Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str MAGDALENA CZEMERSKA, AGNIESZKA WIERZBOWSKA, BARBARA CEBULA, TADEUSZ ROBAK

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str MAGDALENA CZEMERSKA, AGNIESZKA WIERZBOWSKA, BARBARA CEBULA, TADEUSZ ROBAK Ocena ekspresji naczniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) w komórkach nowotworowych oraz osoczowego stęŝenia VEGF i łoŝyskowego czynnika wzrostu (PlGF) u chorych na ostrą białaczkę szpikową Evaluation of intracellular vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in leukemic blasts and plasma concentration of VEGF and placental growth factor (PlGF) in patients with acute myeloid leukemia Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak STRESZCZENIE ZałoŜenia i cel pracy: W ostatnich latach wykazano, Ŝe angiogeneza odgrywa istotną rolę w patogenezie ostrej białaczki szpikowej (OBS). NajwaŜniejszą cytokiną stymulującą angiogenezę jest naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF, vascular endothelial growth factor). Istnieją dowody, Ŝe komórki białaczkowe mogą wykazywać ekspresję VEGF i jego receptorów (VEGFR-1 i VEGFR-2), co wskazuje, Ŝe VEGF jest auto- i parakrynnym czynnikiem wzrostu w OBS. ŁoŜyskowy czynnik wzrostu (PlGF) jest białkiem naleŝącym do rodziny VEGF i oddziaływuje na komórki za pośrednictwem receptora VEGFR-1. Dotychczas brak jest danych oceniających znaczenie PlGF w OBS. Celem pracy była ocena ekspresji VEGF w komórkach białaczkowych oraz analiza osoczowego stęŝenia VEGF i PlGF u chorych na OBS oraz w grupie kontrolnej. Materiał i metody: Ocenę ekspresji VEGF w komórkach białaczkowych przeprowadzono u 19 chorych na OBS (12 kobiet i 7 męŝczyzn) w wieku od 28 do 78 lat (Me 57 lat). Ekspresję VEGF zbadano za pomocą metody Western blot. Ocenę stęŝenia VEGF i PlGF w osoczu przeprowadzono za pomocą metody immunoenzymatycznej (ELISA). Wyniki: U wszystkich chorych stwierdzono ekspresję VEGF w komórkach białaczkowych oraz oznaczalne stęŝenia badanych cytokin w osoczu krwi. Wykazano ponadto, Ŝe osoczowe stęŝenie VEGF i PlGF u chorych na OBS jest znamiennie wyŝsze niŝ w grupie kontrolnej osób zdrowych. Wnioski: Wyniki naszych badań wskazują, Ŝe cytokiny angiogenne z rodziny VEGF są wydzielane przez komórki nowotworowe i odgrywają istotną rolę w patogenezie OBS. Celowa jest kontynuacja badań oceniających ekspresję VEGF w blastach oraz stęŝenie VEGF i PlGF we krwi obwodowej oraz ich znaczenie prognostyczne u chorych na OBS. SŁOWA KLUCZOWE: Ostra białaczka szpikowa Angiogeneza Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu ŁoŜyskowy czynnik wzrostu Western blot

2 622 M. Czemerska i wsp. SUMMARY Background and aim: Angiogenesis plays an important role in the biology of acute myeloid leukemia and VEGF is known to be the most important angiogenic factor. It has been reported that AML blasts express both VEGF and its receptors (VEGFR-1 and VEGFR-2). It may suggest that VEGF can be auto- and paracrine growth factor for the leukemic cells. Placental growth factor (PlGF) is a member of VEGF protein family. PlGF exerts its biologic effect via VEGFR-1. The role of PlGF in AML biology has not been analyzed so far. The aim of this study was to assess the expression of intracellular VEGF in leukemic blasts and plasma VEGF and PlGF concentration in AML patients and control group. Material and methods: The evaluation of intracellular VEGF was performed in 19 patients with newly diagnosed AML (12 women and 7 men) in age from 28 to 78 years (Me 57 years). The expression of VEGF was estimated by Western blot method. Plasma VEGF and PlGF levels were measured using an enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA). Results: The expression of VEGF was detected in blasts from all patients with AML. The plasma concentration of VEGF and PlGF in AML patients was significantly higher than those detected in the healthy control group. Conclusions: Results of our study indicate that VEGF-type angiogenic cytokines play an important role in pathogenesis of acute myeloid leukemia and that leukemic blasts are the main source of them. The further studies on VEGF-type cytokines are needed to better determine their prognostic and therapeutic value in AML. KEY WORDS: Acute myeloid leukemia Angiogenesis Vascular endothelial growth factor Placental growth factor Western blot WSTĘP W ostatnich latach wykazano, Ŝe angiogeneza odgrywa waŝną rolę w etiopatogenezie ostrej białaczki szpikowej (OBS) [1]. Istotą tego złoŝonego i wieloetapowego procesu jest tworzenie nowych naczyń krwionośnych z istniejącej sieci naczyniowej [2]. Głównym stymulatorem angiogenezy jest VEGF, który pobudza aktywację i proliferację komórek śródbłonka i w konsekwencji, tworzenie sieci drobnych naczyń krwionośnych [3]. VEGF wykazuje znaczne podobieństwo do płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF platelet-derived growth factor) [3]. Gen dla VEGF zlokalizowany jest w obrębie chromosomu 6 (6p21.3) i zawiera 8 egzonów przedzielonych 7 intronami [4]. Podczas obróbki mrna, na skutek alternatywnego składania genu (splicing), powstają izoformy naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu o róŝnej długości łańcucha aminokwasowego: VEGF 121, VEGF 165, VEGF 189, VEGF 206, VEGF 145, VEGF 183, VEGF 162 i VEGF 165b [5 9]. Dominującą izoformą jest VEGF 165. Jest to homodimeryczna glikoproteina o masie cząsteczkowej 45 kda [10]. VEGF, zwany równieŝ VEGF-A, naleŝy do rodziny białek, wśród których wyróŝnia się takŝe VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E oraz łoŝyskowy czynnik wzrostu (PlGF, placenta growth factor) [11]. VEGF wywołuje swój efekt biologiczny poprzez wiązanie z jednym ze swoistych receptorów, naleŝących do grupy receptorów kinazy tyrozynowej: VEGFR-1 (FLT-1 fms-like tyrosine kinase-1) [12], VEGFR-2 (KDR kinase insert domain-containing receptor/flk-1 fetal liver kinase-1) [13] lub VEGFR-3 (FLT- 4) [14].

3 Ocena ekspresji naczyniowo-śródbłonkowego 623 Ekspresja VEGF zwiększa się pod wpływem tlenku azotu, hipoksji oraz cytokin prozapalnych i czynników wzrostu takich jak: czynnik wzrostu fibroblastów-4 (FGF-4; fibroblast growth factor-4), PDGF, naskórkowy czynnik wzrostu (EGF; epidermal growth factor), czynnik martwicy nowotworów-α (TNF-α; tumor necrosis factor-α), interleukina-6 (IL-6), interleukina-1β (IL-1β) [15, 16, 17]. Do wzrostu ekspresji VEGF dochodzi takŝe na skutek utraty genów supresorowych np. p53 oraz aktywacji onkogenów ras, v-src i HER-2 [18]. Udowodniono, Ŝe VEGF odgrywa kluczową rolę w proliferacji, dojrzewaniu i migracji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i limfatycznych [19]. VEGF jest głównym czynnikiem stymulującym mobilizację prekursorowych komórek śródbłonka ze szpiku kostnego [20]. Ponadto cytokina ta indukuje wydzielanie i aktywację enzymów odpowiedzialnych za degradację zrębu zewnątrzkomórkowego. Istnieją dowody, Ŝe VEGF zwiększa ekspresję induktorów i inhibitorów plazminogenu [21], receptorów urokinazy [22], a takŝe metaloproteinaz kolagenazy i gelatynazy oraz zmniejsza stę- Ŝenie tkankowych inhibitorów metaloproteinaz 1 i 2 [23, 24]. VEGF zwiększa ekspresję antyapoptotycznych białek Bcl-2, A1 [25], XIAP oraz surwiwiny [26] w komórkach śródbłonka oraz stymuluje je do produkcji tlenku azotu (NO) i prostaglandyny I2 [16]. VEGF jest wytwarzany przez wiele linii komórek nowotworowych, w tym równieŝ przez komórki nowotworów układu krwiotwórczego. Wykazano ekspresję VEGF i jego receptorów VEGFR-1 i VEGFR-2 w komórkach białaczkowych u chorych na ostrą białaczkę szpikową [27]. Udowodniono, Ŝe VEGF jest niezaleŝnym niekorzystnym czynnikiem prognostycznym u chorych na OBS z wysoką liczbą blastów w szpiku kostnym lub krwi obwodowej (powyŝej 70% komórek jednojądrzastych) [28]. PlGF został pierwotnie wyizolowany z ludzkiego łoŝyska [29]. Gen PlGF znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 14 i zawiera 7 egzonów [30]. W wyniku alternatywnej syntezy mrna powstają 4 izoformy PlGF o róŝnej długości łańcucha aminokwasowego: PlGF 131, PlGF 152, PlGF 203, PlGF 224 i róŝnych właściwościach [30, 31, 32]. Wyniki badań eksperymentalnych na modelach zwierzęcych wykazały, Ŝe PlGF wywiera swój biologiczny efekt za pośrednictwem VEGFR-1 oraz odgrywa kluczową rolę w patologicznej angiogenezie w przebiegu niedokrwienia, zapalenia i nowotworów [33, 34]. PlGF stymuluje komórki śródbłonka naczyniowego i potęguje angiogenne działanie VEGF. Poprzez oddziaływanie na komórki mięśni gładkich PlGF indukuje stabilizację i dojrzewanie nowopowstałych naczyń krwionośnych. Ponadto, PlGF mobilizuje komórki progenitorowe (naczyniowe i hematopoetyczne) ze szpiku kostnego oraz komórki zapalne, które odgrywają istotną rolę w procesie tworzenia naczyń pobocznych [33]. Celem pracy była ocena ekspresji VEGF w komórkach białaczkowych oraz analiza osoczowego stęŝenia VEGF i PlGF u chorych na OBS oraz w grupie kontrolnej.

4 624 M. Czemerska i wsp. MATERIAŁ I METODY Charakterystyka chorych Do badania włączono 19 chorych, w tym 12 kobiet i 7 męŝczyzn, z dotychczas nieleczoną OBS. Mediana wieku chorych wynosiła 57 lat (zakres lat). Rozpoznanie postawiono na podstawie standardowych kryteriów morfologicznych, cytochemicznych, cytogenetycznych, molekularnych i immunofenotypowych [35]. Wśród chorych włączonych do badania znalazły się 2 osoby z podtypem M1, 7 z podtypem M2 i 10 z podtypem M4 wg klasyfikacji FAB (French-American-British). Na podstawie przeprowadzonego badania cytogenetycznego chorych zakwalifikowano do odpowiednich grup ryzyka wg SWOG (Southwestern Oncology Group). Charakterystykę chorych przedstawiono w Tabeli 1. Przeprowadzone badania Tabela 1. Charakterystyka chorych Table 1. Characteristic of the patients Wiek (lata) 57 (28 78) Płeć (M/K) 7/12 Klasyfikacja wg FAB M0 0 M1 2 M2 7 M3 0 M4 10 M5 0 M6 0 M7 0 Kariotyp wg SWOG Dobry 2 Pośredni 9 Zły 3 Inne 2 Brak podziałów 3 WBC (G/L) 39,7 (1,14-140,02) Hb (g/dl) 8,4 (5.7 11,2) PLT (G/L) 43 (9,0 396,0) LDH (U/L) n=14 552,5 (214,0 2652,0) W dniu pobrania materiału do oznaczania ekspresji VEGF w komórkach białaczkowych oraz oceny stęŝenia VEGF i PlGF w osoczu krwi u wszystkich chorych wykonano badanie cytologiczne szpiku kostnego, analizę kariotypu, morfologię krwi obwodowej z rozmazem oraz oznaczono aktywność LDH.

5 Ocena ekspresji naczyniowo-śródbłonkowego 625 Izolacja komórek jednojądrowych z krwi obwodowej lub szpiku kostnego W celu uzyskania jednorodnej populacji komórek, do badania kwalifikowano chorych z dotychczas nieleczoną OBS, u których liczba blastów we krwi obwodowej lub szpiku kostnym wynosiła co najmniej 80%. Od kaŝdego chorego przed włączeniem chemioterapii pobrano 3 ml krwi obwodowej (n=9) lub 1,5 ml szpiku kostnego (n=10). Krew lub szpik zawieszano w odczynniku Ficoll-Histopaque (SIGMA; USA) i wirowano przez 20 min, 3600 obr/min. Następnie komórki płukano 3-krotnie (1x w płynie Hanksa i 2 w roztworze PBS). Tak przygotowane komórki zawieszano w 0,5 ml zimnego roztworu PBS, zamraŝano i przechowywano w temperaturze 20ºC. Ocena ekspresji VEGF w komórkach nowotworowych Pomiaru zawartości białka VEGF w komórkach dokonano przy pomocy metody Western blot wykorzystując komercyjnie dostępne przeciwciała monoklonalne Biotinylated Anti-human VEGF Antibody (R&D System). W dniu badania próbki pobranych komórek jednojądrzastych rozmraŝano, przemywano zimnym roztworem PBS i wirowano przez 10 minut (2000 rpm). Następnie próbki przenoszono na lód, dodawano 200 µl buforu lizującego (20 mm HEPES, 150 mm NaCl, 10% glicerol, 1% Triton-X 100, 1,5 mm MgCl 2, 1 mm EGTA) i inkubowano na lodzie przez 1 godzinę. Po godzinie próbki ponownie wirowano przez 10 minut ( obr/min.). W uzyskanych supernatantach oznaczano stęŝenie białka całkowitego metodą Bradford'a. Pomiaru absorbancji dokonywano przy długości fali 595 nm. Z roztworu pobierano objętość zawierającą 20 µg białka. Po dodaniu buforu redukującego (0.252 M Tris-HCl, ph 6,8, 40% glicerol, 10% SDS, 5% ß-merkaptoetanol, 0,01% błękit bromofenolowy) próbki denaturowano w temperaturze 95 0 C przez 5 minut. Tak przygotowane próbki nakładano na Ŝel poliakryloamidowy z SDS (Ŝel zagęszczający 5%, Ŝel rozdzielający 13%), celem uzyskania rozdziału, przy stałym natęŝeniu prądu 10 ma/ŝel w trakcie zagęszczania próbek i 20 ma/ŝel w trakcie rozdziału. Po zakończeniu rozdziału elektroforetycznego dokonywano transferu białek na nitrocelulozę (200 ma przez 2 godz.). Po wypłukaniu membrany w buforze TBS (0,05 M Tris-HCl, ph 7,5, 0,25 M NaCl) traktowano ją 5% roztworem mleka w TBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiąŝących. Następnie dodawano biotynylowane przeciwciało pierwszorzędowe anty-human VEGF (R&D System) w rozcieńczeniu 1:250 i inkubowano w temperaturze 4 0 C przez noc. Po inkubacji membranę płukano czterokrotnie (4 15 minut) buforem TBST (TBS zawierający 0,05% Tween 20), a następnie dodawano poliklonalne kozie przeciwciało drugorzędowe (anty-goat IgG-HRP, R&D System; Minneapolis MN) w rozcieńczeniu 1:1000. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej nadmiar przeciwciał odpłukiwano buforem TBST (jak poprzednio). Wizualizację reakcji immunologicznej białko przeciwciało przeprowadzono przy pomocy metody chemiluminescencji (ECL), zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta zestawu do oznaczeń (PIERCE). Membranę płukano czterokrotnie (4 15 minut) a następnie dodawano 0,2 g BSA, 20 ml PBS łącznie z prze-

6 626 M. Czemerska i wsp. ciwciałem I-rzędowym Anti-ACTIN (SIGMA ALDRICH) w rozcieńczeniu 1:200. Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej stosowano płukanie roztworem TBS (4 15 min.). Następnie membranę traktowano przeciwciałem II-rzędowym Antirabbit IgG-HRP Antibody (R&D System) przez 1 godzinę. Płukano jak wyŝej i wywoływano. Oznaczanie osoczowego stęŝenia VEGF i PlGF Od kaŝdego chorego pobierano 10 ml krwi do jałowych probówek zawierających antykoagulant. Po ochłodzeniu w lodówce do temperatury 4 C, próbki krwi wirowano, a osocze zamraŝano i przechowywano w temperaturze 70 C. StęŜenia w/w białek oznaczano za pomocą metody immunoenzymatycznej (ELISA) stosując komercyjne zestawy firmy Quantikine R&D Systems Inc (USA). ZamroŜone próbki osocza i zestawy do badań przenoszono do temperatury pokojowej na 30 min. przed rozpoczęciem oznaczeń. Oznaczenia stęŝeń badanych białek wykonywano ściśle wg zaleceń podanych przez producenta. Na komercyjnie przygotowane płytki z zagłębieniami opłaszczonymi specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi, nakrapiano po 100 µl rozcieńczalnika (RD) załączonego przez producenta. Następnie, do części zagłębień dodawano po 100 µl próbki standardowej, zawierającej białko w znanym stęŝeniu w celu wykreślenia krzywej wzorcowej, natomiast do części zagłębień po 100 µl badanego osocza. Po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, umoŝliwiającej wiązanie białek z ufiksowanymi przeciwciałami, trzykrotnie płukano buforem dostarczonym przez producenta. Następnie dodawano do zagłębień po 200 µl koniugatów przeciwciał poliklonalnych z odpowiednimi enzymami (peroksydaza chrzanowa) i inkubowano przez kolejne 3 godziny w temperaturze pokojowej. Po czterokrotnym płukaniu dodawano po 200 µl roztworów substratu i inkubowano przez 20 min. w celu wywołania reakcji barwnej. Po upływie tego czasu dodawano 2n roztwór kwasu siarkowego, aby zatrzymać reakcję barwną. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do ilości białka związanego z ufiksowanym przeciwciałem monoklonalnym. Odczytywano ją za pomocą czytnika płytek ELISA Metertech ε960 o długości fali 450 nm., stosując filtr korekcyjny o długości fali 550 nm. StęŜenia białek odczytywano w oparciu o krzywe wzorcowe. Czułość testów dla poszczególnych białek wynosiła odpowiednio: dla VEGF 5,0 pg/ml, dla PlGF 7 pg/ml. Analiza statystyczna Uzyskane wyniki oceniono za pomocą analizy statystycznej. Dane przedstawiono jako mediany i zakresy dla zmiennych ciągłych oraz jako liczby (n) dla zmiennych kategorycznych. Do porównania dwóch prób mierzalnych stosowano test Manna- Whitneya. ZaleŜność pomiędzy parametrami ilościowymi badano za pomocą analizy korelacji a siłę zaleŝności przedstawiono za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana. Porównania i korelacje uznawano za znamienne statystycznie przy wartości p<0.05.

7 Ocena ekspresji naczyniowo-śródbłonkowego 627 WYNIKI Ocena ekspresji VEGF w komórkach białaczkowych metodą Western blot U wszystkich chorych włączonych do badania stwierdzono ekspresję VEGF w komórkach białaczkowych. Wyniki oznaczeń przedstawiono w Tabeli 2. Przykładowy wynik badania ekspresji komórkowego VEGF metodą Western blot obrazuje Rycina 1. Tabela 2. Ekspresja VEGF w komórkach białaczkowych u chorych na OBS Table 2. Expression of VEGF in AML blasts Lp. Płeć Wiek BM PB VEGF WBC LDH 1 M K K K K K K na 8 K na 9 M K M K M na 14 M M na 16 M K K K na BM próbki ze szpiku kostnego PB próbki z krwi obwodowej C VEGF Aktyna Ryc. 1. Ekspresja VEGF w badaniu Western blot. ŚcieŜki 1-5 zawierają materiał pobrany od chorych. Jako kontroli (C) uŝyto linii komórek białaczkowych HL 60. Fig. 1. Western blot. Lanes 1-5 show expression of VEGF in AML blasts, in lane C there is a positive control HL60 cells.

8 628 M. Czemerska i wsp. Ocena osoczowego stęŝenia cytokin angiogennych W osoczu krwi obwodowej u badanych chorych oraz u 18 zdrowych ochotników oznaczono stęŝenie VEGF i PlGF. U wszystkich chorych na OBS i wszystkich osób z grupy kontrolnej stwierdzono oznaczalne stęŝenia VEGF i PlGF. U chorych na OBS mediana stęŝeń VEGF (Me 42,05 pg/ml; zakres 7,2 290,0 pg/ml) była znamiennie wyŝsza w porównaniu z grupą kontrolną (Me 24,1 pg/ml; zakres 2,2 44,2 pg/ml) (p<0.04). Podobnie, osoczowe stęŝenie PlGF u chorych na OBS (Me 23,4 pg/ml pg/ml; zakres 8,6 56,2 pg/ml) było wyŝsze niŝ w grupie osób zdrowych (Me 11,2, zakres 6,4 24,1) (p<0.01) (Ryc. 2). U chorych na AML stęŝenie analizowanych cytokin nie róŝniło się znamiennie w poszczególnych podgrupach definiowanych na podstawie: wieku (<=60 vs >60 lat), płci, stanu ogólnego (PS 0-1 vs 2 3 wg ECOG), etiologii AML (de novo vs po MDS) i klasyfikacji FAB (M0-M7). W analizowanej grupie chorych nie stwierdzono korelacji pomiędzy stęŝeniem badanych cytokin a wybranymi parametrami laboratoryjnymi odzwierciedlającymi masę guza nowotworowego takimi jak WBC, odsetek blastów w szpiku kostnym, bezwzględna liczba blastów we krwi obwodowej i aktywność LDH p < 0, p < 0,01 OBS Grupa kontrolna 0 VEGF pg/ml PlGF pg/ml DYSKUSJA Ryc. 2. Osoczowe stęŝenie VEGF i PlGF u chorych na OBS i w grupie kontrolnej Fig. 2. Plasma concentration of VEGF and PlGF in AML patients and control group W licznych badaniach potwierdzono istotną rolę angiogenezy w etiopatogenezie OBS. Wykazano m.in., Ŝe gęstość drobnych naczyń krwionośnych w szpiku kostnym

9 Ocena ekspresji naczyniowo-śródbłonkowego 629 u chorych na OBS jest znamiennie większa niŝ w grupie kontrolnej [1]. Ponadto u chorych na OBS obserwowano wysokie osoczowe stęŝenie cytokin proangiogennych takich jak VEGF i bfgf [1] oraz wysoką liczbę krąŝących komórek śródbłonka (CEC, circulating endothelial cells), w tym zarówno postaci dojrzałych jak i prekursorowych [36]. VEGF jest głównym czynnikiem wzrostu dla komórek śródbłonka naczyniowego i najsilniejszym czynnikiem indukującym angiogenezę zarówno in vitro jak i in vivo. Istnieją dowody, Ŝe cytokina ta odgrywa równieŝ rolę w stymulowaniu proliferacji oraz przeŝycia komórek białaczkowych [27]. Wiele doniesień potwierdza istotne znaczenie VEGF w patofizjologii OBS, jednakŝe złoŝony mechanizm działania tej cytokiny jest obecnie przedmiotem licznych badań. W naszej pracy u wszystkich analizowanych chorych stwierdziliśmy obecność białka VEGF w komórkach białaczkowych. Wysoką ekspresję VEGF w blastach u chorych na OBS i ostrą białaczkę limfatyczną opisywali równieŝ inni autorzy [28]. Aguayo i wsp. [28] wykazali ponadto, Ŝe wysoka ekspresja VEGF w komórkach białaczkowych jest niezaleŝnym, niekorzystnym czynnikiem prognostycznym dla całkowitego czasu przeŝycia (OS, overall survival) i długości przeŝycia bez objawów choroby (DFS, disease free survival) u chorych na OBS. NaleŜy jednak podkreślić, Ŝe z przyczyn metodologicznych, zarówno w badaniach Aguayo jak i w naszej pracy analiza komórkowej ekspresji VEGF została przeprowadzona u chorych z wysoką liczbą blastów w szpiku lub krwi obwodowej. Dlatego teŝ, naleŝy zachować duŝą ostroŝność przy uogólnianiu tych wyników na całą populację chorych na OBS. W naszej pracy wykazaliśmy równieŝ, Ŝe ekspresji VEGF w komórkach białaczkowych towarzyszy wysokie osoczowe stęŝenie tej cytokiny. Obserwacje te wskazują, Ŝe głównym źrodłem VEGF w OBS są komórki nowotworowe. Aguayo i wsp. stwierdzili ponadto, Ŝe wysokie osoczowe stęŝenie VEGF jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym w OBS i koreluje z krótszym czasem przeŝycia oraz niŝszym prawdopodobieństwem uzyskania całkowitej remisji [37]. Badania Fiedler i wsp. wykazały ekspresję VEGF i jego receptorów VEGFR-1 i VEGFR-2 w komórkach białaczkowych u chorych na ostrą białaczkę szpikową, co wskazuje, Ŝe VEGF jest autokrynnym czynnikiem wzrostu w OBS [27]. Obserwacje te potwierdzają takŝe inni autorzy [38, 39]. Autokrynna stymulacja proliferacji komórek białaczkowych przez VEGF moŝe zachodzić w tzw. pętli zewnętrznej, gdy wydzielany przez komórkę VEGF oddziaływuje ze znajdującym się na jej powierzchni receptorem i w tzw. pętli wewnętrznej, kiedy VEGF nie jest wydzielany poza komórkę, jednak aktywuje jej autonomiczny wzrost poprzez wewnątrzkomórkową część receptora [40, 41]. Wydzielany przez komórki białaczkowe VEGF, oddziaływuje takŝe na komórki śródbłonka, komórki podścieliska szpiku kostnego i prawidłowe komórki krwiotwórcze. Stymuluje je do sekrecji cytokin i krwiotwórczych czynników wzrostu, które w mechanizmie parakrynnym podtrzymują nowotworową proliferację [27]. Istnieją dowody, Ŝe VEGF wydzielany jest takŝe przez komórki podścieliska szpiku oraz komórki zapalne i stymuluje proliferację patologicznych blastów w mechanizmie parakrynnym [42].

10 630 M. Czemerska i wsp. W naszej pracy po raz pierwszy wykazano, Ŝe stęŝenie PlGF w osoczu chorych na OBS jest znamiennie wyŝsze niŝ u osób zdrowych. Dotychczas nie badano znaczenia PlGF w angiogenezie u chorych na OBS, a rola PlGF w patogenezie nowotworów układu krwiotwórczego jest przedmiotem zaledwie pojedynczych doniesień. W licznych badaniach wykazano natomiast wysoką ekspresję PlGF w guzach litych tj. rak jelita grubego, rak nerki, nowotwory tarczycy, guzy zarodkowe i oponiaki [33, 43]. Niewykluczone, Ŝe cytokina ta w istotny sposób przyczynia się równieŝ do rozwoju nowotworów układu krwiotwórczego, w tym OBS. Wyniki naszych badań wskazują, Ŝe cytokiny z rodziny VEGF odgrywają istotną rolę w patogenezie OBS. Przyszłe kierunki badań w ostrej białaczce szpikowej powinny obejmować dalsze poznanie wzajemnych interakcji pomiędzy cytokinami angiogennymi a komórkami nowotworowymi. Zrozumienie tych mechanizmów umoŝliwi rozwój czynników specyficznie blokujących angiogenezę i w przyszłości pozwoli na poprawę wyników leczenia ostrej białaczki szpikowej. Istnieją dowody, Ŝe przeciwciała monoklonalne przeciwko VEGF lub VEGFR-2 skutecznie hamują angiogenezę i proliferację komórek nowotworowych [44, 45]. W badaniach eksperymentalnych wykazano znaczące antyangiogenne i przeciwbiałaczkowe działanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko VEGF i VEGFR-2 [46]. Mysie, humanizowane przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko VEGF (Bevacizumab) w skojarzeniu z chemioterapią znajduje się obecnie w II fazie badań klinicznych [47]. PIŚMIENNICTWO 1. Albitar M. Angiogenesis in Acute Myeloid Leukemia and Myelodysplastic Syndrome. Acta Haematol. 2001; 106: Asahara T, Murohara T, Sullivan A i wsp. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: Leung DW, Cachianes G, Kuang W-J i wsp. Vascular endothelial growth factor is secreted angiogenic mitogen. Science 1989; 246: Vincenti V, Cassano C, Rocchi M i wsp. Assignment of the vascular endothelial growth factor gene to human chromosome 6p21.3. Circulation 1996; 93: Houck KA, Ferrara N, Winer J i wsp. The vascular endothelial growth factor family: identification of fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. Mol Endocrinol 1991; 5: Poltorak Z, Cohen T, Sivan R i wsp.vegf145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 1997; 272: Jingjing L, Xue Y, Agarwal N i wsp. Human Muller cells express VEGF183, a novel variant of vascular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: Lange T, Guttmann-Raviv N, Baruch L i wsp. VEGF162, a new heparin-binding vascular endothelial growth factor splice form that is expressed in transformed human cells. J Biol Chem 2003; 278: Bates DO, Cui TG, Doughty JM i wsp. VEGF (165)b, an inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor, is down-regulated in renal cell carcinoma. Cancer Res 2002; 62: Ferrara N, Houck K, Jakeman L, Leung DW. Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins. Endocr Rev 1992; 13: 18-32

11 Ocena ekspresji naczyniowo-śródbłonkowego Tischer E, Mitchell R, Hartman T i wsp. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem 1991; 266: De Vries C, Escobeo JA, Ueno H i wsp. The fms-like tyrosine kinase receptor, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science 1992; 255: Terman BL, Dougher-Vermazen M, Carrion ME i wsp. Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial cell growth factor. Bioch Biophys Res Commun 1992; 187: Hamada K, Oike Y, Nobuyuki T i wsp. VEGF-C signaling pathways through VEGFR-2 and VEGFR- 3 in vasculoangiogenesis and hematopoiesis. Blood 2000; 96: Shibuya M. Structure and function of VEGF/VEGF-receptor system involved in angiogenesis. Cell Struct Funct 2001; 26: Ferrara N. Vascular endothelial growth factor as a target for anticancer therapy. Oncologist 2004; 9: (1): Shweiki D, Itin A, Soffer D i wsp. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature 1992; 359: Rak J, Yu JL, Klement G i wsp. Oncogenes and angiogenesis: signaling three-dimensional tumor growth. J Investig Deramtol Symp Proc 2000; 5: Korpelainen EL, Alitalo K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol 1998; 10: Asahara T, Takahashi T, Masuda H i wsp. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Embo J 1999; 18: Pepper MS, Ferrara N, Orci L i wsp. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 in microvascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1991; 181: Mandriota SJ, Seghezzi G, Vassalli JD i wsp. Vascular endothelial growth factor increases urokinase receptor expression in vascular endothelial cells. J Biol Chem 1995; 270: Unemori EN, Ferrara N, Bauer EA i wsp. Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells. J Cell Physiol 1992; 153: Lamoreaux WJ, Fitzgerald ME, Reiner A i wsp. Vascular endothelial growth factor increases release of gelatinase A and decreases release of tissue inhibitor of metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro. Microvasc Res 1998; 55: Gerber HP, Dixit V, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and A1 in vascular endothelial cells. J Biol Chem 1998; 273: Tran J, RakJ, Sheehan C i wsp. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins surviving and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1999; 264: Fiedler W, Graeven U, Ergün S i wsp. Vascular endothelial growth factor, a possible paracrine growth factor in human acute myeloid leukemia. Blood 1997; 89: (6): Aguayo A, Estey E, Kantarjian H i wsp. Cellular vascular endothelial growth factor is a predictor of outcome in patients with acute myeloid leukemia. Blood 1999; 94: Maglione D, Guerriero V, Viglietto G i wsp. Isolation of a human placenta cdna coding for a protein related to the vascular permeability factor. Proc Natl Acad Sci U S A 1991; 88: Maglione D, Guerriero V, Viglietto G i wsp. Two alternative mrnas coding for the angiogenic factor, placenta growth factor (PlGF), are transcribed from a single gene of chromosome 14. Oncogene 1993; 8: Cao Y, Ji WR, Qi P i wsp. Placenta growth factor: identification and characterization of a novel isoform generated by RNA alternative splicing. Biochem Biophys Res Commun 1997, 235: Yang W, Ahn H, Hinrichs M i wsp. Evidence of a novel isoform of placenta growth factor (PlGF-4) expressed in human trophoblast and endothelial cells. J Reprod Immunol 2003; 60:

12 632 M. Czemerska i wsp. 33. Autiero M, Luttun A, Tjwa M i wsp. Placental growth factor and its receptor, vascular endothelial growth factor receptor-1: novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatory disorders. J Thromb Haemost 2003; 1: Carmeliet P, Moons L, Luttun A i wsp. Synergism between vascular endothelial growth factor and placental growth factor contributes to angiogenesis and plasma extravasation in pathological conditions. Nat Med 2001; 7: Jaffe ES, Harris NL, Stein H i wsp. Pathology and genetics of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues. WHO classification of tumours Wierzbowska A, Robak T, Krawczyńska A i wsp. Kinetics and apoptotic profile of circulating endothelial cells as prognostic factors for induction treatment failure in newly diagnosed acute myeloid leukemia patients. Ann Hematol 2008; 87 (2): Aguayo A, Kantarjian HM, Estey EH i wsp. Plasma vascular endothelial growth factor levels have prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia but not in patients with myelodysplastic syndromes. Cancer 2002; 95 (9): Bellamy WT, Richter L, Frutiger Y, Grogan TM. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in hematopoietic malignancies. Cancer Res 1999; 59: Bellamy WT, Richter L, Sirjani D i wsp. Vascular endothelial cell growth factor is an autocrine promotor of abnormal localized immature myeloid precursors and leukemia progenitor formation in myelodysplastic syndromes. Blood 2001; 97: Browder TM, Dunbar CE, Nienhuis AW. Private and public autocrine loops in neoplastic cells. Cancer Cells 1989; 1: Rogers SY, Bradbury D, Kozlowski R i wsp. Evidence for internal autocrine regulation of growth in acute myeloblastic leukemia cells. Exp Hematol 1994; 22: Dias S, Shmelkov SV, Lam G i wsp. VEGF 165 promotes survival of leukemic cells by Hsp90 mediated induction of Bcl-2 expression and apoptosis inhibition. Blood 2002; 99 (7): Donnini S, Machein MR, Plate KH, Weich HA. Expression and localization of placenta growth factor and PlGF receptors in human meningiomas. J Pathol 1999; 189: Asano M, Yukita A, Matsumoto T i wsp. Inhibition of tumor growth and metastasis by an immunoneutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor121. Cancer Res 1995; 55: Brekken RA, Overholser JP, Stastny VA i wsp. Selective inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2 (KDR/Flk-1) activity by a monoclonal anti-vegf antibody blocks tumor growth in mice. Cancer Res 2000; 60: Reichert F, Barak V, Tarshis M i wsp. Anti-angiogenic effects and regression of localized murine AML produced by anti-vegf and anti-flk-1 antibodies. Eur J Haematol 2005; 75: Karp JE, Gojo I, Pili R i wsp. Targeting vascular endothelial growth factor for relapsed and refractory adult acute myelogenous leukemias. Clin Cancer Res 2004; 10 (11): Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Klinika Hematologii UM w Łodzi ul. Ciołkowskiego Łódź