WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS DO OZNACZANIA SŁODZIKÓW W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH

Transkrypt

1 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS DO OZNACZANIA SŁODZIKÓW W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH Agata Kot-Wasik, Andrzej Wasik, Jacek Namieśnik Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

2 Cukier... wielu z nas nie potrafi bez niego żyć. Spożycie cukru w Polsce na tle krajów Unii Europejskiej jest wysokie. Według FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) wynosi ono 42 kg/mieszkańca w 2005 roku. Są jednak tacy, którzy muszą sobie bez niego radzić. Dla nich stworzono zastępcze substancje słodzące. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

3 REGLAMENTACJA CUKRU Niemiecka kartka żywnościowa (III Rzesza) Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

4 REGLAMENTACJA CUKRU Pierwsza gierkowska kartka na cukier 1982 rok 1976 rok Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

5 Słodziki stosowane określenia słodziki niskokaloryczne ang. low-calorie sweeteners słodziki bez wartości odżywczej ang. no-calorie sweeteners słodziki intensywne ang. intensive sweeteners słodziki o wysokiej intensywności ang. high intensity sweeteners słodziki o wysokiej mocy ang. high intensity sweeteners słodziki alternatywne ang. alternative sweeteners Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

6 SŁODZIKI CO TO TAKIEGO? Pojęcie SŁODZIK obejmuje zarówno substancje słodzące pochodzenia naturalnego, jak i syntetyczne związki, charakteryzujące się intensywnym słodkim smakiem. Słodziki zapewniają słodki smak bez dostarczania energii (kalorii) lub z bardzo małą ich ilością. Większość z nich nie jest trawiona przez organizm i dlatego nie dostarczają kalorii. Wyjątkiem jest ASPARTAM, który podlega naturalnym procesom metabolizmu Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

7 TROCHE HISTORII Historia powstania słodzików sięga czasów starożytnego Rzymu. SAPA pierwszy sztuczny słodzik (gęsty syrop) otrzymał go PLINIUSZ STARSZY (I w.n.e) przez gotowanie wina (głównie z winorośli). Wykorzystywano naczynia z ołowiu, co powodowało powstawanie soli ołowiu (w reakcji z kwasami) ZWIĄZKI TE CHARAKTERYZUJĄ SIĘ SŁODKIM SMAKIEM. Podejrzewano, że są one szkodliwe ale nadal produkowane SAPĘ. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

8 syntetyczne acesulfam alitam aspartam cyklamat neotam sacharyna sukraloza o wysokiej mocy półsyntetyczne neohesperydyna dihydrochalkon Słodziki naturalne kaloryczne glycyryzyna stewiozyd taunatyna sacharoza melasa miód i cukier klonowy otrzymywane ze skrobi glukoza fruktoza o małej słodkości lecz o dużej masie niskokaloryczne cukry alkohole monosacharydy disacharydy erytriol mannitol sorbitol ksylitol izomalt laktitol maltitol hydrolizaty skrobi tagatoza Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

9 KLASYFIKACJA SŁODZIKÓW ZE WZGLĘDU NA INTENSYWNOŚĆ SŁODZKIEGO SMAKU naturalne cukrowce, półsyntetyczne środki słodzące (polialkohole mniej słodkie od sacharozy), środki intensywnie słodzące (słodsze od sacharozy naturalne i syntetyczne). Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

10 NAJBARDZIEJ POPULARNE SUBSTANCJE SŁODZĄCE ACESULFAM-K ALITAM ASPARTAM CYKLAMINIAN-Na DULCYNA NEOHESPERYDYNA NEOTAM SACHARYNA SUKRALOZA Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

11 WSPÓŁCZYNNIKI SŁODKOŚCI SŁODZIKÓW Klasa związku PROTEINY (białka) (Di)PEPTYDY Słodzik Taumatyna, brazzein, kurkulin, etc. Aspartam, alitam, neotam Intensywność słodzenia w stosunku do sacharozy (cukru) POLIOLE (alkohole cukrowe) SIARCZANY Sorbitol, mannitol, ksylitol, isomalt, etc. Cyklamat-Na, acesulfam-k, saccharyna GLIKOZYDY Neohesperydyna dihydrochalkon, glycyrrhizin, stewiozyd, rebaudiozyd WĘGLOWODAN Sukraloza 500 Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

12 SŁODZIKI DODATKI DO RÓŻNYCH PRODUKTÓW produkcja słodyczy, pieczywo cukiernicze, produkty mleczarskie, mrożone desery żywność dietetyczna, guma do żucia (dzięki nim gumy do żucia dają wrażenie świeżości i ( ochłodzenia napoje gazowane, płatki śniadaniowe, przetwory owocowe i warzywne, dżemy o obniżonej zawartości cukru, farmaceutyki, śledzie. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

13 AKTY PRAWNE UE W SPRAWIE SŁODZIKÓW Dyrektywa 89/107/EEC - tylko słodziki umieszczone w wykazach i tym samym dopuszczone dodatki mogą być stosowane w celu przygotowania i produkcji artykułów spożywczych; - dodatki te muszą mieć technologiczne uzasadnienie ich użycia; - nie mogą w żaden sposób niekorzystnie wpływać na zdrowie konsumenta, czy też wprowadzać go w błąd. Dyrektywa 94/35/EC z poprawkami 96/83/EC, 2003/115/EC i 2006/52/EC - dotyczy przede wszystkim dodatków wzmacniających słodki smak produktów żywnościowych, w tym słodzików; określa zakres dodatków, które mogą zostać użyte w celu produkcji artykułów spożywczych. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

14 ZALETY STOSOWANIA SUBSTANCJI SŁODZĄCYCH W PRODUKTACH ŻYWNOSCIOWYCH niska lub żadna wartość kaloryczna większa siła a słodzs odząca słodziks odzików syntetycznych w porównaniu do cukru (kilkaset razy) mniejszy ich dodatek wystarczy do uzyskania porównywalnej słodkości względy finansowe brak niekorzystnego wpływu na uzębienie w postaci próchnicy uzyskiwanie słodkiego s smaku bez obniżania poziomu cukru we krwi w wyniku stosowania niskokalorycznych słodziks odzików. Można więc łatwo kontrolować dietę cukrzyków. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

15 WADY Odczuwanie metalicznego posmaku (szczególnie przy wyższych szych stęż ężeniach ( słodzika Zakaz spożywania ywania niektórych słodziks odzików w przez dzieci i kobiety cięż ężarne; nie ma dowodów w naukowych potwierdzających szkodliwe działanie anie słodziks odzików w na płód, p przyjęto jednak, iżi lepiej je wyeliminować,, gdyż nie zawierają żadnej wartości odżywczej Zakaz spożywania ywania produktów w zawierających ASPARTAM przez dzieci chore na fenyloketonurię Możliwo liwość wywołania nieprzyjemnych objawów (np.. biegunki), jako wynik spożywania nadmiernych ilości słodziks odzików Rakotwórcze właściwow ciwości niektórych substancji z grupy słodziks odzików w... Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

16 WADY RAKOTWÓRCZO RCZOŚĆ SŁODZIKÓW TO JEST NAJBARDZIEJ KONTROWERSYJNA CECHA SŁODZIKÓW,, zwłaszcza aspartamu,, odkrytego już w 1965 roku) DANE SĄS JEDNAK SPRZECZNE FDA (ang. Food and Drug Administration) ) potwierdza, że aspartam jest bezpieczny EFSA (ang. European Food Safety Authority) ) także e potwierdza, że aspartam jest bezpieczny Konferencja w Paryżu u w 2006r. First European conference on aspartame: Putting safety and benefits into perspective. Jedynie cyklamat i sacharyna sąs podejrzewane o rakotwórcze rcze własności (dane uzyskane sąs na podstawie testów w prowadzonych na zwierzętach z użycie u ogromnych dawek) Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

17 LISTA SŁODZIKÓW DOPUSZCZONA DO STOSOWANIA W UNII EUROPEJSKIEJ Numer EC Substancja słodząca Maksymalna dozwolona dawka [mg/kg] E 950 Acesulfam-K E 951 Aspartam E 952 Caklaminiany E 954 Sacharyna E 955 Sukraloza E 957 Taumatyna E959 Neohesperydyna E 962 Sole aspartamu i acesulfamu Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

18 WYKORZYSTANIE RÓŻNYCH TECHNIK ANALITYCZNYCH W BADANIACH SŁODZIKÓW LC - chromatografia cieczowa GC - chromatografia gazowa TLC - chromatografia cienkowarstwowa CE - elektroforeza kapilarna SP - techniki spektrofotometryczne EA - techniki elektroanalityczne T - techniki miareczkowe G - techniki grawimetryczne IMA - techniki immunoanalityczne Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

19 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA niezwykle użyteczne narzędzie do badań różnego typu produktów w celu wykrycia i oznaczenia zawartości słodzików POTRZEBNE SĄ RÓWNIEŻ ODPOWIEDNIE PROCEDURY ANALITYCZNE Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

20 Oznaczanie słodzików STAN WIEDZY Lawrence JF, Charbonneau CF., Determination of seven artificial sweeteners in diet food preparations by reverse-phase liquid chromatography with absorbance detection. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 71, 934-7, (1988) KoyamaM, YoshidaK, UchiboriN, Wada I, AkiyamaK, SasakiT., Analysis of nine kinds of sweeteners in foods by LC/MS. J. Food Hyg. Soc. Jap., 46, 72-78, (2005) Wasik, A., McCourt., J., and Buchgraber, M., Simultaneous determination of nine intense sweeteners in foodstuffs by high performance liquid chromatography and evaporative light scattering detection - development and single laboratory validation. J. Chromatogr. A , (2007) Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

21 METODYKA OZNACZANIA SŁODZIKÓW (SPE LC/MS) odważenie próbki i jej homogenizacja oczyszczanie ekstraktu detekcja analitów rozpuszczenie próbki / ekstrakcja analitów rozdzielanie analitów Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

22 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS Krok 1: Rozproszenie/rozpylenie Do igły rozpylacza doprowadzany jest strumień fazy ruchomej, który jest rozpylany za pomocą strumienia czystego azotu Strumień azotu rozpyla ciecz i tworzą się kropelki Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

23 Zakres zastosowań różnych typów technik łączonych (GC-MS i LC-MS) Masa cząsteczkowa analitu APCI GC/MS ESI (elektrojonizacja) TERMOROZPYLANIE FAB PBI niepolarne Polarność analitu APCI - Atmospheric Pressure Chemical Ionization ESI - Electrospray Ionization PBI - Particle Beam Interface FAB - Fast Atomic Bombarding bardzo polarne Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

24 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS N (~80 C) 2 Krok 2: Jonizacja wysokie napięcie dysza analizator mas metalowa kapilara aerozol Ciśnienie atmosferyczne separator stożkowy Próżnia N (~80 C) 2 ESI-MS do pompy próżniowej Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

25 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS Krok 2: Jonizacja ESI-MS [M+nH] n+ ODPAROWANIE ROZPUSZCZALNIKA POWSTANIE JONÓW COULOMBOWSKA EKSPLOZJA KROPLI AEROLOZU Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

26 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS TYPOWE JONY W PRZYPADKU ESI Jony dodatnie: [M+H]+ - protonowane cząsteczki [M+Na]+, [M+K]+ - addukty [M+ CH3CN+H]+ - protonowane cząsteczki + rozpuszczalnik Jony ujemne: [M-H] H]- - deprotonowane cząsteczki [M+HCOO-]- - addukty Jony wieloładunkowe masa molowa dużych cząsteczek za pomocą MS o małym zakresie mas niepolarne POLARNOŚĆ jonowe Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

27 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS ZALETY TECHNIKI ESI-MS możliwość pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma może zawierać wodę). natężenie przepływu strumienia fazy ruchomej (rzędu 1 ml/min) przydatność do jonizacji związków wysokocząsteczkowych (peptydy, białka), metaloorganicznych i nieorganicznych wysoka czułość przydatność techniki do łączenia z elektroforezą kapilarną WADY TECHNIKI ESI-MS miękka technika jonizacji niewielki stopień fragmentacji trudności w określeniu struktury analitu Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

28 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS ESI-MS Krok 3: Detekcja (kwadrupol) Pręty kwadrupola Detektor Źródło zasilające pręty kombinacją napięć, stałego i o częstotliowści radiowej Źródło jonów Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

29 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA Rozdzielenie 9 słodzików ACS SAC CYC ASP SCL DUL ALI NHDC NEO BCP 1. Rozdzielenie 9ciu słodziks odzików 2. Czas analizy 25 minut 3. Identyfikacja na podstawie widm MS Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

30 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA PARAMETR CHROMATOGRAFICZNY Element chromatografu cieczowego Kolumna termostatowa 1316A COLCOM (CC 250/3 Nucleodur C 18 pyramid 5 μm (Macherely-Nagel) HPLC 1100, Agilent długość wewnętrzna średnica wielkość cząstek wypełnienia ph buforu 4,5 objętość dozowanej próbki skład fazy ruchomej metanol/bufor/aceton gradient czas trwania analizy faza A faza B 25 min 2 μl 69:24:7 (v/v/v) 11:82:7 (v/v/v) 250 mm 3 mm 5 μm czas %A %B Takie parametry pracy układu chromatograficznego umożliwiają rozdzielenie mieszaniny 9 substancji słodzących Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

31 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA PARAMETRY DETEKTORA Spektrometr mas (MS) Elektrorozpylanie (ESI) cyklamat 178 aspartam 293 sukraloza 397 dulcyna 225 alitam 330 neoesperydyna 611 neotam 377 wzorzec wewnętrzny 538 tryb ujemny energia fragmentacji ev napięcie przyłożone do kapilary 4000 V temperatura gazu suszącego 300 C natężenie przepływu strumienia gazu suszącego 12 l/min Parametry pracy spektrometru mas z pojedynczym kwadrupolem oraz jonizacją typu ESI zapewniają detekcję 9 substancji słodzących Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

32 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA (IDENTYFIKACJA) NEO Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

33 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA (analiza ilościowa) KRZYWE KALIBRACYJNE Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

34 OPRACOWANA PROCEDURA ANALITYCZNA Próbka Przygotowanie próbki Homogenizacja, odgazowanie, etc. Rozpuszczanie badanego materiału 5g próbki w 50mL of buforu Ekstrakcja analitów Kondycjonowanie kolumienki do SPE. Wprowadzenie 10mL roztworu próbki do kolumienki. Przemycie buforem (usuwanie zanieczyszczeń). Elucja analitów metanolem. Analiza HPLC-MS Wynik Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

35 OPRACOWANA PROCEDURA ANALITYCZNA próbka (5 g) homogenizowana bufor ph = 4,5 2 x 5 ml z ekstraktu próbki bufor ph = 4,5 (3 ml) Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

36 OPRACOWANA PROCEDURA ANALITYCZNA ODZYSK I POWTARZALNOŚĆ ANALIT STĘŻENIE [mg kg -1 ] WYNIK ± SD [mg kg -1 ] ODZYSK ± SD [%] ACS-K ± ± 1.1 ACS-K ± ±1.1 SAC ± ± 0.9 SAC ± ±0.8 CYC ± ± 0.9 CYC ± ±0.8 ASP ± ± 0.9 ASP ± ±0.8 SCL ± ± 0.9 SCL ± ±0.9 DUL ± ± 0.9 DUL ± ±0.9 ALI ± ± 0.5 ALI ± ±0.5 NEO ± ± 0.6 NEO ± ±0.6 Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

37 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA Stabilność słodzików w napojach (wpływ promieniowania UV) Neohesperydyna Sacharyna stężenie [%] Acesulfam-K stężenie [%] Alitam czas [miesiące] 20 stężenie [%] stężenie [%] czas [miesiące] czas [miesiące] czas [miesiące] Aspartam Dulcyna stężenie [%] 100 Neotam stężenie [%] czas [miesiące] stężenie [%] 100 Sukraloza czas [miesiące] 20 stężenie [%] czas [miesiące] czas [miesiące] Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

38 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA ASPARTAM i produkty jego degradacji Identyfikacja: L-kwas asparaginowy Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

39 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA ASPARTAM i produkty jego degradacji L-fenyloalanina Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

40 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA ASPARTAM i produkty jego degradacji diketopierazyna Identyfikacja: diketopiperazyna Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

41 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA NEOTAM i produkty jego degradacji t = 0 Identyfikacja: neotam Produkty degradacji neotamu Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

42 OPRACOWANA METODYKA ANALITYCZNA NEOTAM i produkty jego degradacji t = 60 dni Identyfikacja: 1-L-fenyloalanina1 Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

43 PODSUMOWANIE ROLA TECHNIKI HPLC-MS Analiza próbek o skomplikowanym składzie wmusza konieczność zastosowanie technik łączonych. Wzrastające wymagania co do wiarygodności wyniku analizy często wykluczają możliwość identyfikacji analitów jedynie na podstawie czasu retencji. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

44 PODSUMOWANIE c.d. ROLA TECHNIKI HPLC-MS Jedynie połączenie możliwości rozdzielania skomplikowanych mieszanin przy wykorzystaniu metod chromatograficznych z informacją strukturalną daje możliwość wiarygodnej identyfikacji analitów. Dzięki wykorzystaniu technik łączonych można w znacznym stopniu przyspieszyć i obniżyć koszty analiz dzięki mniejszym wymaganiom co do etapu przygotowania próbki do analizy. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

45 HPLC-MS staje się techniką stosowaną do rutynowych analiz! Stąd konieczność opracowania nowych metod analitycznych! Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

46 TERMINOLOGIA ANALITYCZNA PIĘTA ACHILLESOWA POLSKIEJ ANALITYKI Kto odpowiedzialny? 1. nauczyciele akademiccy dwa języki: OFICJALNY ŻARGON (bo podobno łatwiej i szybciej się można porozumieć w laboratorium) 2. marketing firm oferujących odczynniki, wyposażenie i sprzęt niski poziom wiedzy fachowej przedstawicieli bełkot w informatorach i ulotkach informacyjnych 3. brak słowników analitycznych Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

47 TERMINOLOGIA - PIĘTA ACHILLESOWA ANALITYKÓW Forum dyskusyjne czasopisma ANALITYKA NIKT NIE MA PATENTU NA NIEOMYLNOŚĆ, ALE NIE MOŻNA BEZMYŚLNIE KALKOWAĆ TERMINÓW OBCOJĘZYCZNYCH Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

48 PRZYKŁADY (bio) sensor - bio (czujnik) interface - łącznik (interfejs) negative ionisation - ujemna jonizacja (a nie negatywna jonizacja) positive ionisation - dodatnia jonizacja (a nie pozytywna jonizacja) Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

49 KATEDRA CHEMII ANALITYCZNEJ /Analityczna/analit.html Lista publikacji Wykłady prezentowane w czasie konferencji Kursy i szkolenia Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

50 KURSY I SZKOLENIA Kursy indywidualne "Na zamówienie" Wysokosprawna chromatografia cieczowa Wysokosprawna Chromatografia Cieczowa - poziom podstawowy Wysokosprawna Chromatografia Cieczowa - poziom zaawansowany Chromatografia Gazowa - poziom podstawowy Aspekty praktyczne wykorzystania Chromatografii Gazowej Przygotowanie próbek do analizy ABC techniki SPE Technika HPLC w analizie żywności Techniki łączone Kurs Kontrola i jakość wyników pomiarów analitycznych Biotesty w ocenie zanieczyszczenia środowiska Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

51 Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów analitycznych Praca zbiorowa pod. red. P. Konieczki i J. Namieśnika ISBN: Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

52 Opracowanie książkowe należało do 10 NAJLEPIEJ SPRZEDAJĄCYCH SIĘ KSIĄŻEK w roku Nakład został wyczerpany Wydawnictwo WNT podjęło decyzje o przygotowaniu drugiego wydania (1 000 egzemplarzy). Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

53 Nowe opracowanie (w języku angielskim) będzie wyposazone w CD z arkuszami kalkulacyjnymi. Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

54 KATEDRA CHEMII ANALITYCZNEJ Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

55 GORĄCA ZACHĘTA Any... Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,

56 Dziękuję za uwagę! Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej, Warszawa,