Metody oceny wieku śladów entomologicznych

Transkrypt

1 Katarzyna Frątczak-Łagiewska Zakład Taksonomii i Ekologii Zwierząt, Wydział Biologii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Pracownia Kryminalistyki, Wydział Prawa i Administracji, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu katarzyna.fratczak@amu.edu.pl Metody oceny wieku śladów entomologicznych Streszczenie W pracy przedstawiono najnowsze metody oceny wieku śladów entomologicznych wykorzystywane w entomologii medyczno-kryminalnej. Wyszczególnione zostały zalety i ograniczenia poszczególnych technik, a także wskazano, które z nich mogą być rutynowo wykorzystywane w praktyce. Opracowanie obejmuje ponadto charakterystykę poszczególnych śladów wraz ze wskazaniem okoliczności, w jakich mogą być przydatne. Słowa kluczowe entomologia sądowa, czas śmierci, muchówki, chrząszcze Wstęp Entomologia medyczno-sądowa (entomoskopia) to dział entomologii sądowej wykorzystujący owady nekrofilne na potrzeby dowodowe toczących się postępowań karnych. Owady nekrofilne obejmują taksony, które preferują zwłoki jako miejsce żerowania [1]. Do śladów entomologicznych zalicza się żywe i martwe owady, fragmenty owadów, a także ślady ich aktywności [2]. Owady istotne dla entomologii sądowej, czyli przede wszystkim muchówki (Diptera) i chrząszcze (Coleoptera), charakteryzują się przeobrażeniem zupełnym. Oznacza to, że w ich rozwoju występuje stadium poczwarki. Rozwój tych owadów obejmuje więc rozwój zarodkowy, który zachodzi w jaju, a także rozwój pozazarodkowy, w ramach którego wyróżnić można trzy stadia: larwę, poczwarkę oraz imago (owad dorosły, doskonały). Ślady entomologiczne są zatem bardzo zróżnicowaną grupą obejmującą różne stadia rozwojowe owadów o różnej przynależności systematycznej [2]. Do fragmentów owadów zaliczamy głównie puste puparia oraz wylinki, natomiast ślady aktywności owadów to zazwyczaj uszkodzenia zwłok [3] lub ślady wydalania krwi przez imagines muchówek, które mogą być pomylone ze śladami krwi na miejscu odnalezienia zwłok [4-6]. Ślady entomologiczne najczęściej są wykorzystywane do szacowania czasu, jaki upłynął od śmierci do ujawnienia zwłok (jest to tzw. okres pośmiertny, ang. postmortem interval, PMI) [7]. Metody entomologiczne jego szacowania wykorzystują analizę wieku osobników preimaginalnych zabezpieczonych na zwłokach (metoda rozwojowa) oraz analizę wieku zespołu owadów zabezpieczonych na zwłokach (metoda sukcesyjna) [1, 2]. Wiek śladu entomologicznego jest to czas rozwoju danego osobnika, czyli czas od złożenia jaja (lub larwy pierwszego stadium) do zabezpieczenia danego śladu. W związku z tym oszacowany wiek nie jest rzeczywistym czasem zgonu, a jedynie minimalnym czasem, jaki upłynął od momentu zgonu. W celu zwiększenia dokładności szacowania czasu zgonu minimalny PMI można uzupełnić oszacowaniem okresu poprzedzającego pojawienie się danego taksonu na zwłokach. Okres ten określany jest skrótem PAI (ang. pre-appearance interval) [2, 8, 9]. Poniżej przedstawiono najnowsze techniki oceny wieku śladów entomologicznych zabezpieczanych na zwłokach. Jaja W przypadku muchówek stadium jaja jest najkrótszym stadium w trakcie rozwoju, stanowi zaledwie około 5% całego rozwoju [10, 11]. Mimo tego, że okres ten jest bardzo krótki, w pewnych okolicznościach jaja mogą być jedynym śladem entomologicznym obecnym na miejscu ujawnienia zwłok. Są one bardzo przydatne w szacowaniu PMI w przypadku zwłok znalezionych krótko po zgonie. Owady są organizmami zmiennocieplnymi, temperatura ich ciała a w konsekwencji także tempo rozwoju są zależne od temperatury otoczenia. W związku z tym niskie temperatury sprzyjają dłuższemu utrzymywaniu się na zwłokach śladów w postaci jaj. 22 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016

2 Dotychczas niewiele badań skupiało się na ocenie wieku jaj. W pracach dotyczących rozwoju poszczególnych gatunków autorzy podają zazwyczaj wyłącznie czas trwania tego stadium. Ostatnio szczegółowo przeanalizowano formy w obrębie stadium jaja gatunku muchówki Calliphora vicina (Robineau-Desvoidy, 1830; Calliphoridae), identyfikując 15 etapów rozwoju, które można zaobserwować pod stereomikroskopem i na ich podstawie szacować wiek jaja [11]. Wiek jaja można ocenić także metodami molekularnymi wykorzystującymi ekspresję genów [12]. W trakcie rozwoju geny podlegają zróżnicowanej ekspresji. Oznacza to, że ich aktywność jest włączana lub wyłączana w różnym momencie rozwoju. Ekspresja niektórych genów jest przewidywalna i zależna od temperatury, przez co może być przydatna w szacowaniu wieku jaj [13]. Biorąc pod uwagę zmiany w ekspresji genów w trakcie stadium jaja, można je podzielić na krótsze okresy, które stanowią genetyczne punkty orientacyjne w rozwoju. Metoda ta pozwala na szacowanie wieku jaj muchówek z gatunku Lucilia sericata (Meigen, 1826) (Calliphoridae) z dokładnością do 2 godzin [12]. Niestety korzystanie z metod molekularnych w praktyce ma pewne wady. Wymagają one dostępu do laboratorium ze specjalistycznym sprzętem, są czasochłonne, a także kosztowne. Ponadto konieczne jest także odpowiednie zabezpieczenie materiału entomologicznego mające na celu zatrzymanie ekspresji genów oraz utrwalenie jej produktu [12]. Z tego względu wykorzystanie ich w praktyce jest bardzo ograniczone. Larwy Okres rozwoju larwalnego dzieli się u większości gatunków, wykorzystywanych w entomologii sądowej, na trzy stadia. W ramach trzeciego stadium larwalnego można wyróżnić ponadto dwa etapy. W pierwszym z nich larwa intensywnie się odżywia, przez co bardzo szybko rośnie, natomiast w drugim etapie larwa nie pobiera pokarmu (jest to tzw. larwa typu postfeeding). W związku z szybkim wzrostem larw w trakcie trwania dwóch pierwszych stadiów oraz na początku stadium trzeciego opracowano metodę oceny wieku larw na podstawie ich długości i wagi. Po wykonaniu pomiarów tych wskaźników przyrównuje się je do danych rozwojowych uzyskanych w eksperymentach nad rozwojem danego gatunku [1]. Wyniki eksperymentów obrazowane są na diagramach izomegalenicznych [14, 15]. Przedstawione są na nich krzywe, które reprezentują wielkość larwy. Znając temperaturę, w jakiej rozwijał się osobnik, można z nich odczytać, ile czasu upłynęło od rozpoczęcia rozwoju do momentu osiągnięcia określonej wielkości. Wiek może być także szacowany na podstawie stadium larwalnego, w jakim osobnik się znajduje. W tym celu korzysta się z diagramów izomorfenicznych, na których krzywe reprezentują kluczowe momenty rozwojowe, tj. wyklucie, pierwsze linienie, drugie linienie, przepoczwarzenie, pojawienie się imago. Obszary między krzywymi to odpowiadające im stadia rozwoju, np. pomiędzy krzywą drugiego linienia a krzywą przepoczwarzenia mamy do czynienia z larwą trzeciego stadium. W tym przypadku również można oszacować, ile czasu upłynęło od początku rozwoju do osiągnięcia danego momentu w rozwoju w określonych warunkach temperaturowych [14]. Szacowanie wieku larw trzeciego stadium niepobierających pokarmu jest dużo większym wyzwaniem. Tradycyjne wskaźniki wieku, tj. długość ciała i waga, osiągają na tym etapie maksymalne wartości, a następnie nieznacznie maleją. W związku z tym, że ocena wieku takich larw przysparza wielu trudności, biegły, który otrzymuje materiał entomologiczny w postaci larw nieżerujących, często jest w stanie określić wyłącznie to, w jakim stadium rozwoju znajduje się dany osobnik i oszacować czas, przez jaki okaz rozwijał się do rozpoczęcia tego stadium [2]. Ponadto czas trwania fazy postfeeding trzeciego stadium larwalnego może być różny w zależności od warunków środowiska. Larwy niepobierające pokarmu oddalają się nieco od źródła pokarmu w celu przepoczwarzenia, do którego dochodzi w momencie, gdy larwy znajdą miejsce o optymalnych dla nich warunkach (oddalone od drapieżników, zacienione). Czas migracji może wpłynąć na całkowity czas rozwoju, a w konsekwencji może spowodować znaczące błędy w oszacowanym czasie zgonu [16]. Fakt ten może mieć szczególne znacznie w przypadku zwłok rozkładających się w pomieszczeniach zamkniętych, gdzie nie ma sprzyjających warunków do przepoczwarzenia. Larwy, które przygotowują się do przepoczwarzenia, mogą w takich warunkach przemieścić się na odległość nawet do 30 metrów [16]. W związku z tym wyniki badań rozwojowych przeprowadzone w warunkach laboratoryjnych, gdzie larwy przebywają w optymalnych warunkach, nie zawsze będą miały przełożenie na toczące się sprawy. Mając na uwadze powyższe ograniczenia, minimalny PMI oszacowany na podstawie larw nieżerujących może być znacząco niedoszacowany. Metody molekularne opierające się na oznaczaniu ekspresji genów pozwalają na bardziej dokładną ocenę wieku takich larw [17]. Wiek larw może być także szacowany przez analizę węglowodorów, jakimi pokryty jest chitynowy oskórek stanowiący szkielet zewnętrzny owada [18-21]. Ich kompozycja zmienia się w czasie [22-24]. Zmiany te mogą być modelowane, a utworzone modele można wykorzystać do oceny wieku larw. Dane dotyczące kompozycji węglowodorów opracowano dla gatunków L. sericata [19], Aldrichina grahami (Aldrich, 1930) [18], Chrysomya rufifacies Macquart, 1842 [20], Calliphora vomitoria (Linnaeus, 1758), C. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3)

3 vicina i Protophormia terraenovae (Robineau-Desvoidy, 1830) (Calliphoridae) [21]. Poczwarki Poczwarki chrząszczy i muchówek nie pobierają pokarmu, przez co ich rozmiary się nie zmieniają. W związku z tym tradycyjne wskaźniki wieku larw, tj. długość czy waga, nie są przydatne do oceny ich wieku. Dokładna ocena wieku poczwarek jest szczególnie istotna, ponieważ jest to przeważnie, pomijając stadium imago, stadium najdłuższe. Muchówki i chrząszcze, w zależności od gatunku, przebywają w stadium poczwarki od 35 do 69% swojego życia preimaginalnego [10, 25-28]. W praktyce poczwarki są przenoszone żywe do laboratorium i hodowane w warunkach kontrolowanych do postaci dorosłych. Biegły sądowy, znając czas trwania stadium poczwarki w danych warunkach, może oszacować wiek danego osobnika przez odjęcie czasu, który upłynął do osiągnięcia stadium imago, od całkowitego czasu trwania stadium poczwarki. Metoda ta niestety nie sprawdzi się w przypadku poczwarek zakonserwowanych w alkoholu lub takich, które padły podczas hodowli. Poczwarki muchówek są poczwarkami wolnymi. Oznacza to, że przydatki, takie jak skrzydła czy odnóża, nie przylegają do ich ciała. Poczwarki te otoczone są kokonem rzekomym o nazwie puparium. Kolor puparium uważany był początkowo za istotny w ocenie wieku poczwarek. Okazało się jednak, że nie zmienia się on już po kilku godzinach od wytworzenia puparium [13]. Nowsze metody oceny wieku poczwarek opierają się na obserwacji ich cech morfologicznych [26, 29, 30]. Z martwych poczwarek ściągane jest puparium i osobnik obserwowany jest pod stereomikroskopem. Zmiany morfologii mogą dotyczyć m.in.: koloru oczu, szczecin na odnóżach, koloru i kształtu czułków, stopnia rozwinięcia szczecin na czole, obecności szczecin na tułowiu, długości i szerokość odnóży. Wartości tych cech korelowane są z wiekiem wyrażonym w stopniodniach (ADD Accumulated degree days) lub stopniogodzinach (ADH Accumulated degree hours) [26]. Określają one liczbę jednostek cieplnych powyżej temperatury progowej, które organizm musi skumulować, aby mógł osiągnąć dany etap w rozwoju [1]. Inne podejście opiera się na analizie histologicznej, która polega na obserwacji zmian wewnętrznych na poziomie komórkowym (tkankowym) [31]. Zmiany te obserwuje się pod mikroskopem świetlnym po odpowiednim przygotowaniu preparatu histologicznego. W uproszczeniu wymaga to przechowywania poczwarek w ściśle określonych warunkach, wykonania skrawków oraz ich barwienia. Wyniki badań wskazują, że kombinacja cech w budowie morfologicznej i histologicznej jest dużo lepszym wskaźnikiem wieku niż wyłącznie analiza morfologiczna [32]. Metodą, która pozwala na jednoczesną obserwację zmian w strukturach zewnętrznych i wewnętrznych, jest mikrotomografia komputerowa [32]. Dzięki tej metodzie istnieje możliwość analizy wielu próbek jednocześnie, a każdy osobnik może być analizowany z trzech różnych perspektyw. Tradycyjna analiza histologiczna zapewnia tylko jedną płaszczyznę. Metody opisane powyżej związane są z koniecznością uśmiercania osobników. W konsekwencji wiek osobników nie może być oszacowany podczas hodowli. Jedyną metodą, która umożliwia przyżyciowe badanie wieku, jest optyczna tomografia koherencyjna [33]. Pozwala ona jednak tylko na odróżnienie w grupie poczwarek starszych osobników od młodszych. Wiek poczwarek można również określać przy pomocy metod molekularnych wykorzystujących ekspresję genów [13, 25, 34, 35]. Tak jak w przypadku jaja, biorąc pod uwagę zmiany w ekspresji genów w trakcie stadium poczwarki, można je podzielić na krótsze okresy, które stanowią genetyczne punkty orientacyjne w rozwoju. Dla muchówki Calliphora vicina scharakteryzowano 15 takich punktów [35]. Wiek próbowano także szacować poprzez wykorzystanie analizy lotnych związków organicznych wydzielanych przez różne stadia rozwojowe owadów. Wiele prac skupiało się dotychczas na analizie związków wydzielanych ze zwłok po śmierci [36-39]. Z ostatnich badań wynika, że lotne związki organiczne emitowane są także przez wszystkie stadia rozwojowe muchówek [40] i pozwalają na rozróżnienie młodszych poczwarek od starszych. Niestety metoda ta nie pozwala na dokładną ocenę wieku. Dodatkowo czynniki genetyczne i środowiskowe mogą wpływać na kompozycję i emisję tych związków. Ze względu na to, że wpływ wymienionych czynników na emisję lotnych związków organicznych nie został zbadany, metoda ta nie może służyć chociażby ocenie wstępnej wieku poczwarek. Osobniki dorosłe Osobniki dorosłe wykorzystywane są bardzo rzadko w szacowaniu PMI metodą rozwojową, ponieważ dotychczas niewielu autorów skupiało się na opracowaniu wiarygodnych metod oceny ich wieku. Najnowsze badania przeprowadzone na 6 gatunkach muchówek z rodziny plujkowatych (Calliphoridae): Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830), Cochliomyia macellaria (Fabricius, 1775), C. rufifacies, P. terraenovae, C. vicina, C. vomitoria wskazują, że analiza węglowodorów może być skutecznym narzędziem w ocenie wieku osobników dorosłych [21, 41, 42]. Poprawna ocena wieku osobników dorosłych ma szczególne znaczenie w przypadku, gdy zwłoki w zaawansowanym rozkładzie zostają odkryte w pomieszczeniach zamkniętych. Na 24 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016

4 takich zwłokach ujawniane są często puste puparia oraz żywe i martwe imagines much. Minimalny czas zgonu może być w tym przypadku oszacowany poprzez dodanie wieku żywych zabezpieczonych osobników dorosłych do długości cyklu rozwojowego danego gatunku. Martwe osobniki dorosłe nie mogą być wykorzystane w tym celu, ponieważ nie opracowano dotychczas metody, która pozwoliłaby stwierdzić, jak dawno dany osobnik padł. Obecnie osobniki dorosłe wykorzystuje się częściej w przypadku metody sukcesyjnej, która opiera się na ocenie wieku nie konkretnego osobnika, a całego zespołu owadów obecnych na zwłokach [1]. Do oceny wieku osobników dorosłych można wykorzystać także analizę pterydyn [43, 44]. Pterydyny to grupa barwników, które stanowią produkty uboczne rozkładu puryn. Wraz z wiekiem akumulują się one w różnych częściach ciała owadów (są to m.in. oczy, głowa, skrzydła), przez co mogą być markerem starzenia osobników dorosłych [45]. Podstawowym ograniczeniem metody jest konieczność standaryzacji wyników w celu uwzględnienia rozmiaru ciała owada. Większe osobniki zawierają większe ilości pterydyn niż osobniki mniejsze w tym samym wieku. Dodatkowo kumulowanie pterydyn różni się w zależności od płci i jest bardziej przewidywalne w przypadku samców. Kolejna metoda przewiduje korelację ilości pterydyn ze stopniem zużycia skrzydeł. Metoda ta nie uwzględnia jednak stopnia aktywności owadów, który ma duży wpływ na zużycie skrzydeł. Ze względu na to metoda ta nie jest polecana do szacowaniu wieku owadów dorosłych [45]. Do oceny wieku osobników dorosłych może posłużyć spektroskopia bliskiej podczerwieni NIRS (ang. near infrared spectroscopy) [45, 46]. Technika ta wykorzystuje pomiary odbicia światła podczerwonego od kutykuli owadów do wykrywania zmian, które pojawiają się wraz z wiekiem. W porównaniu do analizy pterydyn technika ta jest wygodniejsza i niezależna od rozmiaru osobników i płci. Fragmenty owadów Najważniejszymi dla entomologa sądowego fragmentami owadów są puste puparia i wylinki. Są one znajdowane zazwyczaj na zwłokach w zaawansowanym rozkładzie [22]. W przypadku badania ich wieku, tak jak w przypadku larw czy osobników dorosłych, korzysta się z analizy węglowodorów [22]. Jednak w tym przypadku analiza musi być poprzedzona badaniami identyfikacyjnymi, które pozwolą na określenie gatunku owada, od którego pochodzi dany fragment. Również w tym celu korzysta się z analizy węglowodorów. Każdy gatunek owada ma specyficzny profil węglowodorowy, który jest ważnym narzędziem w identyfikacji gatunkowej [45, 47]. Uzyskany w wyniku analizy profil węglowodorowy jest porównywany do poznanych profili ujętych w bazie. Jeżeli poszukiwany gatunek został w niej ujęty, całość identyfikacji zajmuje kilka godzin. Obecnie analiza węglowodorów z pustych pupariów pozwala na rozróżnienie 6 gatunków muchówek: Aldrichina grahami, Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794), C. rufifacies, L. sericata, Sarcophaga peregrina (Robineau-Desvoidy, 1830) i Sarcophaga crassipalpis (Macquart, 1839) [48]. W celach identyfikacyjnych można wykorzystać także barkoding DNA, jednak jest to czasochłonne i trudne w przypadku pustych pupariów. Zawartość DNA w pupariach jest bowiem bardzo niska, dlatego po pewnym czasie, w warunkach ekspozycji na działanie czynników środowiskowych, zostaje ono zdegradowane [47]. Podsumowanie Pomimo rosnącej liczby nowych technik oceny wieku śladów entomologicznych w dalszym ciągu najpopularniejsze są metody klasyczne, które opierają się na hodowli lub analizie zmian w budowie morfologicznej z wykorzystaniem stereomikroskopu. Większość zaproponowanych metod szacowania wieku śladów entomologicznych nie znalazła zastosowania w praktyce przede wszystkim ze względu na wysokie koszty związane z koniecznością dostępu do laboratorium ze specjalistycznym sprzętem, a także czasochłonność. Bibliografia 1. Matuszewski S., Katalog owadów przydatnych do ustalania czasu śmierci w lasach Polski, Część 1: Wprowadzenie, Problemy Kryminalistyki 2010, nr Matuszewski S., Ekspertyza entomologiczna, [w:] Kała M., Wójcikiewicz J., Wilk D., Ekspertyza sądowa, Wolters Kluwer, 2016 (w druku). 3. Baumjohann K., Benecke M., Trothschild M.A., Schussverletzungen oder Käferfraß, Rechtsmedizin 2014, nr 24(2), s Benecke M., Barksdale L., Distinction of bloodstain pattern from fly artifacts, Forensic Science International 2003, nr 137(2-3), s Durdle A., van Oorschot R., Mitchell J., The morphology of fecal and regurgitation artifacts deposited by the blow fly Lucilia cuprina fed a diet of human blood, Journal of Forensic Sciences 2013, nr 58(4), s Striman B., Fujikawa A., Barksdale L., Carter D.O., Alteration of expirated bloodstain patterns by Calliphora vicina and Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) through ingestion and PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3)

5 deposition of artifacts, Journal of Forensic Sciences 2011, nr 56(1), s Greenberg B., Kunich J.C., Entomology and the law: flies as forensic indicators, Cambridge University Press, Cambridge Matuszewski S., Estimating the preappearance interval from temperature in Creophilus maxillosus L. (Coleoptera: Staphylinidae), Journal of Forensic Sciences 2012, nr 57(1), s Matuszewski S., Estimating the pre-appearance interval from temperature in Necrodes littoralis L. (Coleoptera: Silphidae), Forensic Science International 2011, nr 212(1 3), s Anderson G.S., Minimum and maximum development rates of some forensically important Calliphoridae (Diptera), Journal of Forensic Sciences 2000, nr 45, s Martin-Vega D., Hall M., Estimating the age of Calliphora vicina eggs (Diptera: Calliphoridae): determination of embryonic morphological landmarks and preservation of egg samples, International Journal of Legal Medicine 2016, nr 130, s Tarone A.M., Jennings K.C., Foran D.R., Aging blow fly eggs using gene expression: a feasibility study, Journal of Forensic Sciences 2007, nr 52(6), s Boehme P., Spahn P., Amendt J., Zehner R., Differential gene expression during metamorphosis: a promising approach for age estimation of forensically important Calliphora vicina pupae (Diptera: Calliphoridae), International Journal of Legal Medicine 2013, nr 127, s Grassberger M., Reiter C., Effect of temperature on Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) development with special reference to the isomegalen- and isomorphen-diagram, Forensic Science International 2001, nr 120, s Amendt J., Richards C.S., Campobasso C.P., Zehner R., Hall M.J., Forensic entomology: applications and limitations, Forensic Science, Medicine, and Pathology 2011, nr 7(4), s Mai M., Amendt J., Effect of different post-feening intervals on the total time of development of the blowfly Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae), Forensic Science International 2012, nr. 221, s Baqué M., Amendt J., Verhoff M.A., Zehner R., Descriptive analyses of differentially expressed genes during larval development of Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae), International Journal of Legal Medicine 2015, nr 129, s Xu H., Ye G.Y., Xu Y., Hu C., Zhu G.H., Agedependent changes in cuticular hydrocarbons of larvae in Aldrichina grahami (Aldrich) (Diptera: Calliphoridae), Forensic Science International 2014, nr 242, s Moore H.E., Adam C.D., Drijfhout F.P., Potential use of hydrocarbons for aging Lucilia sericata blowfly larvae to establish the postmortem interval, Journal of Forensic Sciences 2013, nr 58(2), s Zhu G.H., Ye G.Y., Hu C., Xu X.H., Li K., Development changes of cuticular hydrocarbons in Chrysomya rufifacies larvae: potential for determining larval age, Medical and Veterinary Entomology 2006, nr 20(4), s Roux O., Gers C., Legal L., Ontogenetic study of three Calliphoridae of forensic importance through cuticular hydrocarbon analysis, Medical and Veterinary Entomology 2008, nr 22(4), s Zhu G.H., Xu X.H., Yu J.-Y., Zhang Y., Wang J.- F., Puparial case hydrocarbons of Chrysomya megacephala as an indicator of the postmortem interval, Forensic Science International 2007, nr 169(1), s Zhu G.H., Yu X.-Y., Xie L.-X., Luo H., Wang D., Lv J.-Y., Xu X.-H., Time of death revealed by hydrocarbons of empty puparia of Chrysomya megacephala (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae): A field experiment, PLoS ONE 2013, nr 8(9), s. e Drijfhout F.P., Cuticular hydrocarbons: a new tool in forensic entomology?, [w:] Amendt J., Campobasso C.P., Goff M.L., Grassberger M., Current concepts in forensic entomology, Springer, 2010, s Zehner R., Amendt J., Boehme P., Gene expression analysis as a tool for age estimation of blowfly pupae, Forensic Science International: Genetics Supplement Series , s Brown K., Thorne A., Harvey M., Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) pupae: a timeline of external morphological development and a new age and PMI estimation tool, International Journal of Legal Medicine 2015, nr 129, s Ridgeway J.A., Midgley J.M., Collett I.J., Villet M.H., Advantages of using development models of the carrion beetles Thanatophilus micans (Fabricius) and T. mutilatus (Castelneau) (Coleoptera: Silphidae) for estimating minimum post mortem intervals, verified with case data, International Journal of Legal Medicine 2013, nr 128(1), s Watson-Horzelski E.J., Survival and time of development for Creophilus maxillosus (L.) 26 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016

6 (Coleoptera: Staphylinidae) at three constant temperatures, Coleopterists Bulletin 2012, nr 66(4), s Barros-Cordeiro K.B., Báo S.N., Pujol-Luz J.R., Intra-puparial development of the black soldier-fly, Hermetia illucens, Journal of Insect Science 2014, nr Ma T., Huang J., Wang J., Study on the pupal morphogenesis of Chrysomya rufifacies (Macquart) (Diptera: Calliphoridae) for postmortem interval estimation, Forensic Science International 2015, nr 253, s Davies K., Harvey M.L., Internal morphological analyses for age estimation of blow fly pupae (Diptera: Calliphoridae) in postmortem interval estimation, Journal of Forensic Sciences 2013, nr 58(1), s Richards C.S., Simonsen T.J., Abel R.L., Hall M.J.R., Schwynd D.A., Wickleind M., Virtual forensic entomology: Improving estimates of minimum post-mortem interval with 3D microcomputed tomography, Forensic Science International 2012, nr 220(1-3), s Brown K., Harvey M., Optical coherence tomography: Age estimation of Calliphora vicina pupae in vivo?, Forensic Science International 2014, nr 242, s Ames C., Turner B., Daniel B., Estimating the post-mortem interval (II): The use of differential temporal gene expression to determine the age of blowfly pupae, International Congress Series 2006, nr 1288, s Zajac B.K., Amendt J., Horres R., Verhoff M.A., Zehner R., De novo transcriptome analysis and highly sensitive digital gene expression profiling of Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) pupae using MACE (Massive Analysis of cdna Ends), Forensic Science International: Genetics 2015, nr 15, s Dekeirsschieter J., Verheggen F.J., Gohy M., Hubrecht F., Bourguignon L., Lognay G., Haubruge E., Cadaveric volatile organic compounds released by decaying pig carcasses (Sus domesticus L.) in different biotopes, Forensic Science International 2009, nr 189, s Dekeirsschieter J., Stefanuto P.-H., Brasseur C., Haubruge E., Focant J.-F., Enhanced characterization of the smell of death by comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GCxGC-TOFMS), PLoS ONE 2012, nr 7(6), s. e Brasseur C., Dekeirsschieter J., Schotsmansc E.M.J., de Koningd S., Wilsonc A.S., Haubrugeb E., Focant J.-F., Comprehensive twodimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry for the forensic study of cadaveric volatile organic compounds released in soil by buried decaying pig carcasses, Journal of Chromatography A 2012, nr 1255, s Forbes S.L., Perrault K.A., Decomposition odour profiling in the air and soil surrounding vertebrate carrion, PLoS ONE 2014, nr 9(4), s. e Frederickx C., Dekeirsschieter J., Brostaux Y., Wathelet J.P., Verheggen F.J., Haubruge E., Volatile organic compounds released by blowfly larvae and pupae: new perspectives in forensic entomology, Forensic Science International 2012, nr 219(1-3), s Pechal J.L., Moore H., Drijfhout F.P., Benbow M.E., Hydrocarbon profiles throughout adult Calliphoridae aging: A promising tool for forensic entomology, Forensic Science International 2014, nr 245, s Braga M.V., Pinto Z.T., de Carvalho Queiroz M.M., Blomquist G.J., Effect of age on cuticular hydrocarbon profiles in adult Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae), Forensic Science International 2016, nr 259, s. e37-e Zhu G.H., Ye G., Hu C., Determining the adult age of the oriental latrine fly, Chrysomya megacephala (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae) by pteridine fluorescence analysis, Insect Science 2003, nr 10(4), s Zhu G.H., Ye G., Li K., Hu C., Xu H., Determining the age of adult flesh flies, Boettcherisca peregrina, using pteridine fluorescence, Medical and Veterinary Entomology 2013, nr 27(1), s Villet M.H., Amendt J., Advances in entomological methods for death time estimation, [w:] Turk E.E., Forensic Pathology Reviews, Springer, 2011, s Perez-Mendoza J., Dowell F.E., Broce A.B., Throne J.E., Wirtz R.A., Xie F., Fabrick J.A., Baker J.E., Chronological age-grading of house flies by using near-infrared spectroscopy, Journal of Medical Entomology 2002, nr 39(3), s Braga M.V., Pinto Z.T., de Carvalho Queiroz M.M., Matsumoto N., Blomquist G.J., Cuticular hydrocarbons as a tool for the identification of insect species: puparial cases from Sarcophagidae, Acta Tropica 2013, nr 128, s Ye G., Li K., Zhu J., Zhu G.H., Hu C., Cuticular hydrocarbon composition in pupal exuviae for taxonomic differentiation of six necrophagous flies, Journal of Medical Entomology 2007, nr 44(3), s PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3)