Badania mikoserologiczne w inwazyjnej aspergilozie

Transkrypt

1 Prace oryginalne / Original papers Mikologia Lekarska 27, 4 (3): Copyright 27 Cornetis ISSN X Magdalena Bochenek, El bieta Rup, Anna B. Macura Zak³ad Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w Krakowie Streszczenie Abstract Wprowadzenie: Przewlek³a ekspozycja na antygeny Aspergillus mo e prowadziæ do chorób alergicznych, a u osób z zaburzon¹ czynnoœci¹ uk³adu immunologicznego mo e dojœæ do zaka eñ g³êbokich. Ze wzglêdu na brak charakterystycznych objawów klinicznych inwazyjnej aspergilozy oraz w¹tpliwe znaczenie hodowli, istotn¹ rolê diagnostyczn¹ w przypadku podejrzenia systemowej aspergilozy odgrywaj¹ badania mikoserologiczne. Cel pracy: Celem pracy by³o: ) retrospektywne przedstawienie wyników badañ mikoserologicznych wykonanych w naszym Zak³adzie w latach u pacjentów z podejrzeniem inwazyjnej aspergilozy oraz 2) porównanie ró nych metod serologicznych stosowanych w laboratoryjnym rozpoznawaniu inwazyjnej aspergilozy. Materia³ i metody: Na materiale 86 surowic od pacjentów z podejrzeniem grzybicy narz¹dowej lub uogólnionej wykonano odczyny: hemaglutynacji poœredniej (IHA), podwójnej dyfuzji w elu (DD) oraz odczyn lateksowy (LA). Przydatnoœæ diagnostyczn¹ powy szych odczynów porównano z danymi z literatury dotycz¹cymi odczynu immunoenzymatycznego (EIA). Wyniki: W testach wykrywaj¹cych swoiste przeciwcia³a anty-aspergillus uzyskano 226 (2,8%) wyników dodatnich w odczynie IHA (miana : 6) oraz 264 (24,3%) w DD. Antygen kr¹ ¹cy grzyba wykrywano znacznie rzadziej ni przeciwcia³a, bowiem tylko 5 surowic (4,6%) na 86 przebadanych by³o galaktomannano-dodatnich. Wnioski: W diagnostyce mikoserologicznej, odczyn immunoenzymatyczny (EIA) wydaje siê byæ najbardziej przydatny we wczesnym rozpoznawaniu inwazyjnej aspergilozy ze wzglêdu na wysok¹ czu³oœæ testów, zarówno tych wykrywaj¹cych swoiste przeciwcia³a anty-aspergillus, jak i antygeny grzyba. Poniewa odczyn ten nie jest wykonywany w naszym Zak³adzie, optymalnym rozwi¹zaniem w istniej¹cych warunkach jest równoczesne stosowanie odczynów IHA, DD i LA. S³owa kluczowe: Aspergillus, aspergiloza, antygen, przeciwcia³o, mikoserologia Introduction: Long lasting exposure to Aspergillus antigens may result in allergic diseases and, in immunocompromised persons, in deep infections. The lack of distinctive symptoms and signs of invasive aspergillosis as well as doubtful value of culture make mycoserological tests essential in the diagnostics of systemic aspergillosis. Objective: The purpose of this article was: I) a retrospective evaluation of the results of mycoserological tests performed in patients suspected of systemic mycosis at our Department in the years II) a comparison of various serological methods applied in the laboratory diagnostics of invasive aspergillosis. Material and methods: A total of 86 serum samples from patients suspected of generalized mycosis were tested using: indirect haemagglutination test (IHA), double diffusion (DD), and latex agglutination (LA). The diagnostic usefulness of those tests was compared with reported data concerning enzyme immunoassay (EIA). Results: Antibodies against Aspergillus were detected in 226 positive tests results (2.8%) in IHA (titre :6) and in 264 positive ones (24.3%) in DD. Circulating fungal antigen galactomannan was detected considerably less frequently than antibodies positive LA tests were obtained only in 5 out of 86 (4.6%) serum samples. Conclusions: It appears that enzyme immunoassay (EIA) is the most useful mycoserological method in the early diagnosis of invasive aspergillosis because of its high sensitivity in detecting both fungal antigen and specific antibody against Aspergillus in serum. Now that it is not available at our institution, the best solution is simultaneous use of IHA, DD and LA. Key words: Aspergillus, aspergillosis, antigen, antibody, mycoserology 74 Wprowadzenie Grzyby z rodzaju Aspergillus stanowi¹ istotny czynnik etiologiczny wielu ró nych schorzeñ, zarówno w przypadku osób immunokompetentnych, jak i z obni on¹ odpornoœci¹ (, 2). Podstawowym czynnikiem etiologicznym wszystkich postaci klinicznych zaka eñ grzybami z rodzaju Aspergillus jest A. fumigatus. Do innych, rzadziej izolowanych gatunków nale ¹: A. terreus, A. niger, A. flavus, A. nidulans, A. oryzae oraz A. glaucus (2). Adres do korespondencji: Prof. dr hab. n. med. Anna B. Macura Kierownik Zak³adu Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ ul. Czysta 8, 3-2 Kraków tel.: wew. 247, mbmacura@cyf-kr.edu.pl Przewlek³a ekspozycja na antygeny Aspergillus mo e prowadziæ do chorób alergicznych (astma, alergiczny nie yt nosa, alergiczna oskrzelowo-p³ucna aspergiloza ABPA). W przypadku pacjentów ze zmianami w mi¹ szu p³ucnym (np. jamy pogruÿlicze) infekcja grzybami Aspergillus mo e objawiaæ siê klinicznie jako grzybniak kropidlakowy aspergilloma. Guzy kropidlakowe mog¹ lokalizowaæ siê nie tylko w p³ucach, ale równie w zatokach przynosowych. Inwazyjna aspergiloza dotyczy najczêœciej osób z upoœledzon¹ odpornoœci¹. Podstawowym czynnikiem ryzyka rozwoju tej postaci klinicznej infekcji Aspergillus sp. jest neutropenia, st¹d najczêœciej inwazyjn¹ aspergilozê obserwuje siê u pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego lub w przypadku osób poddanych chemioterapii z powodu choroby nowotworowej (, 2). Do grupy osób ze zwiêkszonym ryzy-

2 kiem wyst¹pienia inwazyjnej aspergilozy nale ¹ równie pacjenci z cukrzyc¹, alkoholicy, osoby z powik³aniami pooperacyjnymi oraz pacjenci stosuj¹cy przewlek³¹ antybiotykoterapiê. Pojedyncze przypadki inwazyjnej aspergilozy obserwowano wœród osób bez adnych czynników ryzyka w nastêpstwie ekspozycji na bardzo wysokie stê enie zarodników Aspergillus. W przypadku pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego oraz poddanych intensywnej chemioterapii, inwazyjna aspergiloza stanowi g³ówn¹ przyczynê zgonów. Umieralnoœæ z powodu inwazyjnej aspergilozy w tej grupie pacjentów wynosi a 45%. Tak z³e rokowanie wynika przede wszystkim z trudnoœci diagnostycznych inwazyjnej aspergilozy (3). Wczesne rozpoznanie choroby i w³¹czenie odpowiedniego leczenia ma podstawowe znaczenie prognostyczne. Ze wzglêdu na brak charakterystycznych objawów klinicznych inwazyjnej aspergilozy oraz w¹tpliw¹ wartoœæ hodowli (czêste wyniki fa³szywie ujemne), istotn¹ rolê w przypadku podejrzenia inwazyjnej aspergilozy odgrywaj¹ badania mikoserologiczne (3). Cel pracy Celem pracy by³o: ) retrospektywne przedstawienie wyników badañ mikoserologicznych wykonanych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w Krakowie w latach u pacjentów z podejrzeniem inwazyjnej aspergilozy oraz 2) porównanie ró nych metod serologicznych stosowanych w laboratoryjnym rozpoznawaniu inwazyjnej aspergilozy. Materia³ i metody W Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w latach wykonano 86 badañ mikoserologicznych w kierunku zaka eñ g³êbokich wywo³anych przez grzyby nitkowate z rodzaju Aspergillus. Materia³em by³y surowice pochodz¹ce od pacjentów przebywaj¹cych na oddzia³ach klinicznych, u których podejrzewano grzybicê uogólnion¹ b¹dÿ narz¹dow¹. W surowicach pacjentów poszukiwano: swoistych przeciwcia³ anty- Aspergillus stosuj¹c odczyn hemaglutynacji poœredniej Hemkit Aspergillus IHA (ravo Diagnostika GmbH, Niemcy) oraz odczyn immunoprecypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji, a tak e kr¹ ¹cego antygenu grzyba, który oznaczano za pomoc¹ odczynu lateksowego Pastorex Aspergillus (Bio-Rad, Francja). Odczyn hemaglutynacji poœredniej (IHA), wykrywaj¹cy swoiste przeciwcia³a anty-aspergillus w badanych surowicach, wykonywano wed³ug informacji producenta do³¹czonej do zestawu. Test przeprowadza siê w 96-do³kowych, okr¹g³odennych p³ytkach titracyjnych. W do³kach przygotowuje siê kolejne rozcieñczenia badanych surowic :8, :6, :32, :64 itd., do których nastêpnie dodaje siê zawiesiny krwinek czerwonych barana (SRBC) uczulonych antygenem somatycznym grzyba A. fumigatus. Obecne w surowicach swoiste przeciwcia³a anty- Aspergillus w klasach IgG, IgM oraz IgA powoduj¹ aglutynacjê SRBC. Miano przeciwcia³ w badanej próbce wyznacza siê w stosunku do kontroli negatywnej zawieraj¹cej nieuczulone SRBC. Miano :8, jak podaje producent, uznawane jest za normê, natomiast miana :6 wskazuj¹ na aspergilozê. Za pomoc¹ odczynu IHA mo liwe jest wykrycie przeciwcia³ nie tylko w kierunku A. fumigatus, ale tak e przeciwko innym gatunkom z rodzaju Aspergillus, takim jak: A. niger, A. nidulans, A. terreus, A. flavus. Drugim testem zastosowanym przez nas do oznaczenia swoistych przeciwcia³ anty-aspergillus by³ odczyn precypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji (DD). Odczyn ten wykonuje siê na szkie³kach podstawowych, pokrytych 3 ml 2% agaru Noble z dodatkiem mertiolatu. W elu wycina siê wed³ug schematu trzy otwory jeden otwór o œrednicy 6 mm, do którego dodaje siê 5 l badanej surowicy oraz dwa otwory o œrednicy 4 mm dla antygenów wzorcowych A. fumigatus, otrzymywanych metod¹ w³asn¹. Tak przygotowane szkie³ka podstawowe umieszcza siê w komorze wilgotnej i inkubuje w cieplarce w 37 o C przez dwie doby. Obecne w badanej surowicy przeciwcia³a anty- Aspergillus oraz antygeny wzorcowe grzyba dyfunduj¹ w elu, tworz¹c w strefie równowagi usieciowane kompleksy antygen przeciwcia³o. Kompleksy te s¹ widoczne w elu makroskopowo w postaci jasnych, opalizuj¹cych linii precypitacyjnych, umiejscowionych miêdzy otworami dla antygenu i przeciwcia³a. Aby lepiej uwidoczniæ linie precypitacyjne, el mo na dodatkowo wybarwiæ czerni¹ amidow¹. Obecnoœæ linii precypitacyjnych œwiadczy o dodatnim wyniku badania mikoserologicznego. Do wykrycia kr¹ ¹cych antygenów grzybów z rodzaju Aspergillus pos³u y³ odczyn lateksowy (LA). Odczyn ten wykonywano zgodnie z informacjami producenta. W teœcie cz¹stki lateksu op³aszczone szczurzym monokonalnym przeciwcia³em EBA-2, skierowanym przeciwko galaktomannanowi œciany komórkowej grzyba, aglutynuj¹ w obecnoœci antygenów w surowicy krwi. Dodatni wynik testu widoczny jest makroskopowo w postaci bia³ych k³aczków, bêd¹cych aglutynatami lateks-(eba-2)-galaktomannan. Aby wyeliminowaæ nieswoiste reakcje oraz w celu dysocjacji kr¹ ¹cych w surowicy kompleksów antygen przeciwcia³o, stosuje siê wstêpn¹ obróbkê surowicy. Obróbka ta polega na ogrzaniu surowicy do temperatury o C oraz na wirowaniu przy g przez minut. Wyniki Wyniki oznaczeñ mikoserologicznych surowic pacjentów z podejrzeniem g³êbokiej aspergilozy, wykonanych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w latach 22-26, przedstawiaj¹ tabele I i II. W celu syntezy wyników uzyskanych z poszczególnych lat dokonano analizy zbiorczej metod¹ metaanalizy. ¹cznie w latach przebadano 86 surowic. Dla ka dej surowicy wykonywano dwa odczyny wykrywaj¹ce swoiste przeciwcia³a anty-aspergillus IHA i DD oraz odczyn LA w kierunku antygenu galaktomannanowego grzyba (tab. I). W testach wykrywaj¹cych swoiste przeciwcia³a anty-aspergillus (IHA, DD) uzyskano 49 wyników dodatnich (45,%), w tym 226 (2,8%) wyników dodatnich w odczynie IHA (miana :6) oraz 264 (24,3%) w odczynie DD. Wœród surowic dodatnich w DD zdecydowana wiêkszoœæ 89 (7,6%) wykazywa³a miana :8 w odczynie IHA, uznawane przez producenta za normê, a tylko 75 surowic na 86 przebadanych (6,9%) by³o równoczeœnie dodatnich w IHA (miana :6) i DD. Ponad po³owa surowic DD-, IHA-dodatnich (45 surowic 6%) mia³a miana na poziomie :6 w IHA, natomiast w 5 surowicach (2%) zaobserwowano miana :32 oraz w 5 surowicach (2%) miana :64 (tab. I). Antygen kr¹ ¹cy grzyba wykrywano znacznie rzadziej ni przeciwcia³a, bowiem tylko 5 surowic (4,6%) na 86 przebadanych by³o galaktomannano-dodatnich. Dodatnie odczyny LA i DD wykazano dla surowic (,%). Liczba surowic IHA- -dodatnich oraz LA-dodatnich by³a podobna 2 surowic (,%). Zaobserwowano, i dodatniemu LA odpowiada³y niskie miana przeciwcia³ anty-aspergillus w odczynie IHA. Wœród 5 surowic, w których wykryto antygen, 4 (8,%) mia³o miana na poziomie :8 w IHA, 5 surowic (,%) miana :6 i 5 surowic (,%) miana :32 oraz 2 surowice (4,%) miana :64 (tab. I). Wœród wszystkich przebadanych surowic (86 surowic) 444 surowice (4,9%) wykazywa³y przynajmniej jeden odczyn dodatni na trzy wykonywane dla ka dej surowicy. Ponad po³o- 75

3 Mikologia Lekarska 27, 4 (3) Tabela I: Wyniki badañ mikoserologicznych surowicy pacjentów z podejrzeniem aspergilozy narz¹dowej wykonanych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w latach Table I: Results of mycoserological tests in the serum of patients suspected of systemic aspergillosis, performed at the Dept. of Mycology, Chair of Microbiology CMUJ in the years Rok / Year Liczba badañ Number of tests ,8% IHA odczyn hemaglutynacji poœredniej / indirect haemagglutination test DD odczyn podwójnej dyfuzji w elu / double diffusion LA odczyn lateksowy / latex agglutination Liczba dodatnich odczynów serologicznych Number of positive serological tests IHA DD LA 27 7,38% 8,%,67% 44 2,% 23,8% 5,4% ,2% 2,2%,6% 66 28,7% 24,9% ,7% 3,7% 5,58% ,3% 5 4,6% Tabela II: Zestawienie dodatnich i ujemnych wyników oznaczeñ mikoserologicznych uzyskanych w latach Table II: Combination of positive and negative mycoserological tests results performed in the years Odczyny z A. fumigatus Tests with A. fumigatus 22 n=49 23 n=85 24 n= n=265 Przynajmniej jeden odczyn dodatni 2,5% 4,% 4,% 44,5% At least one test positive Wszystkie odczyny dodatnie All of the tests positive,54%,42% Wszystkie odczyny ujemne All of the tests negative 3 75,8% 6 57,3% 3 55,% 4 52,8% N liczba badañ / number of tests W tabeli pominiêto wyniki w¹tpliwe, które wystêpowa³y w przypadku odczynów DD oraz LA / In the table doubtful DD and LA tests results were omited 26 n= ,% 6 46,2% n= ,9% 2,8% 65 55,7% 76 wa surowic 65 (55,7%) dawa³a wszystkie trzy odczyny ujemne, natomiast tylko 2 surowice (,8%) by³y równoczeœnie IHA-, DD- oraz LA-dodatnie (tab. II). Dyskusja. Testy wykrywaj¹ce przeciwcia³a skierowane przeciwko antygenom grzybów z rodzaju Aspergillus Badania serologiczne wykrywaj¹ce obecnoœæ swoistych przeciwcia³ skierowanych przeciwko antygenom Aspergillus stanowi¹ podstawê rozpoznania alergicznej aspergilozy oskrzelowo-p³ucnej oraz aspergilloma. W przypadku inwazyjnej aspergilozy ocena obecnoœci przeciwcia³ w p³ynach ustrojowych ma raczej znaczenie prognostyczne ni diagnostyczne (). W badaniach klinicznych zaobserwowano, e rosn¹ce miano przeciwcia³ przeciwko Aspergillus koreluje z popraw¹ stanu klinicznego pacjentów, natomiast ca³kowity brak przeciwcia³ przy obecnoœci objawów klinicznych infekcji oznacza najczêœciej niekorzystn¹ prognozê (). Wœród metod s³u ¹cych do oznaczania swoistych przeciwcia³ anty- -Aspergillus w materia³ach klinicznych mo na wymieniæ: podwójn¹ dyfuzjê w elu agarowym (DD), metodê immunoenzymatyczn¹ (EIA), odczyn radioimmunologiczny (RIA), immunoelektroforezê przeciwpr¹dow¹ (CIE), hemaglutynacjê poœredni¹ (IHA) oraz fluorescencjê poœredni¹ (IF) (, 4). DD ze wzglêdu na nieskomplikowan¹ procedurê i niski koszt wykonania badania jest wci¹ czêsto przeprowadzanym testem (2). Jako antygeny w DD wykorzystywane s¹ filtraty z hodowli lub ekstrakty z grzybni Aspergillus. Swoistoœæ omawianych testów jest stosunkowo wysoka lecz czu³oœæ innych metod (np. EIA, RIA) jest zdecydowanie wy sza ni DD (2, 5). W badaniu porównuj¹cym DD, EIA oraz CIE wysoki stopieñ korelacji miêdzy wynikami testów wykazano jedynie w przypadkach, gdy miano przeciwcia³ przeciwko Aspergillus by³o wysokie. Niskie miana przeciwcia³ w DD wykrywane by³y w niewielkim stopniu (6). Kolejn¹, stosunkowo czêsto wykorzystywan¹ metod¹ w badaniach mikoserologicznych zaka eñ wywo³anych przez grzyby z rodzaju Aspergillus jest hemaglutynacja poœrednia (IHA). Czu- ³oœæ tej metody, jak podaje literatura, jest równie wy sza ni DD. W badaniu porównuj¹cym IHA, DD, IF oraz CIE przeciwcia³a przeciwko Aspergillus najczêœciej by³y wykrywane w teœcie IHA oraz IF, jednak w przypadku IF czêste by³y wyniki fa³szywie dodatnie (7). Wysok¹ swoistoœæ komercyjnego testu opartego na immunohemaglutynacji wykazali Kappe i wsp. W badaniu przeprowadzonym na grupie 26 pacjentów z inwazyjn¹ aspergiloz¹ porównywano EIA, IHA oraz eksperymentalny test immunoenzymatyczny wykorzystuj¹cy mitogillinê. Najwy sz¹ czu³oœæ wykazano w przypadku EIA (22%). Czu³oœæ IHA wynosi³a 8%. Oba testy wykrywa³y przede wszystkim przeciwcia³a w klasie IgG. W 2 przypadkach wykryto równie przeciwcia³a w klasie IgM. Swoistoœæ IHA by³a wy sza ni EIA (85% vs. 72%) (8). Wyniki naszych badañ wskazuj¹ na s³ab¹ korelacjê wyników uzyskiwanych w odczynach IHA oraz DD. Wœród 49 surowic, dla których wykryto obecnoœæ swoistych przeciwcia³ anty- -Aspergillus, tylko 75 czyli 5,3% by³o równoczeœnie IHA- oraz DD-dodatnich. Ponad po³owa tych surowic (45 surowic 6%)

4 wykazywa³a miana na poziomie :6 w IHA, 5 surowic (2%) miana :32 oraz 5 surowic (2%) miana :64. Wiêkszoœæ surowic dodatnich w DD (89 7,6%) wykazywa³a w odczynie IHA miana :8. Ze wzglêdu na najwy sz¹ czu³oœæ metody immunoenzymatycznej wœród badañ wykrywaj¹cych obecnoœæ przeciwcia³ przeciwko Aspergillus, to w³aœnie EIA jest obecnie najczêœciej stosowanym odczynem w badaniach mikoserologicznych. Magdalena Bochenek, El bieta Rup, Anna B. Macura 2. Testy wykrywaj¹ce antygeny kr¹ ¹ce grzybów z rodzaju Aspergillus Testy wykrywaj¹ce antygeny kr¹ ¹ce grzybów z rodzaju Aspergillus znacz¹co u³atwiaj¹ wczesne rozpoznawanie inwazyjnej aspergilozy, szczególnie w przypadku pacjentów z neutropeni¹. Rosn¹ce w tkankach grzyby uwalniaj¹ antygeny do ró nych p³ynów ustrojowych. W zale noœci od objawów klinicznych jako materia³ do przeprowadzenia badania mo na wykorzystaæ: osocze, pop³uczyny oskrzelowo-p³ucne, mocz, p³yn mózgowo-rdzeniowy czy p³yn z worka osierdziowego (9). Do metod badawczych wykorzystywanych w mikoserologii do oznaczania kr¹ ¹cych antygenów grzybów nale ¹: aglutynacja lateksowa (LA), odczyn immunoenzymatyczny (EIA) oraz odczyn radioimmunologiczny (RIA) (, 2, 4, 9, ). Podstawowymi antygenami wykrywanymi w przypadku podejrzenia narz¹dowej lub uogólnionej aspergilozy za pomoc¹ wy ej wymienionych metod s¹: galaktomannan,,3- -D-glukan, antygen o masie cz¹steczkowej 8 kda i o aktywnoœci rybonukleazy oraz bia³ko szoku cieplnego hsp9 (9). Najwiêksze znaczenie kliniczne maj¹ badania wykrywaj¹ce galaktomannan. Galaktomannan (GM) jest sk³adnikiem zewnêtrznej warstwy œciany komórkowej grzyba. Antygen ten jest uwalniany z koñców nitek grzybni w trakcie wzrostu grzyba oraz podczas rozpadu grzybni w fazie litycznej. Badania przeprowadzone w warunkach in vitro wykaza³y ró ny stopieñ uwalniania GM w zale noœci od gatunku grzyba. A. fumigatus i A. flavus uwalniaj¹ najmniejsze iloœci GM, natomiast wysokie stê enia obserwowano w przypadku A. terreus, A. niger i A. nidulans (). GM nie jest pojedyncz¹ moleku³¹, lecz stanowi grupê zwi¹zków okreœlan¹ jako galactofuranose(galf)-antygeny, dla których charakterystyczne jest wystêpowanie epitopu reaguj¹cego z przeciwcia³em monoklonalnym EB-A2 (). Detekcja GM ma du e znaczenie w diagnostyce mikologicznej. W 22 roku European Organization for Research and Treatment of Cancer-Mycosis Study Group w³¹czy³a oznaczanie obecnoœci GM do mikrobiologicznych kryteriów rozpoznania inwazyjnej aspergilozy (2). Jednym z najczêœciej wykonywanych testów komercyjnych wykrywaj¹cych GM jest test Pastorex Aspergillus (Sanofi Pasteur, Francja) opieraj¹cy siê na metodzie aglutynacji lateksowej. Wysok¹ czu³oœæ tego testu wykazano w wielu badaniach przeprowadzonych na ludziach i zwierzêtach. W przypadku pacjentów z potwierdzon¹ inwazyjn¹ aspergiloz¹ czu³oœæ testu wynosi³a nawet 95% (). Zaobserwowano jednak, e wyd³u enie okresu przechowywania próbek przed wykonaniem badania znacznie obni a czu³oœæ testu Pastorex (). Istotnym problemem w przypadku omawianego testu jest wysoka czêstoœæ wyników fa³szywie dodatnich zwi¹zanych z obecnoœci¹ GM w po ywieniu, napojach (woda, mleko), probiotykach zawieraj¹cych Bifidobacterium spp. i antybiotykach (piperacylina-tazobaktam, amoksycylina, amoksycylina + kwas klawulanowy, ampicylina, fenoksymetylopenicylina) (, 3, 4). Szczepy Penicillium sp. wykorzystywane do produkcji antybiotyków równie uwalniaj¹ GM reaguj¹ce z przeciwcia³ami EB-A2. W naszych badaniach, przeprowadzonych za pomoc¹ testu Pastorex Aspergillus, GM wykrywany by³ znacznie rzadziej ni swoiste przeciwcia³a anty-aspergillus. Zaledwie 5 surowic na 86 przebadanych (4,6%) by³o GM-dodatnich. Zaobserwowano, i obecnoœci GM w surowicy towarzyszy³y niskie miana przeciwcia³ w odczynie IHA. Surowic IHA i LA-dodatnich oraz DD i LA-dodatnich by³o odpowiednio 2 (,%) oraz (,%). Obecnoœæ GM w p³ynach ustrojowych mo e byæ równie wykrywana za pomoc¹ testów immunoenzymatycznych. EIA ze wzglêdu na wysok¹ czu³oœæ i powtarzalnoœæ wyników badania jest obecnie bardzo czêsto wykorzystywana w przypadku podejrzenia infekcji wywo³anej przez Aspergillus sp. W badaniach klinicznych porównuj¹cych EIA i LA wykazano wy sz¹ czu³oœæ metody immunoenzymatycznej (5-7). Machetti i wsp. zaobserwowali równie, e EIA wykrywa obecnoœæ GM w p³ynach ustrojowych we wczeœniejszych etapach infekcji Aspergillus sp. ni LA i wyniki testów EIA d³u ej pozostaj¹ dodatnie (). W badaniu klinicznym przeprowadzonym na grupie pacjentów z chorobami hematologicznymi badania serologiczne wykrywaj¹ce GM za pomoc¹ metody EIA umo liwi³y rozpoznanie inwazyjnej aspergilozy o 2 do 5 dni przed uzyskaniem wyniku hodowli oraz o 2 do 7 dni przed pojawieniem siê zmian w badaniach radiologicznych (8). Wnioski Mimo wielu ograniczeñ testów serologicznych badania te, szczególnie w przypadku wielokrotnego ich wykonania, stanowi¹ istotn¹ pomoc w ustaleniu rozpoznania jak równie monitorowaniu przebiegu infekcji Aspergillus sp. Z przedstawionych przez nas metod maj¹cych zastosowanie w diagnostyce mikoserologicznej, odczyn immunoenzymatyczny (EIA) wydaje siê byæ najbardziej przydatny we wczesnym rozpoznawaniu inwazyjnej aspergilozy ze wzglêdu na wysok¹ czu³oœæ testów, zarówno tych wykrywaj¹cych swoiste przeciwcia³a anty-aspergillus, jak i antygeny grzyba. Poniewa odczyn ten nie jest wykonywany w naszym Zak³adzie, optymalnym rozwi¹zaniem w istniej¹cych warunkach jest równoczesne stosowanie odczynów IHA, DD i LA. Piœmiennictwo. Matthews R., Burnie J.: Mycoserology. [w:] Microbiology and microbial infections. vol. IV Medical Mycology. red. L. Collier, A. Balows, M. Sussman, vol. ed. L. Ajello, R.J. Hay, wyd. Arnold, Londyn, 998, Kurup V.P., Kumar A.: Immunodiagnosis of aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev., 99, 4, Hopwood V., Johnson E.M., Cornish J.M., Foot A.B., Evans E.G., Warnock D.W.: Use of the Pastorex aspergillus antigen latex agglutination test for the diagnosis of invasive aspergillosis. J. Clin. Pathol., 995, 48, Ochman E.: Diagnostyka mikrobiologiczna i serologiczna uk³adowych zaka eñ grzybiczych. [w:] Zaka enia grzybicze wybrane zagadnienia. red. D. Dzier anowska, wyd. -medica press, Bielsko-Bia³a, 26, Kauffman H.F., Beaumont F., Meurs H., van der Heide S., de Vries K.: Comparison of antibody measurements against Aspergillus fumigatus by means of doublediffusion and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). J. Allergy Clin. Immunol., 983, 72, Hearn V.M., Donaldson G.C., Healy M.J., Trotman D.M.: A method to determine significant levels of immunoglobulin G to Aspergillus fumigatus antigens in an ELISA system and a comparison with counterimmunoelectrophoresis and double diffusion techniques. J. Immunoassay, 985, 6, Kurup V.P., Fink J.N.: Evaluation of methods to detect antibodies against Aspergillus fumigatus. Am. J. Clin. Pathol., 978, 69, Kappe R., Rimek D.: Antibody detection in patients with invasive aspergillosis. Mycoses, 24, 47 Suppl., Dupont B., Richardson M., Verweij P.E., Meis J.F.: Invasive aspergillosis. Med. Mycol., 2, 38 Suppl, Verweij P.E., Poulain D., Obayashi T., Patterson T.F., Denning D.W., Ponton J.: Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol., 998, 36 Suppl., Verweij P.E., Mennink-Kersten M.A.: Issues with galactomannan testing. Med. Mycol., 26, 44, Suppl., Maertens J., Theunissen K., Deeren D., Meersseman W., Van Eldere J.: Defining a case of invasive aspergillosis by serum galactomannan. Med. Mycol., 26, 44, Suppl.,

5 3. Roilides E.: Early diagnosis of invasive aspergillosis in infants and children. Med. Mycol., 26, 44 Suppl., Mennink-Kersten M.A., Klont R.R., Warris A., Op den Camp H.J., Verweij P.E.: Bifidobacterium lipoteichoic acid and false ELISA reactivity in aspergillus antigen detection. Lancet, 24, 363, Machetti M., Feasi M., Mordini N., Van Lint M.T., Bacigalupo A., Latge J.P., Sarfati J., Viscoli C.: Comparison of an enzyme immunoassay and a latex agglutination system for the diagnosis of invasive aspergillosis in bone marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplant., 998, 2, Sulahian A., Tabouret M., Ribaud P., Sarfati J., Gluckman E., Latge J.P., Derouin F.: Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of invasive aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 996, 5, Mikologia Lekarska 27, 4 (3) 7. Herrmann J., Gugel A., Freidank H., Bertz H., Finke J.: Aspergillus antigen detection: comparison of a new sandwich ELISA with the latex agglutination test in patients with histologically proven invasive aspergillosis. Mycoses, 998, 4 Suppl., Jarque I., Andreu R., Salavert M., Gomez D., Peman J., Gobernado M., Sanz M.A.: Value of Aspergillus galactomannan antigen detection in the diagnosis and followup of invasive aspergillosis in hematological patients. Rev. Iberoam. Micol., 23, 2, 6-8. Praca wp³ynê³a do Redakcji: Zaakceptowano do druku: Sprostowanie W numerze /27 Mikologii Lekarskiej, w artykule Szczepionki grzybicze wspó³czesne mo liwoœci i ograniczenia autorstwa prof. Bo eny Dworeckiej-Kaszak wkrad³ siê b³¹d. Na stronie 63, drugi wers drugiej kolumny zamiast: Znacznie póÿniej w XIII w. Edward Jenner... powinno byæ: Znacznie póÿniej w XVIII w. Edward Jenner..., za co autorka i redakcja ML serdecznie przepraszaj¹. 78