Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Transkrypt

1 Vol. 4/2005 Nr 3(12) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Wstępne wyniki leczenia tamoxifenem dziewczynek z zespołem McCune-Albrighta oraz nawracającymi torbielami pęcherzykowymi jajników Tamoxifen treatment in girls with progressive precocious puberty due to McCune-Albright syndrome and recurrent ovarian cysts-preliminary results 1 Jerzy Starzyk, 2 Wiesław Urbanowicz, 3 Bożena Starzyk, 1 Dominika Januś 1 Klinika Endokrynologii Dzieci i Młodzieży Katedry Pediatrii w Krakowie 2 Klinika Urologii Dziecięcej w Krakowie 3 Samodzielna Pracownia Radiologii w Krakowie Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Jerzy Starzyk, Klinika Endokrynologii Dzieci i Młodzieży Katedry Pediatrii Polsko-Amerykańskiego Instytutu Pediatrii, ul. Wielicka 265, Kraków, tel./fax: , mistarzy@cyf-kr.edu.pl Słowa kluczowe: GnRH-niezależne przedwczesne pokwitanie, zespół McCune-Albrighta, leczenie Tamoxifenem Key words: GnRH-independent precocious puberty, McCune-Albright syndrome, Tamoxifen treatment STRESZCZENIE/ABSTRACT W leczeniu rzekomego przedwczesnego pokwitania u dziewcząt z zespołem McCune-Albrighta (MAS) stosuje się powszechnie inhibitory aromatazy, takie jak testolakton. Skuteczność tego leczenia jest jednak niewielka i kwestionowana. Alternatywnym sposobem leczenia pozostaje stosowanie modulatora receptora estrogenowego (silnego antagonisty i słabego agonisty) tamoxifenu, zaproponowane przez Eugster i wsp. w 1999 roku w Indianapolis, na podstawie obserwacji tylko jednej dotychczas leczonej w świecie pacjentki z MAS. Przedstawiamy własne, wstępne wyniki leczenia Tamoxifenem u trzech kolejnych dziewcząt z MAS oraz pierwsze wyniki leczenia 2 dziewczynek z nawracającymi hormonalnie czynnymi torbielami jajników (ROC recurrent ovarian cysts). Po różnie długim okresie leczenia tamoxifenem poszczególnych pacjentek obserwowano u wszystkich chorych ustąpienie miesiączkowania, zanik pokwitaniowej wydzieliny z pochwy, a także częściową regresję drugorzędowych cech płciowych. U pacjentek, których wiek kostny był mniejszy od 13 lat, uległa zmniejszeniu szybkość wzrastania. Zgodnie z receptorowym mechanizmem działania Tamoxifenu, nie obserwowano wpływu tego leku na stężenie estradiolu, które zarówno przed leczeniem, jak i w okresie leczenia charakteryzowało się znaczną zmiennością stężenia. Stwierdzono ponadto zwiększenie się rozmiarów macicy, a także rozmiarów jajników i pęcherzyków / torbieli jajnikowych. Poza epizodem zaczerwienienia skóry twarzy i tułowia nie obserwowano innych objawów ubocznych leczenia. Stosowanie Tamoxifenu wydaje się skutecznie hamować objawy rzekomego pokwitania oraz poprawiać wzrost końcowy nie tylko u dziewcząt z zespołem McCune-Albrighta, ale także z ROC. Tamoxifen wydaje się nie zmniejszać charakterystycznych dla przedwczesnego pokwitania zachowań seksualnych. Obserwowane w okresie leczenia zwiększenie rozmiarów torbieli pęcherzykowych, obok znanego wpływu Tamoxifenu na endometrium, nakazuje ostrożność w jego stosowaniu. Być może selektywne modulatory receptora estrogennego (SERMS: Raloxifen, Faslodex) lub inhibitory aromatazy IV generacji (Arimidex) mogą być bardziej skuteczne i bezpieczne. Vol. 4/2005, Nr 3(12) 45

2 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 4/2005;3(12):45-50 Aromatase inhibitors, such as testolactone, commonly used in the treatment of progressive precocious puberty in girls with McCune-Albright syndrome (MAS) have been characterized by problems with both efficacy and compliance. Treatment with an estrogen receptor modulator tamoxifen was proposed to be an alternative regimen. Material and methods: Tamoxifen was administered over the period of 13 months in 3 girls with MAS and in 2 girls with recurrent ovarian cysts. One girl had been previously treated with testolactone for 1 year. In 2 girls the treatment with a GnRH-analog (Dipherelline, Beaufour Ipsen) was introduced at the bone age of 12 and 13 years, respectively, due to an additional Gn-RH- dependent component of precocious puberty. McCune-Albright syndrome diagnosis was confirmed by DNA molecular analysis. Informal written consent was obtained from the parents. Results: 1. In the course of testolactone treatment progression of sexual development, bone age increment (2 BA yr/1 CA yr.), and repeated menstrual bleeding were observed. 2. Tamoxifen resulted in moderately increased LH and FSH levels with an increased LH/FSH ratio, E2 levels elevation was maintained in all the girls, however, two of them manifested an additional Gn-RH component of precocious puberty. 3. On tamoxifen, regression of breast size, depigmentation of areola, nipples and minor labia and cessation of menstrual bleeding/pubertal fluor were observed parallel with the increase of uterus size, endometrium width and the enlargement of Graafian ovarian cysts. 4. Medium GV decreased from 5 to 3.3 cm/yr. and improved from to cm. 5. An abnormal erotosexual behavior, characteristic for precocious girls, did not improve on tamoxifen treatment. 6. Apart from one episode of rash in one girl we didn`t observe other side effects. Conclusions: 1. Tamoxifen seems to be a recommended pharmacological agent in the treatment of progressive precocious puberty not only in patients with MAS, but also with recurrent ovarian cysts. 2. Tamoxifen seems not to inhibit abnormal erotosexual behavior. 3. As we noticed the enlargement of the ovarian cysts on tamoxifen, possibly the treatment with SERM`s (Raloxifen, Faslodex) or IV generation aromatase inhibitors (Arimidex) might be more effective and safer. Wstęp Zespół McCune-Albrighta (MAS) charakteryzuje się klinicznie triadą objawów: włóknista dysplazja kości (od zmian łagodnych wykrywanych scyntygraficznie do patologicznych złamań włącznie), brązowe nieregularne przebarwienia skóry (plamy café-au lait), zlokalizowane zwykle po tej samej stronie tułowia co zmiany kostne (obecne u 90% chorych), oraz niezależne od GnRH (gonadotropin releasing hormone) przedwczesne pokwitanie [1, 2]. Inne współistniejące endokrynopatie, takie jak nadczynność tarczycy, nadmierne wydzielanie hormonu wzrostu przez komórki somatotropowe przysadki, hyperprolaktynemia czy zespół Cushinga, obserwowane są rzadziej [3 10]. Objawy kliniczne w zespole McCune-Albrighta spowodowane są autonomiczną nadczynnością tkanek w wyniku akumulacji cyklicznego monofosforanu adenozyny (camp). Nadmierne powstawanie camp jest wynikiem aktywnej mutacji genu podjednostki α białka Gs (stimulatory guanine nucleotide binding protein) [3 5, 9 12]. Tkanki nadczynne zawierają większą ilość zmutowanych alleli genu Gsα niż pozostałe tkanki zdrowe. Układ mozaikowy chorych i zdrowych tkanek jest prawdopodobnie wynikiem postzygotycznej mutacji somatycznej [8]. Im wcześniej w okresie rozwoju wystąpi mutacja genu Gsα, tym większa jest ilość nieprawidłowych tkanek i stąd duża zmienność liczby i nasilenia objawów klinicznych u chorych z MAS. Nawracające hormonalnie czynne torbiele jajnikowe mogą być jedną z komponent MAS lub też jego pierwszymi objawami, poprzedzającymi wystąpienie innych charakterystycznych cech zespołu [13 15]. Jak sugerowaliśmy we wcześniejszej pracy własnej [16], zgodnie z innymi autorami [10, 13], nawracające hormonalnie czynne torbiele jajników (ROC recurrent ovarian cysts), będące przyczyną rzekomego GnRH-niezależnego przedwczesnego pokwitania, mogą stanowić również izolowaną postać MAS, na co może wskazywać stwierdzenie w 1997 roku mutacji genu podjednostki α białka Gs w komórkach płynu pobranego drogą biopsji z torbieli jajnikowej [10]. Aktualnie nie ma jeszcze możliwości przyczynowego leczenia, jakim mogłoby być hamowanie zwiększonej aktywności camp w tkankach chorych (terapia genowa?). W leczeniu rzekomego przedwczesnego pokwitania u dziewcząt z MAS stosuje się powszechnie inhibitory aromatazy, takie jak testolakton [17, 18]. Skuteczność tego leczenia jest jednak niewielka i kwestionowana [3 7]. Alternatywnym sposobem leczenia pozostaje stosowanie modulatora receptora estrogenowego (silnego antagonisty i słabego agonisty) tamoxifenu, zaproponowane przez Eugster i wsp. w 1999 roku na podstawie obserwacji tylko jednej dotychczas leczonej w świecie pacjentki z MAS [3]. Przedstawiamy własne, wstępne wyniki leczenia Tamoxifenem u trzech kolejnych dziewcząt z MAS oraz pierwsze wyniki leczenia 2 dziewczynek z ROC. 46

3 Jerzy Starzyk i inni Wstępne wyniki leczenia tamoxifenem dziewczynek z zespołem McCune-Albrighta oraz nawracającymi torbielami pęcherzykowymi jajników Pacjentki Ocenie poddano 5 dziewcząt, u których objawy rzekomego przedwczesnego pokwitania udokumentowane testem GnRH wystąpiły w wieku odpowiednio: 3.5, 5, 0.8, 1.4 oraz 0.3 lat. U trzech dziewcząt przyczyną przedwczesnego pokwitania był zespół McCune-Albrighta, a u 2 nawracające hormonalnie czynne torbiele pęcherzykowe jajników. Leczenie Tamoxifenem w dwóch podzielonych dawkach (20 mg/dobę) rozpoczęto u dziewcząt w wieku odpowiednio: 6.9, 8, 8.7, 10 i 1.4 lat. U trzech dziewczynek wiek kostny wynosił odpowiednio: 11, 11 oraz 3.5 lat, a u dwóch pozostałych rozwój kośćca był zakończony lub bliski zakończenia. Wyniki analizowano po różnie długim u każdej z pacjentek okresie leczenia (średnio 13-miesięcznym; (tabela I). Tabela I. Dane kliniczne pacjentek Table I. Clinical data Nr U jednej chorej z MAS (pacjentka 3) leczenie tamoxifenem włączono po rocznym okresie nieskutecznego leczenia testolaktonem, w trakcie którego obserwowano progresję rozwoju płciowego, prawie regularne krwawienie miesięczne i nadmierny przyrost wieku kostnego (2 lata w okresie jednego roku leczenia). U dwóch dziewczynek z MAS (pacjentki 2 i 3) z powodu wystąpienia GnRH-zależnej komponenty pokwitania włączono leczenie długodziałającym analogiem GnRH (Dipherelina) przy wieku kostnym odpowiednio 11 oraz 15 lat. Metody Rzekome przedwczesne pokwitanie (GnRH-niezależne) Wiek wystąpienia Rozpoznanie pokwitania kliniczne (lata) Rozpoznanie rzekomego GnRH-niezależnego przedwczesnego pokwitania ustalono na podstawie wyników testu GnRH; mierzono stężenia luteotropiny (LH ) i folikulostymuliny (FSH) przed i po 20, 30 oraz 60 minutach po podaniu 100 μg krótkodziałającego analogu GnRH, (Ferring, Niemcy) drogą dożylnego bolusu. Co 3 miesiące oceniano u dziewczynek szybkość wzrastania (GV growth velocity), H-SDS (height SDS), oraz wykonywano USG miednicy małej, a także oznaczano stężenie estradiolu (E2), LH oraz FSH. Przed rozpoczęciem leczenia Tamoxifenem oraz po 13 miesiącach leczenia oceniono wiek kostny metodą Greulicha-Pyle`a [19] oraz obliczono prognozę wzrostu końcowego ( predicted adult height) metodą Bayley-Pinneau. Wpływ leczenia na wzrost końcowy pacjentek określono również jako niedobór wzrostu docelowego (TH-), wyrażonego różnicą wzrostu docelowego TH (TH target height) oraz prognozowanego wzrostu końcowego (). Wiek rozpoczęcia leczenia (lata) Zespół McCune-lbrighta rozpoznano na podstawie obrazu klinicznego. U dwóch dziewczynek z nawracającymi cystami jajników stwierdzono mutację podjednostki α białka Gs w komórkach płynu pobranego drogą laparoskopową z torbieli jajnikowej (badania wykonano w Centres de Recherches INSERM w Montpellier, Francja). Rodzice dziewczynek wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Wyniki Leczenie Tamoxifenem (20 mg/dobę) Wiek kostny rozpoczęcia leczenia (lata) Czas leczenia (mies.) MAS MAS 8 11** MAS 8.7* 15** ROC ROC MAS McCune-Albright syndrome. ROC (recurrent ovarian cysts) nawracające cysty jajników. * 1 rok nieskutecznego leczenia Testolaktonem. ** leczenie Diphereliną. Wyniki auksologiczne Po różnie długim u każdej pacjentki okresie leczenia Tamoxifenem (5 17 miesięcy) obserwowano u wszystkich pacjentek ustąpienie krwawienia z dróg rodnych i zanik pokwitaniowej wydzieliny z pochwy, a także zmniejszenie przebarwienia warg 47

4 Praca oryginalna sromowych mniejszych. U pacjentki 3, która przed leczeniem miesiączkowała prawie regularnie, wystąpił jeden epizod krwawienia. Stwierdzono ponadto zmniejszenie się rozmiarów gruczołów piersiowych o 1 2 stopnie w skali Tannera oraz zmniejszenie turgoru gruczołów piersiowych, pigmentacji otoczki i brodawki sutkowej. Nasilenie rozwoju owłosienia łonowego (pubarche) u 3 z 4 dziewcząt zmniejszyło się o około 1 stopień w tej samej skali, a owłosienia pachowego (axillarche) ustąpiło u 1 pacjentki. U pacjentek 1, 2 i 5, których wiek kostny był mniejszy od 13 lat, szybkość wzrastania zmniejszyła się z około 12 cm do około 8,7 cm na rok. U pacjentek 1 i 2 prognozowany wzrost końcowy, podobnie jak niedobór wzrostu w stosunku do wzrostu docelowego, uległ poprawie o około 3 cm. Ze względu na młody wiek kostny pacjentki 5 (3,5 lat) nie ustalono jej prognozy wzrostowej. U pozostałych 2 pacjentek (3 i 4) obserwowano również zmniejszenie szybkości wzrastania, co jednak było Endokrynol. Ped., 4/2005;3(12):45-50 przede wszystkim wynikiem zaawansowanego wieku kostnego. Stąd brak poprawy lub tylko niewielka poprawa prognozowanego wzrostu końcowego oraz niedoboru wzrostu końcowego (tabela II). Wyniki hormonalne Zgodnie z receptorowym mechanizmem działania Tamoxifenu, nie obserwowano wpływu tego leku na stężenie estradiolu, które zarówno przed leczeniem, jak i w okresie leczenia charakteryzowało się znaczną zmiennością stężenia: od wartości prawidłowych dla okresu przed pokwitaniem (< 7 pg/ml), do ponadfizjologicznego stężenia dla kobiet (530 pg/ml). Obserwowane u wszystkich dziewcząt przed leczeniem zahamowane stężenia obu gonadotropin, w stopniu zależnym od stężenia estradiolu i fazy choroby (obecności lub braku hormonalnie czynnych torbieli), przetrwały w okresie leczenia Tamoxifenem oraz leczenia Tamoxifenem i długodziałającym analogiem GnRH (tabela III). Tabela II. Dane auksologiczne pacjentek Table II. Auxological data 48 Przed leczeniem Nr M/F T P A GV (cm/r) TH- W okresie leczenia M/F T P A GV (cm/r) 1 M F M * M M / T thelarche, P pubarche (skala Tannera). A axillarche. M/F menarche lub fluor pubertalis. * jednokrotne krwawienie Tabela III. Wyniki powtarzanych badań hormonalnych Table III. Results of repeated hormonal tests Nr E2 (pg/ml) Przed leczeniem LH FSH E2 (pg/ml) W okresie leczenia LH FSH * * 1.5* * 0.5* 1.0* *leczenie Diphereliną TH-

5 Jerzy Starzyk i inni Wstępne wyniki leczenia tamoxifenem dziewczynek z zespołem McCune-Albrighta oraz nawracającymi torbielami pęcherzykowymi jajników Tabela IV. Wyniki badania ultrasonograficznego miednicy małej Table IV. Ultrasonography of the small pelvis Nr Macica dł/szer. Endometrium szer. Przed leczeniem lewy prawy Torbiel jajnika średnica Macica dł/szer. Endometrium szer. W okresie leczenia lewy prawy Torbiel jajnika średnica 1 54x x16 26x x x15 30x x x13 19x x x18 29x x x30 41x x x23 34x x x21 45x x x56 50x x x8 20x x x20 19x12 56 Wyniki badania USG U 4 pacjentek stwierdzono po około 15-miesięcznym okresie leczenia Tamoxifenem dalsze zwiększenie się rozmiarów macicy (o około 1 cm w obydwu wymiarach). W tym okresie szerokość endometrium nie uległa praktycznie zmianie (średnio 2 mm przed leczeniem, 2.3 mm po leczeniu). U pacjentki 5 (leczonej 5 miesięcy), u której zaobserwowano zmniejszenie się wymiarów macicy z 39x20 mm do 34x15,4 mm, szerokość endometrium zwiększyła się o około 2 mm. U 4 spośród 5 pacjentek rozmiary obu jajników uległy zwiększeniu, prawdopodobnie z powodu powiększenia się rozmiarów torbieli pęcherzykowych, ale nie z powodu zwiększenia się ich ilości. Rozmiary torbieli zwiększyły się u tych pacjentek od prawidłowych przed leczeniem (do 6 mm średnicy) do 12, 13 mm średnicy, a u pacjentek z ROC istniejące przed leczeniem torbiele uległy dalszemu powiększeniu od odpowiednio 25 i 40 mm średnicy do 40 i 56 mm (tabela IV). W okresie leczenia Tamoxifenem nie obserwowano zmniejszenia się charakterystycznego dla pokwitania zachowania erotoseksualnego. Poza epizodem zaczerwienienia skóry twarzy i tułowia nie obserwowano innych objawów ubocznych leczenia. Wskaźniki morfologii krwi obwodowej oraz stężenia enzymów wątrobowych (AlAT, AsPAT) pozostały w normie. Podsumowanie Stosowanie Tamoxifenu wydaje się skutecznie hamować objawy rzekomego pokwitania oraz poprawiać wzrost końcowy nie tylko u dziewcząt z zespołem McCune-Albrighta, ale także z hormonalnie czynnymi torbielami jajników. Tamoxifen wydaje się nie zmniejszać charakterystycznych dla przedwczesnego pokwitania zachowań seksualnych. Obserwowane również przez innych autorów [7, 20, 21] zwiększenie rozmiarów torbieli pęcherzykowych jajników lub pojawianie się nowych w okresie leczenia, obok znanego wpływu Tamoxifenu na endometrium [20, 22], nakazuje ostrożność w jego stosowaniu. Być może selektywne modulatory receptora estrogenowego (SERMS: Raloxifen, Faslodex) [19, 22 25] lub inhibitory aromatazy IV generacji (Arimidex) [26] w monoterapii lub leczeniu skojarzonym mogą być bardziej skuteczne i bezpieczne [6, 7]. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Albright F., Butler A.M., Hampton A.O, Smith P.: Syndrome chrakterized by osteitis fibrosa disseminata, areas of pigmentation and endocine dysfunction, with precocious puberty in females: report of five cases. N. Engl. J. Med., 1937:216, [2] McCune D.J.: Osteitis fibrosa cystica;the case of nine year old girl who also exhibits precocious puberty, multiple pigmentation of skin and hiperthyroidism. Am. J. Dis. Child., 1936:52, [3] Eugster E., Shankar R., Feezle L., Pescovitz O.: Tamoxifen treatment of progressive Precocious puberty in a patient with McCune-Albright Syndrome. J. Ped. Endocrinol. Metab., 1999:12, [4] Starzyk J.: Przewlekłe zaburzenia rozwoju płciowego uwarunkowane genetycznie. [w:] Medycyna wieku młodzieńczego. Klinika i postępowanie w chorobach przewlekłych. Red. Rybakowa M. Wydawnictwo Medyczne, Kraków 2001,

6 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 4/2005;3(12):45-50 [5] Weinstein l., Shenker A., Gejman P. et al.: Activating mutations of the stimulatory G protein in the McCune-Albright Syndrome. N. Engl. J. Med., 1991:325, [6] Albers N., Jörgens S., Deiss D., Hauffa B.P.: McCune-Albright syndrome-the German experience. J. Ped. Endocrinol. Metabol., 2002:15, Suppl. 3, [7] Roth C., Freiberg C., Zappel H., Albers N.: Effective aromatase inhibition by anastrozole in a patient with gonadotropinindependent precocious puberty in McCune-Albright syndrome. JPEM, 2002:15, Suppl 3, [8] Happie R.: The McCune-Albright syndrome a lethal gene surviving by mosaicism. Clin. Cene, 1986:26, [9] Clayton R.: Gonadotrophin receptors. Clin. Endocrinol. Metabol., 1996:10, 1 8. [10] Pienkowski C., Lumbroso S., Bieth E. et al.: Recurrent ovarian cyst and mutation of the Gsα gene in ovarian cyst fluid cells: what is the link with McCune-Albright syndrome? Acta Paediatr., 1997:86, [11] DiMeglio l., Pescovitz O.: Disorders of puberty: Inactivating and activating molecular mutations. J. Pediatr., 1997:131, S8 12. [12] Schnabel P., Bohm M.: Mutations of signal-transducing G proteins in human disease. J. Mol. Med., 1995:73, [13] Feuillan P.P., Jones J., Manasco P.K., Cutler G.B.: LHRH-independent precocious puberty unresponsive to LHRH agonist therapy in two girls lacking features of McCune-Albright syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1991:73, [14] Chen C.K., Tsai W.Y., Lee J.S. et al.: Sexual precocity due to McCune-Albright syndrome: report of a case. J. Formosan. Med. Assoc., 1993:92 (2), [15] Low L.C.K., Wang C., Leung A., Leong L.Y.: Undetectable levels of serum FSH immunoactivity and bioactivity in girls with sexual precocity due to ovarian cysts. Acta Paediatr., 1994:83, [16] Starzyk J., Wojtyś J., Kalicka-Kasperczyk A. et al.: Izoseksualne rzekome przedwczesne pokwitanie u dziewcząt z nawracającymi hormonalnie czynnymi torbielami jajników. Ginekologia Polska, 1996:1, [17] Feuillan P., Merke D., Leschek E.W., Cutler G.B.: Use of aromatase inhibitors in precocious puberty. Endocrine-Related Cancer, 1999:6, [18] Cummings E., Salisbury S., Givner M., Rittmaster R.: Testolaktone-associated high androgen levels, a pharmacologic effect or a laboratory artifact? J. Clin. Endocrinol. Metab., 1998:83, [19] Greulich W.W., Pyle S.I.: Radiographic atlas of skeletal development of the hand and wrist. Stanford University Press., Stanford [20] Catherino W., Jordan V.C.: A risk-benefit assessment of tamoxifen therapy. Drug-safety, 1993:8 (5), [21] Osborne K.: Tamoxifen in the treatment of breast cancer. N. Engl. J. Med., 1998:339, [22] Howell A., Osborne C.K., Morris C., Wakeling A.: ICI 182, 780 (Faslodex TM ) Development of a novel, Pure Antiestrogen. Cancer, 2000:89, [23] Weryha G., Pascal-Vigneron V., Klein M., Leclere J.: Selective estrogen receptor modulators. Curr. Opin. Rheumatol., 1999: 11, [24] Dutertre M., Smith C.L.: Molecular mechanisms of selective estrogen receptor modulator action. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2000:295 (2), [25] Mitlak B., Cohen F.: Selective estrogen receptor modulators. A look ahead. Drugs, 1999:57, 5, [26] Plourde P., Dyroff M., Dukes M.: Arimidex: a potent and selective fourth-generation aromatase inhibitor. Breast Cancer Research and Treatment, 1994:30,