Wydział Biochemii, Biofozyki i Biotechnologii Zakład Mikrobiologii Kierownik Prof. dr hab. Jan Potempa

Transkrypt

1 Kraków, 13 października 2014 Wydział Biochemii, Biofozyki i Biotechnologii Kierownik Prof. dr hab. Jan Potempa Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Fabiana Giski pt. Rola bakteryjnego czynnika HopQ1 w modelowaniu odpowiedzi roślin na infekcję Tematyka tej pracy doktorskiej wykonanej w Pracowni Patogenezy Roślin Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN pod opieką dr hab. Magdaleny Krzymowskiej wpisuje się w fascynujący nurt badań nad oddziaływaniami pomiędzy roślinami a fitopatogennymi bakteriami. W przeciwieństwie do zwierząt, rośliny nie mogą uciec, czy schronić w bezpieczne miejsce przed zarazą. Nie mają też wyspecjalizowanych w zabijaniu bakterii komórek żernych ani przeciwciał swoistej odpowiedzi immunologicznej. Mimo to, potrafią się skutecznie bronić przed atakiem mikroorganizmów. Z kolei fitopatogeny rozwinęły wiele przystosowań umożliwiających przełamanie tej obrony. Jednym z najbardziej wyrafinowanych systemów ataku na gospodarza zakażenia, roślinę czy zwierzę, jest system sekrecji białek typu III (T3SS). Ten system wygląda, na zdjęciach z TEM, i działa jak molekularna strzykawka, przy pomocy której patogeny wprowadzają tzw. białka efektorowe bezpośrednio do cytoplazmy atakowanej komórki gospodarza. Podczas gdy struktura strzykawki T3SS jest bardzo konserwatywna, eksportowany jest przez nią bardzo szeroki asortyment różnorodnych białek efektorowych. Efektory mają jedna istotną cechę, którą jest to, że uderzają w najbardziej newralgiczne punkty ścieżek sygnałowych, od których zależy prawidłowe funkcjonowanie komórki eukariotycznej. Takim czynnikiem jest białko HopQ1 produkowane przez bakteryjne patogeny roślinne. Badania nad tym białkiem, produkowanym przez Pseudomonas syringae i do tej pory tylko słabo scharakteryzowanym, są tematem pracy doktorskiej mgr Fabiana Giski. Najważniejsze osiągnięcia opisane w rozprawie to: 1) Pokazanie, że HopQ1 ulega fosforylacji w roślinie, co jest niezbędne do utworzenia kompleksu z wewnątrzkomórkowym białkiem roślinnym , co ma znaczenia w przełamaniu odpowiedzi obronnej fasoli. ul. Gronostajowa Kraków tel. +48 (12) jan.potempa@uj.edu.pl

2 2) Charakterystyka kompleksu HopQ1 z w aspekcie wykorzystania białka jako platformy umożliwiającej efektorowi interakcję z innymi białkami komórki roślinnej. 3) Interesujące i nowatorskie odkrycie, że w komórkach tytoniu HopQ1, niezależnie od interakcji z , jest rozpoznawany przez jeszcze nieznane białko R. 4) Wykrycie metodami bioinformatycznymi w strukturze HopQ1 motywu KIM, który występuje w kinazach kinaz MAP i uczestniczy w oddziaływaniu tych kinaz z ich substratami. Podobnie ciekawym odkryciem jest znalezienie nietypowego motywu asparaginianowego odpowiedzialnego za wiązanie jonów wapnia, co wywołuje zmiany strukturalne HopQ1. Funkcjonalność tych motywów została potwierdzona doświadczalnie. Wyżej wymienione główne odkrycia opisane w rozprawie oparte są o bardzo rzetelne wyniki po mistrzowsku wykonanych doświadczeń. Mój podziw wzbudza logika i eleganckie zaplanowanie kolejnych eksperymentów, które uwzględniają wszystkie niezbędne kontrole. Nie dziwi mnie więc fakt, że część wyników przedstawionych w rozprawie została opublikowana w bardzo prestiżowym periodyku naukowym, jakim jest Plant Physiology, wydawanym przez American Society of Plant Biologists. Biorąc pod uwagę bardzo dogłębny system recenzowania prac w tym czasopiśmie przez ekspertów z danej dziedziny uważam, że to mnie zwalnia z obowiązku krytycznych komentarzy tych opublikowanych wyników. Zainteresowało mnie tylko dlaczego subkomórkowa lokalizacja HopQ1 oraz wpływ koekspresji i HopQ1 na jądrowo-cytoplazmatyczną lokalizację tych białek tworzących kompleks (Fig. 5 i 6 w publikacji) nie została wykorzystana w rozprawie. Opublikowanych wyników dotyczą również pytania, na które odpowiedź ma zaspokoić moją ciekawość. Przeprowadzone zostały 4 doświadczenia detekcji białek współoczyszczających się z HopQ1. Za wyjątkiem izoform a, c i e inne izoformy białka wykrywane były z różnym szczęściem, najczęściej w 3 i 4 doświadczeniu. Czym tłumaczy się ten rozrzut? W rozprawie nic na ten temat nie pisze. Zwykle obok pokrycia sekwencji przy identyfikacji białek metoda MS podaje się tzw. Mascot score, który lepiej potwierdza znalezienie danego białka niż % pokrycia sekwencji. Czy był jakiś 2

3 powód, że ten score nie został umieszczony w tabelach 42., 4.3 i 4.4? Z czystej ciekawości chciałbym się tez dowiedzieć, czy były wykrywane inne, niż białko , białka roślinne? Niepublikowane wyniki będące częścią rozprawy są ciekawe i oparte o logicznie zaplanowane i rzetelnie wykonane doświadczenia. W tej części za bardzo ciekawą obserwację uważam wpływ wapnia wiązanego przez niekanoniczny motyw asparaginianowy na strukturę HopQ1. Brakuje mi tutaj pójścia za ciosem i pokazania jak wapń wpływa na funkcje HopQ1. Czy wiązanie wapnia jest niezbędne dla opisanych funkcji HopQ1 w komórce roślinnej? Czy białko ze zmutowanym motywem asparaginianowym ulega fosforylacji, czy wiąże białko roślinne ? Najbardziej kontrowersyjne są wyniki wpływu HopQ1 na poziom ufosforylowania białka roślinnego SIPK w komórkach tytoniu. Wprowadzona mutacja w motywie KIM mocno upośledza ekspresje HopQ1. Być może podstawienie Arg-Lys w motywie KIM innymi resztami niż Glu-Ala nie będzie miało wpływu na poziom ekspresji HopQ1? Nie można jednak oczekiwać, żeby praca doktorska odpowiedziała na wszystkie możliwe pytania. Najważniejsze jest to, ze doktorant zdaje sobie sprawę ze słabych punktów tych wyników. Jestem pewien, że dalsze badania nad motywem asparaginianowym oraz motywem KIM zaowocują kolejnymi świetnymi publikacjami zespołu dr hab. Krzymowskiej. Od strony redakcyjnej ta rozprawa jest jedną z najlepiej przygotowanych, opracowanych, ilustrowanych i napisanych prac doktorskich, jakie miałem okazję recenzować, poprawiać lub po prostu przeglądać. Ponieważ komentarz na ten temat jest standardem w recenzjach prac doktorskich pisze co następuje: Właściwa część pracy poprzedzona jest streszczeniem w języku polskim i angielskim, spisem treści, który dziwnym trafem umieszczony jest po streszczeniach, oraz wykazem najczęściej stosowanych skrótów. Bez odwoływania się do tego wykazu czytanie pracy, a zwłaszcza wstępu najeżonego trzy- i czteroliterowymi akronimami byłoby udręką. 1) Wstęp liczy 31 stron maszynopisu i jest ilustrowany 14 kolorowymi rycinami. We wstępie autor podjął się heroicznej próbie opisu jedynego w swoim 3

4 rodzaju wyścigu zbrojeń pomiędzy bakteryjnymi fitopatogenami a ich ofiarami. Ze względu na skróty nazw efektorów, kinaz, cząsteczek sygnałowych, etc tę część nie czyta się łatwo, ale po staropolsku konia z rzędem temu, kto lepiej potrafiłby w sposób naukowy opisać zmagania roślin z bakteriami. 2) Cel pracy jest określony bardzo precyzyjnie. 3) Materiały i metody są szczegółowo opisane na 19 stronach pracy. 4) Wyniki: Ze względu na logiczny ciąg doświadczeń, które zostały dokładnie i z polotem opisane i świetnie zilustrowane (21 rycin), lektura tych 53 stron maszynopisu sprawiła mi ogromną przyjemność. 5) Dyskusja jest napisana bardzo dobrze w oparciu o dostępną literaturę i jednoznacznie wskazuje na szeroka wiedzę autora w zakresie oddziaływania patogenów z roślinami. Dysonans stanowi tylko pierwsza strona dyskusji która jakby stanowiła podsumowanie całej pracy. 6) Wyciągnięte na podstawie przeprowadzonych wnioski są jednoznaczne i dobrze udokumentowane. 7) Literatura ponad 170 cytowanych prac, z których zdecydowana większość to artykuły opublikowane w ciągu ostatnich kilku lat. Krytyczne uwagi redakcyjne (dla udokumentowania, że jako recenzent uważnie przeczytałem prace): - W legendzie ryciny 4.1 napisane jest, że kolorem niebieskim oznaczone są te rejony HopQ1, dla których przeprowadzona analiza nie wykazała podobieństwa do poznanych białek. Ja osobiście na panelu A ryciny 4.1 widzę kolor zielony. - W legendzie ryciny 4.10 jest dwukrotnie powtórzone słowo pomarańczowa. Podsumowanie Rozprawa doktorska mgr Fabiana Giski zawiera oryginalne wyniki badań, z których większość ma cechy nowości naukowej. Wnoszą one znaczący wkład w nasze rozumienie działania białka HopQ1. W celu uzyskania tych wyników, doktorant posłużył się szeroką gamą nowoczesnych metod badawczych. 4

5 Zamieszczone uwagi i zastrzeżenia, co do interpretacji wyników nie mają wpływu na wysoką ocenę pracy. Moja krytyka, w żaden sposób nie miała na celu podważenie wyników doktoranta, ale raczej ma za zadanie zainspirować dalsze badania w tym bardzo atrakcyjnym temacie. Dlatego też stwierdzam, że rozprawa doktorska mgr Fabiana Giski spełnia wszystkie zwyczajowe i ustawowe wymagania stawiane tego typu pracom w dziedzinie biochemii. Wnoszę więc do wysokiej Rady Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN o przyjęcie rozprawy i dopuszczenie jej autora do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Zwracam się również z wnioskiem o wyróżnienie rozprawy stosowną nagrodą. 5