Oznaczanie RNA w materiale roślinnym

Transkrypt

1 znaczanie RA w materiale roślinnym Prowadzący: mgr inż. Sebastian Derfla pracował: mgr inż. Sebastian Derfla

2 Celem ćwiczenia jest poznanie metody ekstrakcji, oczyszczania i spektrofotometrycznego oznaczania całkowitej zawartości kwasów rybonukleinowych w materiale roślinnym. Wprowadzenie Kwasy nukleinowe Kwasy te są podstawowymi składnikami komórek wszystkich organizmów żywych. W komórkach eukariotycznych wysterują głównie w jądrze komórkowym, a w mniejszych ilościach w cytoplazmie, mitochondriach i chloroplastach. Cegiełkami budulcowymi kwasów nukleinowych są nukleotydy powiązane między sobą wiązaniem fosfodiestrowym (3 5 ). ukleotydy składają się z zasady organicznej purynowej lub pirymidynowej, cukrowca pentozy i reszty kwasu fosforowego. Zależnie od rodzaju od rodzaju pentozy wyróżnia się kwasy deoksyrybonukleinowe (DA), zawierające β-d-deoksyrybozę, i rybonukleinowe (RA), zawierające β-drybozę. Głównymi zasadami purynowymi w DA i RA są adenina (A) i guanina (G), a pirymidynowymi cytozyna (C) w DA i RA są tymina (T) w DAi uracyl (U) w RA. Zasady azotowe są aromatyczne, heterocykliczne i połączonez C-1 cukrowca przez -9 puryn lub -1 pirymidyn. Grupy fosforanowe mogą być przyłączone do C-2 (w rybozie), C-3 lub C-5 (w deoksyrybozie i rybozie), tworząc odpowiednio 2 -,3 - i 5 -nukleotydy. W komórkach w znacznych ilościach wystepują tylko 5 -nukleotydy, gdyż reakcje zarówno syntezy, jak i hydrolizy kwasów nukleinowych przebiegają z ich udziałem. Cząsteczki RA zbudowane są z jednej nici, aczkolwiek zawierają rejony komplementarne typu spinki do włosów (w tra około50% zasad jest sparowanych w ten sposób). Rola większości kwasów rybonukleinowych w komórce wiąże się z procesem syntezy białka zwanym translacją. W translacji uczestniczą trzy rodzaje kwasów nukleinowych: Informacyjny RA (mra) w procesie transkrypcji na mra przenoszona jest informacja z DA w postaci kolejnych trójek nukletydów (kodonów) specyfikujących określone aminokwasy i tym samym sekwencję tych aminokwasów w białkach, Transportujący (transferowy) RA (tra) uczestniczący w aktywacji i nanoszeniu aminikwasów na rybosom, pełni też funkcję adaptorową, gdyż za pośrednictwem antykodonu łączy się z odpowiednim kodonem mra, Rybosomowy RA (rra) składnik rybosomów, pełniący funkcję strukturalną i katalityczną w procesie translacji. W jądrze i cytoplazmie komórek eukariotycznych występuje wiele niskocząsteczkowych RA, określanych jako snra (small nuclear RAs) i scra ( small cytoplasmatic RAs). iskocząsteczkowy snra jest składnikiem małych jądrowych rybonukleoprotein (snrp), które z kolei tworzą kompleksy, tzw. sliceosomy z prekursorowym RA (pre-mra). W spliceosomach odbywa się splicing (czyt. slajsing), czyli jeden z etapów przekształcania pre-mra w mra (tzw. dojrzewania). Splicing polega na rozcięciu pre-mra, usuwaniu intronów (sekwencje niekodujące) i łączeniu eksonów (sekwencje kodujące). Funkcję katalityczną pełni tu RA, a nie białko. Innym przykładem katalitycznego działania RA jest wykryty u pierwotniaka Tetrahymena thermophila RA L-19, uczestniczący w tzw. splicingu autokatalitycznym rra. Jest on zbudowany z 395 nukleotydów,

3 wykazuje aktywność nukleozową i polimerazową, jako kofaktory prawdopodobnie wykorzystuje guanozynę i jony metali; zachowuje się zatem jak prawdziwy enzym. Podobnie w rybonukleazie P (nukleoproteina) uczestniczącej w dojrzewaniu tra funkcję katalityczną pełni RA, gdyż rozpoznaje miejsce w transkrypcie mające ulec rozszczepieniu i rozcina je, a białko tylko zwiększa szybkość reakcji. Dla odróżnienia od białkowych katalizatorów enzymów, kwasy rybonukleinowe wykazujące zdolność katalityczną nazwano rybozymami. Cytoplazmatyczny, niskocząsteczkowy RA scra uczestniczy w kierowaniu nowoutworzonych białek do określonych przedziałów komórkowych lub na zewnątrz komórki. Polimeraza RA II zlokalizowana w nukleoplazmie transkrybuje geny kodujące białko (katalizuje syntezę pre-mra) i wiekszość genów kodujących snra. Wszystkie produkty tego enzymu nazywa się heterogennym jądrowym RA (hnra), a te transkryptory, które po procesie dojrzewania staną się cząsteczkami mra, nazywa się pre-mra. Wytworzony mra przenoszony jest do cytoplazmy i tworzy kompleksy z białkami, co przypuszczalnie stanowi dodatkową ochronę (poza kapem i ogonem poli A) przed nukleazami. Białka te odłączane są przed przyłączeniem mra do rybosomu. Informacyjny RA wykazuje znaczne zróżnicowanie pod względem masy cząsteczkowej i trwałości. Półokres życia tego kwasu może wynosić od kilku minut do wielu godzin. W nasionach roślin występuje tak zwany długowieczny mra, który wykorzystywany jest w początkowym okresie kiełkowania. Polimeraza RA III zlokalizowana w nukleoplazmie transkrybuje między innymi geny kodujące tra. Wytwarzane są duże cząsteczki pre-tra, z których przy udziale rybonukleazy P i rybonukleazy D powstają dojrzałe cząsteczki tra, zawierające od 73 do 93 rybonukleotydów o masie cząsteczkowej około 25 kda. Cechą wyróżniającą tra od innych RA jest występowanie, oprócz A, U, G i C, innych zasad, takich jak:hipoksantyna (nukleozyd inozyna), pseudouracyl, dihydrouracyl oraz pochodnych guaniny, hipoksantyny i cytozyny. Te nietypowe zasady powstają podczas dojrzewania tra. Proces ten obejmuje również przyłączenie trójki nukleotydów (CCA) do końca 3, gdzie wiązany jest aminokwas, oraz wytworzenie charakterystycznej struktury wtórnej. U roślin wykrytoi scharakteryzowano 110 rodzajów tra, z których połowa występuje w cytoplazmie, a reszta w chloroplastach i mitichondriach. Dla każdego z 20 aminokwasów białkowych istnieje co najmniej jeden tra, a dla niektórych kilka różnych. Rybosomowy RA syntetyzowany jest głównie z udziałem polimerazy I zlokalizowanej w jąderku. Powstaje duża (45S) cząsteczka pre-tra i w nastepstwie specyficznych cięć enzymatycznych tworzą się z niej cząsteczki składowe zbudowane z białka i rra podjednostek rybosomów. Wiele swoistych metylacji ryboz, przebiegajacych w czasie dojrzewania pre-rra, odbywa się dzięki oddziaływaniom z małymi jądrowymi cząstkami rybonukleoproteinowymi (snra). Występujące tutaj snra często określa się jako małe jąderkowe RA (snora). U roślin rra charakteryzuje się znaczną zawartością zasad zmetylowanych i przewagą par zasad G + C nad A + U. Jest to najobficiej reprezentowany rodzaj kwasów rybonukleinowych, gdyż stanowi około 80% całej puli RA w komórce, podczas gdy tra około 15%, a mra około 5%. Zawartość RA w komórce roślinnej zmienia się w zależności od rodzaju tkanki i jej stadium rozwojowego. W dojrzałych liściach całkowite stężenie RA wynosi 0,1-0,2% św.m. W liściach i korzeniach starzejących się czy poddanych głodzeniu stężenie to ulega wyraźnemu obniżeniu.

4 Badanie kwasów rybonukleinowych W komórce RA zwykle połączone jest z białkami, które można odłączyć przez działanie detergentami, chlorkiem guanidyny lub proteazami. aturalne mieszniny RA można rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej, sączenia molekularnego w żelach, wirowania w gradiencie sacharozy. Do wyodrębnienia mra z materiału biologicznego wykorzystuje się chromatografię powinowactwa w agarozie lub celulozie z kowalencyjnie związanym poli(u), który wiąże się komplementarnie z ogonem poli(a) mra. Zabieg przeprowadza się w niskiej temperaturze i przy wysokim stężeniu soli, zmieniając warunki można odzyskać mra. Badanie składników RA możne przeprowadzać na preparatach nie hydrolizowanych, wykonując reakcje barwne, na przykład reakcję Biala na rybozę, lub badając składniki po hydrolizie. Hydroliza enzymatyczna polega na kolejnym dzieleniu specyficznymi enzymami, to jest nukleazami (otrzymuję się nukleotydy), nukleotydazą (nukleozydy +Pn) i nukleozydazą (trzymuje się zasady organiczne i rybozę). RA i DA znacznie różnią się wrażliwością na działanie czynników chemicznych (kwasy, zasady) i fizycznych (temperatura). DA ulegają całkowitej hydrolizie dopiero pod działaniem stężonych kwasów i w podwyższonej temperaturze, na przykład w 12 M kwasie nadchlorowym, w czasie jednej godziny, w temperaturze 100ºC. atomiast hydroliza RA jest łatwiejsza do przeprowadzenia, bo już w wyniku działania 1 M kwasu solnego (1 godzina, 100ºC), uwalniane są zasady purynowe (adenina i guanina), fosforany rybozy oraz nukleotydy pirymidynowe (cytydyno-3 -fosforan i urydyno-3 -fosforan). Wiązania -glikozydowe w nukleotydach pirymidynowych są znacznie trwalsze od tych w nukleotydach purynowych i zasady można z nich uwolnić dopiero w 12 M kwasie nadchlorowym. grzewanie RA w 0,5 M wodorotlenku potasu (40ºC) powoduje jego hydrolizę do 2 -, 3 -cyklicznych diestrów mononukleotydów (nie powstają one z DA, który nie ma grup 2 -hydroksylowych). Dalsze ogrzewanie (do 1 godziny, 40ºC) prowadzi do utworzenia w przybliżeniu równych ilości rozpuszczalnych soli potasowych izomerów 2 - i 3 -nukleotydów AMP, GMP, CMP, i UMP (rys.1), których ilość można oznaczyć spektrofotometrycznie. Produkty hydrolizy kwasów nukleinowych można rozdzielić metodami chromatografii bibułowej, HPLC w odwróconej fazie i jonowymiennej lub elektroforenezy, a następnie oznaczać. I tak na przykład, oglądając chromatogram w świetle nadfioletowym ( nm), można wykrywać i identyfikować nukleotydy, nukleozydy oraz zasady purynowe i pirymidynowe, gdyż związki te wygaszając (pochłaniając) promieniowanie, widoczne są jako ciemne plamy na tle jasno fluoryzującej bibuły. a ćwiczeniach do oznaczania RA będzie wykorzystana adaptowana do materiału roslinnego i uproszczona procedura Schmidta i Thannhausera. Polega ona na usunięciu z materiału barwników, lipidów, białek, wolnych nukleotydów i DA. Pozostałe RA hydrolizuje się poprzez łagodne ogrzewanie w roztworze wodorotlenku potasu i powstające 2 - i 3 -mononukleotydy oznacza się spektrofotometrycznie. Wykazują one maksymalną absorbancję przy około 260 nm (rys. 2). Ponadto mierzy się absorbancję roztworu przy 300 nm w celu wprowadzenia poprawki wynikającej z obecnością innych związków pochłaniających

5 promieniowanie o tej długości fali. Wielkość absorbancji przy 300 nm jest wskaźnikiem poprawności wykonania procedury oczyszczania RA. H H H 2 H 5 ' CH 2 H 5 ' CH 2 4 ' 1 ' 4 ' 1 ' H H H H 3 ' 2 ' H P H H H H 3 ' 2 ' P H H 2 H 2 H 5 ' CH 2 H 5 ' CH 2 4 ' 1 ' 4 ' 1 ' H H H H 3 ' 2 ' H P H H H H 3 ' 2 ' P H Rysunek 1. Wzory niektórych 2 - i 3 -nukleotydów powstających w wyniku łagodnej hydrolizy RA

6 Rysunek 2. Widmo absorpcyjne oczyszczonego RA z liścieni grochu dczynniki i materiały (1) 95-procentowy etanol (może być skażony 2-procentowym acetonem). (2) 80-procentowy etanol. (3) Eter naftowy. (4) 0,2 M kwas nadchlorowy (schłodzony). (5) 1,0 M kwas nadchlorowy (schłodzony, 111ml 60-procentowego do 1000ml). (6) 0,5 M wodorotlenek potasu. (7) 8-10-dniowe siewki (pszenica, pszenżyto). Szkło i inne wyposażenie Kolba stożkowa o pojemności 250 ml, moździerz z tłuczkiem, pęseta, lejek szklany z korkiem gumowym, pompa wodna (2 na grupę), kolby ssawkowe z probówką, probówka wirówkowa o pojemności 20 ml z zamknięciem, termometr, cylinder o pojemności 10 ml, pipety, lód, łaźnia elektryczna (100ºC), folia aluminiowa, łaźnia o temperaturze 40ºC, spektrofotometr, kuwety kwarcowe, twarde sączki z bibuły o średnicy około 9 cm.

7 Wykonanie trzymywanie oczyszczonych nukleotydów Etap Sposób wykonania Uzyskany efekt I aważkę 300 mg liści pociąć na 2-3 milimetrowe fragmenty. Kolbę stożkową o pojemności 250 ml zawierającą 100 ml 80-procentowego etanolu przykryć folią aluminiową. Wstawić do wrzącej elektrycznej łaźni Usunięcie większości wodnej i gdy alkohol zacznie wrzeć, stopniowo chlorofilu, lipidów, wolnych dodawać za pomocą pęsety pocięte liście w takim puryn i nukleotydów. tempie, aby alkohol ciągle wrzał. Kolbę przykryć folią i ogrzewać przez dalsze 4 minuty. ie dopuścić do znacznego odparowania alkoholu! II Zawartość kolby schłodzić pod bieżącą wodą, zdekantować alkoholowy roztwór i odrzucić. Pozostałość przenieść do moździerza i dokładnie rozetrzeć, dodać 5 ml 95-procentowego etanolu i dalej rozcierać. Zawiesinę przenieść na lejek szklany z sączkiem z bibuły (nie karbowany) i odsączyć alkohol pod słabą próżnią. Moździerz przepłukać 10 ml 95- procentowego etanolu i roztwór przenieść na sączek. sad na sączku przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) eterem naftowym i odsączyć przy słabym podciśnieniu III sad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) schłodzonym 0,2 M kwasem nadchlorowym. W celu usunięcia kwasu osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) 95-procentowym etanolem. IV Po osączeniu etanolu wyjąć sączek z osadem, zwinąć, włożyć do probówki wirówkowej, dodać 5 ml 0,5 M wodorotlenku potasu i całkowicie zanurzyć sączek w roztworze. Probówkę zamknąć i wstawić na 1 godzinę do łaźni wodnej o temperaturze 40ºC. V Probówkę chłodzić przez 10 minut w wodzie z lodem (mieszając zawartość bagietką), a następnie dodać 5 ml schłodzonego 1M kwasu nadchlorkowego (temperatura około 0ºC zapobiega hydrolizie DA) i łagodnie wymieszać bagietką. Przetrzymać probówkę 15 minut w wodzie z lodem. VI Całość wirować 7 minut w wirówce z chłodzeniem przy g (12 000obr. min -1, K 24), supernatant ostrożnie zdekantować do cylinderka o pojemności 10 ml. Usunięcie chlorofilu, lipidów, karetenoidów. Usunięcie rozpuszczalnych nukleotydów oraz kwasu nadchlorkowego. Hydroliza RA do 2 - i do 3 -mononukleotydów, rozpuszczenie ścian komórkowych, białek i DA. Powstanie osadu; nadchloranu potasu, DA, białka, ścian komórkowych. Uzyskanie roztworu oczyszczonych 2 - i 3 nukleotydów.

8 znaczanie ilości nukleotydów Do probówki odmierzyć 1 ml roztworu nukleotydów RA, dodać 3 ml wody, wymieszać i przenieść do kuwety kwarcowej. Absorbancję zmierzyć przy 260 i 300 nm w spektrofotometrze wyzerowanym na wodę. pracowywanie wyników bliczyć całkowitą ilość RA w materiale wziętym do ekstrakcji, posługując się równaniem: mg RA = 0,031 (A 260 A 300 )(rozcieńczenie ml RA) gdzie: 0,031 średnia wartość absorbancji dla nukleotydów występujących w RA, A 260, A 300 zmierzone wartości przy 260 i 300 nm, rozcieńczenie w tym przypadku 4 (1ml +3 ml wody), ml RA 10 ml. Wyrazić w procentach (w/w) zawartość RA w badanym materiale.