Biotechnika rozrodu ryb jesiotrowatych. Dr inż. Dorota Fopp-Bayat Katedra Ichtiologii UW-M w Olsztynie

Transkrypt

1 Biotechnika rozrodu ryb jesiotrowatych Dr inż. Dorota Fopp-Bayat Katedra Ichtiologii UW-M w Olsztynie

2 Stanowisko systematyczne (Nelson 1994) gromada: ACTINOPTERYGII RYBY PROMIENIOPŁETWE podgromada: CHONDROSTEI GANOIDY CHRZĘSTNE rząd: ACIPENSERIFORMES JESIOTROKSZTAŁTNE rodzina: Acipenseridae jesiotrowate rodzaj: Huso Bieługi rodzaj: Acipenser Jesiotry rodzaj: Scaphirhynchus - Łopatonosy rodzaj: Pseudoscaphirhynchus Pseudołopatonosy rodzina: Polyodontidae wiosłonosowate rodzaj: Polyodon rodzaj: Psephurus

3 Przedstawiciele ryb jesiotrokształtnych jesiotr zachodni (Acipenser sturio) sterlet (Acipenser ruthenus) wiosłonos (Polyodon spathula)

4 Import ryb jesiotrowatych do Polski

5 Lp Gatunek / mieszaniec Różnorodność gatunków i hybrydów ryb jesiotrowatych hodowanych w Polsce Nazwa łacińska 1 jesiotr syberyjski Acipenser baerii SB 2 jesiotr rosyjski Acipenser gueldenstaedti R 3 sterlet Acipenser ruthenus S 4 siewruga Acipenser stellatus SW Symbol 5 jesiotr syberyjski x jesiotr rosyjski 6 bester (bieługa x sterlet) Acipenser baerii x Acipenser gueldenstaedti Huso huso x Acipenser ruthenus 7 bieługa x bester (Huso huso) x (Huso huso x Acipenser ruthenus) SB x R BS B. BS 8 jesiotr syberyjski x jesiotr zielony Acipenser stenorrhynchus x Acipenser medirostris 9 wiosłonos Polyodon spathula W SB x Z

6 Dojrzewanie płciowe jesiotrów W warunkach naturalnych ryby jesiotrowate osiągają dojrzałość płciową w wieku lat, przy czym samce dojrzewają o 2-3 lata wcześniej. Wyjątek stanowią sterlety, które dojrzałość płciową osiągają już po 5-8 latach. Po osiągnięciu dojrzałości płciowej większość gatunków ryb jesiotrowatych przystępuje do tarła co 3-5 lat. Jedynie sterlety mogą odbywać tarło corocznie.

7 Stadium dojrzałości płciowej samców Fot. Paweł Woźnicki

8 Stadium dojrzałości płciowej samic Fot. Paweł Woźnicki

9 Do owulacji u samic i spermiacji u samców niezbędna jest stymulacja środowiskowa i hormonalna

10 Stymulacja środowiskowa temperatura wody od 12 do 16 o C wzrost intensywności przepływu wody Fot. Dorota Fopp-Bayat

11 Stymulacja hormonalna Iniekcje z wyciągu odwodnionej w acetonie przysadki mózgowej dojrzałych jesiotrów lub ryb karpiowatych w ilości od 2 do 8 mg/kg masy ciała samicy (w zależności od stadium dojrzałości gonad i aktywności przysadki (Barannikova i in. 1983, 1993) Ovopel 1 granulka na 1 kg masy ciała samca Syntetyczne analogi LH-RH i GnRH w dawkach od 0,1 do 0,25 μg/kg masy ciała (Doroshov i Lutes 1984)

12 Efektywność stymulacji hormonalnej ESH jest uzależniona od stadium dojrzałości oocytów, który ocenia się na podstawie stopnia polaryzacji jąder komórkowych oocytów pobranych przyżyciowo z gonady samicy

13 Fot. Paweł Woźnicki

14 Osobnik jesiotra syberyjskiego gotowy do tarła Fot. Dorota Fopp-Bayat

15 Anestezja przed pobieraniem produktów płciowych Fot. Dorota Fopp-Bayat

16 Uśpiony samiec przygotowany do pobrania mlecza Fot. Dorota Fopp-Bayat

17 Uśpiona samica przygotowana do pobrania ikry Fot. Dorota Fopp-Bayat

18 Pobieranie mlecza od sterleta Fot. Dorota Fopp-Bayat

19 Pobieranie mlecza od jesiotra syberyjskiego Fot. Dorota Fopp-Bayat

20 Nacinanie jajowodów w celu pozyskania ikry Fot. Dorota Fopp-Bayat

21 Pobieranie ikry od jesiotra syberyjskiego Fot. Dorota Fopp-Bayat

22 Pobieranie ikry od sterleta Fot. Dorota Fopp-Bayat

23 Pobrana ikra przygotowana do zaplemnienia Fot. Dorota Fopp-Bayat

24 Odklejanie ikry Roztwór mleka Roztwór taniny dwukrotne przepłukanie ikry za pomocą roztworu taniny o stężeniu 0,3 g/l. Czas trwania kąpieli wynosi ok. 30 s, po czym ikrę należy przepłukać w wodzie (Kolman i Szczepkowski 2005)

25 Zapłodniona i odklejona ikra przygotowana do inkubacji Fot. Dorota Fopp-Bayat

26 Odpijanie tarlaków Fot. Dorota Fopp-Bayat

27 Inkubacja ikry w typowych aparatach Weissa Fot. Dorota Fopp-Bayat

28 Inkubacja ikry Fot. Dorota Fopp-Bayat

29 Pierwsze podziały komórkowe Fot. Dorota Fopp-Bayat

30 Informacje na temat rozrodu ryb jesiotrowatych opracowano w oparciu o Poradnik hodowcy JESIOTRY chów i hodowla. Ryszard Kolman 2006.

31 Szacowanie zmienności genetycznej ryb jesiotrowatych przy zastosowaniu markerów genetycznych Dr inż. Dorota Fopp-Bayat Katedra Ichtiologii UW-M w Olsztynie

32 Zachowanie zmienności genetycznej stad rozrodczych jest kluczowym działaniem w pracach hodowlanych

33 Zastosowania technik molekularnych w badaniach ichtiologicznych mają stosunkowo krótką historię. lata 70-te rozwinięcie technik elektroforetycznego badania białek lata 80-te rozkwit bezpośrednich badań genomu (mitochondrialny DNA, mt DNA) lata 90-te analizy jądrowego DNA (ndna)

34 Łańcuchowa Reakcja Polimerazy (Polimerase Chain Reaction) PCR W połowie lat 80 opracowano technikę, służącą do amplifikacji (powielania) dowolnej sekwencji DNA z użyciem pary oligonukleotydowych starterów oraz termostabilnej polimerazy DNA.

35 Łańcuchowa Reakcja Polimerazy (Polimerase Chain Reaction) PCR Denaturacja nici DNA w temp. 95oC Przyłączanie starterów reakcji PCR do matrycy w 55oC Polimeryzacja nici DNA w temp. 72oC

36 Analiza mikrosatelitarnego DNA 5 ATGGTGTAGCTAAAC ATTAT TATTATT (ATT) 25 ACCTTGATCCTT 3 Sekwencje starterów reakcji PCR Sekwencja powtarzająca się

37 Metody wizualizacji fragmentów mikrosatelitarnego DNA: Elektroforeza agarozowa i wybarwianie bromkiem etydyny. Elektroforeza poliakrylamidowa i wybarwianie azotanem srebra lub przy pomocy radioizotopów. Elektroforeza kapilarna i wybarwianie fluorescencyjne.

38 Sprzęt podstawowy 1. Aparat do elektroforezy 2. Obudowa 3. Przewody elektryczne 4. Forma do żelu 5. Grzebień 6. Zasilacz pipety, probówki eppendorf, mikrofalówka Elektroforeza agarozowa Odczynniki 1. Agaroza 2. Bufor TBE lub TAE 3. Bromek etydyny 4. Marker (wzorzec molekularny)

39 Przygotowanie żelu agarozowego Dodanie bromku etydyny i umieszczenie żelu w formie z grzebieniem Nakładanie prób i wzorca masowego Elektroforeza

40 Bromek etydyny Wizualizacja żelu w świetle UV

41 0 Schemat postępowania podczas analizy mikrosatelitarnego DNA Pobieranie prób Izolacja DNA PCR 0,7 0,6 Analiza danych 0,7 0,6 Elektroforeza i wizualizacja w żelu poliakrylamidowym Określenie zmienności genetycznej frekwencja alleli frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0, długość allelu (pz) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, długość allelu (pz) frekwencja alleli frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0, długość allelu (pz) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, długość allelu (pz)

42 Analiza mikrosatelitarnych loci wybranych gatunków i hybrydów ryb jesiotrowatych Prążki DNA zidentyfikowane jako allele w locus ls-68: M - marker Øx174, jesiotr syberyjski (SB.L) ścieżki 9 18, 21, 26, jesiotr syberyjski x jesiotr rosyjski (SB. L x R) ścieżki 1-7, 20, jesiotr rosyjski (R) - ścieżka 24, bester (BS) - ścieżka 8, bieługa x bester (BBS) - ścieżki 19, 23, 25, 27, jesiotr syberyjski x jesiotr zielony (SB.L x Z) - ścieżka 22.

43 Frekwencja alleli w locus ls-68 0,7 0,7 0,6 0,6 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, długość allelu (pz) długość allelu (pz) jesiotr rosyjski jesiotr syberyjski 0,7 0,7 0,6 0,6 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, długość allelu (pz) długość allelu (pz) sterlet wiosłonos

44 Obliczanie hetrozygotyczności obserwowanej i oczekiwanej Population Sample size Number of alleleles Volga Observed heterozygosity (H o ) Expected heterozygosity (H e ) 0,66 0,69 Kama ,68 0,80 Dnieper ,63 0,72 Dniester 5 4,50 Danube ,67 0,65 0,70 0,75

45 Analiza wariancji Locus F IS F IT F ST Afu- 68 Afu- 19 Afu- 39 Aox (0.110) (0.052) (0.101) (0.033) (0.133) (0.063) (0.134) (0.090) (0.041) (0.013) (0.040) (0.057)

46 Analiza pokrewieństw filogenetycznych

47 Zastosowanie analiz genetycznych do identyfikacji osobników ryb jesiotrowatych po manipulacjach genomowych określenie ploidalności w grupach doświadczalnych metoda cytogenetyczna, identyfikacja matczynego genomu u potomstwa przy zastosowaniu analizy polimorfizmu mikrosatelitarnego DNA.

48 Prążki mikrosatelitarnego DNA w locus Afu-68 u gynogenetycznego potomstwa jesiotra syberyjskiego (Acipenser baeri); (Fopp-Bayat i inni 2006).

49 Prążki mikrosatelitarnego DNA w locus Afu-68 u diploidalnego i triploidalnego potomstwa jesiotra syberyjskiego (Acipenser baeri); Fopp-Bayat i inni 2006.

50 Dziękuje za uwagę.