Rodzaje autoprzeciwciał w chorobach reumatycznych i metody ich oznaczeń

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(3): Praca poglądowa Review Article Rodzaje autoprzeciwciał w chorobach reumatycznych i metody ich oznaczeń Different types of autoantibodies in rheumatic diseases and methods of their determination Alicja Grim 1, Katarzyna Komosińska-Vassev 2, Paweł Olczyk 3 1 Śląskie Centrum Reumatologii, Rehabilitacji i Zapobiegania Niepełnosprawności im. gen. Jerzego Ziętka w Ustroniu Sp. z o. o. 2 Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 3 Zakład Farmacji Aptecznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Streszczenie Choroby reumatyczne, to grupa chorób przewlekłych o zróżnicowanej, często niewyjaśnionej etiologii o podłożu autoimmunizacyjnym. Są konsekwencją odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko własnym antygenom w procesie autoimmunizacji. Powstające autoprzeciwciała łączą się z autoantygenem prowadząc do uszkodzenia komórek i tkanek organizmu. Choroby te cechuje występowanie autoprzeciwciał z charakterystyczny profilem reaktywności antygenowej, pomocnym dla postawienia właściwego rozpoznania. Stwierdzono korelację występowania niektórych autoprzeciwciał, tak zwanych markerowych z określonym obrazem klinicznym. Przeciwciała te mają dużą wartość diagnostyczną i prognostyczną. Należy podkreślić, że stwierdzenie samej obecności przeciwciała w badanej surowicy, nie może stanowić kryterium rozpoznania choroby, bez wystąpienia objawów klinicznych. Ważną rolę w immunodiagnostyce chorób reumatycznych odgrywają badania serologiczne, zwłaszcza metoda immunofluorescencji pośredniej, która stanowi złoty standard w diagnostyce przeciwciał przeciwjądrowych. Praca zawiera opis przeciwciał występujących w przebiegu chorób reumatycznych wraz z oceną przydatności klinicznej tych przeciwciał a także ich immunodiagnostykę laboratoryjną. Summary Rheumatic diseases are a group of chronic disorders with varied and frequently unexplained autoimmune etiology. They results from an immune response targeted against own antigens in the autoimmune process. Arising autoantibodies bind to the autoantigen, ultimately leading to cell and tissue damage. Rheumatic diseases are characterized by the presence of antibodies exhibiting a specific antigenic activity which is useful for making the correct diagnosis. There is a known correlation between the certain autoantibodies, so-called marker autoantibodies, and specific clinical findings. Autoantibodies from this group have a high diagnostic and prognostic value. It must be emphasized that the detection of antibody in the blood serum is not in itself sufficient for diagnosis a disease, if no clinical symptoms are present. A major role in the immune diagnostics of rheumatic diseases is played by serological tests, primarily the indirect immunofluorescence assay, the last one being recognized as a gold standard in antinuclear antibodies detection. This thesis contains a description of different types of antibodies found in rheumatic disorders, an evaluation of their clinical usefulness and immunodiagnostic methods of their determination. Słowa kluczowe: Key words: choroby reumatyczne, ANA, RF, CCP, ANCA, diagnostyka laboratoryjna rheumatic diseases, ANA, RF, CCP, ANCA, laboratory diagnostics. Wstęp Choroby reumatyczne o podłożu autoimmunizacyjnym należą do grupy chorób o zróżnicowanej, często niewyjaśnionej etiologii i bogatej symptomatologii. Wspólną ich cechą, oprócz podłoża łącznotkankowego, jest różna etiologia w tym infekcyjna, immunologiczna, lekowa, środowiskowa, mechaniczna zaś w obrazie klinicznym długotrwały przebieg z okresami remisji i zaostrzeń, obejmujący różne tkanki i narządy, mający często charakter układowy. Złożoność objawów klinicznych, wahania ich nasilenia, także częstość nakładania się jednostek chorobowych może nastręczać trudności diagnostyczne. Choroby autoimmunizacyjne występują częściej u kobiet niż u mężczyzn, częściej także we wczesnym okresie dorosłego życia [1, 2]. Cechują się ponadto występowaniem autoprzeciwciał i charakterystycznym profilem 235

2 reaktywności antygenowej, pomocnym dla postawienia właściwego rozpoznania [1]. Określony profil przeciwciał nie tłumaczy jednak, dlaczego dany narząd lub tkanka są atakowane w danym zespole klinicznym, natomiast wskazuje, iż ich uszkodzenie jest wynikiem procesu zapalnego, powstającego na podłożu zaburzeń immunologicznych. Stwierdzenie obecności przeciwciał niekoniecznie ma związek przyczynowy z chorobą i nie może stanowić kryterium rozpoznania choroby [1]. Coraz częściej podkreśla się jednak znaczenie prognostyczne i rokownicze przeciwciał, gdyż ich obecność koreluje z objawami klinicznymi [3]. Klasyczne zapalne choroby reumatyczne to między innymi reumatoidalne zapalenie stawów RZS (RA; rheumatoid arthritis), seronegatywna postać zapalenia stawów kręgosłupa, toczeń rumieniowaty układowy TRU (SLE; systemic lupus erythematosus), zespół Sjögrena (SS; Sjögren, s syndrome), zespół anty-fosfolipidowy (APS; antiphosholipid syndrome), mieszana choroba tkanki łącznej (MCTD; mixed connective tissue disease), twardzina układowa, różne typy zapaleń naczyń, zapalenie wielomięśniowe (PM; polymyositis) i skórno-mięśniowe (DM; dermatomyositis) [1]. Etiopatogeneza chorób autoimmunizacyjnych W warunkach fizjologicznych układ odpornościowy posiada umiejętność rozróżniania własnych antygenów od zewnątrzpochodnych i nie odpowiada na własne antygeny. Mimo selekcji limfocytów w narządach takich jak grasica (limfocyty T) i szpik kostny (limfocyty B), w warunkach fizjologii powstają w niewielkiej ilości limfocyty T i B potencjalnie autoreaktywne. Pomimo występowania tych komórek autoreaktywnych, nie dochodzi jednak do aktywacji limfocytów, czemu przeciwdziałają mechanizmy autotolerancji. Przełamanie stanu autotolerancji i uruchomienie mechanizmów autoagresji wobec elementów własnych komórek i tkanek, prowadzi do chorób autoimmunizacyjnych [2, 4]. Są one konsekwencją odpowiedzi immunologicznej, skierowanej przeciwko własnym antygenom w procesie autoimmunizacji. Powstające autoprzeciwciała łącząc się z autoantygenem stają się pozanaczyniowymi lub krążącymi kompleksami immunologicznymi (CIC; circulating immune complexses). Ich akumulacja może indukować reakcje zapalne poprzez aktywację systemu dopełniacza, wzmagać działania procesów krzepnięcia, prowadząc do agregacji płytek i erytrocytów [2, 4, 5]. Etiologia chorób autoimmunizacyjnych nie jest do końca poznana. Istotną rolę w indukcji procesu chorobowego odrywają najprawdopodobniej zarówno czynniki wewnątrzpochodne (geny głównego układu zgodności tkankowej, inne geny, nadprodukcja cytokin, hormony płciowe, zaburzenia apoptozy) jak i czynniki zewnątrzpochodne (uraz, infekcje wirusowe i bakteryjne, promieniowanie UV, rozpuszczalniki organiczne, leki). Nie bez znaczenia jest również wzajemna interakcja między tymi czynnikami [6]. Czynniki wewnątrzpochodne Geny głównego układu zgodności tkankowej wykazują silny związek z występowaniem wielu chorób. Najsilniejszy związek opisano w przypadku genów dla cząsteczek (MHC; major histocompatibility complex) klasy II, co stanowi potwierdzenie głównej roli limfocytów Th (CD4+) w rozwoju procesu autoimmunizacji. Występowanie antygenów HLA-DR4 (ang. human leukocyte antigen) stwierdzono w reumatoidalnym zapaleniu stawów, a HLA- -B27 w zesztywniającym zapaleniu stawów kręgosłupa [1, 4]. Ponadto genetycznie uwarunkowana nadprodukcja niektórych cytokin, jest także wiązana z rozwojem chorób autoimmunizacyjnych. Konsekwencja defektu genu prowadzącego do nadekspresji czynnika martwicy nowotworów α jest destrukcyjna choroba stawów przypominająca reumatoidalne zapalenie stawów [6]. Istotną rolę w etiopatogenezie chorób autoimmunizacyjnych odgrywają także hormony płciowe. Kobiety stanowią bowiem 60-70% chorych na RZS, zaś ponad 80% chorych na TRU i twardzinę układową [2]. Wyjątkiem jest zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, na które częściej chorują mężczyźni [6]. Do aktywacji procesów autoimmunizacji i rozwoju chorób z autoagresji prowadzić mogą zaburzenia szlaków apoptozy np. mutacja genu Fas u osób chorujących na zespół podobny do tocznia. Zaburzenie procesu apoptozy skutkuje brakiem usuwania potencjalnie autoreaktywnych limfocytów B [2]. Czynniki zewnątrzpochodne Uraz fizyczny, termiczny lub zapalny identyfikowane są jako prawdopodobne czynniki mogące doprowadzić do przełamana bariery tolerancji immunologicznej na własne antygeny i w konsekwencji zapoczątkować procesy autoimmunizacyjne. Zakażenie wirusami lub bakteriami posiadającymi epitopy wykazujące podobieństwo do antygenów gospodarza, może poprzez mechanizm mimikry molekularnej prowadzić do aktywacji limfocytów autoreaktywnych. Jako przykład mogą posłużyć zakażenia retrowirusami, zakażenia wirusem Epsteina-Barr, które są egzogennymi czynnikami ryzyka w TRU [2]. Również inne czynniki środowiska zewnętrznego, mogą indukować szereg zaburzeń immunologicznych. I tak np. promieniowanie UV jest induktorem zmian skórnych w toczniu, chlorek winylu i związki krzemu mają istotną rolę w indukcji odpowiedzi immunologicznej w twardzinie układowej, zaś hydralazyna w przebiegu toczenia rumieniowatego układowego [2]. Zależności pomiędzy mechanizmem powstania i rozwojem schorzeń autoimmunizacyjnych, a układem immunologicznym są wielorakie. Do zasadniczych funkcji układu immunologicznego należą rozpoznanie antygenu (patogenu), przez limfocyty T z udziałem cząstek HLA klasy I, HLA klasy II, odpowiedź humoralna zależna od limfocytów, współdziałanie komórek immunokompetentnych, swoistość reakcji i pamięć immunologiczna. W sytuacji, kiedy układ immunologiczny nie rozpoznaje, bądź nie eliminuje antygenu (patogenu), np. w wyniku niedostatecznego powstawania limfocytów TCD8 (cytotoksycznych), dochodzi do rozwoju reakcji immunopatologicznych. Elementami procesu autoimmunizacyjnego są autoantygeny, komórki dendrytyczne, autoreaktywne limfocyty T i B i autoprzeciwciała [5, 6]. Autoantygeny, to antygeny związane z prawidłowymi komórkami organizmu. Mogą nimi być receptory znajdujące się na powierzchni komórki np. antygeny komórek na płytkach krwi, antygeny występujące we wnętrzu komórki np. antygen jąderkowy ślinianek w zespole Sjögrena, czy też substancje wytwarzane i wydzielane przez prawidłowe komórki np. hormon tyreotropowy przysadki w nadczynności tarczycy [2, 6]. 236

3 Diagn Lab 2015; 51(3): Główne zagrożenie rozwojem procesu autoimmunizacji stanowi nadmierna odpowiedź komórek T i B, a także autoreaktywne limfocyty Th /CD4+/, które kontrolują limfocyty Tc i B, prowadząc do aktywacji autoreaktywnych limfocytów B, a dalej do ich transformacji blastycznej i produkcji autoprzeciwciał. Autoreaktywne limfocyty B są w stanie również rozpoznać autoantygeny rozpuszczalne bez połączenia z cząsteczkami MHC. Spełniają też funkcję komórek prezentujących autoantygeny autoreaktywnym limfocytom T [6]. Autoprzeciwciała mogą wiązać epitopy autoantygenów rozpuszczalnych i powierzchniowych. Powstające w ten sposób kompleksy immunologiczne, odkładają się w naczyniach, prowadząc do rozwoju stanu zapalnego, a w konsekwencji do uszkodzenia naczyń i narządów [1]. Autoprzeciwciała i autoreaktywne limfocyty występują również w organizmie w warunkach fizjologicznych, pomagają eliminować z krążenia autoantygeny i w większości przypadków nie doprowadzają do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych. Do uszkodzenia komórek i tkanek w chorobach autoimmunologicznych dochodzi na drodze dwóch głównych mechanizmów. Pierwszym z nich są mechanizmy nadwrażliwości, prowadzące do uszkodzeń powstających wskutek działania przeciwciał (nadwrażliwość typu II i III) i/ lub limfocytów T (typ IV reakcji nadwrażliwości). Autoprzeciwciała mogą także naśladować lub blokować działanie endogennych ligandów dla własnych białek, w tym hormonów [6]. Modele chorób autoimmunizacyjnych Choroby autoimmunologiczne do których należą choroby reumatyczne, są schorzeniami o przebiegu przewlekłym, które prowadzą do uszkodzenia komórek i tkanek gospodarza. Często prowadzą do trwałego inwalidztwa, a czasami do śmierci. Choroby te charakteryzują się okresami remisji i pogorszenia stanu zdrowia osoby chorej. Na choroby autoimmunizacyne cierpi około 5% populacji krajów zachodnioeuropejskich [2]. Ze względu na umiejscowienie autoantygenu choroby autoimmunizacyjne można podzielić na narządowo-swoiste i układowe [4]. W chorobach narządowo-swoistych, odpowiedź autoimmunologiczna skierowana jest przeciwko wielu antygenom, zlokalizowanym w określonym narządzie. Większość z najczęściej występujących zaburzeń autoimmunologicznych narządowo- -swoistych dotyka pojedynczego gruczołu endogennego, np. w cukrzycy typu 1, przeciwciała skierowane są przeciwko komór- Tabela I. Częstość występowania przeciwciał ANA (%) w wybranych chorobach reumatycznych z zaznaczeniem przeciwciał markerowych [ 3 ]. Autoprzeciwciała Jednostka chorobowa SLE Twardzina układowa anty-dsdna < 5 < 5 < 5 anty-ssdna < 30 < 50 <20 anty-histonowe < 5 < 5 < 5 anty Sm < 5 < 5 < 5 anty-ss-a/ro < < 5 anty-ss-b/la < 20 < < 5 ACA anty U1-RNP anty-scl-70 < pogrubione autoprzeciwciała markerowe kom β wysp trzustkowych Langerhansa. Przykładem specyficznej narządowo choroby autoimmunizacyjnej jest także pierwotna żółciowa marskość wątroby, definiowana przez krążące autoprzeciwciała przeciwmitochondrialne (AMA-M2). Zaburzenia układowe dotykają z kolei wielu narządów i są związane z odpowiedzią autoimmunologiczną, skierowaną przeciwko antygenom występującym powszechnie w organizmie. Wśród tych ostatnich antygenów wymieniane są cząsteczki wewnątrzkomórkowe zaangażowane w transkrypcję i translację kodu genetycznego, w tym dwuniciowe DNA i histony, przeciwko którym indukowana jest odpowiedź autoimmunologiczna w toczniu rumieniowatym układowym, czy też topoizomeraza I i białka centromerowe, związane z indukcją odpowiedzi autoimmunologicznej w twardzinie [5, 6]. Autoprzeciwciała w chorobach reumatycznych Zjawiskiem powszechnym i typowym dla chorób reumatycznych jest pojawienie się w krążeniu autoprzeciwciał i/lub autoreaktywnych limfocytów T, skierowanych przeciwko różnym własnym antygenom w tym składnikom jądra komórkowego i cytoplazmy, organellom komórkowym, składnikom tkanki łącznej, chrzęstnej i stawów. Zidentyfikowano ponad 150 autoantygenów, przeciwko którym wytwarzane są autoprzeciwciała w przebiegu chorób reumatycznych [7]. Należy podkreślić, że stwierdzenie samej obecności przeciwciała w badanej surowicy, nie może stanowić kryterium rozpoznania choroby, bez wystąpienia objawów klinicznych [4]. Badania serologiczne, w których wykrywa się przeciwciała, stanowią obecnie podstawę immunodiagnostyki układowych chorób tkanki łącznej. Stwierdzono ponadto korelację występowania niektórych autoprzeciwciał z określonym obrazem klinicznym, a jednostką chorobową. Przeciwciała te, określa się także jako tzw. przeciwciała markerowe. Przykłady przeciwciał markerowych w chorobach tkanki łącznej podano w tabeli I. Przeciwciała te obecne u osób z określonymi objawami klinicznymi mają dużą wartość diagnostyczną i prognostyczną. Cechy, jakimi powinny oznaczać się przeciwciała markerowe w chorobach reumatycznych obejmują wysoką czułość pozwalającą na rozpoznanie choroby w jak najwcześniejszym stadium, a także wysoką swoistość dla danej jednostki chorobowej, co może być pomocne w diagnostyce różnicowej z innymi chorobami reumatycznymi (canca w ziarniniakowatości z zapaleniem naczyń) [4, 8]. Ponadto miano przeciwciała markerowego powinno odzwierciedlać aktywność procesu chorobowego, Sjögrena MCTD a obecność korelować z określonymi objawami klinicznymi. Zależność taką opisano np. w stosunku do przeciwciał anty-dsdna w toczniu rumieniowatym układowym z powikłaniami nerkowymi, których miano korelowało z obecnością powikłań nerkowych [4]. < 5 < Metody oznaczania autoprzeciwciał Autoprzeciwciała oznaczane są przy użyciu wielu różnych technik badaw- 237

4 czych, do których należą metoda immunofluorescencji, metody immunoenzymatyczne (testy ELISA), technika Colorzyme, immunodyfuzja, immunoblot, Western-blot, pozostałe metody nefelometryczne, turbidymetryczne, chemiluminescencyjne, koagulometryczne i lateksowe [1,5]. W ostatnich latach nastąpił rozwój różnego typu technologii multipleksowych [9,10] Właściwe rozpoznanie typów fluorescencji w metodzie IIF (tabela II), pozwala wykryć prawdopodobne spektrum przeciwciał przeciwjądrowych ANA, skierowanych przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym [14, 15, 16]. Do najczęściej rozpoznawanych rodzajów świecenia w obrębie jądra wymienić należy: homogenne, gruboplamiste, drobnoplamiste, centromerowe i jąderkowe, zaś do świeceń cytoplazmatycznych 1. Metoda immunofluorescencji pośredniej Złotym standardem w immunodiagnostyce układowych chorób tkanki łącznej pozostaje wprowadzona ponad 40 lat temu metoda immunofluorescencji pośredniej (IIF; indirect immunofluorescence), która jest kilkakrotnie bardziej czuła niż metoda bezpośrednia (DIF; direct immunofluorescence), oparta na reakcji antygenów ze znakowanymi fluorescencyjnie swoistymi przeciwciałami [1, 5]. W metodzie immunofluorescencji IIF, w pierwszym etapie następuje wiązanie antygenu ze swoistym przeciwciałem nieznakowanym, do którego dołącza się drugie przeciwciało, znakowane fluorochromem, skierowane przeciwko immunoglobulinom zwierzęcia, od którego wyizolowano pierwsze przeciwciało. Jako źródło antygenów w metodzie tej wykorzystuje się substraty komórkowe lub tkankowe, np. skrawki wątroby, nerki i żołądka szczura lub małpy, linię hodowlaną komórek raka krtani człowieka HEp-2, HEp-2000, pierwotniaka Crithidium luciliae, czy też granulocyty obojętnochłonne [1, 7]. Kompleksy powstałe w wyniku połączenia przeciwciał z antygenami wykrywa się przy użyciu znakowanych barwnikiem fluoryzującym przeciwciał zwierzęcych, skierowanych przeciwko ludzkim immuglobulinom. Najpowszechniej stosowanym w niej fluorochromami są izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) oraz rodamina B [11, 12, 13]. W miejscu związania znakowanego przeciwciała z antygenem obserwuje się w mikroskopie fluorescencyjnym zaopatrzonym w lampę emitującą promieniowanie UV charakterystyczne świecenie np. żółto-zieloną fluorescencję z zastosowaniem znacznika najczęściej obserwowanych w metodzie IIF należą świecenie rozlane, drobnoplamiste, delikatne plamiste i świecenie włókien cytoplazmatycznych [14, 15]. W badaniu ilościowym, poprzez wykonanie kolejnych rozcieńczeń badanej surowicy, można określić miano przeciwciał przeciwjądrowych. Mianem określa się takie rozcieńczenie surowicy, przy którym można jeszcze rozpoznać typ świecenia. Przeciwciała ANA, istotne klinicznie należą najczęściej do klasy IgG immunoglobulin. Należy podkreślić, że badanie to, jest oznaczeniem wstępnym, stwierdzającym obecność autoprzeciwciał, wymagającym dalszej ich identyfikacji [15]. Reakcje fałszywie negatywne w testach IIF występują zazwyczaj w przypadku nieprawidłowego utrwalania i przygotowywania skrawków tkankowych, które może doprowadzić do zablokowania niektórych determinant antygenowych. Najczęściej występującymi przyczynami reakcji fałszywie pozytywnych są z kolei: niespecyficzna adsorpcja przeciwciał oraz obecność kilku antygenów pokrewnych o podobnych epitopach [12]. Rozwój nowych technologii diagnostycznych, znajdujących zastosowanie w laboratorium immunologii klinicznej, przyczynił się do wprowadzenia nowych metod multipleksowych, w różnym stopniu zautomatyzowanych i zdolnych do jednoczesnego pomiaru licznych przeciwciał przeciwjądrowych. Są one często wyposażone w specjalistyczne programy ekspertowe z zakresu cyfrowej analizy obrazu. Automatyzacja metody IIF może znacznie poprawić standaryzację oznaczeń ANA i pomóc w obniżeniu zmienności wewnątrzlaboratoryjnej [17]. FITC. Metoda ta jest czasochłonna i wymaga doświadczonego, profesjonalnego personelu [12]. 2. Metody immunoenzymatyczne fazy stałej Testy ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) oparte na metodach Tabela II. Najczęstsze rodzaje świecenia obserwowane w metodzie immunofluorescencji pośredniej [15] immunoenzymatycznych pozwalają Świecenie w obrębie jądra Antygen zarówno na jakościowe jak i ilościowe Homogenne dsdna, histony, chromatyna/nukleosomy oznaczenie przeciwciał we wszystkich Gruboziarniste U1-SnRNP, Sm klasach immonoglobulin. Mogą służyć Drobnoziarniste SS-A/Ro, SS-B/La, Topo-1 do oceny dynamiki poziomu przeciwciał Centromerowi CENP-A, B, C, F w przebiegu podjętej terapii [2]. Jąderkowe PM(Scl), RNA-polimeraza I-III, fibrylaryna/u3 rybonukleoproteina, To/Th, B23 fosfoproteina, numatryna, aneksyna II i V Po raz pierwszy technika immunoenzymatyczna została opisana w 1969 r. Świecenie cytoplazmatyczne Antygen przez Masona, a w latach następnych była wielokrotnie modyfikowana Rozlane Rib-P, Jo-1, inne syntetazy trna, SRP w celu zwiększenia czułości i swoistości. Drobnoplamiste Jo-1, mitochondria, SRP Można wyodrębnić kilka eta- Delikatne plamiste lizosomy, endosomy pów oznaczenia przeciwciał testami Włókna cytoplazmatyczne aktyna, cytokeratyna, wimentyna, tropomiozyna ELISA, opłaszczenie mikropłytki testowej CENP białko centromerowe (centromere protein); dsdna dwuniciowe DNA (double stranded DNA); PM-Scl (polymiositis/ scleroderma); RibP rybosomalne białko P (ribosomal P protein); SRP cząstka rozpoznająca sygnał (signal recognition particle), Topo-1 topoizomeraza 1 (topo-isomerase-1). antygenem, płukanie mikropłytki, dodanie badanych surowic i związanie z antygenem specyficznych prze- 238

5 Diagn Lab 2015; 51(3): ciwciał obecnych w próbkach badanych, inkubacja, wypłukanie niezwiązanego materiału i dodanie koniugatu znakowanego enzymem (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna), kolejne płukanie i przeprowadzenie reakcji enzymatycznej poprzez dodanie odpowiedniego substratu, jako chromogenu (tetrametylobenzydyna, paranitrofenylofosforan sodowy), zahamowanie reakcji barwnej przez zastosowanie odczynnika stopującego (NaOH, H 2 SO 4 ) i pomiar spektrofotometryczny barwnego produktu reakcji enzymatycznej [1, 12]. Podstawowym podłożem wiążącym antygeny w oznaczeniach immunoenzymatycznych jest polistyren. Oprócz polistyrenu powierzchnię wiążącą płytek może stanowić poliwęglan, polipropylen lub polichlorek winylu [12]. Do głównych źródeł antygenów wykorzystywanych do identyfikacji i pomiaru autoprzeciwciał zalicza się ekstrakty komórkowe, antygeny oczyszczone z tkanek, antygeny rekombinowane, mieszaniny ekstraktów i antygenów rekombinowanych oraz mieszaniny antygenów oczyszczonych i rekombinowanych. W diagnostyce medycznej stosuje się do oznaczeń dostępne w handlu gotowe testy, zawierające płytki opłaszczone antygenami danego czynnika patogennego, zestaw buforów i odczynników, koniugaty, wzorce, kontrole oraz dokładny opis procedury wykonania [12, 18]. Testy ELISA cechuje proste, choć czasochłonne wykonanie. Posiadają dużą czułość i swoistość związaną ze zastosowaniem wysoce oczyszczonych antygenów na stałym podłożu (faza stała) i użyciem do detekcji znakowanych antygenów, połączonych z substancją, której ilość lub aktywność można zmierzyć [1, 12]. Zaletą technik ELISA w porównaniu z technikami immufluorescencyjnymi jest wyeliminowanie czynnika subiektywnego przy interpretacji wyników badań [1, 12]. Obecnie z punktu widzenia przydatności diagnostycznej testy immunoenzymatyczne znalazły zastosowanie do detekcji i analizy ilościowej wielu różnych autoprzeciwciał m.in. przeciw dsdna, SS-A/Ro, SS-B/La, U1-RNP, Sm, Scl-70 i Jo-1, Pm Scl, kardiolipinie, aneksynie V, RNA-azie i wielu innych [12]. Istnieje jednak wiele problemów związanych z powtarzalnością tej metody, związanych najczęściej z przygotowywaniem antygenów służących do opłaszczenia płytek ELISA. Stosowane antygeny mogą w czasie preparatyki ulegać denaturacji, co powoduje obniżenie wiarygodności wyników uzyskiwanych tymi metodami. Z drugiej strony obecność nawet minimalnych zanieczyszczeń dodatkowymi antygenami powoduje, że testy te dają fałszywie dodatnie wyniki [12, 18]. 3. Technika Colorzyme Jest metodą peroksydazową, która stanowi połączenie metody immunoenzymatycznej z techniką immunofluorescencji pośredniej [1]. W metodzie tej stosuje się analogiczne substraty jak w technice IIF, ale zamiast koniugatów z fluorochromem, wykorzystuje się koniugaty antyglobulinowe, związane z peroksydazą chrzanową, stąd nazwa metody. Technika Colorzyme daje charakterystyczne typy wybarwienia zamiast wzorów świeceń w metodzie IIF. Zmodyfikowaną metodę Colorzyme stosuje się przede wszystkim w laboratoriach bez dostępu mikroskopu fluorescencyjnego [1]. 4. Immunodyfuzja Zarówno antygeny, jak i przeciwciała mają zdolność swobodnej dyfuzji w żelu agarowym lub agarozowym. Metoda podwójnej immunodyfuzji polega na podwójnej dyfuzji w żelu agarozowym badanej surowicy i ekstraktu grasicy cielęcej lub innej tkanki bogatej w materiał jądrowy, będących źródłem natywnych antygenów. W miejscu spotkania antygenu i specyficznego względem niego przeciwciała, gdy ich proporcje są optymalne, tworzą się kompleksy antygen-przeciwciało. Powstałe kompleksy ulegają precypitacji i są widoczne w postaci białych, lekko opalizujących linii precypitacyjnych, zwanych łukami. Linie precypitacyjne badanych surowic porównuje się z liniami surowic wzorcowych, zawierających znane przeciwciało [1, 12]. Immunodyfuzja podwójna jest metodą pomocniczą w której wykrywa się i identyfikuje jakościowo autoprzeciwciała skierowane przeciw grupie rozpuszczalnych antygenów jądrowych (ENA; extractable nuclear antigen) takich jak: SS-A/Ro, SS-B/La, nrnp, Sm, Scl-70, Jo-1 [1]. Technika podwójnej immunodyfuzji jest również czasochłonna i wymaga dużego doświadczenia w interpretacji wyników, pomimo to jest stosowana od lat, szczególnie w laboratoriach naukowych, jako nieskomplikowana i prosta do wykonania [8]. Stosowana jest w różnych modyfikacjach przy ocenie miana przeciwciał, w określaniu podobieństwa antygenowego i w wykrywaniu reakcji krzyżowych. Dzięki użyciu natywnych, nie zdenaturowanych antygenów, cechuje ją wysoka swoistość, ale niższa czułość w porównaniu do metod immunoblot, czy testów ELISA [1, 12]. 5. Immunoblot, Western-blot W technikach tych wykorzystuje się paski lub membranę nośnika (nitroceluloza) z naniesionymi z rozdzielonych elektroforetycznie na żelu poliakrylamidowym w określonych miejscach wysoko oczyszczonymi antygenami, które inkubuje się z badaną surowicą, a następnie z koniugatem, czyli sprzężonym z enzymem: peroksydazą chrzanową, przeciwciałem zwierzęcym, skierowanym przeciwko ludzkiej immunoglobulinie odpowiedniej klasy. Po dodaniu substratu dla enzymu w miejscu, gdzie powstaje barwny prążek, znajduje się antygen o odpowiedniej masie cząsteczkowej [1, 12]. Procedura immunoblotingu przebiega przez wykonanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, transferu elektroforogramu na wiążącą, nitrocelulozową membranę, inkubację kolejno z pierwszym nieznakowanym przeciwciałem i drugim przeciwciałem znakowanym znacznikiem, enzymem, radioizotopem lub fluorochromem w celu immunodetekcji [12]. Metoda Western-blotting, ze względu na skomplikowaną technikę, służy w zasadzie jako metoda weryfikująca, potwierdzająca wyniki uzyskane metodą immunoenzymatyczną [2]. Charakteryzuje ją nieco wyższa czułość [2]. Oprócz złożonych procedur immunoblotingu w diagnostyce medycznej stosuje się testy dotingowe, w których odpowiednio przygotowane paski testowe zawierają nitrocelulozę z dobranym zestawem antygenów komórek ludzkich, wychwytujących w teście autoprzeciwciała [12, 19]. 6. Metody koagulometryczne, nefelometryczne, turbidymetryczne, chemiluminescencyjne, lateksowe Do oznaczania przeciwciał mogą być wykorzystywane również inne metody diagnostyczne, tj. koagulometryczne, stosowane do 239

6 oznaczania antykoagulanta toczniowego, nefelometryczne do oznaczania czynnika reumatoidalnego (RF; rheumatoid factor), czy też turbidymetryczne i chemiluminescencyjne. Do wykrywania czynnika RF stosowane są także testy lateksowe, polegające na aglutynacji cząsteczek nośnika opłaszczonych antygenem (lateks polistyrenowy) przez zawarty w badanej surowicy czynnik RF [1, 12]. 7. Najnowsze metody i techniki multipleksowe W immunodiagnostyce chorób reumatycznych zastosowanie znajdują również nowe technologie multilpeksowe, pozwalające na jednoczesną detekcję w pojedynczym oznaczeniu autoprzeciwciał przeciwko wielu różnym antygenom pochodzenia jądrowego i cytoplazmatycznego, a tym samym określić pełen profil zaburzeń immunologicznych u danego pacjenta [5, 10, 20]. Do najczęściej stosowanych technik multipleksowych należą: liniowe techniki immunoblot pozwalają na jakościową lub półilościową ocenę od kilku do kilkunastu autoprzeciwciał w jednym oznaczeniu; technika wykorzystuje paski nośnika (zwykle nitrocelulozy), z naniesionymi w określonych miejscach wysoko oczyszczonymi antygenami w postaci cienkich linii; sposób przeprowadzenia inkubacji i interpretacji wyników jest zbliżony do powszechnie znanej techniki Western blot [20]; cytometria przepływowa pozwala na równoczesny pomiar od kilkunastu do kilkudziesięciu autoprzeciwciał w niewielkiej ilości płynu biologicznego przy użyciu opłaszczonych autoantygenami mikrokuleczek polistyrenowych, uprzednio wyznakowanych fluorochromami [5]. W diagnostyce chorób reumatycznych technika ta znalazła również zastosowanie w ocenie markerów stanu aktywacji komórek T (CD137, CD154), ilości komórek B, wykazujących ekspresję receptorów dla chemokin (CXCR3, CCR3), co może mieć znaczenie w ocenie aktywności procesu zapalnego. Ocenie poddawano również stan aktywacji i różnicowania komórek B, odgrywających tak istotną rolę w chorobach autoimmunologicznych, na podstawie analizy ekspresji antygenów powierzchniowych CD69, CD23 i CD24. Cytometria pozwala na identyfikację całej linii komórek B takich jak dziewicze komórki B (IgM + /IgD + /CD19 + /CD27 ), komórki plazmatyczne (CD19 lo /CD20 /CD27 hi ), wczesne komórki B pamięci (IgM + /IgD + /CD19 + / CD27 + ), późne komórki B pamięci (IgM /IgD /CD19 + /CD27 + ) komórki B1 (CD5 + /IgM + / CD19 + ), a także ocenę stanu ich aktywacji w przebiegu schorzeń reumatycznych, co może być istotne dla pełniejszego poznania mechanizmów patogenetycznych tych chorób [21-24]. mikromacierze technika pozwala na równoczesne oznaczenie od kilkuset do nawet kilku tysięcy autoprzeciwciał na podstawie naniesionych na fazę stałą fragmentów antygenów, tworzących rodzaj macierzy o określonym położeniu poszczególnych swoistości [1, 10, 20]; czipy antygenowe (antigen chip) technologia podobna do techniki mikromacierzy, która dzięki jeszcze większej miniaturyzacji pozwala na jednoczesne oznaczenie jeszcze większej ilości autoprzeciwciał. W technologii tej fragmenty autoantygenów zostają za pomocą precyzyjnych robotów, zdeponowane w określonych pozycjach na cieniutkich płytkach szklanych [5, 10, 20]. Te są mechanicznie dzielone na milimetrowej wielkości fragmenty (biochipy), a następnie biochipy są przyklejane do szkiełek mikroskopowych. Do przeprowadzenia pojedyńczych badań na każdym polu reakcyjnym umieszczony jest jeden biochip. Jeśli wymagane jest badanie jednej próbki w kierunku przeciwciał przeciwko kilku substratom (profil przeciwciał), można umieścić wiele różnych biochipów obok siebie na tym samym polu reakcyjnym (mozaika biochipów). Mikrochipy są umieszczane z badanymi próbkami surowic zawierającymi autoprzeciwciała, które wiążą się ze specyficznymi immobilizowanymi autoantygenami [12]. Stężenie badanych autoprzeciwciał ocenia się najczęściej metodą fluorescencji z użyciem drugich przeciwciał sprzężonych z fluorochromem. Technologia biochip, pozwala u chorego oznaczyć jednocześnie autoprzeciwciała skierowane przeciwko wielu antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym, a tym samym określić pełen profil zaburzeń immunologicznych [1]. Technologia biochip znalazła zastosowanie w oznaczaniu przeciwciał ANA, profilu ANA, przeciwciał przeciw cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych (ANCA; antineutrophil cytoplasmic antibodies), a także innych autoprzeciwciał [5]. Ciągły postęp technologiczny, jaki dokonuje się w ostatnich latach wiążę się z wprowadzeniem automatyzacji metod użytecznych w diagnostyce autoimmunologicznej, w tym techniki immunofluorescencji pośredniej, immunologicznych technik mono i multipleksowych dla określania profilu autoprzeciwciał. Implementacja automatyzacji celem harmonizacji wyników, zminimalizowania błędu i skrócenia czasu wykonania badania, a także wprowadzenie procesów konsolidacji i integracji różnych technologii analitycznych w jednym urządzeniu lub jednej grupie powiązanych ze sobą urządzeń analitycznych, otworzyły nową erę w immunodiagnostyce [25]. Znaczenie diagnostyczne autoprzeciwciał w chorobach reumatycznych I. Czynnik reumatoidalny (RF) jako immunologiczna cecha RZS, po raz pierwszy wzmiankowany był już w 1922 roku [26]. RF jest przeciwciałem skierowanym przeciwko fragmentom Fc (domenie CH2 i CH3) ludzkiej lub zwierzęcej immunoglobuliny klasy G [1, 27]. Czynnik reumatoidalny wykryty został ponad siedemdziesiąt lat temu i należy do wielu klas immunoglobulin o różnych izotypach i powinowactwach [28]. Najczęściej, gdyż aż 85% czynnik ten występuje w klasie IgM [2]. Poza tym czynniki reumatoidalne mogą występować także w klasach IgG, IgA, rzadziej w IgD i IgE. Rutynowo oznacza się RF w klasie IgM, gdyż obecność RF w innych klasach niż IgM traktowana jest jako pomocnicza [1, 24]. Czynnik reumatoidalny jest głównym serologicznym markerem reumatoidalnego zapalenia stawów RZS, na podstawie którego wyróżnia się postać choroby seropozytywną (obecny czynnik RF IgM) lub seronegatywną (brak czynnika RF IgM). Czynnik RF odgrywa główną rolę w patogenezie tej choroby. Oprócz stymulacji układu immunologicznego i tworzenia kompleksów immunologicznych bierze udział w aktywacji dopełniacza, nasilając procesy zapalne, prowadząc w ten sposób do niszczenia chrząstki i destrukcji stawu, a także rozwoju pozastawowej postaci RZS. RF 240

7 Diagn Lab 2015; 51(3): w klasie IgM oznacza się za pomocą odczynu Waalera-Rose, odczynu lateksowego, przy użyciu metody nefelometrycznej lub immunoenzymatycznej. Czynnik RF wykrywa się w surowicy, płynie stawowym, a także w płynach wysiękowych. Zwiększone miano RF koreluje z nasileniem zmian chorobowych i służy do oceny skuteczności farmakoterapii. RF ma znaczenie prognostyczne obok przeciwciał przeciwko CCP. Razem w testach serologicznych, RF z anty-ccp i wskaźnikami ostrej fazy tj. OB, CRP, jest jednym z kryteriów klasyfikacyjnych dla RZS [29]. Występuje u 60-80% chorych na RZS, jego specyficzność wynosi 62% [1, 7]. Czynnik RF nie jest markerem swoistym, ponieważ może występować w innych chorobach tkanki łącznej. Jego obecność można stwierdzić także w zespole Sjögrena, toczniu rumieniowatym układowym, mieszanej chorobie tkanki łącznej, zapaleniu wielomięśniowym, twardzinie układowej i w młodzieńczym idiopatycznym zapaleniu stawów. Ponadto, jego obecność stwierdza się również u 3-5% osób zdrowych, szczególnie po 60 r. ż. [1], wzrasta z wiekiem. I tak pomiędzy 20 a 60 rokiem życia jest on obecny u 2-4% osób, między 60 a 70 rokiem życia u 5%, natomiast u osób powyżej 70 roku życia u 10-25% populacji [7]. Nie stwierdza się natomiast jego obecności w chorobie Stilla, dnawym zapaleniu stawów, enteropatiach, gorączce reumatycznej, łuszczycowym zapaleniu stawów, zespole Reitera, zesztywniającym zapaleniu stawów kręgosłupa, chorobie zwyrodnieniowej stawów i w ropnym zapaleniu stawów [1,28]. II. Krążące kompleksy immunologiczne (CIC; circulating immune complexses) są agregatami białkowymi powstającymi w skutek wiązania przeciwciał do antygenów. Nie są specyficzne dla konkretnej choroby, a ich udział chorobach autoimmunologicznych został potwierdzony w TRU, RZS, zespole Sjögrena, MCTD, a także w kłębuszkowym zapaleniu nerek. CIC wykrywa się u 80% chorych na RZS i 54% chorych na TRU, a ich obecność świadczy o wysokiej aktywności choroby. Ich podwyższone stężenie pojawia się w infekcjach bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych, alergiach, nowotworach, przewlekłych chorobach skóry i wątroby. Oznaczanie ich poziomu może służyć do monitorowania terapii, przebiegu, aktywności choroby i rokowań, a stały wzrost CIC wskazuje na przewlekłą, aktywną postać choroby. Metodą oznaczenia pierwszego wyboru jest test ELISA. Można je oznaczać nefelometrycznie, turbidymetrycznie [15]. III. Przeciwciała przeciw cytrulinowanym białkom (ACPAs; anti- -citrullinated protein antibodies) należą do grupy autoprzeciwciał reagujących z determinantami antygenowymi, zawierającymi cytrulinę powstałą w wyniku potranslacyjnej modyfikacji reszt argininy, katalizowanej przez enzym deiminazę peptydyloargininową [30]. Cytrulina jest niestandardowym aminokwasem, występującym w takich białkach jak filagryna, wimentyna, mielina. Przeciwciała ACPAs mają znaczenie prognostyczne w RZS, a także predykcyjne dla agresywnej, nadżerkowej postaci tej choroby [31, 32]. Przeciwciała przeciw czynnikowi okołojądrowemu (APF; anti- -perinuclear factor) opisane zostały po raz pierwszy w 1964 r. APF były pierwszymi spośród nowej grupy przeciwciał skierowanych przeciw białkom cytrulinowanym. Głównym antygenem dla APF jest białko o ciężarze cząsteczkowym kda związane z ludzką naskórkową profilagryną. Przeciwciała APF w większości występują u 49-91% chorych na RZS, głównie w klasie IgG, rzadziej w IgA i IgM. Ich miano koreluje ze stopniem zaawansowania choroby, a ich obecność może nawet poprzedzać objawy kliniczne RZS [26]. Oznaczanie APF cechuje wysoka specyficzność (73-99%), a mimo to, nie znalazły zastosowania w rutynowej diagnostyce zapaleń stawów, ze względu na trudności z uzyskaniem odpowiedniego substratu dla oznaczania i brakiem standaryzacji wyników [1]. Przeciwciała przeciwkeratynowe (AKA; antikeratin antibodies) zostały wykryte w 1979 r. w metodzie immunofluorescencji IIF, na podstawie świecenia zewnętrznej warstwy rogowej nabłonka przełyku szczurzego. Później okazało się, że antygenem dla AKA nie jest keratyna, lecz antygeny należące do grupy niekeratynowych białek późnego różnicowania, o ciężarze cząsteczkowym , i 210 kda, w tym również białka związane z ludzką naskórkową filagryną [1].Przeciwciała AKA występują u 36-59% chorych na RZS, a także u 25-30% chorych na seronegatywną postać RZS. Ich obecność może poprzedzać objawy kliniczne RZS i nie zależy od czasu trwania choroby. Wykazano, że miana AKA korelują z innymi przeciwciałami w tym z czynnikiem RF, a ponadto z aktywnością i ciężkością choroby. Podstawową metodą oznaczania AKA jest nadal metoda IIF z wykorzystaniem skrawków przełyku szczurzego. Przeciwciała AKA można też oznaczać techniką Colorzyme [1, 7, 15]. Przeciwciała przeciw filagrynie (AFA; anti-filaggrin antibodies) reagują z filagryną, związaną z filamentami pośrednimi, uczestniczącymi w agregacji filamentów cytokeratynowych w procesie rogowacenia naskórka. Filagryna odkryta w latach osiemdziesiątych ubiegłego stulecia, składa się z dwóch izoform o ciężarze cząsteczkowym 37 i 40 kda. Syntetyzowana jest z białka prekursorowego, jakim jest profilagryna, magazynowanego w ziarnistościach keratohialiny. Przeciwciała AFA stwierdza się u 41% chorych na RZS. Ponadto obecność AFA wykrywa się we wczesnym RZS. Przeciwciała AFA wykazują wysoką specyficzność (>90%) dla RZS [26]. Stąd też oznaczanie przeciwciał przeciw filagrynie z zastosowaniem metod immunoblotingu lub ELISA z użyciem rekombinowanej filagryny, może zwiększyć czułość tych metod do 52%, a ty samym być przydatnym narzędziem w diagnozowaniu reumatoidalnego zapalenia stawów [1]. Przeciwciała przeciw cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi (anty-ccp; anti-cyclic cytrullinated peptide) najczęściej należą do IgG i są produkowane miejscowo w reumatoidalnie zmienionej błonie maziowej stawu. Przeciwciała te zostały włączone do najnowszych kryteriów klasyfikacyjnych RZS według ACR/EULAR z 2010 roku [33]. Cechuje je wysoka czułość, specyficzność dla RZS i wyższa wartość diagnostyczna we wczesnym i niezróżnicowanym zapaleniu stawów [1, 33]. Mają zastosowanie dla rozpoznania RZS we wczesnym stadium choroby, a ich miano wyjściowe w czasie rozpoznania, może być czynnikiem predykcyjnym 241

8 późniejszego rozwoju choroby, jej agresywnej postaci i ciężkości zmian radiologicznych [34-36]. W grupie chorych na reumatoidalne zapalenie stawów, anty-ccp z pośród grupy przeciwciał ACPAs, są niezależnym, niekorzystnym czynnikiem rokowniczym [13]. Ich czułość i specyficzność wynosi odpowiednio 75-82% i 98% [1]. Przeciwciała anty-ccp obserwuje się u 70% chorych z serologicznie dodatnią postacią RZS i u 33% z seronegatywną [7]. Przeciwciała anty-ccp mogą być także używane jako marker w diagnostyce różnicowej, np. w różnicowaniu zapalenia wątroby związanego z artropatią z RZS [37]. Praktycznie nie wykrywa się przeciwciał anty-ccp u osób zdrowych (0-1%) i tylko w kilku procentach występują w innych chorobach reumatycznych, najczęściej w zespołach nakładania RZS z innymi chorobami układowymi tkanki łącznej [18]. Jako metodę oznaczania przeciwciał anty-ccp stosuje się testy ELISA drugiej (CCP2) bądź trzeciej generacji (CCP3) z użyciem wysoko oczyszczonych, syntetycznych, zmodyfikowanych cytrulinowanych peptydów, jako źródło antygenu, co pozwoliło na uzyskanie czułości w zakresie 75-82% i specyficzności 98% [1, 24, 38]. Badania przeprowadzone przez Demoruelle i wsp. wykazały, iż u pacjentów z pełnoobjawowym RZS, CCP2 były bardziej specyficzne, podczas gdy u pacjentów z niezróżnicowanym zapaleniem stawów, CCP3 miały większą wartość predykcyjną dla rozwinięcia się RZS [39]. Przeciwciała przeciw zmutowanej, cytrulinowanej wimentynie, anty-sa (anty-mcv; anti-mutated citrullinated vimentin antibodies, anti-sa) reagują z antygenem Sa, odkrytym w 1994 r. Antygen ten, o ciężarze cząsteczkowym kda, jest prawdopodobnie cytrulinową formą przejściową filamentów białka wimentyny [1, 26]. Przeciwciała anty-mcv są wysoce swoistymi i czułymi markerami RZS. Ich specyficzność dla RZS wynosi około 98% [26]. Miano przeciwciał jest wprost proporcjonalne do następujących u pacjenta zmian klinicznych. Dzięki temu, oznaczanie przeciwciał anty-mcv, staje się dobrym narzędziem do monitorowania przebiegu terapii [1]. Przeciwciała anty-mcv oznaczane są metodą ELISA z zastosowaniem rekombinowanej, zmutowanej cytrulinowanej wimentyny, co może zwiększyć czułość tej metody [1, 26]. IV. Przeciwciała przeciw karbamylowanym białkom (anty-carp; Anti Carbamylated Protein Antibodies) są skierowane przeciwko posttranslacyjnie zmodyfikowanym w wyniku karbamylacji białkom. Wykryto je u około 45% pacjentów chorych na RZS, a także, co ważne, u 30% pacjentów z RZS, u których nie wykryto przeciwciał przeciw cytrulinowanym białkom (ACPA) [40, 41]. Karbamylacja jest nieenzymatyczną modyfikacją chemiczną, w wyniku której cyjanian wiąże się z cząsteczkami zawierającym grupy aminowe lub tiolowe i tworzy grupy karbamylowe. Cyjanian występuje naturalnie w organizmie i pozostaje w równowadze z mocznikiem. Wzmożoną reakcję karbamylacji po raz pierwszy zaobserwowano u pacjentów z podwyższonym stężeniem mocznika, tj. pacjentów z chorobami nerek, a następnie w przebiegu chorób układu sercowo-naczyniowego. Nasilenie reakcji karbamylacji stwierdzono także w zaburzeniach tolerancji immunologicznej [42]. Nieznany jest bezpośredni udział przeciwciał anty-carp w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów, lecz wykazano, iż u pacjentów ACPA-ujemnych, występowanie przeciwciał anty-carp jest związane z bardziej zaawansowaną progresją zmian radiologicznych. Ponadto, przeciwciała anty- -carp mogą pojawić się na wiele lat przed rozpoznaniem choroby i można w oparciu o ich stwierdzenie przewidzieć rozwój choroby u pacjentów z bólem stawów, niezależnie od obecności przeciwciał anty-ccp oraz RF w klasie IgM. Wykazano ponadto, że obecność przeciwciał anty-carp u pacjentów z bólem stawów wiąże się z podwyższonym ryzykiem zachorowania na RZS. Co więcej, przeciwciała anty-carp mogą być czynnikiem predykcyjnym uszkodzenia stawów, a także przyszłego rozwoju RZS nie tylko u chorych z bólem stawów, ale również u potencjalnie zdrowych osób. Pomimo, że czułość tych przeciwciał jest dość niska (2-29%), cechują się one bardzo wysoką swoistością (95-100%). Stąd też ich oznaczanie wydaje się mieć znaczenie w diagnostyce niezróżnicowanych zapaleń stawów oraz u pacjentów seronegatywnych. Jednoczesna ocena przeciwciał anty-carp i ACPA może okazać się pomocna w identyfikacji pacjentów z grupy ryzyka i tych z wczesną postacią RZS [40-43]. V. Przeciwciała przeciw składowej dopełniacza C1q (ang. anti- -complement component C1q antibodies) występują w wielu chorobach autoimmunizacyjnych w tym pokrzywkowym zapaleniu naczyń z hipokomplementemią (HUV; hypocomplementemic urticarial vasculitis), TRU, zespole Sjögrena, MCTD, a także w przebiegu chorób infekcyjnych oraz u 4-18% zdrowej populacji [44, 45]. W przebiegu TRU podkreśla się ich wysoką negatywną wartość predykcyjną (87-100%) w diagnozowaniu, ocenie aktywności i przewidywaniu zaostrzeń nefropatii toczniowej [45]. Początkowo wykrywano je za pomocą metod radioimmunologicznych. Obecnie w powszechnym użyciu są komercyjne testy ELISA [46]. VI. Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA; antinuclear antibodies) są istotnym elementem rozpoznania i klasyfikacji układowych chorób tkanki łącznej [47]. Obejmują heterogenną grupę przeciwciał, skierowanych przeciwko stałym i rozpuszczalnym antygenom zlokalizowanym w obrębie komórki. ANA należą do przeciwciał klasy głównie G immuglobulin. Do przeciwciał przeciwjądrowych zalicza się przeciwciała przeciw DNA, histonom, centromerom, nukleosomom, rybosomom, cyklinom i przeciwciała przeciw rozpuszczalnym antygenom jądra komórkowego (ENA) [1, 48]. Do przeciwciał grupy ENA należą przeciwciała przeciw Sm, RNP, SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, Jo-1, Pm (Scl), Mi-1, Mi-2 [1, 7, 18]. Metoda IIF jest badaniem wstępnym obecności ANA, określanym jako złoty standard diagnostyki serologicznej chorób autoimmunologicznych [1]. Metodą tą można określić zarówno miana ANA, jak i typy fluorescencji w obrębie jądra i cytoplazmy (tabela II), a tym samym powiązać z wystąpieniem określonej jednostki chorobowej (tabela III). Najczęściej stwierdzanym typem fluorescencji jest plamiste świecenie jąder komórkowych [15]. Nie jest ono swoiste dla żadnej z układowych chorób tkanki łącznej, wykazuje jedynie obecność ANA. Ocenę swoistości dokonuje się z wyko- 242

9 Diagn Lab 2015; 51(3): rzystaniem metody ELISA lub immunoblot. Obecnie dostępne są zestawy komercyjne do szczegółowej oceny autoprzeciwciał, np. ANA-profil. Ponadto wykorzystuje się gotowe profile, oceniające swoistość ANA w poszczególnych chorobach reumatycznych, w tym np. profil twardziny (sclerosis profil), obejmujący testowanie przeciwciał przeciw Scl-70, centromerom A, centromerom B, RNA polimerazie 3, fibrylarynie, NOR-90, Th/To, PM-Scl-100, PM-Scl-75, Ku, PDGFR, Ro-52 [49], czy też profil zapalenia mięśni [50]. W przypadku stwierdzenia plamistego typu fluorescencji lub gdy nie stwierdza się ANA, a objawy wskazują na układową chorobę tkanki łącznej, należy przeprowadzić badanie w kierunku obecności przeciwciał przeciw rozpuszczalnym antygenom jądra komórkowego (ENA) z zastosowaniem metod ELISA, podwójnej dyfuzji lub Western-blot [15]. Należy jednak podkreślić, że poza układowymi chorobami tkanki łącznej, dla których występowanie przeciwciał przeciwjądrowych jest cechą charakterystyczną, przeciwciała ANA można wykryć również w innych chorobach autoimmunologicznych, takich, jak pierwotna żółciowa marskość wątroby (przeciwciała SS-A/Ro), czy autoimmunologiczne zapalenie wątroby / przeciwciała SS-A/Ro), a także w okresie ciąży lub u członków rodzin chorych na choroby reumatyczne. Przeciwciała ANA mogą występować również w niskich mianach u zdrowej populacji w 8%, zaś u dzieci w 15%. Ich miana są wyższe u kobiet i wzrastają wraz z wiekiem [48]. ANA w niskim mianie występują także u chorych na infekcję wirusową lub bakteryjną, u osób z chorobami rozrostowymi układu krwiotwórczego [51-53]. W przypadku, gdy miano jest wyższe niż 1/160, należy rozważyć obecność układowej choroby tkanki łącznej, miano powyżej 1/5120 stwierdza się zwykle u pacjentów z mieszaną chorobą wemu denaturowanemu DNA (ssdna single structure DNA) reszty zasad purynowych i pirymidynowych [56]. Najistotniejszą rolę odgrywają przeciwciała anty-dsdna, które uważane są za swoisty marker tocznia rumieniowaty układowego, a w szczególności ciężkiej jego postaci, przebiegającej z zajęciem nerek. Przeciwciała te występują u pacjentów chorych na TRU z częstością 40-90%. Są więc jednym z najważniejszych kryteriów diagnostycznych TRU, a ich miano koreluje z aktywnością procesu chorobowego i może służyć do monitorowania skuteczności zastosowanego leczenia [1, 45]. Kompleksy anty-dna-dna mogą ulegać kumulacji w macierzy mezangium nerek, prowadząc do kłębuszkowe zapalenie nerek w przebiegu tocznia układowego. Przeciwciała anty-dsdna mogą również przyczynić się do schyłkowej postaci toczniowego zapalenia nerek przez bezpośrednie wiązanie odsłoniętych fragmentów chromatyny w błonie podstawnej kłębuszków nerkowych [45]. Oznaczanie przeciwciał dla ds-dna powinno być uzupełnione o badanie awidności przeciwciał. Stadium choroby i stopień zajęcia narządów wewnętrznych koreluje z obecnością przeciwciał anty-dsdna o wysokiej awidności. Niewątpliwą wartość diagnostyczną przeciwciał anty-dsdna obniżają trudności związane z utrzymaniem struktury drugorzędowej DNA podczas konstruowania testów, jak również istotne różnice w czułości stosowanych testów W ocenie przeciwciał anty-dsdna znalazły zastosowanie metoda IIF z użyciem Crithidia luciliae, testy radioimmunologiczne oraz ELISA [56]. Oznaczanie przeciwciał anty-ssdna nie ma dużej wartości diagnostycznej. Przeciwciała te mogą występować oprócz TRU, także w zespole Sjögrena, twardzinie układowej, MCTD, zapaleniu wielomięśniowym i skórnomięśniowym, czy też w RZS [18]. tkanki łącznej [50]. Ponadto ciąża oraz leki np. immunoglobuliny, inhibitory TNFα mogą indukować wytwarzanie przeciwciał ANA [7, 54, 55]. Podkreśla się, iż stwierdzenie obecności przeciwciał ANA metodą IIF ma większą wartość diagnostyczną dla wykluczenia układowych chorób tkanki łącznej, niż dla potwierdzenia takiego rozpoznania [18]. Przeciwciała przeciwhistonowe (ang. anti-histone antibodies) reagują z kompleksem nuklesomu obecnym w chromatynie jądrowej. Skierowane są przeciwko pięciu białkom histonowym H1, H2A, H2B, H3 i H4. Są ważnym i swoistym markerem w TRU idukowanym lekami, takimi jak prokainamid, izoniazyd czy hydralazyna i występują w tym schorzeniu w prawie 100% przypadków. Spotyka się je także w toczniu rumieniowatym układowym (30- Przeciwciała przeciw DNA (ang. anti-dna antibodies) obejmują dwie populacje przeciwciał, różniące się epitopem docelowym. Dla przeciwciał przeciw dwuniciowemu natywnemu DNA (dsdna double structure DNA) epitopem jest wyeksponowany w dsdna szkielet fosforo-cukrowy, zaś dla przeciwciał przeciw jednonicio- 70%) oraz w RZS (15 20%), w zespole Felty ego, zespole Sjögrena, twardzinie układową, pierwotnej żółciowej marskości wątroby, w chorobach zakaźnych (włącznie z infekcją wirusem HIV), a nawet w zaburzeniach neurologicznych, włączając chorobę Alzheimera [2, 45]. Kompleksy białek histonowych z przeciwciałami przeciwko tym białkom mogą odgrywać istotną rolę w rozwoju toczniowego zapalenia Tabela III. Występowanie przeciwciał ANA w wybranych chorobach reumatycznych [3]. nerek. W swoich badaniach Sui i wsp. Autoprzeciwciała ważne diagnostycznie Jednostka chorobowa wykazali silny związek pomiędzy jednoczesnym anty-dsdna, anty-sm, anty-ss-a/ro, antyrybosomalne TRU występowaniem przeciw- anty-ssdna, przeciwhistonowe Polekowy TRU ciał przeciw-dna, przeciw nukleosomom anty-u1-rnp MCTD i przeciw histonom, a stopniem anty-ss-a/ro, anty-ss-b/la Zespół Sjögrena zaawansowania zmian w nerkach, anty-scl-70, ACA, anty-u3-rnp Twardzina układowa zwłaszcza w proliferacyjnym kłębuszkowym Jo-1 Zapalenie wielomięśniowe zapaleniu nerek [57]. Najbar- Jo-1, Mi-2 Zapalenie skórno-mięśniowe dziej wiarygodną metodą detekcji tych przeciwciał jest technika ELISA [45]. 243

10 Przeciwciała antycentromerowe (ACA; anti-centromere protein antibodies) są skierowane przeciwko licznym konstytutywnym białkom centromerowym CENPs (centromere proteins), takim jak CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-D, CENP-G i CENP-H oraz przeciwko grupie białek przejściowych, ujawniających się w określonym stadium cyklu podziałowego komórki: CENP-E i CENP-F [58]. Głównymi autoantygenami są białka: A, B, C, znacznie rzadziej białka: D, E, H [58]. W metodzie immunofluorescencji pośredniej przeciwciała te dają centromerowy typ fluorescencji, charakteryzujący się obecnością małych, jednakowej wielkości ziarnistości, równomiernie rozłożonych w jądrze komórkowym. Przeciwciała antycentromerowe występują u 20-30% chorych na twardzinę układową. Uważa się je za swoiste dla twardziny układowej typu limited występują u 60-80% chorych z tą postacią [59]. Rzadko są obecne u chorych z postacią uogólnioną twardziny (2-5%). Przeciwciała przeciwko centromerowemu białku A mogą wyprzedzać pojawienie się przeciwciał anty-cenp-b. Mogą one zatem stanowić użyteczne narzędzie do wczesnego wykrywania twardziny [60, 61]. Ich obecność koreluje z obecnością objawu Raynaud i jest związana z lepszym rokowaniem niż w przypadku wykrycia innych przeciwciał związanych z chorobą. W niskich mianach są obecne w RZS, toczniu, czy zespole Sjögrena [1]. Obecność tych przeciwciał u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym może być związana z zajęciem stawów i zespołem antyfosfolipidowym [1]. Przeciwciała przeciw nukleosomom (AnuA; anti-nucleosome antibodies) są wykrywane u 60% pacjentów z TRU i tylko w niewielkim procencie w twardzinie układowej i zapaleniu wielomięśniowym [1]. Są uważane za patognomoniczne dla TRU, wykazując swoistość wobec TRU bliską 85%, porównywalną z przeciwciałami dla dsdna [2]. Mogą stanowić najbardziej czuły marker do diagnozowania TRU, zwłaszcza u pacjentów, u których nie stwierdza się obecności przeciwciał anty-ds-dna. Stwierdzono ponadto silną zależność pomiędzy stężeniem przeciwciał przeciw nukleosomom a ciężkością choroby. Omawiane przeciwciała pozwalają także lepiej przewidzieć okresy zaostrzenia objawów klinicznych w toczniu [45]. Przeciwciała antyrybosomalne (ang. anti-ribosomal antibodies) do których zalicza się przeciwciała przeciw rybosomalnemu białku P (ARPA; anti-ribosomal P protein antibodies) reagują z antygenami rybosomalnymi, tj. białkami P0, P1 i P2 podjednostki 60 S rybosomów [1]. Obecność przeciwciał przeciw rybosomalnemu białku P u chorych na toczeń rumieniowaty układowy nie stanowi pewnej wskazówki na zajęcie ośrodkowego układu nerwowego, nerek, wątroby, czy obecność powikłań hematologicznych [62]. Nie ma zgodnych badań potwierdzających jednoznacznie jakoby przeciwciała te miały wysoką specyficzność wobec neuropsychiatrycznej postaci tocznia [1, 63]. ARPA wydają się mieć potencjalne znaczenie w patogenezie chorób autoimmunologicznych, gdyż poprzez wiązanie się z powierzchnią limfocytów T, monocytów czy komórek śródbłonka, mogą oddziaływać na komórki. Ponadto przeciwciała te mogą wnikać do wnętrza żywych komórek, prowadząc do ich dysfunkcji na drodze hamowania syntezy białek, indukcji wytwarzania cytokin prozapalnych i nasilania procesu apoptozy [45]. Wykazano ponadto, iż ARPA mogą wykazywać reaktywność krzyżową z kardiolipiną, ssdna, dsdna i nukleosomami, co może być przyczyną przeszacowania ilości tych przeciwciał u osób z TRU, posiadających inne autoprzeciwciała często stwierdzane w przebiegu choroby [45]. Przeciwciała przeciw Sm (ang. anti-smith antibodies). Antygen Sm składa się z co najmniej 4 białek: B (28 kda), B1(29 kda), D (19 kda), i E (13 kda). Przeciwciała przeciw-sm są wysoce specyficznym markerem TRU. Obok przeciwciał anty-dsdna są zaliczane do przeciwciał patognomonicznych dla tej choroby, mimo że występują tylko u 15-30% pacjentów. Obok anty-dsdna, mają najwyższą swoistość dla rozpoznania tocznia [2]. Nie potwierdzono związku przeciwciał z objawami klinicznymi choroby. Wykazano co prawda, iż miano anty-sm zmienia się w zależności od aktywności choroby i podjętego leczenia, ale nie jest jasne, czy ocena dynamiki zmian tych przeciwciał może określić ryzyko zaostrzenia objawów klinicznych [45]. Przeciwciała przeciw rybonukleoproteinie RNP (ang. anti-ribonucleoprotein antibodies) Antygen RNP należy do grupy małocząsteczkowych rybonukleoprotein (snrnp; small nuclear ribonecleoprotein), zawierających niskocząsteczkowy RNA o dużej zawartości urydyny (U-RNA) oraz różne białka rdzenia o ciężarze cząsteczkowym 70kDa (U1), 33kDa (białko A) i 22 kda (białko C). Komponenty RNA oznaczone są jako U1 do U6. Przeciwciało RNP jest niejednorodne skierowane przeciw różnym epitopom, z których najważniejszy ma masę cząsteczkową 70 kda [1, 45]. Przeciwciała anty U1-snRNP w wysokich mianach występują w mieszanej chorobie tkanki łącznej (MCTD) u % pacjentów. We wszystkich kryteriach diagnostycznych MCTD wymagana jest obecność w surowicy przeciwciał anty-u1 RNP. Przeciwciała te stwierdzane u wszystkich chorych często w wysokich mianach, nie zawsze są obecne od początku choroby, miana ich mogą ulegać wahaniom, utrzymują się w okresie aktywności choroby, a często i w okresach klinicznej remisji, ale też w okresach poprawy mogą występować w niższych mianach, bądź znikać całkowicie. Mogą być także obecne u 30-40% chorych na TRU, oraz pacjentów z RZS i zespołem Sjögrena [1, 45]. Miano ich nie koreluje jednak z aktywnością choroby [45]. Przeciwciała przeciw jądrowej rybonukleoproteinie (nrnp; nuclear ribonucleoprotein) wykrywane metodą pośredniej immunofluorescencji (substraty antygenowe-tkankowe i komórki HEp 2) dają plamisty (ziarnisty) typ świecenia. Do precyzyjniejszej identyfikacji poszczególnych autoprzeciwciał stosuje się metodę immunoenzymatyczną (ELI- SA) oraz technikę Western-blotting, która pozwala na uzyskanie dodatkowych danych jak ciężar cząsteczkowy antygenów i skład subfrakcji poszczególnych antygenów [1, 12, 45]. Przeciwciała przeciw SS-A/Ro (ang. anti-rose antibodies) są skierowane przeciwko kompleksowi małocząsteczkowego RNA (micro-rna) i białek o ciężarze cząsteczkowym 45, 52, 54 i 60 kda. W rutynowej diagnostyce chorób autoimmunologicznych zastosowanie znalazły przeciwciała przeciwko SS-A(Ro52)/TRIM21 244

11 Diagn Lab 2015; 51(3): i SS-A(Ro60) [45, 64]. Są to jedne z najczęściej wykrywanych autoprzeciwciał i występują w wielu chorobach reumatycznych m.in. TRU, toczniu skórnym, zespole Sjögrena, twardzinie układowej, zapaleniach mięśni, wrodzonym bloku serca oraz autoimmunologicznych chorobach wątroby jak pierwotna żółciowa marskość wątroby i autoimmunologiczne zapalenie wątroby. Ich znaczenie diagnostyczne polega głównie na współistnieniu tych przeciwciał z innymi bardziej swoistymi chorobowo przeciwciałami [64, 65]. Najbardziej czułą i specyficzną techniką ich detekcji jest metoda ELISA. Można je wykryć także metodą IIF, wykorzystując jako substrat ludzkie komórki nowotworowe transfekowane antygenem SSA /Ro. Sugerowano istnienie ścisłej korelacji pomiędzy przeciwciałami przeciw SSA/Ro i toczniem rumieniowatym układowym o późnym początku (średnia wieku 50 lat). Obecność omawianych przeciwciał korelowała także z nadwrażliwością na promieniowanie UV, zapaleniem naczyń skórnych i zaburzeniami hematologicznymi, wliczając niedokrwistość, leukopenię i trombocytopenię [65]. Przeciwciała przeciw SS-A/Ro przenikając przez łożysko mogą spowodować rozwój tocznia noworodkowego lub wrodzony blok serca u noworodka. W przypadku tocznia noworodkowego ich obecność stwierdza się niemal w 100% przypadków [1, 2, 7, 45]. Przeciwciała przeciw SSA/Ro60 są częściej wykrywane u osób z TRU oraz toczniem skórnym. Obecność obydwu rodzajów przeciwciał tj. przeciw SSA/Ro60 jak i przeciw SSA/Ro52/TRIM21 jest częstsza w podostrej postaci tocznia rumieniowatego układowego (SCLE subacute cutaneus lupus erythematosus), zaś izolowana obecność przeciwciał przeciw podjednostce Ro52/TRIM21 jest silniej związana z całkowitym blokiem przedsionkowo-komorowym w przebiegu tocznia noworodkowego [1, 2, 7, 45]. Przeciwciała przeciw SS-B/La (ang. anti-lane antibodies) są skierowane przeciwko fosfoproteinie o ciężarze cząsteczkowym 48 kda (La), wspomagającą RNA-polimerazę 3 [7]. Występują niemal wyłącznie u kobiet z zespołem Sjögrena (80%), a także chorych na TRU (10-20%) [1]. W zespole Sjögrena przeciwciała przeciw SS-B/La występują prawie zawsze łącznie z przeciwciałami przeciw SS-A/Ro [45]. Obecność omawianych przeciwciał we krwi matki jest silnie związana z rozwojem tocznia noworodkowego i bloku przedsionkowo-komorowego [66]. Przeciwciała przeciw topoizomerazie I (Scl-70) reagują swoiście z katalitycznym, karboksylowym regionem DNA topoizomerazy I, enzymu uczestniczącego w replikacji DNA [7]. Scl-70 wspólnie z przeciwciałami przeciw centromerom znalazły zastosowanie w diagnostyce różnicowej twardziny układowej i miejscowej. Chorzy z obecnością przeciwciał anty-scl70 zazwyczaj rozwijają postać uogólnioną twardziny i wiąże się to z gorszym rokowaniem [1, 67]. Uważa się, że przeciwciała te są odpowiedzialne za uogólnione stwardnienie skóry, zmiany włókniste w tkance płucnej oraz zajęcie mięśnia sercowego w przebiegu choroby [7]. W niektórych badaniach wykazano również ich związek z występowaniem przełomów nerkowych [68]. Około 40% chorych na twardzinę układową uogólnioną nie posiada jednak przeciwciał Scl-70. Należy także pamiętać, iż zarówno przeciwciała przeciw Scl-70 jak i przeciw centromerom występują także u chorych na inne układowe choroby tkanki łącznej [69]. Przeciwciała przeciw Jo-1 antygenem dla tych przeciwciał jest syntetaza histydylo-trna. Są swoistym markerem zapalenia wielomięśniowego i skórno-mięśniowego u 25-35% chorych [1]. Ich obecność koreluje ze zmianami śródmiąższowymi płuc, objawem Raynauda oraz zapaleniem stawów w przebiegu choroby [7]. Przeciwciała przeciw Pm (Scl) są skierowane przeciwko kompleksom polipeptydowym o ciężarze cząsteczkowym kda zlokalizowanym w jąderku. Docelowym antygenem jest jednak białko jąderkowe o ciężarze cząsteczkowym 100 kda. Przeciwciała przeciw Pm (Scl) są swoiste dla zespołu nakładania, zapalenia wielomięśniowego i skórno-mięśniowego [1], mogą także występować u chorych na twardzinę układową. Przeciwciała przeciw Mi-2. Antygenem dla tych przeciwciał jest kompleks pięciu białek o ciężarze cząsteczkowym kda. Przeciwciała przeciw Mi-2 są charakterystyczne dla zapalenia skórno-mięśniowego [7, 15]. Częstość ich występowania dla zapalenia skórno-mięśniowego wynosi 15-20% [7]. VII. Przeciwciała antyfosfolipidowe (APLA; antiphosholipid antibodies) są heterogenną grupą przeciwciał klasy IgM, IgG, IgA skierowanych przeciwko fosfolipidom, głównym składnikom błon komórkowych, odgrywającym istotną rolę w procesach krzepnięcia krwi [1, 4]. Przeciwciała te reagują z różnymi antygenami, do których zalicza się fosfatydyloserynę, fosfatydylocholinę, kardiolipinę, czy kofaktory reakcji antygen-przeciwciało, jak β2-glikoproteina 1, protrombina, białko C i białko S, czynnik krzepnięcia XI, czy też aneksyna V [15]. Do przeciwciał antyfosfolipidowych, które mają istotną wartość diagnostyczną zaliczane są przeciwciała antykardiolipinowe (acl; anti-cardiolipin antibodies), antykoagulant toczniowy (LA; lupus anticoagulant) i przeciwciała przeciwko β2 -glikoproteinie 1 (anty-β2 GP1; anti-β2 glycoprotein I antibodies) [1, 70]. Dla oznaczania przeciwciał APA znalazły zastosowanie dwie podstawowe metody: koagulometryczna (związana z oznaczaniem APTT czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji, czasu krzepnięcia osocza po dodaniu jadu węża Russela oraz czasu protrombinowego) dla wykrywania antykoagulanta toczniowego i immunoenzymatyczna ELISA dla wykrycia przeciwciał acl, czy też przeciwciał przeciwko β2-glikoproteinie1. Przeciwciała antyfosfolipidowe występują u około 8% osób zdrowych [7]. Stwierdzenie obecności przeciwciał antyfosfolipidowych jest jednym z laboratoryjnych kryteriów klasyfikacyjnych pierwotnego lub wtórnego zespołu antyfosfolipidowego (APS; antiphospholipid syndrome), występującego, jako odrębna jednostka chorobowa lub towarzyszącego innym chorobom, takim jak TRU, RZS, czy też toczeń indukowany lekami [15]. Najważniejszą i najczęściej występującą kliniczną manifestacją APS, włączoną do kryteriów diagnostycznych rozpoznania zespołu antyfosfolipidowego jest zakrzepica w obrębie naczyń tętni- 245

12 czych, żylnych albo włosowatych, w obrębie jakiejkolwiek tkanki lub narządu, potwierdzona metodami diagnostyki obrazowej, metodą Dopplera lub histopatologicznie. Zmiany zakrzepowe zazwyczaj przyjmują postać zakrzepicy żylnej kończyn dolnych i często współistnieją z zatorowością płucną. Niepowodzenia położnicze, stanowią poza zakrzepicą naczyń, drugą grupę klinicznych kryteriów klasyfikacyjnych APS. Najczęstszymi powikłaniami ciąż u pacjentek z APS są: obumarcie płodu, poród przedwczesny w związku ze stanem przedrzucawkowym, rzucawką lub ciężką niewydolnością łożyska oraz nawracające poronienia samoistne [71]. Do rozpoznania APS upoważnia spełnienie jednego z wyżej wymienionych kryteriów klinicznych (zakrzepicy naczyń lub powikłań położniczych) oraz stwierdzenie, co najmniej dwukrotne w odstępie 12 tygodni, obecności przeciwciał antyfosfolipidowych: antykoagulantu tocznia lub przeciwciał antykardiolipinowych lub przeciwciał przeciw β2-gpi. Konieczność potwierdzenia obecności APLA w odstępie minimum 12 tygodni wynika z faktu, że w przebiegu infekcji wirusowych, bakteryjnych i pasożytniczych mogą się pojawić przeciwciała o właściwościach APLA, które zanikają po kilku tygodniach i najczęściej nie dają żadnych objawów klinicznych [15, 71, 72]. Wykazano, że obecność wszystkich trzech przeciwciał antyfosfolipidowych (acl, anty-β2-gpi, LA) silniej wiąże się z nawracającymi późnymi (>10 tygodnia ciąży) utratami płodu i epizodami zakrzepicy niż obecność dwóch lub jednego przeciwciała, pozwalając na identyfikację pacjentek z wysokim ryzykiem nawrotu poronienia. Obecność LA silnie koreluje z późnymi poronieniami, natomiast obecność acl wiąże się zarówno z wczesnymi, jak i późnymi poronieniami nawracającymi. Wzrost miana tych przeciwciał w czasie ciąży jest złym czynnikiem rokowniczym [45, 72]. Przeciwciała antykardiolipinowe (acl; anti-cardiolipin antibodies) Oznaczanie przeciwciała acl jest najczęściej wykonywanym oznaczeniem w diagnostyce zespołu antyfosfolipidowego. Należy jednak pamiętać, że wykluczenie APS wymaga wykonania oznaczeń LA i przeciwciał przeciw β2-glikoproteinie I. Duże ryzyko powikłań APS związane jest z występowaniem przeciwciał antykardiolipinowych w średnich lub wysokich mianach [72]. Proces wiązania przeciwciał z antygenem wymaga obecności kofaktora β2-glikoproteiny I (β2gpi), która jest białkiem o masie cząsteczkowej 50kDa, należącym do β2 globulin osocza, odgrywającym istotną rolę w procesach krzepnięcia krwi. Przeciwciała acl występują od 0,2-10% pacjentów z zakrzepicą tętniczą. W niskim mianie obecne są u 2 do 7% zdrowych dawców krwi, a w wysokim mianie u 0,2% zdrowej populacji, przy czym odsetek ten wzrasta wraz z wiekiem badanych [7]. Przeciwciała antykardiolipinowe mogą także być obecne w chorobach reumatycznych, jak: TRU, RZS, twardzina układowa, zespół Sjögrena. Wykazano, że wysokie miano przeciwciał antykardiolipinowych w klasie IgG lub IgG2, jest złym czynnikiem prognostycznym [7, 45]. Antykoagulant toczniowy LA (LA; lupus anticoagulant) Antykoagulant toczniowy (LA) stanowi heterogenną grupę przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom, uczestniczącym w procesie krzepnięcia krwi. Ich obecność wydłuża czasy krzepnięcia osocza zależne od fosfolipidów, w tym: APTT (ang. Activated Partial Thromboplastin Time) czas częściowej tromboplastyny po aktywacji, czas krzepnięcia osocza po dodaniu jadu węża Russella (drvvt; dilute Russell viper venom time) lub czas protrombinowy. Wydłużenie jednego z wymienionych wyżej czasów krzepnięcia zalecanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy, oznaczonych dwukrotnie w odstępie nie krótszym niż 12 tygodni, wystarczy do stwierdzenia LA [72, 73]. Należy pamiętać, że dla diagnostyki antykoagulantu toczniowego bardzo ważna jest faza przedlaboratoryjna, w tym właściwe pobieranie materiału oraz wirowanie próbki. Wielu badaczy uważa, że LA jest bardziej specyficznym, ale mniej czułym wykładnikiem zmian zakrzepowych w porównaniu do przeciwciał antykardiolipinowych. W ogólnej populacji antykoagulant toczniowy występuje u około 1% osób zdrowych [5, 73]. Przeciwciała przeciw β2-glikoproteinie I w klasie IgG i IgM (anty β2-gpi; anti-β2 glycoprotein I antibodies) β2-glikoproteina I jest właściwym epitopem dla przeciwciał antyfosfolipidowo-białkowych. Uważa się, że test ten jest bardziej specyficzny, ale mniej czuły w odniesieniu do obecności objawów APS od testu na obecność przeciwciał acl, natomiast ich korelacja z objawami choroby jest bardzo podobna. Wydaje się, że najważniejszym wskazaniem do oznaczenia tych przeciwciał jest mocne podejrzenie APS przy ujemnych wynikach przeciwciał acl w klasach IgG i IgM oraz antykoagulantu toczniowego. U 3-10% chorych z APS są one jedynym dodatnim testem wykrywającym APLA. Wykazano ponadto, że istnieje korelacja pomiędzy obecnością przeciwciał anty β2-gpi, a pierwszym zachorowaniem na zakrzepicę żył głębokich. Obecność omawianych przeciwciał jest także niezależnie związana z podwyższonym ryzykiem utraty kolejnej ciąży, a wzrost ich miana w przebiegu ciąży jest złym czynnikiem rokowniczym [45, 72, 73] Inne przeciwciała antyfosfolipidowe Rzadziej przeciwciała APLA mogą być skierowane przeciw innym antygenom, takim jak protrombina, kompleks fosfatydyloseryny z protrombiną, heparyna, aktywne białko C, białko S, czynnik XI, czynnik V, kompleks czynnika VII z czynnikiem VIIa, tkankowy aktywator plazminogenu (t-pa), aneksyna II (A2) lub aneksyna V (A5) [72, 73]. Sądzi się, iż protrombina jest drugim, obok β2-glikoproteiny 1, kofaktorem przeciwciał antyfosfolipidowych. Przeciwciała przeciw protrombinie w klasie IgG i IgM są w niektórych przypadkach związane z występowaniem LA, chociaż korelacja tych przeciwciał z objawami klinicznymi zespołu antyfosfolipidowego jest słabsza. W praktyce klinicznej oznaczać można także przeciwciała przeciw fosfatydyloserynie w klasie IgG i IgM oraz przeciw fosfatydyloinozytolowi w klasie IgG i lgm, często współistniejące z obecnością innych przeciwciał antyfosfolipidowych. Do testów, których przydatność diagnostyczna jest w trakcie badań, należą między innymi test oporności na aneksynę V (A5R), oznaczanie przeciwciał przeciw domenie I B2-GPI, przeciwciał przeciw protrombinie i przeciwciał przeciw fosfatydyloserynie [72,73]. 246

13 Diagn Lab 2015; 51(3): VIII. Przeciwciała przeciwko cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych (ANCA; antineutrophil cytoplasmic antibodies) ANCA w metodzie immunofluorescencji pośredniej, dają dwa typy fluorescencji, klasyczny cytoplazmatyczny (canca cytoplasmic), charakterystyczny dla przeciwciał przeciwko proteinazie 3 (PR-3) i okołojądrowy (panca perinuklear), który wykazują przeciwciała przeciwko mieloperoksydazie (MPO), katepsynie G (KT), elastazie (EL), lizozymowi (LIZ), azurocydynie (AZ), enolazie (EN), aktynie (AK) [74]. Metoda IIF jest badaniem wstępnym, w którym w zależności od lokalizacji antygenu różnicowany jest typ przeciwciał (c-anca lub p-anca). Typ cytoplazmatyczny, charakteryzuje się gruboziarnistym świeceniem całej cytoplazmy komórki ze szczególnym nasileniem w obszarze między płatami jądra. P-ANCA wywołują z kolei intensywne świecenie wokoło jądra komórkowego. Jako standardowy substrat, służący do identyfikacji ANCA stosowane są ludzkie granulocyty. Antygenami reagującymi z surowicą pacjenta są mieloperoksydaza, elastaza, laktoferyna, lizozym lub katepsyna G dyfundujące do błony jądrowej granulocytów [74]. Dla określenia swoistości antygenowej przeciwciał ANCA służą testy immunoezymatyczne ELISA [7]. Najczęściej w testach tych oznacza się przeciwciała przeciw mieloperoksydazie cytoplazmy granulocytów (MPO-ANCA), przeciw proteinazie 3 cytoplazmy granulocytów (PR3-ANCA), jak również profil ANCA o różnej swoistości (MPO, PR3, laktoferyna, katepsyna, elastaza) [7, 74]. Istotna rola przeciwciał przeciwko cytoplazmie granulocytów obojętnochłonnych w patogenezie grupy zapaleń naczyń, obejmujących głównie małe naczynia, stała się ważnym argumentem za wprowadzeniem nowego nazewnictwa i podziału zapaleń naczyń, uzgodnionego podczas Międzynarodowej Konferencji w Chapel Hill w 2012 roku. Wprowadzono nowe kategorie zapaleń naczyń, w tym zapalenia związane z ANCA (AAV ANCA-asssociated vasculitis), do których należą mikroskopowe zapalenie naczyń (MPA; microscopic polyangiitis), ziarniniakowatość z zapaleniem naczyń (GPA; granulomatosis with polyangiitis, dawniej ziarniniakowatość Wegenera) oraz eozynofilowa ziarniniakowatość z zapaleniem naczyń (EGPA; eosinophilic granulomatosis with polyangiitis, dawniej zespół Churga i Strauss) [8]. Obecność przeciwciał przeciwgranulocytowych skierowanych przeciwko proteinazie 3 (PR3-ANCA) częściej stwierdza się u chorych z GPA, w przeciwieństwie do przeciwciał przeciwko mieloperoksydazie (MPO-ANCA), które są głównie związane z występowaniem zapaleń małych naczyń, sklasyfikowanych jako MPA i EGPA [75]. Badania ostatnich lat podkreślają silny związek PR3-ANCA z konkretnymi polimorfizmami w locus dla HLA-DP oraz w genie kodującym α1-antytrypsynę (SERPINA1), która jest inhibitorem proteinazy 3. Z kolei MPO-ANCA są silniej związane z HLD-DQ [76]. Pojawiła się też propozycja wprowadzenia nowej klasyfikacji zapaleń naczyń związanych z ANCA, uwzględniającej zajęcie odpowiednio: przewodu pokarmowego lub układu sercowo-naczyniowego, bądź nerek, a w tym ostatnim przypadku obecność przeciwciał PR3-ANCA [76, 77, 78]. IX. Przeciwciała przeciw mitochondrium (AMA; anti-mitochondrial antibodies) mogą być wykrywane w wielu chorobach, najczęściej wraz z innymi autoprzeciwciałami. Wartość diagnostyczną dla chorób autoimmunologicznych posiadają AMA, tj. od M1 do M9, a szczególnie znacząca jest dla pierwotnej żółciowej marskości wątroby [2, 15]. Przeciwciała przeciwko mitochodriom (AMA) mogą być wykrywane przy użyciu różnych histologicznych substratów oraz komórek HEp-2. Jako standardowe substraty do identyfikacji tych przeciwciał stosowane są mrożone skrawki nerki szczura bądź myszy. Cytoplazma kanalików proksymalnych i dystalnych wykazuje ziarnistą fluorescencję wzmożoną u podstawy. Wzór fluorescencji odpowiada obrazowi uzyskanemu dla pozytywnej surowicy kontrolnej. Metodą immunofluorescencji pośredniej z zastosowaniem substratów tkankowych można dokładnie określić miano AMA [2, 4]. Przeciwciała AMA-M1 występują w 5-15% u chorych na TRU, twardzinę układową, RZS, zespół Sjögrena. Przeciwciała AMA-M2 występują u 96% chorych na pierwotną żółciową marskości wątroby i są swoistym markerem tej choroby [2,4]. W niższych mianach mogą być wykrywane w innych przewlekłych schorzeniach wątroby w 30% przypadków, a także w postępującej twardzinie układowej w 7-25%. U pacjentów z TRU, którzy wykazują te przeciwciała, może występować zespół nakładania z pierwotną żółciową marskością wątroby [2, 15]. X. Przeciwciała przeciw mięśniom gładkim (ASMA; anti-smooth muscles antibodies) występują w różnych chorobach wątroby w tym autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, czy też marskość wątroby. W 70% przypadkach ich wysokie miano jest oznaką autoimmunologicznego zapalenia wątroby i może korelować z aktywnością choroby. Oznaczanie metodą immunofluorescencji pośredniej ANA i miana ASMA wraz z innymi przeciwciałami, takimi jak przeciwciała przeciw mikrosomom nerki i wątroby LKM-1 (ang. anti-liver kidney microsomal antibodies), pozwala na różnicowanie autoimmunizacyjnego zapalenia wątroby z wirusowym zapaleniem, bądź zaburzeń hepatologicznych związanych ze TRU, czy twardziną układową [2, 4]. Przeciwciała przeciwko mięśniom gładkim reagują z mrożonymi skrawkami żołądka szczura, myszy, dając wyraźną fluorescencję cytoplazmy błony mięśniowej, jak również międzykłębuszkowych włókien i torebki surowiczej. Zasadniczo taki sam obraz fluorescencji uzyskuje się dla pozytywnej surowicy kontrolnej [2, 15]. Podsumowanie i wnioski Choroby reumatyczne nie dotyczą jednego narządu, lecz są niejednokrotnie odzwierciedleniem zmian chorobowych całego ustroju. Badania laboratoryjne stosowane w chorobach reumatycznych, są bardzo cennym elementem uzupełniającym obserwacje kliniczne i wspomagającym rozpoznanie. Służą one do oceny aktywności i dynamiki procesu zapalnego, pozwalają ocenić skuteczność zastosowanej terapii. Ułatwiają również ocenę stopnia remisji. Mogą też być sygnałem rozpoczynającego się zaostrzenia, czy też 247

14 nawrotu procesu chorobowego w monitorowaniu jego przebiegu. Mają również znaczenie prognostyczne przez ocenę czynników ostrej fazy, jak i serologicznych]. Stanowią więc bardzo użyteczne narzędzie i źródło informacji, jakimi powinien posługiwać się współczesny klinicysta w diagnostyce różnicowej chorób autoimmunologicznych. Badania laboratoryjne pełnią ciągle rolę pomocniczą, a ich wyniki należy rozpatrywać w połączeniu z danymi klinicznymi. Obserwowany w ostatnich latach rozwój nowych technologii badawczych, w tym technik multipleksowych, a także ich automatyzacja diametralnie zmienia oblicze diagnostyki laboratoryjnej, czyniąc ją istotną składową medycyny personalizowanej. Ciągły postęp w serodiagnostyce autoprzeciwciał oraz antygenów, polegający na wprowadzeniu niezwykle czułych, złożonych technicznie i coraz częściej zautomatyzowanych metod, obliguje do szczegółowego przestrzegania standardowych warunków oznaczeń oraz rozwinięcia szerokiego programu standaryzacji, obejmującego metodykę, stosowane odczynniki, jak i surowice wzorcowe [25, 79]. Piśmiennictwo 1. Odrowąż-Sypniewska G. Diagnostyka laboratoryjna wybranych chorób reumatycznych. MedPharm Polska, Wrocław, Ząbek J. Wsparcie diagnostyczne w rozpoznaniu schorzeń z autoimmunizacją. Medyk, Warszawa, Damoiseaux J, Andrade L, Fritzler M, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimm Rev 2015; 14: Anyszek T, Obtułowicz K, Furgał J. Diagnostyka dysfunkcji układu immunologicznego. Dembińska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Urban and Partner, Wrocław, 2010: Salamunić I. Laboratory diagnosis of autoimmune diseases new technologies, old dilemmas. Biochemia Medica 2010; 20: Chapel H, Heaney M, Misbah S, Snowden N. Immunologia kliniczna, Wydawnictwo Czelej, Lublin, Puszczewicz M, Białkowska-Puszczewicz G, Majewski D. Znaczenie autoprzeciwciał w rozpoznaniu chorób reumatycznych. Post Nauk Med 2012; 2: Jennette JC, Falk RJ, Bacon PA, et al revised International Chapel Hill Consensus Conference Nomenclature of Vasculitides. Arthritis Rheum 2013; 65: Kumble S, Lopez-Muedano C, Kumble K. Microarray ELISA screening In connective tissue disease. J Clin Diagn Res 2012; 6: Kingsmore S. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat Rev Drug Discov 2006; 5: American College of Rheumatology. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: an introduction. Arthritis Care Res, 2002; 47: Kątnik-Prastowska I. Immunochemia w biologii medycznej. PWN, Warszawa, 2009: , Ząbek J. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej. Reumatologia 2005; 43: Agmon-Levin N, Damoiseaux J, Kallenberg C, et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis 2014; 73: Zimmermann-Górska I. Postępy reumatologii klinicznej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, Ząbek J, Palacz A, Pyka J, Krzewska I. Przeciwciała przeciwjąderkowe w serodiagnostyce zespołu antyfosfolipidowego. Pol Arch Med Wewn. 2008; 118 (Suppl): Tozzoli R, Bonaguri Ch, Melegari A et al. Current state of diagnostics technologies in the autoimmunology laboratory. Clin Chem Lab Med 2013; 51: Castro Ch, Gourley M. Diagnostic testing and interpretation of tests for autoimmunity. Allergy Clin Immunol 2010; 125 (2 Suppl 2): S238 S Stott DI. Immunoblotting, dot-blotting, and elispot assays: methods and applications. J Immunoassay 2000; 21: Hrycaj P. Nowe testy serologiczne w diagnostyce reumatologicznej. Reumatologia 2007; 45: Soloski M, Chrest F. Multi-parameter flow cytometry for discovery of disease mechanisms In rheumatic diseases.arthritis Rheum 2013; 65: Blair PA, Norena LY, Flores-Borja F, et al. CD19(+)CD24(hi)CD38(hi) B cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic Lupus Erythematosus patients. Immunity 2010; 32: Wei Ch, Jenks S, Sanz I. Polychromatic flow cytometry In evaluating rheumatic disease patients. Arthritis Res Ther 2015; 17: Foti DP, Greco M, Palella E, Gulletta E. New laboratory markers for the management of rheumatoid arthritis patients. Clin Chem Lab Med 2014; 52: Tozzoli R, D Aurizio F, Villalta D, Bizzaro N. Automation, consolidation, and integration in autoimmune diagnostics. Autoimmun Highlights 2015; 6: Farid S, Azizi G, Mirshafiey A. Anti-citrullinated protein antibodies and their clinical utility in rheumatoid arthritis. Int J Rheumat Dis 2013; 16: Ingegnoli F, Castelli R, Gualtierotti R. Rhematoid factors: clinical applications. Dis Markers 2013; 35, 6: Dörner T, Egerer K, Feist E, et al. Rheumatoid factor revisited. Curr Opin Rheumatol 2004; 16, 3: Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, et al. Rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/Eurropean League Against Rheumatism collaborative initiative. Ann Rheum Dis 2010; 69: Szodoray P, Szabo Z, Kapitany A, et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoantibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of disease outcome in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev 2010; (9)3: Jilani AA, Mackworth-Yong CG. The role of citrullinated protein antibodies in predicting erosive disease in rheumatoid arthritis: a systematic literature review and meta-analysis. Int J Rheumatol 2015; Valesini G, Gerardi M, Ianuccelli C, et al. Citrullination and autoimmunity. Autoimmunity Rev 2015; 14: Aletaha D., Neogi T, Silman A, et al. Rheumatoid arthritis classification criteria. Arthritis Rheum 2010; 62: Shovman O, Gilburd B, Shoenfeld Y, et al. The diagnostic utility of anti-cyclic citrullinated peptide antibodes, matrix metalloproteinase-3, rheumatoid factor, erythrocyte sedimentation rate, and C-reactive protein in patiens with erosive and non-erosive rheumatoid arthritis. Clin Devel Immunol 2005; (12) 3: Syversen SW, Gaarder PI, Goll GL, et al. High anti-cyclic citrullinated peptide levels and an algorithm of four variables predict radiographic progression in patients with rheumatoid arthritis: results from a 10-year longitudinal study. Ann Rheum Dis 2008; 67, 2: Syversen SW, Goll GL, van der Heijde D, et al. Prediction of radiographic progression in rheumatoid arthritis and the role of antibodies against mutated citrullinated vimentin: results from a 10-year prospective study. Ann Rheum Dis 2010; 69, 2: Lienesch D, Morris R, Metzger A, et al. Absence of cyclic citrullinated peptide antibody in nonarthritic patients with chronic hepatitis C infection. J Rheumatol 2005; 32: Whiting PF, Smidt N, Sterne JA, et al. Systematic review: accuracy of anticitrullinated peptide antibodies for diagnosing rheumatoid arthritis. Ann Intern Med 2010; 152: , Demoruelle M, Parish M, Derber L, et al. Performance of anti-cyclic citrullinated peptide assays differs in subjects at increased risk of rheumatoid arthritis and subjects with established disease. Arthritis Rheum 2013; 65: Shi J, van Veelen PA, Mahler M, et al. Carbamylation and antibodies against carbamylated proteins in autoimmunity and other pathologies. Autoimmun Rev 2014; 13: ; 41. Shi J, van de Stadt LA, Levarht EW, et al. Anti-carbamylated protein (anti-carp) antibodies precede the onset of rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2014; 73: A Stoop JN, Liu B-S, Shi J, et al. Antibodies specific for carbamylated proteins precede the onset of clinical symptoms in mice with collagen induced arthritis. PLoS ONE 2014; 9: e

15 Diagn Lab 2015; 51(3): Shi J, van de Stadt LA, Levarht EW, et al. Anti-carbamylated protein antibodies are present in arthralgia patients and predict the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2013; 65: Trendelenburg M. Antibodies against C1q in patients with systemic lupus erythematosus. Springer Semin Immun 2005; 27: Cozzani E, Drosera M, Gasparini G, Parodi A. Serology of lupus erythematosus: correlation between immunopathological features and clinical aspects. Autoimmune Dis 2014, Article ID , 13 pages. 46. Mok C, Ho L, Leung H, Wong L. Performance of anti-c1q, antinucleosome, and anti-dsdna antibodies for detecting concurrent disease acrivity in systemic lupus erythematosus. Translat Res 2010; 156: Mahler M, Meroni PL, Bossuyt X, Fritzler MJ. Clinical and serological features of patients referred through a Rheumatology Triage System because of positive antinuclear antibodies, PLoS ONE 2014; 9(4). 48. Wiik AS, Bizzaro N. Missing links in high quality diagnostics of inflammatory systemic rheumatic diseases. It is all about the patient! Autoimmun Highlights 2010; 3: Mehra S, Walker J, Patterson K, et al. Autoantibodies in systemic sclerosis. Autoimmun Rev 2013; 12: Puszczewicz M. Przeciwciała przeciwjądrowe cóż z nimi począć? Reumatologia 2013; 51, 3: Satoh M, Chan EKL, Ho LA, et al. Prevelence and sociodemographic correlates of antinuclear antibodies in the united states. Arthr Rheum 2012; 64: Cabiedes J, Nunez-Alvarez CA. Antinuclear antibodies. Rheumatol Clin 2010; 6: Wiik AS, Holer-Madsen M, Forslid J, et al. Antinuclear antibodies: A contemporary nomenclature using Hep-2 cells. J Autoimmunol 2010; 35: Atzeni F, Talotta R, Salaffi F, et al. Immunogenicity and autoimmunity during anti-tnf therapy. Autoimmun Rev 2013; 12: Meroni PL, Schur PH. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis 2010; 69: Ząbek J, Palacz A, Horbacz I, Pyka J. Ocena wiarygodności oznaczania niektórych typów swoistości przeciwciał przeciwjądrowych. Rematologia 2009; 47(6): Sui M, Lin Q, Xu Z et al. Simultaneous positivity for anti-dna, anti-nucleosome and anti-histone antibodies is a marker for more severe lupus nephritis. J Clin Immunol 2013; 33: Pyka J, Horbacz I, Biernacka E, et al. Znaczenie przeciwciał antycentromerowych w diagnostyce chorób reumatycznych i nowotworowych. Reumatologia 2012; 50, 1: Ho KT, Reveille JD. The clinical relevance of autoantibodies in scleroderma. Arthritis Res Ther. 2003; 5: Fritzler MJ, Rattner JB, Luft LM, et al. Historical perspectives on the discovery and elucidation of autoantibodies to centromere proteins (CENP) and the emerging importance of antibodies to CENP-F. Autoimmun Rev 2011; 10: Mahler M, Mierau R, Genth E, et al. Development of a CENP-A/CENP-B specific immune response in a patient with systemic sclerosis. Arthr Rheum 2002; 46: Olesińska M. Przeciwciała przeciwko rybosomalnemu białku P znaczenie kliniczne i udział w patogenezie tocznia rumieniowatego układowego. Reumatologia 2005; 43, 5: Massardo L, Burgos P, Martinez ME, et al. Antiribosomal P protein antibodies in Chilean SLE patients: no association with renal disease. Lupus 2002; 11: Defendenti C, Atzeni F, Spina MF, et al. Clinical and laboratory aspects of Ro/ SSA-52 autoantibodies. Autoimmun Rev 2011; 10: Yoshimi R, Ueda A, Ozato K, et al. Clinical and pathological roles of Ro/SSA autoantibody system. Clin Dev Immunol 2012 Article ID , 12 pages. 66. Shiboski S, Shiboski C, Criswell L, et al. American College of Rheumatology classification criteria for Sjogren s syndrome: a data-driven, expert consensus approach in the Sjogren s International Collaborative Clinical Alliance cohort. Arthritis Care and Research 2012; 64, Hanke K, Dahnrich C, Bruckner CS, et al. Diagnostic value of anti-topoisomerase I antibodies in a large monocentric cohort. Arthritis Res Ther 2009; 11: R Nishijima C, Sato S, Hasegawa M, et al. Renal vascular damage in Japanese patients with systemic sclerosis. Rheumatology (Oxford) 2001; 40: Spencer-Green G, Alter D, Welch HG. Test performance in systemic sclerosis: anti-centromere and anti-scl-70 antibodies. Am J Med. 1997; 103: Mahler M, Norman GL, Meroni PL, et al. Autoantibodies to domain 1 of beta 2 glycoprotein 1: a promising candidate biomarker for risk management in antiphospholipid sydrome. Autoimmun Rev 2012; 12, 2: Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, et al. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost 2006; 4: Zawilska K, I. Zimmermann-Górska, J. Skrzypczak. Zespół antyfosfolipidowy, rozdział 8, strona , Postępy reumatologii klinicznej, PZWL, Warszawa Brandt JT, Triplett DA, Alving B, et al. Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulant/ Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 1995; 74: Csernok E, Moosig F. Current and emerging techniques for ANCA detection in vasculitis. Nat Rev Rheumatol 2014; 10: Alberici F, Martorana D, Vaglio A. Genetic aspects of anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant 2015; 30 Suppl 1: i Millet A, Pederzoli-Ribeil M, Guillevin L, et al. Republished: Antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitides: is it time to split up the group? Postgrad Med J 2014; 90: Mahr A, Katsahian S, Varet H, et al. Revisiting the classification of clinical phenotypes of anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis: a cluster analysis. Ann Rheum Dis 2013; 72: Hazebroek MR, Kemna MJ, Schalla S, et al. Prevalence and prognostic relevance of cardiac involvement in ANCA-associated vasculitis: Eosinophilic granulomatosis with polyangiitis and granulomatosis with polyangiitis. Int J Cardiol 2015; 199: Satoh M, Tanaka S, Chan E. The uses and misuses of multiplex autoantibody assays in systemic autoimmune rheumatic diseases. Front Immunol 2015; 6: 181. Adres do korespondencji: dr hab. n. med. Katarzyna Komosińska-Vassev Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Tel ; kvassev@sum.edu.pl Zaakceptowano do druku:

16 250