Biotechnologia stosowana - biotechnologia środowiska studia II stopnia ADSORPCJA METALI PRZEZ MIKROORGANIZMY

Transkrypt

1 Metale ciężkie są bardzo ważnym elementem skorupy ziemskiej. Uważane są za nieodnawialne bogactwa naturalne. Problem środowiskowy, jaki one stwarzają, jest złożony. Z jednej strony mamy do czynienia ze znacznym ubytkiem rud, w skład których one wchodzą, z drugiej zaś, występują one w coraz wyższych stężeniach w żywych organizmach (rośliny, zwierzęta, ludzie) i środowisku, w którym bytują te organizmy. Przyczyną rozproszenia i wzrostu toksycznego wpływu wielu metali na organizmy żywe są głownie procesy antropogeniczne. Metale niezbędne i toksyczne Spośród ponad stu pierwiastków układu okresowego występujących w biosferze, znaczną ich część stanowią metale. Większość metali nie występuje w stanie czystym a jedynie w rudach razem z innymi składnikami. Metale dzieli się na: niezbędne i toksyczne, żeliwne i nieżeliwne, lekkie i ciężkie oraz wyróżnia się grupę metali szlachetnych. Metale ciężkie to te metale, których gęstość jest większa od 4,5 [g/cm 3 ]. Należą one często do grupy pierwiastków śladowych. Dzieli się na cztery grupy: - pierwiastki o bardzo wysokim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska, do których zalicza się m.in.: Cd, Hg, Cr, Ag, Zn, Au, Sb, Sn, Tl, - pierwiastki o wysokim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska: Mo, Mn, Fe, Se i in., - pierwiastki o średnim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska: V, Ni, Co, W i in., - pierwiastki o niskim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska: Zr, Ta, La, Nb i in. Wybrane metale ciężkie i gałęzie przemysłu będące źródłem ich emisji do środowiska: - Cd - galwanizernie, produkcja barwników, baterii, akumulatorów, farb i tworzyw sztucznych, stabilizatorów polimerów, przem. chemiczny, ochrony roślin, zakłady graficzne i drukarskie - Pb - produkcja barwników, akumulatorów, baterii, nawozów, motoryzacja, przem. energetyczny, ochrony roślin, elektrochemiczny - Cr - przemysł galwanizerski, garbarski, impregnacji drewna, włókienniczy, produkcji barwników i tworzyw sztucznych, zakłady drukarskie i graficzne - Cu - przemysł metalurgiczny, farbiarski, tekstylny, produkcja środków ochrony roślin i nawozów - Hg - produkcja baterii, kwasu fosforowego, sody kaustycznej, celulozowni, produkcja środków ochrony roślin i wytwarzania rtęci metalicznej - Ni - przemysł galwanizerski, papierniczy, rafinerie, stalownie, fabryki nawozów sztucznych - Zn - produkcja baterii, farb, przem. tekstylny, tworzyw sztucznych, stabilizatorów polimerów, zakłady drukarskie i graficzne Toksyczność metali ciężkich wynika nie tylko ze stopnia skażenia środowiska, ale także z ich biochemicznej roli, jaką spełniają w procesach metabolicznych oraz ze stopnia wchłaniania i wydalania ich przez organizmy żywe. Rośliny są głównym odbiorcą składników mineralnych z gleby, wód, w tym niebezpiecznych metali a jednocześnie głównym ich źródłem w pożywieniu ludzi i zwierząt. Zagrożenie ze strony metali ciężkich polega głownie na wchodzeniu ich do łańcucha pokarmowego. Przechodzenie metali ciężkich do wyższych ogniw łańcucha pokarmowego jest uzależnione od naturalnych barier biologicznych. Szczególnie niebezpieczne dla środowiska i organizmów żywych są: Cd, Pb, Hg, Cr, As, Zn, Cu. Kadm jest trucizną kumulującą się w organizmie. Organami docelowymi gdzie deponowany jest ten pierwiastek są wątroba i nerki. Kadm narusza przemiany metaboliczne wapnia, magnezu, żelaza, cynku i miedzi. Wypłukiwanie wapnia przez kadm ze szkieletu i innych narządów powoduje deformację i łamanie kości, uszkodzenia narządów wewnętrznych. Zatrucie kadmem powoduje bole i zanik mięśni, niedokrwistość, nadciśnienie tętnicze, uszkodzenia wątroby, nerek i płuc. Jego nadmiar może być przyczyną powstawania nowotworów, zwłaszcza nerek i gruczołu krokowego. Chrom w niskich stężeniach i na III stopniu utlenienia jest pierwiastkiem niezbędnym dla funkcjonowania organizmu żywego. W wyższych stężeniach może wywołać poważne zmiany immunologiczne w organizmach ssaków. Chrom(VI) cechuje się wysoką toksycznością, wykazuje też działania kancerogenne, najczęściej powoduje raka płuc. Rtęć i jej związki mogą wywoływać gwałtowne objawy zatrucia. Wchłaniane ich w niewielkich dawkach powoduje systematyczne kumulowanie się w organizmie. Najłatwiej wchłaniane są alkilowe związki, które są najbardziej szkodliwe, ponieważ szybko przedostają się do komórek nerwowych. Toksyczne działanie tego pierwiastka polega na jego wiązaniu z białkami, zmianie w działaniu hormonów, enzymów, hemoglobiny i białych ciałek krwi. Ma też działanie kancerogenne. Ołów jego szkodliwość dotyczy m.in. obniżenia poziomu inteligencji, upośledzenia słuchu, zaburzenia rozwoju fizycznego i umysłowego, a czasem prowadzi do śmierci. Zmiany spowodowane nadmiarem ołowiu we krwi są nieodwracalne w okresie rozwojowym każdego organizmu. Ołów odkłada się głownie w nerkach i tkance kostnej. Arsen jest czynnikiem kancerogennym. Niebezpieczne dla człowieka związki arsenu(iii) przedostają się do organizmu człowieka przez układ oddechowy i pokarmowy. Może powodować też: upośledzenia słuchowe u dzieci, poronienie samoistne, wady wrodzone u dzieci. Cynk - będąc składnikiem rożnych enzymów, spełnia wiele podstawowych funkcji w organizmach. Jego szkodliwość jest najczęściej związana z wywołaniem wtórnego deficytu. Niedobór cynku prowadzi u ludzi do karłowatości, zmniejsza tempo krzepnięcia krwi, gojenia się ran i zapaleń skory. Nadmiar cynku uważa się za jedną z przyczyn zmian nowotworowych. Miedź i jej szkodliwy wpływ na organizm człowieka wiąże się z nadmiarem tego pierwiastka w diecie, co może prowadzić do zatruć chemicznych. Wywołuje rożne zmiany metaboliczne, uszkadza wątrobę, nerki, tkanki mózgowe, naczynia wieńcowe i serce.

2 Ścieki zawierające metale ciężkie najczęściej oczyszcza się metodami: chemicznymi (neutralizacja, redukcja i/lub utlenianie, strącanie), fizyko-chemicznymi (sorpcja, ekstrakcja, wymiana jonowa), elektrochemicznymi. Wybór metody zależny jest do: rodzaju ścieków, składu, postaci i stężenia usuwanych składników i wymaganego stopnia oczyszczenia. Ekstrakcję stosuje się najczęściej w przypadkach, gdy zależy nam na wydzieleniu określonego składnika z mieszaniny i otrzymania go w czystej postaci. Metody ekstrakcyjne są proponowane głownie do oczyszczania ścieków galwanicznych. Neutralizację prowadzi się w celu osiągnięcia określonego przepisami odczynu ph, przy zastosowaniu określonych reagentów (kwasy, zasady). W zależności od składu ścieków i stosowanego reagenta, procesowi neutralizacji może towarzyszyć chemiczne współstrącanie i strącanie wodorotlenków metali ciężkich. Chemiczne strącanie prowadzi najczęściej do wytrącenia wodorotlenków metali ciężkich. Strącanie poszczególnych metali zależy ściśle od wartościach ph. W przypadku roztworów jednoskładnikowych ilość jonów metali ciężkich pozostałych w ściekach zależy od iloczynu rozpuszczalności wodorotlenków. Na skuteczne wytrącenie kationów metali z roztworu ma wpływ wiele czynników: rodzaj neutralizującego reagenta, skład i stężenie substancji rozpuszczonych, szybkość mieszania. W przypadku występowania w roztworze kilku jonów metali ciężkich stosowana dawka środka neutralizującego jest wypadkową zapotrzebowania na strącenie poszczególnych jonów. Utlenianie/redukcja to procesy wykorzystywane w oczyszczaniu m.in. ścieków galwanicznych, np. redukcja silnie toksycznego chromu Cr(VI) do Cr(III), a następnie wytrącanie Cr(OH) 3. Wymiana jonowa jest to proces, w którym wykorzystuje się wymieniacze jonowe zwane jonitami. Są to substancje wielkocząsteczkowe, wykazujące zdolności do wymiany własnych jonów na jony w otaczającym je roztworze. W zależności od tego, czy wymieniane są kationy czy aniony, wyróżnia się kationity i anionity. Proces ten wykorzystuje się także do oczyszczania ścieków pogalwanicznych. Mikroorganizmy wykorzystywane w procesach usuwania metali ciężkich przy wykorzystywaniu metod mikrobiologicznych stosowane są szczepy mikroorganizmów charakteryzujące się dobrą zdolnością namnażania nawet w niekorzystnych warunkach środowiskowych. Zastosowanie mają również mieszane populacje drobnoustrojów. Do mikroorganizmów, dzięki którym możliwe jest usuwanie metali ze ścieków, osadów ściekowych, odpadów stałych czy terenów nimi skażonych, zalicza się: bakterie, drożdże, promieniowce, pleśnie, grzyby (bez kapeluszowych), glony (bez plechowych). Bakterie są najliczniej reprezentowaną grupą mikroorganizmów w procesach biosorpcji metali. Ze względu na istotną rolę, jaką pełnią osłony komórek bakteryjnych w procesie usuwania metali ciężkich ze ścieków, osadów ściekowych czy w innych procesach technologicznych, przedstawiona zostanie charakterystyka rodzaju tych osłon. Osłony komórki bakteryjnej są utworzone z: - błony cytoplazmatycznej, - ściany komórkowej - polimerów, występujących u bakterii zewnątrzkomórkowych. Błona cytoplazmatyczna składa się z dwóch nieprzepuszczalnych dla elektronów warstw białek przedzielonych warstwą fosfolipidów. Udział fosfolipidów w masie błony komórkowej stanowi 40%. Każda cząsteczka fosfolipidów zawiera część polarną zbudowaną z grupy fosforanowej i glicerolu (ma ona hydrofilowy charakter a więc jest rozpuszczalna w wodzie) oraz część niepolarną zbudowaną z kwasów tłuszczowych (wykazuje hydrofobowy charakter i jest nierozpuszczalna w wodzie). Białka występujące w błonie cytoplazmatycznej dzieli się na: - białka peryferyczne, przylegające do warstwy lipidowej po stronie wewnętrznej i zewnętrznej, słabo z nią związane, - białka integralne wnikające w głąb warstwy lipidowej, silnie z nią związane; białka te to permeazy oraz białka uczestniczące w transporcie wykorzystującym system grup translokacyjnych. Do podstawowych funkcji błony cytoplazmatycznej należy: - transport substancji pokarmowych i innych do komórki i wydalanie zbędnych produktów metabolizmu, - udział w procesach oksydacyjno-redukcyjnych, - wydzielanie enzymów hydrolitycznych rozkładających makrocząsteczki na mniejsze, - uczestniczenie w syntezie ściany komórkowej. Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich zbudowana jest mureiny i kwasów tejchojowych. Pod względem chemicznym mureina jest polimerem zbudowanym z powtarzających się jednostek utworzonych z N-acetyloglukozoaminy oraz kwasu N- acetylomuraminowego, połączonych wiązaniem beta-1,4-glikozydowym. Do każdej cząsteczki przyłączone są krótkie boczne łańcuchy peptydowe, ktore mogą być połączone ze sobą poprzecznymi mostkami peptydowymi. Mureina w ścianach bakterii gramdodatnich tworzy struktury wielowarstwowe i może stanowić 90% materiału ściany komórkowej. Kwasy tejchojowe są z kolei polimerami składającymi się z powtarzających się jednostek glicerolu lub rybitolu, połączonych wiązaniem fosfodiestrowym. Są one powiązane z mureiną lub błoną cytoplazmatyczną za pomocą wiązań kowalencyjnych. Ściana komórki bakterii gramujemnych zbudowana jest z kilku warstw: mureiny, lipoproteiny, błony zewnętrznej. Mureina składa się tylko z jednej do maksymalnie trzech warstw, stanowiąc 5-20 % materiału ściany komórkowej i jest mniej usieciowana poprzecznie. Lipoproteina wiąże błonę zewnętrzną z mureiną. Część białkowa lipoproteiny połączona jest wiązaniem peptydowym z bocznym łańcuchem peptydowym mureiny, a część lipidowa związana jest z lipidami błony zewnętrznej. Błona zewnętrzna bakterii składa się z białek, fosfolipidów i lipopolisacharydów. Nie zawiera kwasów tejchojowych (typowych dla bakterii gramdodatnich). Błona zewnętrzna jest w małym stopniu przepuszczalna dla substancji o charakterze hydrofilowym. Część

3 rzeczywistej przepuszczalności tej błony zależy od jej białek. Białka błony zewnętrznej, które uczestniczą w transporcie do komórki, zwane są porynami. Przez nie mogą dyfundować rożnego rodzaju substancje. Dzieli się je na: - poryny specyficzne, które umożliwiają przechodzenie ściśle określonych substancji - poryny niespecyficzne umożliwiające przepuszczanie cząsteczek o określonej wielkości i hydrofilowym charakterze. Fosfolipidy stanowią wewnętrzną warstwę błony zewnętrznej. Lipopolisacharyd - charakterystyczny składnik dla bakterii gramujemnych, umiejscowiony jest w zewnętrznej warstwie błony. Zbudowany jest z trzech składników: lipidu A, wielocukru rdzeniowego i O-swoistego łańcucha cukrowego. Bakterie gramdodatnie i gramujemne mogą syntetyzować i wydzielać substancje o charakterze polimerów. Polimery tworzące zbitą warstwę ściśle otaczającą komórkę i ściśle z nią związaną nazywa się otoczką. Gdy polimery tworzą warstwę luźno związaną z komórką, przybierając formę włókienek sterczących na zewnątrz komórek, nazywa się je glikokaliksem. Jeżeli polimery są całkowicie odłączone od komórki bakteryjnej, ale ją otaczają, nazywa się je warstwą śluzową. Polimery te mogą być: polisacharydami, polipeptydami lub polisacharydopolipeptydami. Polisacharydy zbudowane są z: cukrów, aminocukrów i kwasów uronowych. Funkcje i właściwości zewnątrzkomórkowych polimerów są rożnorodne i zależą w dużym stopniu od sposobu ich ukształtowania wokół komórki. Egzoplimery poza ochroną komórki przed wysychaniem i szkodliwymi czynnikami, wpływają także na przechodzenie związków chemicznych do jak i z komórki. Usuwanie metali ciężkich przez mikroorganizmy wynika z mechanizmów: - powierzchniowego wiązania metali przez reaktywne polimery i makrocząsteczki występujące w osłonach komórkowych, - wewnątrzkomórkowego wiązania metali. Oporność drobnoustrojów na metale ciężkie wynika z obecności systemów komórkowych umożliwiających wydalanie metali na zewnątrz, bioakumulację lub przemiany enzymatyczne prowadzące do powstawania mniej toksycznych form metali. Usuwanie metali z udziałem mikroorganizmów jest określana mianem biosorpcji. Jest to proces, który polega na: - wiązaniu jonów metali przez grupy reaktywne biopolimerów występujących w osłonach komórkowych mikroorganizmów, - zatrzymaniu na powierzchni nierozpuszczalnych wodorotlenków, soli lub kompleksów metali, - reakcji chemicznych z wydzielanymi na zewnątrz metabolitami, - tworzeniu nierozpuszczalnych związków metali, a następnie ich gromadzeniu i krystalizacji w obrębie osłon komórkowych. Mechanizmy usuwania metali ciężkich przez mikroorganizmy: a) Powierzchniowe wiązanie metali zależy głownie od składu chemicznego osłon, a w szczególności od: - rodzaju i liczebności dostępnych ligandów, - ich rozmieszczenia przestrzennego, - powinowactwa chemicznego do metalu. Osłony komórkowe mają charakter anionowy, a wiązanie metali może być skutkiem adsorpcji jonowymiennej, przyciągania elektrostatycznego bądź reakcji chemicznych. Główną rolę w procesach zewnątrzkomórkowego wiązania metali przez drobnoustroje odgrywają procesy: - wymiany jonowej, - tworzenia trwałych kompleksów. W procesach wymiany jonowej biorą udział grupy funkcyjne polimerów i makrocząsteczek komórkowych, a w szczególności grupa karboksylowa i fosforanowa. Grupy karboksylowe występują licznie w białkach ściany komórkowej, odpowiednio podstawionych mono- i polisacharydach. Fosforany występują w polisacharydach komórkowych, lipoproteinach i lipopolisacharydach. b) Tworzenie trwałych kompleksów to mechanizm zewnątrzkomórkowego wiązania metali. Ujemnie naładowane grupy: karboksylowa i hydroksylowa oraz posiadająca wolną parę elektronową grupa aminowa, łatwo tworzą kompleksy z elektrododatnimi jonami metali, jak: Al 3+, Cr 3+, Fe 2+, Co 2+, Ti 2+, Zn 2+, Sn 2+. Istotną rolę białek w procesach sorpcji metali potwierdzają liczne badania. Obniżając zawartość białka w stosunku do węglowodanów w ścianie komórkowej u Saccharomyces cerevisiae, nastąpiło obniżenie sorbowanej miedzi o 30%. Białka odgrywają natomiast mniejsze znaczenie w przypadku wiązania takich metali jak kadm i nikiel. Istotną rolę w procesie wiązania kadmu ma chityna, składnik ściany komórkowej u grzybów. Z kolei mannan - jeden z głównych składników ściany komórkowej drożdży charakteryzował się największą zdolnością sorpcji miedzi i kobaltu. Badania czterech szczepów bakterii: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli i Pseudosomonas aureginosa pod kątem sorpcji takich metali jak: kadm, miedź, srebro, lantan dowiodły, że gramujemne bakterie (Escherichia coli, Pseudosomonas aureginosa) usuwały kadm z większą efektywnością niż bakterie gramdodatnie (Bacillus subtilis, Bacillus cereus). Z kolei miedź była najefektywniej usuwana przez Bacillus subtilis. c) Wewnątrzkomórkowe wiązanie metali ciężkich. Różnice w zdolności wiązania metali przez bakterie gramdodatnie i gramujemne wynikają głownie ze zróżnicowanego składu chemicznego ścian komórkowych. Przyjmuje się, że gramdodatnie bakterie efektywniej wiążą metale w porównaniu z gramujemnymi. Zdaniem niektórych badaczy gramujemne bakterie wiążą około dziesięciokrotnie mniej metali ciężkich niż gramdodatnie. Zdolność bakterii gramdodatnich do efektywniejszego wiązania metali wiąże się z obecnością mureiny (peptydoglikanu), która u tych bakterii składa się z kilkudziesięciu warstw (u gramujemnych tworzy ona od jednej do trzech warstw). Wiązanie jonów przez mureinę ma charakter jonowy. Kwasy tejchojowe, drugi obok mureiny budulec ścian komórkowych bakterii gramdodatnich, ze względu na wysoką zawartość fosforanów, posiadają silnie kwasowy charakter. W dużej mierze odpowiada to za ujemny ładunek powierzchni komórek gramdodatnich. Ważną rolę w powierzchniowym wiązaniu metali pełnią też otoczki i warstwy śluzowe. Większość z nich składa się z polimerów obojętnych cukrów, kwasów (uronowego, pirogronowego, octowego) oraz polipeptydów. Nadają one egzopolimerom anionowy charakter

4 wynikający z przewagi grup elektroujemnych i pozwala na wiązanie znacznych ilości kationów metali. Egzopolimery efektywnie usuwają kadm z roztworów wodnych. d) Wewnątrzkomórkowe wiązanie metali ciężkich. Metale ciężkie są usuwane z wód, ścieków, osadów ściekowych czy terenów nimi zanieczyszczonych przez mikroorganizmy w wyniku procesów związanych z ich metabolizmem komórkowym. Wśród takich procesów metabolicznych wyróżnić można: - pozakomórkowe wydzielanie przez mikroorganizmy substancji nieorganicznych lub organicznych, reagujących z występującymi w roztworze metalami, powodujących zmianę odczynu, w wyniku czego tworzą się związki o małej rozpuszczalności, - biotransformację polegającą na biologicznym utlenianiu lub redukcji metalu w wyniku czego usuwanie metalu jest skutkiem jego przechodzenia z form rozpuszczalnych w mniej rozpuszczalne, - biotransformację rozpuszczalnych form metali do lotnych związków organopochodnych czy czystego pierwiastka (np. rtęci), które następnie mogą być uwalniane do atmosfery, - wewnątrzkomórkowe pobieranie i wytrącanie metali. Wpływ ph środowiska Podczas wzrostu wielu gatunków mikroorganizmów ulega zmianie odczyn ph środowiska. Przykładem może być wzrost bakterii z rodzaju Citrobacter czy Pseudosomonas na pożywkach organicznych, który powoduje podwyższenie ph. Zmiana odczynu powoduje przesunięcie równowagi chemicznej pomiędzy formami metali występującymi w roztworze, a pośrednio ma wpływ na powinowactwo adsorpcyjne metalu do otoczek i ścian komórkowych. W środowisku alkalicznym tworzą się słabo rozpuszczalne związki metali, podczas gdy w środowisku kwaśnym dominują rozpuszczalne formy, w których metal występuje w formie jonowej. Zdolność zmiany odczynu przez mikroorganizmy zależy w dużej mierze od podłoża, na którym są namnażane. Mechanizm zwiększonego usuwania kadmu z roztworu z udziałem Alcaligenes denitrificans, jest związany ze zdolnością tego gatunku do silnej alkalizacji środowiska w wyniku denitryfikacji. Wpływ wydzielanych metabolitów Inny mechanizm, stymulujący usuwanie z roztworu, metali jest związany z wydzielaniem organicznych oraz nieorganicznych metabolitów. Niektóre wydzielane pozakomórkowo kwasy organiczne czy niskocząsteczkowe białka łatwo przyłączają kadm. Powstające kompleksy są deponowane następnie w obrębie błon lub ściany komórkowej, dzięki czemu zachodzi jego usuwanie z roztworu. Niektóre gatunki mikroorganizmów redukują siarczany do siarkowodoru dzięki obecności reduktaz występujących w białkach błonowych. Umożliwia to wytrącenie metali w postaci nierozpuszczalnych siarczków np. srebra, kadmu, niklu czy miedzi. Wysoka efektywność usuwania kadmu osiągana jest przy użyciu Citrobacter sp. Bakterie te rosnąc na podłożach zawierających fosfoglicerol lub inne organiczne fosforany, wytwarzają specyficzny enzym - kwaśną fosfatazę. Enzym ten zlokalizowany jest na powierzchni komórek i odpowiada za hydrolizę substratu, wskutek czego uwalniane są jony HPO Usuwanie metalu polegało na ich reakcji z jonami HPO 4 2- i wytrącaniu nierozpuszczalnych MeHPO 4 na powierzchni komórek. Wpływ procesów biologicznego utleniania redukcji. Przemiany enzymatyczne w transformacjach metali to procesy utleniania-redukcji oraz metylacji i demetylacji, prowadzące do zmiany formy występowania, a często do detoksykacji środowiska. Arsen może zostać utleniony do As(V) przy udziale oksydaz, a ten jest z kolei mniej toksyczny oraz łatwiej strącany przez fosforany, wapno czy chlorek żelaza(iii). Jednym ze sposobów usuwania chromu(vi) z roztworu jest zdolność wykorzystania go przez mikroorganizmy jako akceptora elektronów, dzięki czemu następuje jego redukcja do Cr(III). Do bakterii redukujących chromiany zaliczyć można Enterobacter cloacae. Do usuwania rtęci wykorzystuje się szczep Aeromonas hydrophila. Proces ten przebiega dwuetapowo: - redukcja jonowej formy rtęci do rtęci metalicznej przez system reduktaz, - gromadzenie rtęci na zewnątrz komórek. Akumulacja Z metabolizmem komórkowym związany jest proces bioakumulacji metali. Zależna od metabolizmu komórkowego kumulacja metali jedno- i wielowartościowych odbywa się przez systemy transportowe. Obecność metali ciężkich w środowisku indukuje u mikroorganizmów syntezę specyficznych białek metalotionein. Są to politiolowe polipeptydy zawierające znaczne ilości (do 30%) cysteiny. U glonów i wyższych roślin wykryto fitochelatyny polipeptydy wiążące metale. Bogata w reszty tiolowe metalotioneina zdolna jest do wiązania takich metali jak: Zn, Cu, Ag, Sn, Hg, Cd. Po związaniu z metalotioneiną nie mogą się one związać z innymi ważnymi funkcjonalnie białkami, co obniża ich toksyczność. Synteza metylotioneiny w komórkach indukowana jest obecnością metali i cysteiny. Zdolność usuwania miedzi i kadmu przez mikroorganizmy rosnące na podłożu z cysteiną była odpowiednio o 38 i 88% większa w porównaniu z próbą kontrolną. Fitochelatyny- to białka, które są indukowane przez rośliny i glony podczas ich kontaktu z wysokim stężeniem metali w środowisku. Metale mogą być też wiązane w komórkach w postaci granul polifosforanowych np. z kadmem. Drożdże wiążą metale wewnątrz komórek w postaci niskocząsteczkowych polifosforanów w wakuolach lub w postaci granulek. Adsorpcja Na powierzchni zetknięcia się dwóch faz zawsze występuje pewne pole niewysyconych sił przyciągających (sił niewysyconych wiązań chemicznych, sił Van der Waalsa itp.), które we wnętrzu fazy kompensują się. W wyniku oddziaływania tych sił substancje pozostające w fazie gazowej nad cieczą lub ciałem stałym oraz substancje rozpuszczone w roztworze mogą być selektywnie gromadzone w pobliżu granicy faz lub też odpychane z tej przestrzeni. W konsekwencji mogą występować różnice stężeń pomiędzy średnim składem ośrodka gazowego lub ciekłego, a składem warstw przyległych do granicy faz. Zjawisko to nazwano adsorpcją.

5 Jeśli na powierzchni granicznej występuje wzrost stężenia danej substancji - mówimy o adsorpcji dodatniej, jeśli natomiast stężenie substancji na granicy faz jest mniejsze od stężenia we wnętrzu fazy ciekłej lub gazowej - o adsorpcji ujemnej. Adsorpcja jest zjawiskiem złożonym. Na jej przebieg wpływa przede wszystkim niejednorodność powierzchni adsorbentów (defekty punktowe, defekty jedno-, dwu- i trójwymiarowe). W zależności od geometrycznego ułożenia atomów na powierzchni ciała stałego oraz od rodzaju tych atomów, w różnych punktach powierzchni adsorbentu działają siły o różnej naturze i wartości. Na skutek tego na powierzchni istnieją miejsca różniące się wartościami energii wiązania danego adsorbentu z adsorbatem, a więc miejsca o różnej aktywności w procesie adsorpcji i o różnym cieple adsorpcji. Te miejsca aktywne nazwano centrami aktywnymi. Ponadto cząsteczki zaadsorbowane wykazują resztkowe siły przyciągające, które mogą powodować adsorbowanie kolejnych cząsteczek i tworzenie się wielocząsteczkowych warstw zaadsorbowanej substancji. W zależności od natury sił działających pomiędzy powierzchnią ciała adsorbującego (adsorbentu) a cząsteczkami ciała adsorbowanego (adsorbatu) rozróżniamy adsorpcję fizyczną i chemiczną (chemisorpcję). W przypadku adsorpcji fizycznej siły działające mają charakter słabych oddziaływań międzycząsteczkowych (siły Van der Waalsa), natomiast w przypadku chemisorpcji - znacznie silniejszych oddziaływań chemicznych. Dla jednocząsteczkowej warstwy substancji zaadsorbowanej zależności ilości substancji zaadsorbowanej od parametrów opisujących układ (temperatura, ciśnienie lub stężenie substancji, rodzaj adsorbentu, adsorbatu itp.) są stosunkowo proste i łatwe do interpretacji. Dla adsorpcji wielowarstwowej zależności te mają jakościowo podobny charakter, jednak interpretacja wyników jest znacznie bardziej złożona. W stanie równowagi istnieje określony podział adsorbatu między fazę roztworu i fazę adsorbentu. Gdzie ilość substancji rozpuszczonej, adsorbowanej na jednostkę masy adsorbentu, jest przedstawiana jako funkcja stężenia substancji rozpuszczonej, pozostającej w roztworze w stałej temperaturze. Wyrażenie takie jest nazywane izoterma adsorpcji. q eq = f(c eq ) temp Układ jednoskładnikowy. Stosunkowo prosty model procesu adsorpcji został zaproponowany przez Langmuira. Opierając się na następujących założeniach: na powierzchni adsorbentu znajduje się określona liczba miejsc aktywnych, zdolnych do wiązania adsorbatu; ich liczba jest proporcjonalna do wielkości powierzchni; jednemu miejscu aktywnemu odpowiada jedna cząsteczka adsorbatu; ma miejsce adsorpcja zlokalizowana. Czyli cząsteczka adsorbatu nie ma możliwości swobodnego przemieszczania się po powierzchni adsorbentu; nie występują wzajemne oddziaływania pomiędzy zaadsorbowanymi cząsteczkami adsorbatu; powstała warstwa adsorpcyjna zmniejsza oddziaływanie sil adsorpcyjnych, co uniemożliwia powstawanie następnych warstw. Tradycyjne równanie Langmuira wyraża się wzorem: K L C eq q eq = q max 1 + K L C eq gdzie: q eq masa zaadsorbowanej substancji (metalu) [mg/g]; K L stała w równaniu Langmuira [dm 3 /mg]; C eq równowagowe stężenie substancji (metalu) w roztworze [mg/dm 3 ]; q max maksymalna pojemność adsorpcyjna monowarstwy adsorbentu [mg/g]. Równanie to jest prawdziwe jeżeli po linearyzacji zależność 1 q eq = f( 1 C eq ) jest linią prostą. Otrzymane po linearyzacji stałe K L i q max oddają nam naturę sorbenta i pozwalają nam na porównanie procesu biosorpcji. Stała K L izotermy Langmuira określa jak stroma jest izoterma, czyli jak duże jest powinowactwo sorbenta do sorbantu. Jeżeli natomiast stanowi linię łamaną to można przypuszczać że substancja jest wiązana na sorbencie przez więcej niż jeden rodzaj miejsc aktywnych. Parametr KL jest miarą powinowactwa i wydajności sorpcji różnych biomas, duży współczynnik K L wskazuje na duże powinowactwo dla absorbatu, i odpowiada nachyleniu wykresu izotermy sorpcji w początkowym zakresie. Najbardziej pożądane są biosorbenty o najwyższej możliwej q max i najwyższym współczynniku K L. Jednym z założeń teorii Langmuira jest to, że energia adsorpcji dla wszystkich miejsc (centrów) aktywnych jest taka sama i nie zależy od stopnia pokrycia powierzchni cząstkami adsorbatu. W praktyce jednak jest inaczej, a zostało to uwzględnione w izotermie adsorpcji Freundlicha, postaci: 1 n q eq = K F C eq gdzie: K F i n(1/n) to stałe adsorpcji w równaniu Freundlicha C eq stężenia adsorbowanej substancji (metalu) w roztworze w stanie równowagi [mg/dm 3 ], q eq masa zaadsorbowanej substancji (metalu) [mg/g]. Wykładnik na ogół przyjmuje wartości mniejsze niż 1, co oznacza że stężenie powierzchniowe adsorbatu wzrasta wolniej niż jego stężenie w roztworze, nie osiągamy nasycenia, ponieważ na powierzchni występują zawsze miejsca o wysokiej energii adsorpcji.

6 Znacznie częściej stosowaną izotermą jest izoterma Langmira, miedzy innymi ze względu na łatwość interpretacji wyników. Jedną z podstawowych różnic jest ta, że w izotermie Freundlicha nie można określić q max. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest ocena stopnia neutralizacji jonów metali ciężkich w roztworze metodą biosorpcji. Wykonanie ćwiczenia 1. Wyznaczanie izoterm adsorpcji jonów metali (Pb(II), Ni(II), Cu(II), Cr(VI), Cr(III)) przez biomasę drożdży W 6 kolbach stożkowych o pojemności cm 3 przygotowujemy po 100 cm 3 (V) roztworu wskazanego przez prowadzącego jonu metalu w stężeniach odpowiednio: ok. 10, 25, 50, 100, 150 i 200 mg/dm 3 (rozcieńczamy roztwór roboczy danego jonu metalu wodą redestylowaną) 1.2. Ustalamy odpowiednie ph roztworu, w zakresie W przygotowanych roztworach określamy dokładne stężenie jonów metalu (C 0) metodą spektrofotometryczną, z wykorzystaniem testów kuwetowych patrz pkt Kolby umieszczamy w termostacie (30 o C) z wytrząsaniem (150 rpm) i wprowadzamy do nich po 0,2 g suchej masy komórek drożdży (m) Po 45 minutach (t) pobieramy po 5 ml roztworu metalu z każdej kolby i po jego filtracji określamy stężenie metalu (C e) metodą spektrofotometryczną patrz pkt Pomiar stężenia metalu metodą spektrofotometryczną: przed wykonaniem pomiaru na spektrofotometrze należy: 2.1. przefiltrować roztwór - jeżeli występuje w nim zawiesina i roztwór jest nieklarowny z wykorzystaniem zestawu do filtracji próżniowej i użyciem sączków celulozowych 0,45µm Odpowiednio rozcieńczyć badany roztwór ( np. 100-krotnie) tak aby stężenie jonów badanego metalu mieściło się w zakresie pomiarowym odpowiedniego testu kuwetowego rozcieńczenia należy wykonywać bardzo dokładnie z wykorzystaniem kolb miarowych!!! 2.3. Postępować zgodnie z instrukcją użycia danego testu kuwetowego, przestrzegać kolejności i objętości dodawanych odczynników, oraz czasu ich reakcji Test ołowiu(ii) w zasadowym środowisku jony Pb(II) reagują z 4-(2 -pirydylazo) rezorcyną (PAR) tworząc czerwono zabarwiony kompleks, który oznaczamy fotometrycznie (520 nm). Zakres pomiarowy 0,1 5,0 mg/dm 3. ph próby musi mieścić się w granicach 3-6. Procedura - do probówki szklanej wprowadzić: Odczynnik Pb-1 0,25 ml Odczynnik Pb-2 0,25 ml probówkę wymieszać (vortex) Przygotowana próba 8 ml probówkę wymieszać (vortex) Wprowadzić przygotowany roztwór do kuwety i dokonać pomiaru w fotometrze. Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,13 mg/dm 3 Pb(II) 2.5. Test niklu(ii) jony Ni(II) poddaje się utlenieniu przy pomocy jodu, a następnie w reakcji z dimetyloglioksymem, w środowisku amoniakalnym, tworzą czerwono-brązowy kompleks, który jest oznaczany fotometrycznie. Zakres pomiarowy 0,1 5,0 mg/dm 3. ph próby musi mieścić się w granicach 3-8. Procedura do probówki szklanej wprowadzić: Przygotowaną próbę 5 ml Odczynnik Ni-1 1 kropla dodać i wymieszać, delikatne żółte zabarwienie musi się utrzymać. Jeżeli zachodzi potrzeba dodać odczynnika Ni-1 kroplami do momentu, gdy barwa pozostanie stabilna. Pozostawić na 1 minutę czas reakcji A Odczynnik Ni-2 2 krople dodać i wymieszać. Wartość ph próbki musi mieścić się w granicach ( w razie potrzeby skorygować ph) Odczynnik Ni-3 2 krople dodać i wymieszać. Pozostawić na 2 minuty czas reakcji B Przelać próbkę do kuwety i dokonać pomiaru w fotometrze. Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,11 mg/dm 3 Ni(II) Test miedzi(ii) środowisku amoniakalnym, jony miedzi(ii) reagują z kupryzonem tworząc niebieski kompleks, który jest oznaczany fotometrycznie. Zakres pomiarowy 0,1 6,00 mg/dm 3. ph próby musi mieścić się w granicach Procedura do probówki szklanej wprowadzić:

7 Przygotowaną próbę 5 ml Odczynnik Cu-1 1 poziom zielonej łyżeczki pomiarowej dodać i wstrząsać energicznie do momentu rozpuszczenia odczynnika, ph próbki musi mieścić się w granicach 7-9, Odczynnik Cu-2 5 kropli dodać i wymieszać Pozostawić na 5 minut (czas reakcji) Przelać próbkę do kuwety pomiarowej i dokonać pomiaru w fotometrze. Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,15 mg/dm 3 Cu(II) Test chromu(vi) metoda polega na zredukowaniu chromu(vi) przy użyciu difenylokarbazydu w roztworze zawierającym niewielkie stężenie fluorowodoru. Przejściowym produktem tej reakcji jest niezhydratowany chrom(iii). Tworzy on czerwono-fioletowy kompleks z difenylokarbazonem, produktem utleniania difenylokarbazydu. Kompleks jest oznaczany fotometrycznie. Zakres pomiarowy 0,11 6,69 mg/dm 3. ph próby musi mieścić się w granicach 1-9. Procedura do probówki szklanej wprowadzić: Odczynnik Cr-1 1 poziom szarej mikrołyżeczki umieścić w pustej probówce Odczynnik Cr-2 6 kropli dodać i wstrząsać energicznie do momentu całkowitego rozpuszczenia odczynnika Przygotowana próba 5 ml dodać i wymieszać Pozostawić na 1 minutę (czas reakcji), następnie wprowadzić próbkę do kuwety i dokonać pomiaru. Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,04 mg/dm 3 Cr(VI) Oznaczanie chromu(iii) - wersenian disodu w słabo kwaśnym środowisku (ph 4-5) tworzy z jonami chromu(iii) fioletowy kompleks, który ma maximum absorpcji przy długości światła λ=540 nm. Stanowi to podstawę kolorymetrycznego oznaczania stężenia jonów chromu(iii). Procedura do probówki szklanej wprowadzić: Przefiltrowana próba 4 ml EDTA 95 mg. Całość inkubujemy w temperaturze 95 o C przez 10 minut (łaźnia wodna). Następnie odczytujemy wartość adsorbancji A 540 względem próby odniesienia przygotowanej w taki sam sposób jak badane próbki (4 ml wody destylowanej i 95 mg EDTA) Krzywa wzorcowa chromu(iii) y = -1,16+603x R 2 = 0, Opracowanie wyników 3.1. Uzyskane dane zestawić w tabeli: Co [mg/g] Ce [mg/g] qeq [mg/g] 3.2. Wielkość sorpcji rzeczywistej metalu przez biomasę drożdży (q eq, metal mg/g suchej biomasy) obliczamy ze wzoru; q eq = (C 0 C e )V m gdzie: C 0 było początkowym stężeniem metalu (mg/dm 3 ), C e końcowym stężeniem metalu (mg/l), V objętością roztworu metalu (dm 3 ) i m suchą masa komórek (g).

8 3.3. Na podstawie uzyskanych wyników wykreślić izotermę adsorpcji Langmuira jonów metalu przez biomasę drożdży, tzn. zależność ilości jonów metalu zaadsorbowanych przez jednostkę biomasy drożdży q eq od stężenia roztworu po osiągnięciu stanu równowagi C eq 1 = f( 1 ) q eq C eq 3.4. Z wykresu izotermy wyznaczyć stałe K L [dm 3 /mg] i q max [mg/g] 4. Literatura 4.1. Łebkowska M., Klimiuk E., Biotechnologia w ochronie środowiska, WN PWN, Warszawa Sadowski Z., Biogeochemia wybrane zagadnienia, Oficyna wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2005.