Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych o etiologii Aspergillus i Candida w chorobach rozrostowych układu krwiotwórczego

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Acta Haematologica Polonica Review Article 2006, 37, Nr 4 str ANNA KĘDZIERSKA 1, AGATA PIETRZYK 2, JOLANTA KĘDZIERSKA 3, PIOTR KOCHAN 2, ALEKSANDER B. SKOTNICKI 4 Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych o etiologii Aspergillus i Candida w chorobach rozrostowych układu krwiotwórczego Immunodiagnosis of invasive Aspergillus and Candida infections in patients with haematological malignancies 1 Zakład Mikrobiologii Klinicznej Katedry Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii Collegium Medicum UJ w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. J. Pryjma 2 Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum UJ w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Piotr B. Heczko 3 Pracownia Mikrobiologii Zakładu Diagnostyki Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. J. Naskalski 4 Katedra i Klinika Hematologii Collegium Medicum UJ w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Aleksander B. Skotnicki SŁOWA KLUCZOWE: Inwazyjna aspergiloza Kandydoza układowa Antygenemia Neutropenia allo BMT Antygeny ściany komórkowej grzybów Testy serologiczne KEY WORDS: Invasive aspergillosis Systemic candidiasis Antigenaemia Neutropenia allo BMT Fungal cell-wall antigens Serological assays STRESZCZENIE: W pracy przedstawiono aktualne metody wykrywania wysoce immunogennych składników ściany komórkowej grzybów antygenów: galaktomannanowego i mannanowego oraz przeciwciał anty-mannanowych w surowicy pacjentów. W oparciu o bieżące piśmiennictwo oceniono przydatność wykrywania wymienionych markerów na wczesnym etapie fungemii oraz podano możliwe przyczyny reakcji fałszywie dodatnich i ujemnych. SUMMARY: This review discusses the currently available methods, which allow detection of highly immunogenic components of fungal cell wall: galactomannan and mannan antigens, as well as anti-mannan antibodies in the patients sera. On the basis of current literature the usefulness of these antigens during the early stage of fungemia, and possible reasons of false-positive and false-negative reactions are evaluated.

2 28 A. KĘDZIERSKA i wsp. Chorzy z chorobami nowotworowymi układu krwiotwórczego, zwłaszcza z ostrą białaczką szpikową, stanowią grupę szczególnie predysponowaną do rozwoju inwazyjnych zakażeń grzybiczych (IFI s, invasive fungal infections) (1, 2). Pomimo powszechnie stosowanego empirycznego leczenia przeciwgrzybiczego, zagrażające życiu grzybice głębokie rozwijają się u 20 30% chorych z ostrą białaczką szpikową AML, 10 15% chorych z chłoniakami i 5% pacjentów z guzami litymi. Głównymi czynnikami etiologicznymi są grzyby drożdżopodobne z rodzaju Candida i pleśniowe z rodzaju Aspergillus. Do rozwoju inwazyjnej kandydozy (IC, invasive candidiasis) predysponuje przede wszystkim wcześniejsza kolonizacja przez blastospory Candida oraz uszkodzenie śluzówki przewodu pokarmowego w następstwie chemio i/lub radioterapii. W większości przypadków epizody IC pojawiają się we wczesnej fazie neutropenii po intensywnej chemioterapii z powodu ostrej białaczki szpikowej lub allogenicznego przeszczepienia szpiku (1). Ciężkie zakażenia układowe obarczone są 18-70% śmiertelnością (3). Wysokie ryzyko zgonu występuje również u chorych z inwazyjną aspergilozą (IA, invasive aspergillosis) w przebiegu, której całkowitą śmiertelność szacuje się na 58%, a u biorców szpiku aż na 87% (4, 5). Do rozwoju IA predysponowani są głównie chorzy po allogenicznej transplantacji szpiku, pacjenci z GvHD (graft-versus host disease) oraz chorzy w neutropenii (6, 7, 8). Ryzyko wystąpienia IA wzrasta proporcjonalnie do czasu trwania neutropenii i wynosi aż 70% po 34 dniach granulocytopenii (9). Precyzyjne i dostatecznie wczesne rozpoznanie grzybicy głębokiej jest trudne z powodu braku swoistych objawów. Klasyczne badania mykologiczne obejmujące ocenę histopatologiczną, metody mikroskopowe oraz hodowle próbek materiału klinicznego mają ograniczoną wartość diagnostyczną (5, 10, 11, 12). Obecnie zaleca się stosowanie jednocześnie czułych metod serologicznych, których przydatność diagnostyczną potwierdzono już na wczesnym etapie infekcji grzybiczej (2, 4, 5, 13, 14, 15). Nowe techniki diagnozowania grzybic inwazyjnych, pozwalają na wykrywanie w surowicy krwi rozpuszczalnych antygenów grzybów z rodzaju Candida i Aspergillus oraz/lub ich metabolitów. Zastosowanie metod serologicznych doceniono szczególnie u chorych z nowotworami układu krwiotwórczego, w tym u pacjentów po przeszczepieniu allogenicznych komórek hematopoetycznych, u których z powodu aplazji szpiku w następstwie cytotoksycznej chemioterapii możliwości diagnostyczne są bardzo ograniczone (1, 2, 9, 11). Markery serologiczne wykorzystywane w immunodiagnostyce inwazyjnych zakażeń grzybiczych Aktualnie stosowane metody diagnostyki serologicznej opierają się na wykrywaniu komponentów ściany komórkowej określonych gatunków grzybów mannoprotein, pełniących rolę markerów antygenowych. W okresie utrzymywania się układowego zakażenia grzybiczego antygeny te występują w krwiobiegu przejściowo, skąd są łatwo eliminowane przez powstające kompleksy immunologiczne oraz na drodze endocytozy

3 Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych 29 przez komórki Kupffera w wątrobie (12). W związku z powyższym duże znaczenie praktyczne ma regularne monitorowanie ich obecności w płynach ustrojowych (surowicy krwi i/lub plazmie) chorych obarczonych czynnikami ryzyka rozwoju IFI s (5, 8, 14). Galaktomannan (galf-antigen) W diagnostyce IA istotną wartość ma wykrywanie krążącego w surowicy krwi antygenu galaktomannanowego (GM). GM jest polisacharydem ściany komórkowej o ciężarze molekularnym od 35 kda kda. Jego obecność wykazano u A. fumigatus i innych gatunków z rodzaju Aspergillus (A. flavus, A. niger, A. versicolor, A. terreus, A. nidulans, A. oryazeae). GM stanowi wysoce immunogeny antygen i dlatego został uznany za dobry marker aspergilozy (4, 5, 13). Obecność we krwi chorych z IA krążącego galaktomannanu jest determinowana wieloma czynnikami biologicznymi i epidemiologicznymi. Wpływ, przynajmniej części z nich, jest trudny do oceny z powodu wciąż niedostatecznej wiedzy na temat kinetyki uwalniania GM in vivo, przenikania antygenu do krwiobiegu oraz jego eliminacji z krążenia. Wiadomo jednak, że ilość uwolnionego in vivo antygenu może zostać znacząco zredukowana z powodu braku lub niedostatecznej ilości składników odżywczych w miejscu infekcji. Uwolniony antygen może zostać wykorzystany jako potencjalne źródło węgla przez rozwijającą się grzybnię Aspergillus niger i Penicillium fellutanum. W obszarach martwicy niedokrwiennej brak glukozy i tlenu może hamować uwalnianie antygenów przez Aspergillus spp. Niski poziom GM występuje także u chorych, u których stwierdza się równocześnie obecność przeciwciał anty-aspergillus (13). W praktyce klinicznej wskazania do monitorowania obecności GM dotyczą grup pacjentów wysokiego ryzyka rozwoju IA (13). Należą do nich chorzy: a) z ostrą białaczką szpikową; b) z zespołem mielodysplastycznym; c) biorcy allogenicznego przeszczepu komórek macierzystych szczególnie od niespokrewnionych dawców; d) leczeni z powodu GvHD oraz e) biorcy organów litych, w tym płuc i wątroby. Maertens i wsp. (5) sugerują objęcie badaniami chorych z proliferacyjnymi hemocytopatiami a) poddanych chemioterapii z powodu: ostrej białaczki limfoblastycznej ALL, przewlekłej białaczki szpikowej CML, chłoniaka nieziarniczego NHL, ostrej białaczki mieloblastycznej AML z przewidywanym czasem trwania neutropenii (<500 komórek/µl, min. 10 dni); b) chorych po przeszczepieniu allogenicznym szpiku kostnego allo-bmt lub po przeszczepieniu autologicznym komórek macierzystych z krwi obwodowej auto- PBSCT. Autorzy cytowanej pracy sugerują jednocześnie odstąpienie od wykonywania badań u pacjentów: a) poddanych autologicznemu przeszczepieniu szpiku auto-bmt; b) poniżej 16-go r.ż oraz c) z anemią aplastyczną. Autorzy dowodzą, że wyłączenie z badań chorych z niskim prawdopodobieństwem rozwoju IA w znacznym stopniu eliminuje możliwość otrzymania wyników fałszywie ujemnych, z drugiej zaś zwiększa czułość testu na obecność GM u pacjentów z potwierdzoną IA.

4 30 A. KĘDZIERSKA i wsp. Czułość wykrywania GM zależy od miejsca toczącego się zakażenia. W zlokalizowanej aspegilozie, na przykład w inwazyjnej aspergilozie płuc, czułość detekcji krążącego antygenu jest znamiennie niższa w porównaniu do postaci rozsianej (9, 16). Obniżanie się poziomu GM wydaje się mieć związek z dobrym rokowaniem, z drugiej jednak strony brak antygenu nie wyklucza IA oraz procesu infekcyjnego o etiologii innej niż Aspergillus np. Alternaria, Fusarium, Mucorales. We wczesnych stadiach zakażenia antygen Aspergillus może występować w bardzo niskim stężeniu. Zgodnie z wytycznymi EORTC/MSG (Europaean Organization for Research and Treatment of Cancer/Mycosis Study Group) stwierdzenie obecności GM w krwiobiegu stanowi jedno z dużych kryteriów pozwalających na udokumentowanie IA pomimo ujemnych wyników uzyskanych w klasycznych badaniach mykologicznych (17). Maertens i wsp. (5) wykazali, że w przypadku 2/3 infekcji pozytywny wynik testu uzyskiwano przed wystąpieniem u pacjentów objawów klinicznych, zmian radiologicznych i/lub dodatnim wynikiem potwierdzającym zakażenie, uzyskanym innymi metodami diagnostycznymi. Ponadto, wg danych autorów u 96% badanych, serologiczne potwierdzenie antygenemii galaktomannanowej poprzedzało na 2 do 110 dni diagnozę potwierdzonej IA (udokumentowanej histo/cytochemicznie i/lub mikrobiologicznie). U 90% pacjentów obecność GM potwierdzano średnio na 10 dni przed uzyskaniem dodatnich wyników hodowli materiałów klinicznych. Podobnie, w innym badaniu prospektywnym antygenemię wykrywano przed wystąpieniem u pacjentów pierwszych objawów radiologicznych (około 8 dni wcześniej) i klinicznych (około 7 dni wcześniej) (18). Wykazano ponadto, że obecność GM koreluje z klinicznie potwierdzoną aspergilozą i z odpowiedzią na terapię przeciwgrzybiczą (19). Co więcej, obserwacje Maertens i wsp. (5) wskazują, że potwierdzony dodatni wynik na obecność krążącego antygenu w klinicznie udokumentowanych przypadkach IA może być podstawą do wdrożenia lub zmiany terapii przeciwgrzybiczej, nawet przy braku pozostałych kryteriów diagnostycznych. W ocenie autorów, aż w 76% przypadków potwierdzonej IA wykazanie obecności GM zbiegało się w czasie lub poprzedzało (1 do 27 dni) włączenie leczenia przeciwgrzybiczego. U pozostałych 24% chorych GM stwierdzano w krwiobiegu średnio po 6 dniach stosowania terapii przeciwgrzybiczej (1 58 dni). Ponadto, monitorowanie próbek surowic po wdrożeniu leczenia przeciwgrzybiczego dawało możliwość oceny prawdopodobieństwa odpowiedzi na terapię i/lub konieczności włączenia leczenia alternatywnego (5, 8). U chorych w neutopenii, u których na podstawie obrazu klinicznego i radiologicznego podejrzewa się inwazyjną postać aspergilozy oraz u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka rozwoju IA sugeruje się codzienne lub, co najmniej dwukrotne w ciągu tygodnia monitorowanie antygenu ze względu na jego przejściowe występowanie w krwiobiegu (2, 5, 11, 20, 21). Dodatni wynik na obecność GM uznawany jest za miarodajne kryterium rozpoznania prawdopodobnej aspergilozy (17). W przypadku stwierdzenia dodatniego wyniku na obecność antygenu podkreśla się konieczność oceny nowej próbki surowicy w dniu następnym i monitorowania kinetyki indeksu dla GM w kolejnych dniach celem wykluczenia wyniku fałszywie dodatniego. U chorych

5 Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych 31 poddanych leczeniu z powodu aspergilozy Sulahian i wsp. (18) proponują monitorowanie antygenemii w odstępach dwutygodniowych. Warto przy tym podkreślić brak obowiązujących schematów postępowania diagnostycznego dotyczących liczby i częstości pobierania próbek surowicy oraz czasookresu monitorowania antygenemii w przypadku podejrzenia IA u pacjentów z grup wysokiego ryzyka. Wykrywanie galaktomannanu w diagnostyce inwazyjnej aspergilozy Standardowe techniki immunodyfuzji, testy precypitacji i odczyn wiązania dopełniacza okazały się niewystarczająco czułe i swoiste, aby mogły być stosowane w diagnostyce IFI s u osób z niewydolnym układem odpornościowym (12, 22). Immunodiagnostyka IA oparta na wykrywaniu przeciwciał anty-aspergillus nie znalazła zastosowania u tych chorych, pomimo, że we wczesnej fazie neutropenii stwierdzano przeciwciała w wysokim mianie (1, 2, 4, 11, 12, 13, 21). Uzupełnienie klasycznych metod diagnostycznych o oznaczanie obecności GM stało się możliwe dzięki wprowadzeniu na rynek dwóch komercyjnych testów immunoenzymatycznego (Platelia Aspergillus EIA, Bio-Rad, Francja) i aglutynacji lateksowej (LA Pastorex Aspergillus, Bio-Rad). Wyniki badań wykazały, że w rozpoznawaniu IA bardziej przydatny jest test EIA, który umożliwia wykrycie ponad 10-krotnie mniejszej ilości GM w 1 ml krwi w porównaniu z testem aglutynacji lateksowej (23). Zalety i wady wymienionych testów przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1. Wartość diagnostyczna testów serologicznych wykrywających antygenemie galaktomannanową Table 1. Diagnostic value of serological tests detecting of galactomannan antigenemia Zalety Wady Test immunoenzymatyczny EIA (Platelia Aspergillus) Wykrywanie galaktomannanu (GM) na wczesnym Wynik ujemny nie wyklucza inwazyjnej aspergilozy etapie rozwoju zakażenia * Skuteczny w wykrywaniu IFI s o etiologii Aspergillus i Penicillium i zakażeń o etiologii Fusarium Brak zastosowania w diagnostyce zygomykoz Detekcja antygenu GM ng/ml krwi Konieczność regularnego monitorowania serii próbek surowic w związku z szybką eliminacją antygenu z krwiobiegu oraz dla wykluczenia wyniku fałszywie dodatniego Wysoka swoistość (> 85%) Zmienna czułość wykrywania GM w zakresie 29% 100% Test aglutynacji lateksowej, LA (Pastorex Aspergillus) Szybka diagnostyka ciężkich zakażeń grzybami Wykrywanie IA w zaawansowanym stadium infekcji Aspergillus spp. Wysoka swoistość w zakresie % Niski próg detekcji Ag GM (15 ng/ml krwi) * Wynik dodatni na obecność GM metodą EIA (Platelia Aspergillus) uzyskiwano, co najmniej 5 dni wcześniej niż metodą aglutynacji lateksowej (23). Test Platelia Aspergillus wprowadzili w 1995 roku Stynen i wsp. (24). Od wielu lat test dostępny jest w Europie. W Stanach Zjednoczonych został stosunkowo niedawno

6 32 A. KĘDZIERSKA i wsp. zatwierdzony przez FDA (8). W teście zastosowano monoklonalne przeciwciała szczura EBA-2 przeciwko antygenowi galaktomannanowemu Aspergillus. Test wykrywa antygen z czułością 1 ng/ml surowicy. Wielu autorów podkreśla wysoką czułość i swoistość tego testu w diagnostyce IA u chorych onkohematologicznych. W prospektywnych badaniach przeprowadzonych przez Sulahian i wsp. (18) na grupie 450 chorych po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych szpiku i 375 dzieci z chorobami nowotworowymi krwi czułość testu przekraczała 90%, a swoistość sięgała 94%. Podobne wyniki uzyskali także Martens i wsp. (5). U chorych poddanych przeszczepieniu allogenicznych komórek hematopoetycznych, u których oznaczanie obecności GM wykonywano 2 razy w tygodniu czułość i swoistość testu wynosiły około 90%. Na wysoką, wynoszącą około 80% czułość i swoistość testu wskazują także wyniki badań przeprowadzonych przez FDA (8). Z drugiej jednak strony pojawiają się doniesienia, które podkreślając wysoką swoistość testu Platelia Aspergillus w detekcji GM wskazują równocześnie na jego niską czułość. Przykładem są wyniki badań Herbrecht a i wsp. (25) przeprowadzonych wśród dorosłych i dzieci z oddziałów onkologicznych i hematologicznych. Czułość testu w cytowanych badaniach wynosiła około 65%, 16% i 26% odpowiednio dla chorych z potwierdzoną (proven), prawdopodobną (probable) i możliwą (possible) IA zdefiniowaną wg kryteriów EORTC/MSG. Inny przykład stanowią badania Pinel i wsp. (26) obejmujące grupę 807 chorych z oddziałów hematologii i intensywnej terapii z potwierdzoną i prawdopodobną IA. Wyniki tych badań wskazują także na niską, wynoszącą jedynie 50% czułość testu. Dyskutowanym obecnie problemem jest zmiana przyjętego przez producenta testu indeksu wartości cut-off. Dotychczas za ujemne uznawano próbki o indeksie poniżej 1, za dodatnie próbki o indeksie 1,5, natomiast wartości indeksu w zakresie 1-1,5 interpretowano jako wynik wątpliwy ( grey zone ). Niektórzy autorzy sugerowali obniżenie wartości granicznej indeksu zarówno dla próbki ujemnej, jak i dla dodatniej wskazując, że dotychczas obowiązujące są zbyt wysokie, co w konsekwencji prowadzi do spadku czułości testu (25, 27). Obecnie, zgodnie z zaleceniami producenta, za dodatnie pod względem obecności GM uważane są surowice o wartości indeksu 0,5. Próbki surowic o wartości indeksu <0,5 uznaje się za ujemne. Producent zaleca także, aby wszystkie próbki o indeksie równym i powyżej 0,5 oznaczyć ponownie używając tej samej surowicy oraz oceniać wartość indeksu w nowych, kolejno pobieranych próbkach surowic w celu eliminacji wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniem materiału. Dwa kolejne badania z dodatnim wynikiem na obecność GM świadczą o inwazyjnej aspergilozie. Dodatni wynik należy interpretować w świetle danych klinicznych oraz w połączeniu z wynikami badań radiologicznych i innych testów laboratoryjnych. Mannan i wykrywanie mannanu w diagnostyce inwazyjnej kandydozy Immunodiagnostyka IC opiera się na wykrywaniu krążącego w surowicy krwi antygenu mannanowego, będącego głównym składnikiem ściany komórkowej grzybów z rodzaju Candida. Mannan jest wysoce immunogennym antygenem polisacharydo-

7 Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych 33 wym o właściwościach immunomodulujących, którego oligomannozowe epitopy mogą indukować odpowiedź humoralną (14, 15, 28). Fakt ten wykorzystano w nowej strategii diagnozowania IC opartej na równoległym monitorowaniu miana krążącego mannanu i miana przeciwciał anty-mannanowych u pacjentów obarczonych ryzykiem rozwoju układowej kandydozy (2, 3, 15, 29). Połączenie detekcji antygenu i przeciwciał anty-candida pozwala na wzrost częstości rozpoznawania IC w przypadku pacjentów: a) nie wykazujących odpowiedzi immunologicznej na antygen mannanowy Candida, b) z dodatnim wynikiem testu na obecność przeciwciał anty-mannanowych, u których nie można wykryć antygenów. Potwierdzają to wyniki badań uzyskane przez Sendid a i wsp. (15), którzy wykazali, że u chorych z udowodnioną IC obecność mannanu stwierdzano tylko w 40% przypadków, a przeciwciał jedynie u 53% pacjentów. Równoległe wykrywanie obu markerów pozwoliło znacznie zwiększyć czułość (80%) i swoistość (93%) detekcji inwazyjnej kandydozy. Tym niemniej, niektórzy pacjenci wykazują dodatni wynik dla obu markerów na różnych etapach tego samego epizodu zakażenia, co najlepiej potwierdza rozwój infekcji. Przydatność równoczesnego monitorowania mannanemii i obecności przeciwciał anty-candida wykazano także u chorych hematologicznych w okresie neutropenii (14). U pacjentów z upośledzonym układem odpornościowym, u których mogą wystąpić zaburzenia w tworzeniu przeciwciał zaleca się monitorowanie ich poziomu, a także wykonywanie testu wykrywającego antygen mannanowy Candida. Yera i wsp. (3) u 73% badanych uzyskali dodatnie wyniki testów serologicznych na 2 do 15 dni przed potwierdzeniem obecności grzybów we krwi metodą hodowli. Średni czas między dodatnim wynikiem na obecność przeciwciał anty-mannanowych i antygenu mannanowego, a dodatnią hodowlą krwi wynosił odpowiednio 7 i 6 dni. Stały nadzór serologiczny chorych obarczonych ryzykiem rozwoju IC może zatem przyczynić się do potwierdzenia fungemii na jej wczesnym etapie zwłaszcza, jeśli odpowiednio częste monitorowanie mannanu (co 3 dni) i przeciwciał anty-mannanowych połączone jest z metodą hodowli. Z uwagi na fakt współistnienia szczytu antygenemii z dodatnią hodowlą krwi korzystne wydaje się pobieranie próbek krwi na posiew przy dodatnich wynikach na obecność antygenu w krwiobiegu (3, 29). Kontrola poziomu przeciwciał anty-mannanowych jest szczególnie istotna przy określaniu statusu immunologicznego chorego w przebiegu zakażenia Candida. Obecność przeciwciał odzwierciedla aktualne lub przebyte zakażenie, u pacjentów poddawanych immunosupresji oraz innych z grup wysokiego ryzyka wskazuje na możliwość układowej kandydozy. Z drugiej strony wykazanie obecności przeciwciał uniemożliwia rozróżnienie pomiędzy inwazyjną, a powierzchniową postacią kandydozy (3, 15). Sugeruje się, że długotrwale utrzymująca się antygenemia (mannanemia) przy braku produkcji przeciwciał może być niepomyślnym czynnikiem rokowniczym. Wyniki badań Yera i wsp. (3) ujawniły, że u chorych o profilu onkohematologicznym antygenemia zdecydowanie częściej poprzedzała odpowiedź humoralną, w przeciwieństwie do chorych z oddziałów chirurgicznych, u których obecność przeciwciał wykazywano przed wystąpieniem mannanemii i izolacją Candida z łożyska naczyniowego. Nagły wzrost poziomu przeciwciał może świadczyć o rozwoju aktywnego zakażenia.

8 34 A. KĘDZIERSKA i wsp. Natomiast, ujemny wynik na obecność przeciwciał anty-mannanowych nie wyklucza inwazyjnej kandydozy. Wykorzystanie antygenu mannanowego do diagnostyki IC zasugerowali po raz pierwszy 10 lat temu Weiner i Coats-Stephen (30). Do wykrywania zakażenia na wczesnym etapie oraz przy niskiej antygenemii, zalecany jest test immunoenzymatyczny Platelia Candida Ag (Bio-Rad), wykonywany równolegle z testem EIA wykrywającym przeciwciała anty-mannanowe (Platelia Candida Ab/Ac/Ak; Bio-Rad). Dotyczy to w szczególności pacjentów nie wykazujących odpowiedzi immunologicznej na antygen mannanowy Candida lub chorych z dodatnim wynikiem testu na obecność przeciwciał anty-mannanowych, u których nie można wykryć antygenów. W teście Platelia Candida Ag wykorzystano dobrze scharakteryzowane, monoklonalne przeciwciało EBCA-1, skierowane przeciwko α-1-5 oligomannozydom Candida. Z uwagi na komplementarny charakter wymienionych testów sugeruje się ich stosowanie w immunodiagnostyce układowych kandydoz niezależnie od statusu immunologicznego chorego i/lub stadium rozwoju fungemii (3). Czułość i swoistość obu testów stosowanych w detekcji zakażeń wywołanych przez większość patogennych gatunków Candida, Sendid i wsp. (15) ocenili odpowiednio na 80% i 93%. Autorzy podkreślają jednak, że wykrycie obecności antygenu mannanowego na wczesnym etapie zakażenia zależy w dużym stopniu od liczby i częstości oznaczeń wykonanych dla danego pacjenta. Antygenemię (mannanemię) potwierdzono u 40% pacjentów, od których próbki surowic pobierano wielokrotnie i tylko u 11%, u których oznaczenie wykonano jednorazowo. Co więcej, ujemny wynik na obecność antygenu nie wykluczał IC. Przyczyną wyników fałszywie ujemnych mogło być zbyt niskie stężenie antygenu, który w przebiegu zakażenia podlega szybkiej eliminacji z krwiobiegu. Tabela 2. Wartość diagnostyczna testów serologicznych wykrywających antygenemie mannanową Table 2. Diagnostic value of serological tests detecting of mannan antigenemia Zalety Wady Test immunoenzymatyczny EIA (Platelia Candida Ag) Wykrywanie mannanu na wczesnym etapie Wykrycie Ag mannanowego na wczesnym etapie IC rozwoju inwazyjnej kandydozy (IC) zależne od liczby i częstości oznaczeń Dodatni wynik na obecność mannanu może Konieczność regularnego monitorowania serii próbek surowic korelować z IC Wysoka swoistość - 93% Zróżnicowana czułość wykrywania mannanu w zakresie 40% 100% zależnie od gatunków Candida Stosowany w immunodiagnostyce IC niezależnie od statusu immunologicznego i/lub wyklucza IC np. np. zbyt niskie stężenie Ag Ujemny wynik na obecność Ag mannanowego nie stadium rozwoju fungemii Możliwość uzyskania dodatniego wyniku przed pierwszą dodatnią hodowlą krwi (12 do 2 dni) Możliwość wystąpienia reakcji krzyżowych u pacjentów przyjmujących infuzje plazmy hydro-ksyetyloskrobiowej Wskazane równoległe wykonanie testu na obecność

9 Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych 35 przeciwciał anty-mannanowych Z przeprowadzonych dotychczas retrospektywnych badań wynika również, że czułość testu Platelia Candida jest stosunkowo wysoka i waha się w zakresie % w przypadku rozpoznawania zakażeń o etiologii C. albicans, C. glabrata i C. tropicalis. Niższą czułość wykrywania mannanu i przeciwciał anty-mannanowych, wynoszącą 40-50% stwierdza się natomiast u chorych z IC wywołaną przez grzyby z gatunku C. krusei (3, 15). Zalety i wady testu przedstawiono w Tabeli 2. Pewne nadzieje w zakresie rozpoznawania inwazyjnej kandydozy o etiologii C. parapsilosis i C. quilliermondii budzi opracowany przez Fujita i wsp. (31) nowy test Unimedi Candida monotest (Unitka) (down-flow immunoassay), który w przeciwieństwie do testu Platelia Candida Ag, odznacza się znamiennie wyższą czułością (p<0,01) wykrywania mannanu. Chociaż w większości publikacji dyskutowana jest przede wszystkim przydatność wykrywania mannanu w rozpoznawaniu rozsianej postaci kandydozy, w ostatnim czasie pojawiło się także doniesienie o zastosowaniu z sukcesem testu Platelia Candida w rozpoznaniu udokumentowanej kandydozy ośrodkowego układu nerwowego o etiologii C. albicans u chorej w przebiegu ostrej białaczki nielimfatycznej (32). Nieswoiste reakcje krzyżowe Wykrywanie rozpuszczalnych antygenów jest metodą szybszą od klasycznej hodowli, lecz jak we wszystkich metodach immunologicznych mogą wystąpić nieswoiste reakcje krzyżowe. Wczesne wykrycie antygenu galaktomannanowego przed wystąpieniem objawów klinicznych i zmian w obrazie radiologicznym odpowiada faktycznie dodatniemu wynikowi u pacjentów, u których zostanie potwierdzona aspergiloza. Tym niemniej, w niektórych przypadkach na ostateczny wynik badania może mieć wpływ kilka czynników, które przedstawiono w Tabeli 3 (33, 34, 35). Wyniki fałszywie dodatnie przy braku objawów klinicznych można uzyskać u noworodków i małych dzieci, u których z powodu upośledzonej integralności bariery jelitowej dochodzi do translokacji GM do krwiobiegu z kontaminowanej antygenem żywności. Mleko w proszku, w odróżnieniu od mleka ludzkiego, zawiera wysokie stężenie GM. W interpretacji przebiegu antygenemii w tej grupie wiekowej oraz u pacjentów z zaburzoną funkcją bariery jelitowej należy uwzględnić rodzaj diety. Inną przyczyną reakcji fałszywie dodatnich są kolonizujące przewód pokarmowy bakterie z gatunku Bifidobacterium bifidum sp pennsylvanicum, których kwas lipotejchojowy wykazuje powinowactwo do przeciwciała EB-A2 (35). Reakcje fałszywie dodatnie obserwuje się także u chorych po przeszczepieniu allogenicznych komórek hematopoetycznych, zwłaszcza w pierwszym miesiącu po przeszczepie, w którym nasilony jest proces niszczenia śluzówki przewodu pokarmowego w następstwie chemioterapii (25). Ostrożnej interpretacji wymagają również wyniki testu Platelia Aspergillus uzyskiwane u pacjentów w immunosupresji leczonych profilaktycznie piperacyliną z tazobaktamem. Walsh i wsp. (34) wskazali na występowanie u tych chorych istotnie wyższe-

10 36 A. KĘDZIERSKA i wsp. go poziomu GM w krwiobiegu w porównaniu do pacjentów leczonych innymi antybiotykami (z grupy penicylin i cefalosporyn) pomimo braku IA. Możliwość otrzymania wyników fałszywie dodatnich zaobserwowano także u chorych poddanych profilak- Tabela 3. Przyczyny reakcji fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych w immunodiagnostyce antygenemii galaktomannanowej Table 3. Some reasons of false-positive and false-negative reactions for immunological detection of galactomannan Wyniki fałszywie dodatnie prawdopodobne Wyniki fałszywie ujemne prawdopodobne przyczyny przyczyny Test immunoenzymatyczny EIA (Platelia Aspergillus) Cyklofosfamid potencjalny induktor GM Ograniczona angioinwazja Reaktywność krzyżowa z egzoantygenami Wysokie miano przeciwciał anty-aspergillus grzybów z rodzajów: Penicillium (P. chrysogenum, P. digitatum), Paecilomyces (P. variotti) i Alternaria spp. * Dożylna podaż antybiotyków piperacylina-tazobaktam, amoksycylina-kwas klawulanowy A. fumigatus gatunek, np. A. terreus Inwazyjna aspergiloza wywołana przez inny niż interferencja z GM Brak eliminacji GM (heat-resistant) w procesie sterylizacji żywności translokacja cząsteczek GM przez zniszczoną błonę śluzową jelita do krwiobiegu Wysoki odsetek u pacjentów pediatrycznych (>83%) możliwość translokacji GM obecnego w mleku, ryżu lub bogato-białkowych składnikach odżywczych przez śluzówkę jelita Zanieczyszczone powietrze badanie próbek surowic w pomieszczeniu, w którym hoduje się grzyby Profilaktyczne oraz wyprzedzające (pre-emptive) stosowanie amfoterycyny B może hamować ekspresję GM i wzrost mycelium (wykazano w modelu zwierzęcym) Przewlekła choroba ziarniniakowa miano antygenu pozostaje długotrwale ujemne nawet w czasie epizodów zaostrzenia Lokalizacja inwazyjnej aspergilozy ** Test aglutynacji lateksowej, LA (Pastorex Aspergillus) Przeciwciała przeciwko GM grzybów z rodzaju Stężenie Ag GM w surowicy niższe niż wartość Penicillium (P. marneffei) progowa * Chociaż inwazyjne zakażenia grzybami z wyżej wymienionych rodzajów występują sporadycznie mogą być one przyczyną kontaminacji próbek materiałów klinicznych. ** Odnotowane w 2 przypadkach ostrej IA zapalenia zatok (sinusits) i zanikania rozpływnego kości (osteolysis). tycznej terapii itrakonazolem (5, 13). Przyczyny tego zjawiska nie zostały jeszcze wyjaśnione. Dotychczasowe obserwacje wskazują, iż reakcje fałszywie dodatnie mogą wystąpić zarówno przy badaniu pojedynczej, jak i serii próbek surowic pobranych od chorego bez objawów IA. Okazjonalne uzyskanie wyniku dodatniego w toku regularnego monitorowania próbek surowic sugeruje reakcję fałszywie dodatnią (16, 36). Dla udokumentowania grzybicy inwazyjnej istotne znaczenie ma więc systematyczne monitorowanie pacjentów z grup wysokiego ryzyka. Możliwa jest również sytuacja, w której testy na obecność antygenu galaktomannanowego wypadają fałszywie ujemnie. Częstość takich wyników nie przekracza jednak 5% (12). Pinel i wsp. (26) donoszą o fałszywie ujemnych wynikach testu Platelia

11 Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych 37 Aspergillus, które uzyskano w 3 przypadkach z udowodnioną i 14 z prawdopodobną IA. Wśród przyczyn wyników fałszywie ujemnych, autorzy wymieniają brak powtarzalności oznaczeń z tą samą próbką surowicy, różny profil kliniczny chorych (pacjenci z oddziałów pediatrycznego i geriatrycznego), obecność swoistych przeciwciał i lokalizację infekcji. W konsekwencji tłumaczy to niską, bo zaledwie 50% czułość testu. Warto podkreślić, że niektóre leki stosowane w terapii grzybic mogą znamiennie obniżać stężenie GM w surowicy krwi. Przykładem jest amfoterycyna B, która hamuje ekspresję komponentów ściany komórkowej grzybni - chityny i galaktomannanu (13). Okazuje się również, że występujący w krwiobiegu GM może tworzyć kompleksy immunologiczne wiążąc obecne we krwi przeciwciała anty-aspergillus. Powoduje to maskowanie epitopów i w konsekwencji brak wiązania z przeciwciałem EBA-2. W celu eliminacji reakcji nieswoistych i inaktywacji (dysocjacji) kompleksów immunologicznych przed wykonaniem oznaczenia wymagane jest ogrzanie surowicy do 100 º C. PODSUMOWANIE Tradycyjne metody diagnostyki grzybów chorobotwórczych, w tym z rodzajów Candida i Aspergillus opierają się na określaniu odpowiednio cech biochemicznych i morfologicznych izolatów uzyskanych z materiału klinicznego. Diagnostykę infekcji o tej etiologii utrudnia często brak swoistych dla zakażenia grzybiczego objawów oraz niska czułość metod hodowli grzybów z krwi. Badania zmierzające do udokumentowania inwazyjnego zakażenia grzybiczego muszą być przeprowadzone szybko i kontynuowane już po wdrożeniu leczenia. W świetle danych literatury światowej duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem testów serologicznych wykrywających swoiste antygeny grzybów w płynach ustrojowych pacjentów obarczonych wieloma czynnikami ryzyka rozwoju inwazyjnej aspergilozy i kandydozy. Priorytetowe znaczenie przypisuje się metodzie EIA pozwalającej na oznaczenie galaktomannanu Aspergillus spp. w surowicy chorego na wczesnym etapie infekcji. Należy jednak pamiętać, że wyniki żadnego z aktualnie dostępnych testów same nie wystarczają do postawienia diagnozy, ale w powiązaniu z innymi badaniami, w tym obrazowymi umożliwiają rozpoznanie, co najmniej prawdopodobnej grzybicy inwazyjnej. PIŚMIENNICTWO 1. Martino R, Subirá M. Invasive fungal infection in hematology: new trends. Ann Hematol 2002; 81: Ruhnke M, Böhme A, Buchheidt D i wsp. Diagnosis of invasive fungal infection in hematology and oncology. Ann Hematol 2003; 82 (Suppl 2): Yera H, Sendid B, Francois N, Camus D. Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20:

12 38 A. KĘDZIERSKA i wsp. 4. Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K. Use of circulating galactomannan screening for early diagnosis of invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients. J Infect Dis 2002; 186: Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, Van Elderle J, Boogaerts M. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and steam cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 2001; 97: Cordonnier C, Ribaud P, Herbrecht R i wsp. Societe Francaise de Greffe de Moelle et de Therapie Cellulaire. Prognostic factors for death due to invasive aspergillosis after hematopoietic stem cell transplantation: a 1-year retrospective study of consecutive patients at French transplantation centers. Clin Infect Dis 2006; 42: Hayeas-Lattin B, Maziarz RT. Update in the epidemiology, prophylaxis, and treatment of fungal infections in patients with hematologic disorders. Leukemia & Lymphoma 2004; 45: Wingard JR, Leather HA. New Era of Antifungal Therapy. Biology of Blood and Marrow Transplantation 2004; 10: Reichenberger F, Habicht JM, Gratwohl A, Tamm M. Diagnosis and treatment of invasive pulmonary aspergillosis in neutropenic patients. Eur Respir J 2002; 19: Marr KA, Carter RA, Crippa F, Wald A, Corey L. Epidemiology and outcome of mould infections in hematopoetic stem cell transplant recipients. Clin Infect Dis 2002; 34: Verweij PE, Meis JF. Microbiological diagnosis of invasive fungal infections in transplant recipients. Transpl Infect Dis 2000; 2: Yeo SF, Wong B. Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fungal infections. Clin Microbiol Rev 2002; 15: Mennink-Kersten MA, Donnelly JP, Verweij PE. Detection of circulating galactomannan for the diagnosis and management of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis 2004; 4: Sendid B, Caillot D, Baccouch-Humbert B i wsp. Contribution of the Platelia Candida specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalis infection in neutropenic adults. J Clin Microbiol 2003; 41: Sendid B, Tabouret M., Poirot JL, Mathieu D, Fruit J, Poulain D. New Enzyme Immunoassays for Sensitive Detection of Circulating Candida albicans Mannan and Antimannan Antibodies: Useful Combined Test for Diagnosis of Systemic Candidiasis. J Clin Microbiol 1999; 37: Kami M, Tanaka Y, Kanda Y i wsp. Computed tomographic scan of the chest, latex agglutination test and plasma (1 3)-β-D-glucan assay in early diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis: A prospective study of 215 patients. Haematologica 2000; 85: Ascioglu S, Rex H, de Pauw B i wsp. Defining opportunistic invasive fungal infection in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin Infect Dis 2002; 34: Sulahian A, Boutboul F, Ribaud P, Leblanc T, Lacroix C, Derouin F. Value of antigen detection using an Enzyme Immunoassay in the diagnosis and prediction of invasive aspergillosis in two adult and Pediatric Hematology Units during a 4-year prospective study. Cancer 2001; 91: Pazos C, Pontón J, Del Palacio A. Contribution of (1 3)-β-D-Glucan Chromogenic Assay to diagnosis and therapeutic monitoring of invasive aspergillosis in neutropenic adult patients: a comparision with serial screening for circulating galactomannan. J Clin Microbiol 2005; 43: Maertens J, Theunissen K, Verhoef G i wsp. Galactomannan and computed tomography-based preemptive antifungal therapy in neutropenic patients at high risk for invasive fungal infection: a prospective feasibility study. Clin Infect Dis 2005; 41: Stevens D. Diagnosis of fungal infections: current status. J Anticrob Chemoth 2002; 49 (Suppl S1): Bardana EJ, Gerber JD, Craig S, Cianciulli FD. The general and specific humoral immune response to pulmonary aspergillosis. Am Rev Resp Dis 1975; 112:

13 Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych Verweij PE, Stynen D, Rijs AJ, de Pauw BE, Hoogkamp-Korstanje JA, Meis JF. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay compared with Pastorex Latex Agglutination Test for diagnosing invasive aspergillosis in immunocompromised patients. J Clin Microbiol 1995; 33: Stynen D, Goris A, Sarfati J, Latge JP. A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 1995; 33: Herbrecht R, Letscher-Bru V, Oprea C i wsp. Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of invasive aspergillosis in cancer patients. J Clin Oncol 2002; 20: Pinel C, Fricker-Hidalgo H, Lebeau B i wsp. Detection of circulating Aspergillus fumigatus galactomannan: Value and limits of the Platelia Test for diagnosing invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 2003; 41: Verweij PE, Erjavec Z, Sluiters W i wsp.the Dutch Interuniversity Working Party for Invasive Mycoses. Detection of antigen in sera of patients with invasive aspergillosis: intra- and interlaboratory reproducibility. J Clin Microbiol 1998; 36: Martinez JP, Gil ML, Lopez-Ribot JL, Chaffin WL. Serologic response to cell wall mannoproteins and proteins of Candida albicans. Clin Microbiol Rev 1998; 11: Sendid B, Poirot JL, Tabouret M i wsp. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J Med. Microbiol; 2002; 51: Weiner MH, Coats-Stephen M. Immunodiagnosis of systemic candidiasis: mannanemia detected by radioimmunoassay in experimental and human infections. J Infect Dis 1979; 140: Fujita S, Takamura T, Nagahara M, Hashimoto T. Evaluation of a newly developed down-flow immunoassay for detection of serum mannan antigens in patients with candidaemia. J Med Microbiol 2006; 55: Verduyn-Lunel FM, Voss A, Kuijper EJ i wp. Detection of the Candida antigen mannan in Cerebrospinal Fluid specimens from patients suspected of having Candida Meningitis. J Clin Microbiol 2004; 42: Verweij PE, Weemaes CM, Curfs JH, Bretagne S, Meis JF. Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with Chronic Granulomatosus Disease and Invasive Aspergillosis. J Clin Microbiol 2000; 38: Walsh TJ, Shoham S, Petraitiene R i wsp. Detection of galactomannan antigenemia in patients receiving piperacillin-tazobactam and correlations between in vitro, in vivo, and clinical properties of the drug-antigen interaction. J Clin Microbiol 2004; 42: Mennink-Kersten MA, Klont RR, Warris Aop den Camp HJ, Verweij PE. Bifidobacterium lipoteichoic acid and false ELISA reactivity in aspergillus antigen detection. Lancet 2004; 363: Swanink C, Meis J, Rijs A, Donnelly JP, Verweij PE. Specificity of a Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detecting Aspergillus Galactomannan. J Clin Microbiol 1997; 35: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: dr Anna Kędzierska Zakład Mikrobiologii Klinicznej Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii Collegium Medicum UJ ul. Wielicka Kraków mmkedzie@cyf-kr.edu.pl

14 40 A. KĘDZIERSKA i wsp.