiązania maleimidu-5 -eozyny (test EMA) [18]. Test FCM OF, w porównaniu z innymi metodami oznaczenia oporności osmotycznej, jest mniej pracochłonny, oszczędza czas oraz koszty, a ilościowa i obiektywna analiza bez wątpienia stawiają tę metodę na pierwszym miejscu wśród innych technik określania oporności osmotycznej, w laboratoriach dysponujących analizatorem mogącym zliczać komórki w czasie. Jest to jednak metoda, która wymaga dalszej weryfikacji w trakcie kolejnych badań klinicznych [18, 19, 20]. Microfluidic Platform Pojawienie się po raz pierwszy projektu microfluidic platform (co miało miejsce w 1970 roku) skłoniło naukowców do szerszego spojrzenia na problem wielu zagadnień biomedycznych, w tym również oporności osmotycznej [20]. Chip, będący podstawowym elementem pomiarowym platformy, jest zbudowany z mikrokanału wykonanego z polidimetylosiloksanu (DPMS) uszczelnionego szklaną przykrywką. System ten umożliwia wykonanie badania z wykorzystaniem tylko kilku mikrolitrów pobranego materiału, a czas pojedynczej analizy to zaledwie kilka minut. Stosunkowo niski koszt oraz mobilność przenośnego chipu to dodatkowe zalety tej metody. Ogromne znaczenie platformy ma jej biokompatybilność, optyczna transparentność, znikoma toksyczność oraz niski koszt produkcji [20]. DPMS jest to polimer, którego główny łańcuch zbudowany jest z połączonych na przemian atomów tlenu oraz krzemu, przy czym większość atomów krzemu jest podstawionych grupami metylowymi. Jest to polimer silnie hydrofobowy, przepuszczalny dla gazów, przezroczysty. Znajduje szerokie zastosowanie w dziedzinie nauk biologiczno-medycznych oraz fizycznych, a w ostatnich latach jest coraz częściej wykorzystywany do produkcji mikrosystemów chemicznych (tzw. Lab-On-a-Chip) [21]. Istotnym elementem platformy są również dwie strzykawki pełniące funkcję pomp aplikujących próbkę krwi oraz czystą wodę. Materiałem wykorzystywanym w badaniu jest świeża krew rozcieńczona w stosunku 1:10 roztworem NaCl w różnym stężeniu. Roztwory te są tworzone na pojedynczym chipie. Różne poziomy hemolizy (brak, częściowa hemoliza oraz całkowita hemoliza) są określane dzięki możliwości komputerowego przetwarzania obrazu oraz liczenia komórek, które mogą być obserwowane bezpośrednio pod mikroskopem. Wyniki analizy są zapisywane i automatycznie analizowane przez komputer. Możliwość oszacowania stopnia hemolizy na podstawie porównania liczby komórek w obrazach za pomocą programu komputerowego, prostota oraz szybkość wykonywanych oznaczeń dają szansę na wykorzystanie tej metody w przyszłej diagnostyce zaburzeń czerwonokrwinkowych [21, 22]. Podsumowanie Wiele prac naukowych ostatnich lat skupiało się na udoskonaleniu tradycyjnej techniki oceny oporności osmotycznej. Dzięki tym osiągnięciom możliwe, iż test ten ponownie zyska na swoim znaczeniu, a dzięki łatwości w wykonaniu oraz swej dostępności powróci do rutynowej diagnostyki przesiewowej zaburzeń czerwonokrwinkowych, w tym sferocytozy wrodzonej. Zmniejszenie minimalnej objętości materiału wymaganego do przeprowadzenia badania to milowy krok w kierunku udoskonalenia diagnostyki najmłodszych pacjentów. Piśmiennictwo 1. Walski T, Chludzińska L, Komorowska M. Individual Osmotic Fragility Distribution: A New Parameter for Determination of the Osmotic Properties of Human Red Blood Cell. BioMed Res Int 2014; 2014: Sowemimo-Coker SO. Red blood cell hemolysis during processing. Transfus Med Rev 2002; 16 (1): Pribush A, Hatskeleton L, Kapelushnik J. Osmotic swelling and whole formation in membranes of thalassemic and spherocytic erythrocytes. Blood Cells Mol Dis 2003; 31: Gmerek K, Fabijańska-Mitek J, Łoniewska-Lwowska A. Impact of red blood cell storage under the blood bank conditions on their reactivity with autoantibodies. Centr Eur J Immunol 2012; 37: Manhanda N. Anemias red blood cells morphology and approach to diagnosis; w Keohane EM, Smith LJ, Walenga FM. Rodak s Hematology: clinical principles and applications. Wyd. Elsevier Health Sciences, St. Louis, 2007:

5 Diagn Lab 2015; 51(3): Paleari R, Mosca A. Controversies on the osmotic fragility test, Enerca (The European network aimed at improving he diagnosis, epidemiological knowledge and medical education on rare and congenital anaemia), News (2008): Adamowicz-Salach A. Sferocytoza wrodzona u dzieci badania disgnostyczne i postępowanie terapeutyczne. Borgis Postępy Nauk medycznych 2013; 9: Fathelrahman M H, Altrasheedy Y. K. Validation of Osmotic Fragility Test Using a modified new Garden Angelica Reagent in Healthy Individuals Blood, Saudia Arabia. Asian Journal of Biomedical and pharmaceutical sciences 2012; 2: Żarlak W, Adamowicz-Salach A, Ciepiela O. Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej. Diagn Lab 2012; 48: Bolton-Mags P. H. B, Langer J. C, Iolascon A. Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocitosis-2011 update. Br J Haematol 2011; 156: Bianchi P, Fermo E, Vercellati C. Diagnostic Power of laboratory tests for hereditary spherocytosis: a comparison study in 150 patients grouped according to molecular and clinical characteristics. Haematologica 2012; 97 (4): Sank Hyuk P, Chan-Jeoung P, Bo-Ra L. Comparison Study of the Eosin-5 -Maleimide Binding Test, Flow cytometric Osmotic Fragility Test and Cryohemolysis Test in the Diagnosis of Hereditary Spherocytosis. Am J Clin Pathol 2014; 142: Christensen RD, Henry E. Hereditary Spherocytosis in Neonates with hyperbilirubinemia. Pediatrics 2010; 126: Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis test: a screening for hereditary spherocytosis. Br J Haematol 1980; 45: Perrota S, Gllagher PG, Mohandas N. Hereditary spherocytosis. The Lancet 2008; 372: Vettore L, Zanella A, Molaro GL. A new test for the laboratory diagnosis of spherocytosis. Acta Haemat 1984; 72: Sureda Balari A, Villarrubia Espinosa J, Fernandez Fuertes I. A New Madification of the Pink Test for the Diagnosis of Hereditary. Acta Hemat 1989; 82: Warang P, Gupta M, Kedar P. Flow Cytometric Osmotic Fragility An effective screening approach for red cell membranopathies. Cytometry 2011; 80 (B): Won DI, Suh JS. Flow cytometric detection of erythrocyte osmotic fragility. Cytometry 2009; 76 (B): Hara Prasad P, Sonal J. Flow Cytometry in Hematological Disorders; Indian J Pediatr 2013; 80: Lei L, Jing S, Jing L. A microfluidic platform for osmotic fragility test of red blood cells. RSC Advances 2012; 2: Cooper McDonald J, Duffy D. C, Anderson J.R. Fabrication of microfluidic systems in poly (dimethylsiloxane). Electrophoresis 2000; 21: Adres do korespondencji: dr n. med. Olga Ciepiela Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego Warszawski Uniwersytet Medyczny Warszawa, ul. Żwirki i Wigury 63a Tel olga.ciepiela@wum.edu.pl Zaakceptowano do druku:

6 234