(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 5/07 ( ) C12N 5/078 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/20 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Techniki in vitro z użyciem komórek macierzystych (30) Pierwszeństwo: US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/10 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/10 (73) Uprawniony z patentu: Kwalata Trading Limited, Nicosia, CY (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 VALENTIN FULGA, Tel Aviv, IL YAEL PORAT, Hod Hasharon, IL DANNY BELKIN, Givat Shmuel, IL DAPHNA SHIMONI-ZALK, Nes Ziona, IL SVETLANA POROZOV, Rehovot, IL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH ul. Żurawia 47/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 12656/11/P-RO/AT/KM EP B1 Techniki in vitro z użyciem komórek macierzystych Opis ODNOŚNIKI DO PODOBNYCH ZGŁOSZEŃ PATENTOWYCH [0001] Niniejsze zgłoszenie zastrzega prawo pierwszeństwa przed: (a) tymczasowym zgłoszeniem patentowym USA 60/576,266, złożonym 1 czerwca 2004 r., zatytułowanym Techniki in vitro do stosowania z komórkami macierzystymi oraz (b) tymczasowym zgłoszeniem patentowym USA 60/588,520, złożonym 15 lipca 2004 r., zatytułowanym Wskazania do stosowania komórek macierzystych. [0002] Oba te zgłoszenia są przypisane do cesjonariusza niniejszego zgłoszenia patentowego. DZIEDZINA WYNALAZKU [0003] Niniejszy wynalazek dotyczy w zasadzie sposobów i aparatury do leczenia chorych z zaburzeniami naczyniowymi, a zwłaszcza sposobów i aparatury ułatwiającej angiogenezę i/lub neowaskularyzację i/lub waskulogenezę. TŁO WYNALAZKU [0004] Niektóre zaburzenia czynności tętnic występują z powodu zwężenia tętnic przez złogi tłuszczowe lub inne zaburzenia naczyniowe. Może to zakłócać przepływ krwi i/lub uniemożliwia dostarczanie wystarczającej ilości składników odżywczych i tlenu do tkanek i narządów. [0005] Zaburzenia naczyniowe są powszechnymi dolegliwościami i mogą poważnie pogorszyć jakość życia pacjenta. Mimo znacznych postępów w terapii medycznej i udoskonalenia procedur rewaskularyzacji w zaburzeniach czynności tętnic, takich jak przeszczep pomostów tętnic, angioplastyka balonowa oraz stentowanie naczyń wieńcowych, znaczna część pacjentów cierpi na chorobę związaną z zaburzeniami czynności tętnic. [0006] Komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) zostały wykorzystane do leczenia pacjentów cierpiących z powodu chorób naczyniowych. W takich poważnych przypadkach, kiedy leki lub bezpośrednie procedury rewaskularyzacji nie są już skuteczne, lub nie mogą być stosowane, wymagane są alternatywne metody leczenia. EPC zostały nałożone na tkankę niedokrwioną. EPC mają zdolność do różnicowania się w celu utworzenia śródbłonka, warstwy komórek tworzących naczynia krwionośne. Komórki te biorą udział w ponownej endotelializacji, neowaskularyzacji, waskulogenezie i procesach angiogenezy. Mechanizmy, dzięki którym wszczepione EPC mogą stać się częścią procesu leczenia obejmują ponowną samopopulację, fuzję z komórkami uszkodzonych tkanek oraz wydzielanie cytokin i czynników wzrostowych. Ponowna populacja EPC oraz ich różnicowanie się w dojrzałe komórki śródbłonkowe uaktywnia ich funkcje w procesach: ponownej endotelializacji,

3 - 2 - neowaskularyzacji, waskulogenezy i angiogenezy. Ostatnie dane eksperymentalne wskazują na to, że fuzja EPC z komórkami uszkodzonych tkanek poprawia regenerację funkcji tkanek. Ponadto, w związku z wydzielaniem cytokin i czynników wzrostowych, EPC mogą wpływać na przeżywalność komórek właściwych dla tkanek i mogą pomagać w mobilizacji komórek macierzystych do uszkodzonych tkanek. [0007] Powszechna komórka prekursorowa, hemangioblast, powoduje powstanie prekursorów śródbłonkowych i krwiotwórczych (komórek krwi). Ta komórka prekursorowa różnicuje się w krwiotwórcze komórki macierzyste oraz angioblasty, które są mezodermalnymi komórkami prekursorowymi, różnicującymi się w prekursory śródbłonkowe. Komórki te mają zdolność do proliferacji, migracji i różnicowania się w komórki śródbłonkowe, ale nie nabyły jeszcze specyficznych dojrzałych markerów śródbłonkowych. Po zaangażowaniu w linię śródbłonkową, angioblasty tworzą prymitywny naczyniowy splot żył i tętnic, w procesie zwanym waskulogenezą. Ten pierwotny układ naczyniowy jest następnie poprawiany do funkcjonalnej sieci w drodze angiogenezy oraz poprzez przebudowę i arteriogenezę nowo utworzonych naczyń. Okazało się, że EPC mobilizują się (tj. migrują w zwiększonej liczbie ze szpiku kostnego (BM) do krążenia) u pacjentów z urazem naczyń lub ostrym zawałem mięśnia sercowego (AMI) (Zobacz, na przykład, poniższe dwa artykuły: (a) Gill, M., S. Dias, i wsp. (2001), "Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2(+)AC133(+) endothelial precursor cells," [Uraz naczyniowy wywołuje gwałtowną, ale przejściową mobilizację prekursorowych komórek śródbłonka VEGFR2(+)AC133(+)] Circ Res 88(2): ; oraz (b) Shintani, S., T. Murohara, i wsp. (2001), "Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction," [Mobilizacja progenitorowych komórek śródbłonka u pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego] Circulation 103(23): ) Ogólnie rzecz biorąc, stosowanie EPC ma na celu pobudzenie tworzenia się naturalnych pomostów omijających w tkankach niedokrwionych lub zbliznowaciałych, a tym samym złagodzenie stanu klinicznego u tych pacjentów. [0008] Liczne doświadczenia na zwierzętach oraz badania kliniczne zbadały możliwości tego leczenia, aby zwiększyć przepływ krwi oraz przynieść związane z tym złagodzenie objawów niedokrwienia, co przejawia się w poprawie funkcjonowania fizycznego pacjenta. [0009] Różne źródła dla autologicznych EPC do transplantacji zostały opisane, w tym komórki macierzyste aspirowane bezpośrednio ze szpiku kostnego (BM) oraz komórki macierzyste krwi obwodowej pochodzące ze szpiku kostnego. [0010] Komórki progenitorowe lub komórki macierzyste obejmują komórki szpiku kostnego, które mogą się rozmnażać, migrować i różnicować się w wiele różnych typów komórek. Krwiotwórcze komórki macierzyste szpiku kostnego są opisywane jako pozytywne CD34 (CD34+), czyli wykazują ekspresję markera CD34. [0011] Zakłada się, że plastyczność wyraźnie określonych populacji krwiotwórczych komórek progenitorowych pozwala im transróżnicować się w odpowiedzi na sygnały

4 - 3 - środowiska obecne w narządzie docelowym, a dokładniej, do przekształcania na komórki śródbłonkowe. [0012] Przeszczep szpiku kostnego jest klinicznie interesujący ze względu na relatywną prostotę procedury medycznej. Pociąga to za sobą aspirację szpiku kostnego z grzebienia kości biodrowej i natychmiastowe ponowne wstrzyknięcie aspiratu lub wybranych komórek do blizny pozawałowej. Niemniej jednak procedura jest inwazyjna i musi być wykonywana w znieczuleniu. [0013] Pierwsze dane eksperymentalne, wskazujące na obecność komórek macierzystych w krążeniu dorosłych zostały uzyskane, gdy jednojądrzaste krwinki u zdrowych ludzkich ochotników wykazały nabywanie in vitro fenotypu podobnego do komórek śródbłonkowych i przyłączanie in vivo do naczyń włosowatych. (Zobacz Asahara, T., T. Murohara, i wsp.(1997), "Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis," [Wyizolowanie domniemanych progenitorowych komórek śródbłonka do angiogenezy] Science 275(5302): 964-7). [0014] Te domniemane EPC zostały scharakteryzowane poprzez ekspresję CD34 i czynnika wzrostu śródbłonka naczyń połączonego z receptorem-2 (VEGFR-2/KDR), dwóch antygenów dzielonych przez embrionalne nabłonkowe komórki progenitorowe oraz krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC). Oprócz CD34, wczesne krwiotwórcze komórki progenitorowe wykazują ekspresję CD133.(AC133), która nie wykazuje ekspresji po różnicowaniu się. Obecnie powszechnie przyjętą definicją EPC w krążeniu są, dla celów praktycznych, komórki CD34+/VEGFR-2+ lub CD133+/VEGFR-2+. [0015] EPC krwi obwodowej można uzyskać z krwi nieleczonych pacjentów lub od pacjentów leczonych w celu zwiększenia mobilizacji EPC za pomocą cytokin, takich jak czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i monocytów (GM-CSF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) oraz czynnik wzrostu fibroblastów (FGF). Zwykle unika się zabiegów mobilizacji u pacjentów, którzy cierpią na zaburzenia pochodzenia hematologicznego lub tętniczego. Odnotowano również, że zabiegi takie jak inhibitory reduktazy HMG CoA (statyny) zwiększają liczbęepc w krążeniu. Zobacz, na przykład: 1. Dimmeler S., i wsp. (2001), "HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway," [Inhibitory reduktazy HMG-CoA (statyny) zwiększają śródbłonkowe komórki progenitorowe poprzez szlak PI3-kinazy/kinazy Akt] J. Clin. Invest 108: Hyun-Jae, Hyo-Soo Kim, i wsp. (2003), "Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilized with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infraction: the MAGIC cell randomized clinical trial," [Wpływ wewnątrzwieńcowej infuzji komórek macierzystych krwi obwodowej mobilizowanych z czynnikiem stymulującym wzrost kolonii granulocytów na funkcji skurczowej lewej komory i restenozy po zabiegach wprowadzania stentów wieńcowych w zawale mięśnia

5 - 4 - sercowego: randomizowane badanie kliniczne komórek MAGIC] The Lancet 363: Brigit Assmus, Volker Schachinger i wsp., (2002), "Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infraction (TOPCARE- AMI)," [Przeszczepienie komórek progenitorowych i poprawa regeneracji w ostrym zawale mięśnia sercowego (TOPCARE-AMI)] Circulation 106: Alexandra Aicher, Winfreid Brenner, i wsp., (2003), "Assessment of the tissue distribution of transplanted human endothelial progenitor cells by radioactive labeling," [Ocena rozmieszczenia tkanek przeszczepionych ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka przy pomocy radioaktywnego znakowania] Circulation 107: [0016] Procedura usuwania krwi obwodowej jest prostsza i wygodniejsza dla pacjenta niż usuwanie BM. Fakt, że EPC mogą zostać wyizolowane z krwi obwodowej jest dodatkowym ważnym czynnikiem w wyborze stosowania tych komórek w terapii. Wyizolowanie komórek progenitorowych z BM, który zawiera wiele innych typów komórek, jest również technicznie trudniejsze. [0017] Wyniki z zabiegów EPC i BMC pokazują poprawioną poprawioną pracę serca, większą gęstość naczyń włosowatych, znaczny wzrost liczby naczyń obocznych, poprawę echokardiograficznej frakcji wyrzutowej lewej komory, zmniejszenie zabliźniania się obszaru niedokrwienia oraz zapobieganie apoptozie kardiomiocytów w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego. Ponadto, poprawa przepływu krwi oraz gęstości naczyń włosowatych, jak i zmniejszenie tempa utraty kończyny tylnej łapy zostały wykazane w modelu niedokrwienia u nagich myszy. [0018] Poniższe artykuły opisują techniki, które mogą być stosowane w połączeniu z technikami opisanymi w niniejszym dokumencie: (1) Kalka, C., H. Masuda, i wsp.(2000). "Vascular endothelial growth factor (165) gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells in human subjects." [Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (165) zwiększa transfer genów krążących komórek progenitorowych śródbłonka u ludzi] Circ Res 86(12): (2) Kawamoto, A., H. C. Gwon, i wsp.(2001). "Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia." [Potencjał terapeutyczny ex vivo rozszerzonych progenitorowych komórek śródbłonka dla niedokrwienia mięśnia sercowego] Circulation 103(5): (3) Kawamoto, A., T. Tkebuchava, i wsp.(2003). "Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia." [Wewnątrzsercowe przeszczepianie autologicznych progenitorowych komórek śródbłonka dla terapeutycznej neowaskularyzacji niedokrwienia mięśnia sercowego] Circulation 107(3):

6 - 5 - (4) Kamihata, H., H. Matsubara, i wsp.(2001). "Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines." [Wszczepienie komórek jednojądrzastych szpiku kostnego do niedokrwionego mięśnia sercowego zwiększa oboczne krążenie pozaustrojowe oraz funkcję obszaru poprzez boczną dostawę angioblastów, angiogennych ligandów i cytokin] Circulation 104(9): (5) Kocher, A. A., M. D. Schuster, i wsp.(2001). "Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function." [Neowaskularyzacja niedokrwionego mięśnia sercowego przez ludzkie angioblasty pochodzące ze szpiku kostnego zapobiega apoptozie kardiomiocytów, zmniejsza zmianę kształtu oraz poprawia czynność sercową] Nat Med 7(4): [0019] Poniższe artykuły i rozdział książki, które również są włączone do tego dokumentu, jako odniesienie, opisują techniki, które mogą być używane w połączeniu z technikami opisanymi w niniejszym dokumencie: Flammera J i wsp.(2002). "The impact of ocular blood flow in glaucoma." [Wpływ ocznego przepływu krwi w jaskrze] Progress in Retinal and Eye Research 21: Zarbin MA (2004). "Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration." [Bieżące poglądy na patogenezę zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem] Arch Ophthalmol. 122(4): Frank RN (2004). "Diabetic retinopathy." [Retinopatia cukrzycowa] N Engl J Med 350: Singleton JR (2003). "Microvascular complications of impaired glucose tolerance." [Mikronaczyniowe powikłania upośledzonej tolerancji glukozy] Diabetes 52: Bahlmann FH i wsp. (2004). "Erythropoietin regulates endothelial progenitor cells." [Erytropoetyna reguluje śródbłonkowe komórki progenitorowe] Blood 103(3): Greenfield, Ed. (2001). "Surgery: scientific principles and practice." [Chirurgia: naukowe zasady i praktyka] Lippincot: Filadelfia, rozdział 107. Kouwenhoven EA i wsp.(2000). "Etiology and pathophysiology of chronic transplant dysfunction." [Etiologia i patofizjologia przewlekłej dysfunkcji przeszczepu] Transplant Internat. 13(6): Browne EZ i wsp.(1986). "Complications of skin grafts and pedicle flaps." [Powikłania przeszczepów skóry oraz płatów uszypułowanych] Hand Clin.2:353-9.

7 - 6 - Chen i wsp.(1991). "Four types of venous flaps for wound coverage: a clinical appraisal." [Cztery rodzaje klap żył na pokrycie rany: ocena kliniczna] J. Trauma 31(9): Beatrice i wsp.(2004) Dermatol. Surg. 30(3):399. Ferretti i wsp.(2003). "Angiogenesis and nerve regeneration in a model of human skin equivalent transplant." [Angiogeneza i regeneracja nerwów w modelu przeszczepu odpowiednika ludzkiej skóry] Life Sci. 73: Schechner i wsp.(2003). "Engraftment of a vascularized human skin equivalent." [Wszczepienie unaczynionego ludzkiego odpowiednika skóry] FASEB J. 17(15): [0020] Badania zostały przeprowadzone u ludzi w ciągu ostatnich kilku lat w celu zbadania potencjalnych korzyści wynikających z zastosowania EPC i innych komórek pochodzących ze szpiku kostnego w leczeniu zaburzeń mięśnia sercowego. Ostatnie badania pokazują, że implantacja autologicznych komórek progenitorowych po ostrym zawale mięśnia sercowego wydaje się ograniczać szkody pozawałowe. Następujące badania kliniczne koncentrują się na badaniach, w których oceniano bezpieczeństwo i skuteczność komórek pochodzących ze szpiku kostnego lub krwi podawanych u pacjentów z zaburzeniami sercowymi. [0021] Perin i wsp. przeprowadzili badanie kliniczne, które obejmowało 21 pacjentów (14 w grupie leczonej, 7 w grupie kontrolnej), którzy otrzymali zastrzyki dosercowe autologicznych jednojądrzastych BMC. (Zobacz Perin, E. C., H. F. Dohmann, i wsp. (2003), "Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure," [Dosercowy, autologiczny przeszczep komórek szpiku kostnego w ciężkiej, przewlekłej niedokrwiennej niewydolności serca] Circulation 107(18): ). W 4 miesiącu wystąpiła poprawa frakcji wyrzutu, zmniejszenie objętości końcowoskurczowej oraz znaczna mechaniczna poprawa wstrzykiwanych segmentów u leczonych pacjentów. [0022] Inna grupa wstrzykiwała autologiczne EPC do strefy granicznej zawału u sześciu pacjentów, którzy cierpieli na zawał mięśnia sercowego i zostali poddani operacji pomostowania naczyń wieńcowo-tętniczych. Od trzech do dziewięciu miesięcy po operacji, wszyscy pacjenci żyli i czuli się dobrze, a globalna funkcja lewej komory zwiększyła się u czterech pacjentów. U wszystkich sześciu pacjentów odnotowano znaczną poprawę wydolności wysiłkowej. W drodze analizy jakościowej odnotowano, że skany perfuzji mięśnia sercowego uległy zdecydowanej poprawie u pięciu z sześciu pacjentów. Wyniki tego badania wskazują, że wszczepienie EPC do serca prawdopodobnie indukuje angiogenezę, co poprawia perfuzję po zawale mięśnia sercowego. (Zobacz Stamm, C., B. Westphal, i wsp.(2003), "Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration," [Autologiczne przeszczepienie komórek macierzystych szpiku kostnego dla regeneracji serca] Lancet 361(9351): 45-6.) [0023] Badanie przeszczepienia komórek progenitorowych oraz poprawy regeneracji w ostrym zawale serca (TOPCARE-AMI) obejmowało podawanie krążących/obiegowych komórek progenitorowych śródbłonka lub komórek szpiku kostnego bezpośrednio do tętnic

8 - 7 - wieńcowych po zawale u pacjentów z reperfuzyjnym ostrym zawałem mięśnia sercowego (Zobacz Assmus, B., V. Schachinger, i wsp. (2002), "Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI)," [Przeszczepianie komórek progenitorowych oraz poprawa regeneracji w ostrym zawale mięśnia sercowego] Circulation 106(24): ). U pierwszych 20 pacjentów, 11 otrzymało EPC, a 9 otrzymało BMC. W 4 miesiącu, transplantacja komórek progenitorowych spowodowała znaczny wzrost globalnej frakcji wyrzutu lewej komory, echokardiografia wykazała poprawę miejscowej kurczliwości w strefie zawału, zmniejszone końcowoskurczowe objętości lewej komory oraz zwiększoną żywotność mięśnia sercowego w obszarze zawału w porównaniu z nierandomizowaną, dobraną grupą odniesienia. Nie wystąpiły żadne zdarzenia niepożądane leczenia u żadnego z pacjentów, takie jak zaburzenia rytmu serca lub zwiększenie aktywności kinazy keratynowej oraz troponiny. Nie było różnicy pomiędzy komórkami pochodzącymi ze szpiku kostnego i krwi obwodowej. [0024] Badanie przeprowadzone przez zespół kierowany przez Amit Patel z Uniwersytetu w Pittsburghu obejmowało 20 pacjentów z ciężką niewydolnością serca, z których dziesięciu wstrzyknięto do naczyń wieńcowych EPC pochodzące ze szpiku kostnego. W trakcie jedno-, trzy- i sześciomiesięcznej obserwacji, szybkość frakcji wyrzutu dla pacjentów komórek macierzystych uległa znacznej poprawie w porównaniu do innych pacjentów. (Zobacz: Wyciąg z Amerykańskiego Towarzystwa Chirurgii Klatki Piersiowej, Toronto, maj 2004 r.). [0025] Następujące artykuły mogą być również interesujące: J. Folkman, Y. Shing, J. Biol. Chem. 267, (1992) W. Brugger, S. Heimfeld, R. J. Berenson, R. Mertelsmann, L. Kanz, N. Engl J. Med. 333,283 (1995) F. Katz, R. W. Tindle, D. R. Sutherland, M. D. Greaves, Leuk. Res. 9, 191 (1985) R. G. Andrews, J. W. Singer, I. D. Bernstein, Blood 67, 842 (1986) B. 1. Terman, M. Dougher-Vermazen, M. E. Carrion, D. Dimitrov, D. C. Armellino, et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1579 (1992) B. Millauer, S. Wizigmann-Voos, H. Schnurch, R. Martinez, N. P. H. Moller, et al, Cell 72, 835 (1993) J. C. Voyta, D. P. Via, C. E. Butterfield, B. R. Zetter, J. Cell Biol. 99, 2034 (1984) P. J. Newman, M. C. Berndt, J. Gorski, G. C. White, S. Lyman, et al, Science 247, 1219 (1990) T. N. Sato, Y. Tozawa, U. Deutsch, K. Wolburg-Buchholz, Y. Fujiwara, et al, Nature 376, 70 (1995) H. Schnurch, W. Risau, Development 119, 957 (1993) J. L. Liesveld, K. E. Frediani, A. W. Harbol, J. F. DiPersio, C. N. Abboud, Leukemia 8, 2111 (1994).

9 - 8 - S. Takeshita, L. P. Zheng, E. Brogi, M. Kearney, L. Q. Pu, et al, J. Clin. Invest. 93, 662 (1994) R. Baffour, J. Berman, J. L. Garb, S. W. Rhee, J. Kauffman, et al, J. Vasc. Surg. 16, 181 (1992) J. M. Isner, A. Pieczek, R. Schainfeld, R. Blair, L. Haley, et al, Lancet 348, 370 (1996) Y. Sato, K. Okamura, A. Morimoto, R. Hamanaka, K. Hamanaguchi, et al, Exp. Cell Res. 204, 223 (1993) [0026] Następujące artykuły mogą być również interesujące: Badorff, C., R. P. Brandes, i wsp.(2003). "Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes." Circulation 107(7): Bhattacharya, V., P. A. McSweeney, i wsp. (2000). "Enhanced endothelialization and microvessel formation in polyester grafts seeded with CD34(+) bone marrow cells." Blood 95(2): Grant, M. B., W. S. May, i wsp.(2002). "Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization." Nat Med 8(6): Hirata, K., T. S. Li, i wsp.(2003). "Autologous bone marrow cell implantation as therapeutic angiogenesis for ischemic hindlimb in diabetic rat model." Am J Physiol Heart Circ Physiol 284(1): H Ikenaga, S., K. Hamano, i wsp.(2001). "Autologous bone marrow implantation induced angiogenesis and improved deteriorated exercise capacity in a rat ischemic hindlimb model." J Surg Res 96(2): Kalka, C., H. Masuda, i wsp.(2000). "Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization." Proc Natl Acad Sci USA 97(7): Kaushal, S., G. E. Amiel, i wsp.(2001). "Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo." Nat Med 7(9): Kornowski, R., M. B. Leon, i wsp.(2000). "Electromagnetic guidance for catheterbased transendocardial injection: a platform for intramyocardial angiogenesis therapy. Results in normal and ischemic porcine models." J Am Coll Cardiol 35(4): Li, R. K., Z. Q. Jia, i wsp.(1996). "Cardiomyocyte transplantation improves heart function." Ann Thorac Surg 62(3): ; discussion Rajnoch, C., J. C. Chachques, i wsp.(2001). "Cellular therapy reverses myocardial dysfunction." J Thorac Cardiovasc Surg 121(5): Schatteman, G. C., H. D. Hanlon, i wsp.(2000). "Blood-derived angioblasts accelerate blood-flow restoration in diabetic mice." J Clin Invest 106(4):

10 - 9 - Shintani, S., T. Murohara, i wsp.(2001). "Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation." Circulation 103(6): Strauer, B. E., M. Brehm, i wsp.(2002). "Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans." Circulation 106(15): Taylor, D. A., B. Z. Atkins, i wsp.(1998). "Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation." Nat Med 4(8): Thompson, C. A., B. A. Nasseri, i wsp.(2003). "Percutaneous transvenous cellular cardiomyoplasty. A novel non-surgical approach for myocardial cell transplantation." J Am Coll Cardiol 41(11): Tomita, S., R. K. Li, i wsp.(1999). "Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function." Circulation 100(19 Suppl): II Tomita, S., D. A. Mickle, i wsp.(2002). "Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation." J Thorac Cardiovasc Surg 123(6): Wang i wsp.(2004). "Rosiglitazone facilitates angiogenic progenitor cell differentiation toward endothelial lineage: a new paradigm in glitazone pleiotropy." Circulation 109(11): Rupp i wsp.(2004). "Statin therapy in patients with coronary artery disease improves the impaired endothelial progenitor cell differentiation into cardiomyogenic cells." Basic Res Cardiol. 99(1): Quirici i wsp.(2001). "Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells." Br J Haematol. 115(1): Di Stefano i wsp.(2002) "Different growth conditions for peripheral blood endothelial progenitors." Cardiovasc Radiat Med. 3(3-4): Akita i wsp.(2003). "Hypoxic preconditioning augments efficacy of human endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization." Lab Invest. 83(1): Wang i wsp.(2004). "Mechanical, cellular, and molecular factors interact to modulate circulating endothelial cell progenitors." Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286(5): H Bahlmann i wsp. (2003). "Endothelial progenitor cell proliferation and differentiation is regulated by erythropoietin." Kidney Int. 64(5): Heeschen i wsp. (2003). "Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization." Blood. 102(4):

11 Verma i wsp. (2004). "C-reactive protein attenuates endothelial progenitor cell survival, differentiation, and function: Further evidence of a mechanistic link between C-reactive protein and cardiovascular disease." Circulation. 109 (17): [0027] Patenty USA , oraz autorstwa Isnera i wsp. na ogół opisują produkty farmaceutyczne, w tym prekursory EC do stosowania w sposobach regulacji angiogenezy, czyli do poprawy lub hamowania tworzenia naczyń krwionośnych u wybranego pacjenta oraz w pewnych korzystnych przykładach wykonania dla kierowania modulatora angiogenezy do określonych miejsc. Na przykład, protoplasty komórek śródbłonka mogą być stosowane w celu wzmocnienia angiogenezy lub podawania modulatora angiogenezy, np. anty- lub pro-angiogennych środków, odpowiednio, do miejsc angiogenezy patologicznej lub funkcjonalnej. Dodatkowo, w innym przykładzie wykonania, protoplasty komórek śródbłonka mogą zostać wykorzystane do wywołania ponownej endotelializacji z uszkodzonych naczyń krwionośnych, a tym samym zmniejszyć restenozę przez pośrednie hamowanie proliferacji komórek mięśni gładkich. [0028] Patent USA autorstwa Kanza i wsp. opisuje wysokie dawki chemioterapii dla pacjentów cierpiących na niektóre rodzaje raka. W celu ułatwienia powrotu do zdrowia, proces pozaustrojowej ekspansji komórek progenitorowych krwi obwodowej jest opisane, przy czym komórki CD34 + są wzbogacane oraz hodowane w pożywce zawierającej IL-1, IL- 3, IL-6, EPO i SCF. Uzyskane podczas ekspansji pozaustrojowej komórki progenitorowe krwi obwodowej mogą być podawane chorym na raka pacjentom po chemioterapii. [0029] Publikacja zgłoszenia patentowego USA 2003/ autorstwa Itescu opisuje sposób leczenia zaburzeń serca u pacjenta po utracie kardiomiocytów. Metoda obejmuje podawanie pacjentowi ilości środka opisanego jako skutecznie powodującego proliferację kardiomiocytów w sercu pacjenta tak, aby w ten sposób leczyć to zaburzenie. W przykładzie wykonania, środek stanowią ludzkie komórki progenitorowe śródbłonka. Zgłoszenie patentowe opisuje również sposoby określania podatności kardiomiocytów u pacjenta na apoptozę. [0030] Zgłoszenie PCT WO 01/94420 autorstwa Itescu, opisuje sposób stymulowania waskulogenezy tkanki uszkodzonej przez zawał mięśnia sercowego u pacjenta, obejmujący: (a) usuwanie komórek macierzystych z lokalizacji u pacjenta; (b) odzyskiwanie komórek progenitorowych śródbłonka z komórek macierzystych (c) wprowadzenie komórek progenitorowych śródbłonka z etapu (b) do innej lokalizacji u pacjenta tak, że prekursory migrują do i stymulują rewaskularyzację tkanki. Komórki macierzyste mogą być usuwane bezpośrednio lub w drodze mobilizacji. Komórki progenitorowe śródbłonka mogą być poddawane ekspansji przed ich wprowadzeniem do organizmu pacjenta. Sposób indukowania angiogenezy w tkance okołozawałowej jest opisany. Sposób jest także opisany dla selektywnie rosnącej wymiany prekursorów komórek śródbłonka pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego do tkanki uszkodzonej w wyniku obrażenia niedokrwiennego, które obejmuje: (a) podawanie komórek progenitorowych śródbłonka pacjentowi, (b) podawanie chemokin pacjentowi z zastrzeżeniem, żeby w ten sposób przyciągnąć prekursory komórek śródbłonka do tkanki niedokrwionej. Opisany jest również sposób stymulowania

12 waskulogenezy lub angiogenezy tkanki uszkodzonej przez zawał mięśnia sercowego u pacjenta, obejmujący wstrzykiwanie allogenicznych komórek macierzystych do pacjenta. Sposób ten jest także opisany w celu poprawy funkcji mięśnia sercowego u pacjenta, który przeszedł zawał mięśnia sercowego, zawierający którykolwiek z błyskawicznych sposobów. Sposób ten jest także opisany w celu poprawy funkcji mięśnia sercowego u pacjenta, który przeszedł zawał mięśnia sercowego, zawierający wstrzykiwanie G-CSF lub przeciwciał anty- CXCR4 pacjentowi w celu mobilizowania komórek progenitorowych śródbłonka. [0031] Patent USA 5,199,942 autorstwa Gillis opisuje sposób autologicznej transplantacji komórek krwiotwórczych u pacjentów poddawanych terapii cytoredukcyjnej, w tym: (1) otrzymujących krwiotwórcze komórki progenitorowe ze szpiku kostnego lub krwi obwodowej od pacjenta przed terapią cytoredukcyjną; (2) rozszerzających krwiotwórcze komórki progenitorowe ex vivo z ex vivo czynnikiem wzrostu wybranym z grupy składającej się z interleukiny-3 (IL-3), współczynnika stali (SF), czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), interleukiny-1 (IL-1), białek fuzyjnych GM- CSF/IL-3 i ich kombinacji, w celu dostarczenia preparatu komórkowego zawierającego populację komórek progenitorowych poddaną ekspansji; oraz (3) podawanie pacjentowi preparatu komórkowego jednocześnie z lub po terapii cytoredukcyjnej. Sposób ten opcjonalnie obejmuje wstępne leczenie czynnikiem wzrostu przyciągającym krwiotwórcze komórki progenitorowe do krwi obwodowej oraz późniejszego leczenia za pomocą czynnika wzrostu ułatwiającego wszczepienie i proliferację krwiotwórczych komórek progenitorowych podawanych w preparacie komórkowym. Patent opisuje także kompozycję podłoża do mnożenia krwiotwórczych komórek progenitorowych zawierającą podłoża komórkowe, czynnik wzrostu ex vivo oraz surowicę autologiczną. [0032] Patent USA 4,656,130 autorstwa Shoshan opisuje płytkę wzrostu komórek powlekaną kolagenem, która zawiera podłoże pokryte stabilną powłoką magazynowania z włókienek kolagenowych. Sposób przygotowania płytki wzrostu komórek, powlekanej kolagenem, obejmuje dozowanie biologicznie czynnych włókienek kolagenowych zawieszonych w wodzie destylowanej na szalkę Petriego z tkanką. Następnie, szalka Petriego, zawierająca zawiesinę włókienek kolagenowych umieszczana jest w kapturze z przepływem laminarnym o sterylnym strumieniu powietrza i świetle ultrafioletowym. Osad włókien oraz przylega do dna naczynia, woda wyparowuje w sterylnym strumieniu powietrza i jest usuwana na wylocie kaptura z laminarnym przepływem, a światło ultrafioletowe zapewnia, że powstała cienka warstwa włókienek kolagenowych jest sterylna i gotowa do zaszczepienia żywych komórek. Sposób ten jest opisany jako uzyskiwanie dogodnej, wstępnie powlekanej płytki wzrostu komórek, która może utrzymać rozsądny okres trwałości, gdy jest przechowywana w temperaturze pokojowej, bez znacznego spadku właściwości wspomagających wzrostu komórek. [0033] Patent USA 5,932,473 autorstwa Swiderek i wsp. opisuje podłoże hodowli komórkowej, które pokryte jest kompozycją zawierającą promotor adhezji komórek w roztworze soli. Podłoże, takie jak tworzywo sztuczne, szkło lub mikroporowate włókna pokryte jest kompozycją zawierającą około ug/ml poli-d-lizyny w cytrynianie 0.005

13 ,5 M lub roztworze soli siarczanowej, w celu dostarczenia około ul kompozycji na cm2 podłoża. Powlekane podłoże jest płukane, aby usunąć obce materiały i osuszane w celu uzyskania powlekanego podłoża o zwiększonej trwałości i/lub stabilności. Powlekane podłoże może być sterylizowane przez płukanie środkiem do sterylizacji, takim jak etanol. [0034] Patent USA 6,040,182 autorstwa Septak opisuje sposoby i materiały ułatwiające wysoką zdolność wiązania białek na powierzchniach z tworzyw sztucznych do hodowli tkankowych, takich jak, na przykład, płytki do testów z polistyrenu. [0035] Patent USA 4,450,231 autorstwa Ozkan opisuje testy immunologiczne próbki surowicy lub tym podobne w celu ustalenia kompleksów immunologicznych. Opisany jest sposób, który obejmuje wytwarzanie podłoża z tworzywa sztucznego warstwy niebiałkowego, niejonowego polimeru, który będzie przylegać do podłoża z tworzywa sztucznego i który ma zdolność absorpcyjną kompleksów immunologicznych próbki, umieszczania próbki na warstwie i leczenia warstwy w celu wytworzenia wskazania ilości kompleksów immunologicznych. Polimerem może być glikol polietylenowy, dekstran, polichlorek winylu, poliol polimerowy lub związek addycyjny glikolu polietylenowego. Korzystnym produktem do stosowania w takim teście jest płytka z dołkami lub probówka wykonana z tworzywa sztucznego, polistyrenu i polichlorku winylu, z warstwą takiej niebiałkowej, niejonowej warstwy na dołkach płytki lub wnętrzu probówki. [0036] Publikacja zgłoszenia patentowego USA 2003/ autorstwa Kutryk i wsp. opisuje kompozycje i sposoby wytwarzania urządzenia medycznego, takiego jak stent, stentgraft, sztuczna proteza naczyniowa lub zastawek serca, które są pokryte biokompatybilną macierzą zawierającą przeciwciała, fragmenty przeciwciał lub małe cząsteczki, które rozpoznają, wiążą się z i/lub wchodzą w reakcję z antygenem powierzchniowym komórki progenitorowej w celu unieruchomienia komórek na powierzchni urządzenia. Powłoka na urządzeniu może również zawierać związek lub czynnik wzrostu pobudzający progenitorową komórkę śródbłonka do przyspieszenia przywierania, wzrostu i różnicowania się związanych komórek w dojrzałe i funkcjonalne komórki śródbłonka na powierzchni urządzenia, aby uniknąć rozrostu błony wewnętrznej. Sposoby przygotowania takich urządzeń medycznych, kompozycji i sposobów leczenia ssaka z chorobą naczyniową, taką jak restenoza, miażdżyca lub inne rodzaje obstrukcji naczyniowych są opisane. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0037] Niniejsze zgłoszenie patentowe wyszczególnia sposoby izolowania, różnicowania się i ekspansji komórek macierzystych z tkanki. Na przykład, komórki macierzyste mogą zawierać komórki progenitorowe śródbłonka (EPC). Alternatywnie lub dodatkowo, tkanka może zawierać ludzką krew obwodową. Zazwyczaj komórki macierzyste przeszczepiane do dawcy lub do innej osoby (np. w celu zwiększenia waskulogenezy i/lub angiogenezy i/lub neowaskularyzacji). Niniejsze zgłoszenie patentowe dostarcza protokoły w celu uzyskania produktu zawierającego odpowiednią liczbę funkcjonalnych EPC. Opisane sposoby obejmują: (a) ekstrakcję podpopulacji komórkowej z tkanki; (b) ekspansję oraz różnicowanie się EPC w hodowli przez 1-30 dni (lub 3-30, bądź 4, 5, 6, 7 lub 8 dni ) we wzbogaconej pożywce; i/lub

14 (c) identyfikacja komponentów komórkowych hodowli; (d) wszczepienie pacjentowi odpowiedniej liczby EPC. Należy zrozumieć, że podczas, gdy niektóre przykłady wykonania opisane w niniejszym dokumencie odnoszą się konkretnie do EPC pozyskiwanych z krwi, zakres niniejszego wynalazku obejmuje techniki do stosowania z komórkami macierzystymi pochodzącymi z różnych tkanek ciała, mutatis mutandis. [0038] W niektórych zastosowaniach, sposób składa się z pobierania próbek krwi od dawcy i/lub pacjenta, izolowanie z tej próbki komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, oddzielenia populacji komórek bogatych w CD31 oraz komórek progenitorowych z części komórek jednojądrzastych, i hodowania tych komórek w warunkach, które spowodują, że krwiotwórcze komórki progenitorowe obecne w mieszaninie komórek będą różnicować się w EPC i rozmnażać. Ten etap ekspansji ex vivo jest zwykle wykorzystywany, ponieważ liczba EPC w obiegu wynosi poniżej 0,1%. Po tym etapie zwiększania, komórki mogą być wszczepiane poprzez wstrzykiwanie do naczyń krwionośnych narządu docelowego, takiego jak naczynia wieńcowe lub do mięśnia sercowego pacjenta. [0039] Dostarcza się zatem sposobu użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmującego: wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; oraz zwiększenie liczby komórek o gęstości w zakresie od 1,055 do 1,068 g / ml, poprzez hodowanie komórek drugiego przejścia przez okres trwający od 3 do 30 dni. [0040] Zastosowanie komórek krwi do pierwszego gradientu obejmuje zastosowanie komórek krwi do gradientu zawierającego kopolimery sacharozy i epichlorohydryny, takie jak Ficoll-Paque Plus (TM) (Amersham Biosciences, Uppsala, Szwecja) lub Lymphoprep (TM) (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norwegia) lub możliwe do uzyskania z innego źródła. W przykładzie wykonania, gradient gęstości jest przygotowywany przez technika na miejscu. [0041] Zastosowanie komórek pierwszego przejścia komórki do drugiego gradientu obejmuje zastosowanie komórek pierwszego przejścia do gradientu zawierającego wodny roztwór jodiksanolu takiego jak OptiPrep (TM) lub Nycodenz (TM) (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norwegia). [0042] Zastosowanie komórek pierwszego przejścia do drugiego gradientu obejmuje zastosowanie komórek pierwszego przejścia do gradientu, w tym koloidów krzemionkowych pokrytych poliwinylopirolidonem, takich jak Percoll (TM) (Amersham Biosciences, Uppsala, Szwecja). [0043] Ponadto istnieje sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanymi komórkami macierzystymi, obejmujący:

15 zastosowanie tkanki zawierającej komórki macierzyste do pierwszego gradientu nadającego się do wybierania komórek pierwszego przejścia komórek o gęstości mniejszej niż g/ml; wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; zastosowanie komórek drugiego przejścia do trzeciego gradientu nadającego się do wybierania komórek trzeciego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; oraz zwiększenie liczby komórek o gęstości w zakresie od do g/ml, poprzez hodowanie komórek trzeciego przejścia przez okres trwający od 3 do 30 dni. [0044] Trzeci gradient nadaje się do wybierania komórek o gęstości w zakresie od do g/ml, przy czym zastosowanie komórek drugiego przejścia do trzeciego gradientu obejmuje wybieranie komórek o gęstości w zakresie od do g/ml. [0045] Istnieje również sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmujący: wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; oraz inkubację komórek drugiego przejścia na powierzchni zawierającej (np. powlekanej) osocze krwi i/lub przeciwciało. [0046] Dostarczono na dodatek sposobu użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmującego: wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; oraz inkubację komórek drugiego przejścia na powierzchni zawierającej cząsteczkę przyspieszającą wzrost, inną niż kolagen lub fibronektyna. [0047] Inkubacja komórek drugiego przejścia obejmuję inkubację komórek drugiego przejścia na powierzchni, która zawiera, oprócz cząsteczki przyspieszającej wzrost, przynajmniej jedno z następujących: kolagen i fibronektyna. [0048] Istnieje jeszcze dodatkowo sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmujący:

16 wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; oraz hodowanie komórek drugiego przejścia przez okres trwający od 1 do 5 dni w pożywce zawierającej 5% surowicy (np. brak surowicy, mniej niż 1% surowicy lub od 1 do 5% surowicy). [0049] Jest jeszcze dodatkowo sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmujący: wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; oraz hodowanie komórek drugiego przejścia przez okres trwający od 1 do 5 dni w pożywce zawierającej więcej niż lub równo 10% surowicy. [0050] Hodowanie komórek drugiego przejścia obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej mniej niż 20% surowicy. [0051] Istnieje również sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmujący: wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; podczas niskiego stężenia surowicy, hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej mniej niż 10% surowicy; oraz podczas wysokiego stężenia surowicy, hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej ponad 10% surowicy. [0052] Hodowanie komórek drugiego przejścia podczas niskiego stężenia surowicy obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia przez okres od 1 do 5 dni. [0053] Hodowanie komórek drugiego przejścia podczas wysokiego stężenia surowicy obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia przez okres od 1 do 30 dni. [0054] Hodowanie komórek drugiego przejścia podczas niskiego stężenia surowicy odbywa się przed hodowaniem komórek drugiego przejścia podczas wysokiego stężenia surowicy. [0055] Hodowanie komórek drugiego przejścia podczas niskiego stężenia surowicy odbywa się po hodowaniu komórek drugiego przejścia podczas wysokiego stężenia surowicy [0056] Dostarczono ponadto sposobu użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmującego:

17 wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie od do g/ml; w okresie hipoksja i/lub hiperkapni (H/H), trwającym przynajmniej 2 godziny, hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H; oraz w okresie nie występowania H/H, trwającym przynajmniej 1 dzień, hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach nie występowania H/H. [0057] W kontekście niniejszego zgłoszenia patentowego oraz w zastrzeżeniach patentowych, termin hiperkapnia odnosi się do stężenia CO2, które jest większe niż 5%. [0058] Okresy występowania H/H i nie występowania H/H mieszczą się w przedziale czasowym trwającym krócej niż 30 dni, a hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H podczas pierwszych dwóch dni okresu hodowli. [0059] Okresy występowania H/H i nie występowania H/H mieszczą się w przedziale czasowym trwającym krócej niż 30 dni, a hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H podczas ostatnich dwóch dni okresu hodowli. [0060] Okresy występowania H/H i nie występowania H/H mieszczą się w przedziale czasowym trwającym krócej niż 30 dni, a hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H przez przynajmniej 2 godziny pomiędzy pierwszymi dwoma dniami, a dwoma ostatnimi dniami okresu hodowli. [0061] Hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H odbywa się przed hodowaniem komórek drugiego przejścia w warunkach niewystępowania H/H. [0062] Hodowanie komórek drugiego przejścia w warunkach H/H odbywa się po hodowaniu komórek drugiego przejścia w warunkach niewystępowania H/H. [0063] Dostarczono ponadto sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmujący: wybierania komórek drugiego przejścia w zakresie od do g/ml; oraz hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej przynajmniej jedno z następujących: erytropoetyna, VEGF, IGF, FGF, cząsteczka z rodziny estrogenów (np. 17-β-estradiol, estron, estriol, pochodna estradiolu, walerianian estradiolu, cypionian estradiolu, mestranol, chinestrol), cząsteczka z rodziny progestagenów (np.

18 progesteron, karonian hydroksyprogesteronu, octan medroksyprogesteronu), statyna (np. simwastatyna, atorwastatyna) oraz środek przeciwcukrzycowy (np. rozyglitazon). [0064] Środek przeciwcukrzycowy zawiera rozyglitazon, a hodowanie komórek drugiego przejścia obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej rozyglitazon. [0065] Statyna obejmuje symwastatynę lub atorwastatynę, a hodowanie komórek drugiego przejścia obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej symwastatynę lub atorwastatynę. [0066] Cząsteczki hormonu z rodziny estrogenów i progestagenów zawierają 17-β-estradiol oraz progesteron, a hodowanie komórek drugiego przejścia obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej 17-β-estradiol i/lub progesteron. [0067] Cząsteczki hormonu z rodziny estrogenów i progestagenów zawierają 17-β-estradiol oraz progesteron, a hodowanie komórek drugiego przejścia obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej 17-β-estradiol, i do której progesteron dodawany jest po pewnym czasie. [0068] Cząsteczki hormonu z rodziny estrogenów i progestagenów zawierają 17-β-estradiol oraz progesteron, a hodowanie komórek drugiego przejścia obejmuje hodowanie komórek drugiego przejścia w pożywce zawierającej progesteron i do której 17-β-estradiol jest dodawany po pewnym czasie. [0069] Ponadto istnieje jeszcze sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanych komórek macierzystych, obejmujący: zastosowanie tkanek zawierających komórki macierzyste do pierwszego gradientu nadającego się do wybierania komórek pierwszego przejścia o gęstości mniejszej niż g/ml; wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml; oraz zwiększenie liczby komórek o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml poprzez hodowanie komórek drugiego przejścia przez okres trwający od 3 do 30 dni. [0070] Sposób ten obejmuje ekstrakcję komórek macierzystych ze szpiku kostnego. [0071] Sposób ten obejmuje mobilizowanie komórek macierzystych ze szpiku kostnego w celu ułatwienia ekstrakcji komórek macierzystych. [0072] Sposób ten obejmuje ekstrakcję komórek macierzystych z krwi, krwi pępowinowej, zarodka, płodu lub łożyska. [0073] Hodowanie komórek drugiego przejścia obejmuje: hodowanie komórek drugiego przejścia komórki w pierwszym pojemniku w trakcie pierwszej części okresu;

19 usuwanie przynajmniej części komórek drugiego przejścia z pierwszego pojemnika pod koniec pierwszej części okresu; oraz hodowanie, w drugim pojemniku, podczas drugiej części okresu, komórek usuniętych z pierwszego pojemnika. [0074] Usuwanie przynajmniej niektórych komórek drugiego przejścia obejmuje wybieranie do usunięcia komórek, które przylegają do powierzchni pierwszego pojemnika. [0075] Usuwanie przynajmniej niektórych komórek drugiego przejścia obejmuje wybieranie do usunięcia komórek, które nie przylegają do powierzchni pierwszego pojemnika. [0076] Pierwszy pojemnik zawiera na swojej powierzchni cząsteczkę przyspieszającą wzrost, a hodowanie komórek w pierwszym pojemniku obejmuje hodowanie komórek w pierwszym pojemniku, który zawiera cząsteczkę przyspieszającą wzrost. [0077] Drugi pojemnik zawiera na swojej powierzchni cząsteczkę przyspieszającą wzrost, a hodowanie komórek w drugim pojemniku obejmuje hodowanie komórek w drugim pojemniku, który zawiera cząsteczkę przyspieszającą wzrost. [0078] Cząsteczka przyspieszająca wzrost jest wybierana z listy składającej się z: osocza krwi (które może być autologiczne, allogeniczne lub ksenogenne), kolagenu, fibronektyny, czynnika wzrostu oraz przeciwciała dla receptora powierzchni komórek macierzystych. [0079] Istnieje zatem sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmujący: wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml; zwiększenie liczby komórek o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml, poprzez hodowanie komórek drugiego przejścia przez okres trwający od 3 do 30 dni; oraz identyfikację komórek progenitorowych śródbłonka w hodowli komórkowej. [0080] Zastosowanie krwi do pierwszego gradientu obejmuje zastosowanie krwi do roztworu zawierającego kopolimer sacharozy i epichlorohydryny. [0081] Zastosowanie komórek pierwszego przejścia do drugiego gradientu obejmuje zastosowanie komórek pierwszego przejścia do wodnego roztworu jodiksanolu. [0082] Zastosowanie komórek pierwszego przejścia do drugiego gradientu obejmuje zastosowanie komórek pierwszego przejścia do roztworu o stopniowej gęstości zawierającego koloidy krzemionkowe powlekane poliwinylopirolidonem. [0083] Zastosowanie komórek krwi do pierwszego gradientu obejmuje zastosowanie komórek krwi do gradientu podobnego do Ficoll.

20 [0084] Zastosowanie komórek pierwszego przejścia do drugiego gradientu obejmuje zastosowanie komórek pierwszego przejścia do gradientu podobnego do OptiPrep. [0085] Zastosowanie komórek pierwszego przejścia do drugiego gradientu obejmuje zastosowanie komórek pierwszego przejścia do gradientu podobnego do Percoll. [0086] Istnieje również sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanych komórek macierzystych, obejmujący: zastosowanie tkanki zawierającej komórki macierzyste do pierwszego gradientu nadającego się do wybierania komórek pierwszego przejścia o gęstości mniejszej niż g/ml; wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml; zastosowania komórek drugiego przejścia do trzeciego gradientu nadającego się do wybierania komórek trzeciego przejścia o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml; zwiększenie liczby komórek o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml, poprzez hodowanie komórek trzeciego przejścia przez okres trwający od 3 do 30 dni; oraz identyfikację komórek progenitorowych śródbłonka w hodowli komórkowej. [0087] Trzeci gradient nadaje się do wybierania komórek o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml, przy czym zastosowanie komórek drugiego przejścia do trzeciego gradientu obejmuje wybieranie komórek o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml. [0088] Istnieje również sposób użycia z wykorzystaniem ekstrahowanej krwi, obejmujący: wybierania komórek drugiego przejścia o gęstości w zakresie pomiędzy a g/ml; hodowanie komórek drugiego przejścia na powierzchni zawierającej osocze krwi; oraz identyfikację komórek progenitorowych w hodowli komórkowej. [0089] Hodowanie obejmuje hodowane komórek drugiego przejścia na powierzchni, gdy powierzchnia jest pokryta autologicznym osoczem krwi. [0090] Hodowanie obejmuje hodowane komórek drugiego przejścia na powierzchni, gdy powierzchnia jest pokryta przynajmniej jednym z osoczy krwi, wybranym z listy składającej się z: osocza allogenicznego i osocza ksenogennego. [0091] Istnieje również sposób użycia z wykorzystaniem tkanek, obejmujący: hodowanie tkanek na powierzchni zawierającej osocze krwi. [0092] Tkanka zawiera krew. Osocze krwi zawiera osocze autologiczne.