RECENZJA OCENA MERYTORYCZNA PRACY

Transkrypt

1 Kraków, 21 lutego 2018 r. Dr hab. Aleksandra Duda-Chodak Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Wydział Technologii Żywności Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej RECENZJA pracy doktorskiej mgr Anny Goszkiewicz pt. Mikroorganizmy jelitowe i ich aktywność u dzieci na diecie wegetariańskiej wykonanej w Instytucie Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej, pod kierunkiem prof. dr hab. Zdzisławy Libudzisz Liczne badania wskazują na istotny wpływ mikrobioty jelitowej na zdrowie człowieka i potwierdzają, że wszelkie zaburzenia jej składu i aktywności (dysbioza) mogą wywierać negatywne skutki w postaci różnych chorób jak rozwój nowotworów, otyłość czy zaburzenia neurologiczne. Skład gatunkowy oraz wzajemne proporcje mikroorganizmów zasiedlających jelito w dużej mierze są determinowane przez 1000 pierwszych dni życia, jednak mogą zmieniać się w czasie życia osobniczego pod wpływem różnych czynników. Coraz częściej upatruje się przyszłości medycyny w celowanym modyfikowaniu mikrobioty jelit tak, by wspomagała ona proces leczenia różnych jednostek chorobowych. Mając powyższe na uwadze, podjęcie przez mgr Annę Goszkiewicz badań, mających na celu sprawdzenie jak stosowanie diety wegetariańskiej w porównaniu do diety tradycyjnej wpływa na skład i aktywność ekosystemu jelitowego, należy uznać za jak najbardziej uzasadnione. OCENA MERYTORYCZNA PRACY Ocena poprawności sformułowania celu pracy oraz jego uzasadnienia Celem pracy było porównanie czy skład i aktywność bakterii z rodzajów dominujących w ekosystemie jelitowym u dzieci pozostających na diecie wegetariańskiej różni się istotnie od dzieci 1

2 stosujących dietę tradycyjną. Choć w pracy nie sformułowano hipotez badawczych, to jednak uważam, że ogólny cel badań, jak również cele szczegółowe, zostały przedstawione prawidłowo. Sformułowanie celu badań poprzedziła wnikliwa i krytyczna ocena aktualnego stanu wiedzy z tego zakresu, którą Doktorantka przedstawiła we Wstępie obejmującym 31 stron. Omówiła w nim zasady wegetarianizmu i różnice pomiędzy poszczególnymi typami tej diety, ze szczególnym uwzględnieniem zalet i zagrożeń wynikających z ich stosowania, także w odniesieniu do grupy wiekowej będącej tematem jej pracy doktorskiej. Następnie Doktorantka szczegółowo opisała skład i znaczenie mikrobioty jelitowej, szeroko pochylając się nad czynnikami mającymi bezpośredni lub pośredni wpływ na zespół mikroorganizmów jelitowych, w tym rodzaj porodu, sposób karmienia, wiek, stosowana dieta, zażywane leki, antybiotyki, pro- i prebiotyki oraz otoczenie. Na szczególne podkreślenie zasługuje obiektywizm w ocenie różnego typu diet wegetariańskich, poparty właściwie dobranym piśmiennictwem, oraz lekkość i przejrzystość, z jaką została napisana ta część pracy. Ocena metodologii badań Generalnie uważam, że metody wykorzystane do badań zostały dobrane właściwie i umożliwiały realizację założonego celu. Z poczucia obowiązku recenzenta, mogę tylko wyrazić żal, że nie oznaczano liczebności bakterii z rodzaju Ruminococcus, gdyż ta grupa bakterii mogła ulegać zmianom pod wpływem diety wegetariańskiej. Natomiast szczególnie duże uznanie należy się Doktorantce za wybór metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), dzięki czemu można było wyeliminować wpływ na uzyskane wyniki dużego odsetka mikroorganizmów niehodowlanych lub w stanie VBNC w mikrobiocie jelitowej. Jednak obiektywnie patrząc to właśnie ta część pracy budzi najwięcej moich uwag/zastrzeżeń, które wymagają wyjaśnienia, szczególnie przed wysłaniem do druku publikacji przygotowanych w oparciu o uzyskane wyniki. Ponieważ przypuszczam, że moje zastrzeżenia wynikają jedynie z niezbyt dokładnego i jasnego opisania metodyki, dlatego proszę o ustosunkowanie się do poniższych uwag w trakcie publicznej obrony i wyjaśnienie tych nieścisłości. Po pierwsze, Autorka napisała, że próby kału pobierano według określonej procedury, a następnie przechowywano w temperaturze -70 C do momentu analizy (str. 36). Nie podaje jednak żadnych informacji jak wygląda ta procedura, tzn. kto pobierał próbę, czy od jednego dziecka próbę pobierano tylko raz, czy może przez kilka kolejnych dni (jak np. podczas rutynowego 2

3 wykrywania bakterii Salmonella), do czego pobierano próby, w jakich warunkach były one transportowane oraz ile czasu mijało od pobrania do zamrożenia. Czas, dostęp do tlenu i temperatura podczas transportu próby mogły w istotny sposób wpłynąć na niektóre mikroorganizmy, szczególnie na wrażliwe beztlenowce. Nie wyjaśniono również nigdzie z czego wynikają różnice w liczebności prób użytych w poszczególnych analizach, np. spośród 39 osób na diecie tradycyjnej do analizy liczebności bakterii metodą hodowlaną użyto 37 prób kału, metodą FISH 38, a do analiz enzymatycznych tylko 34 (rys. 12, strona 37). Proszę również o wyjaśnienie dlaczego brakuje tak istotnych danych, jak np. masa ciała dziecka i BMI (tabela 2 i 3), szczególnie w odniesieniu do pacjentów Zakładu Żywienia Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie. Zgodnie z informacjami w dalszej części pracy (str. 144) pacjenci zostali dokładnie przebadani, wykonano u nich badania antropometryczne, analizy biochemiczne krwi i moczu i inne podstawowe badania potwierdzające dobry stan zdrowia, w tym prawidłowe BMI. Moje wątpliwości budzi brak oznaczenia zawartości suchej masy w próbach kału. Z pewnością występowały różnice w zawartości wody i mogły one w sposób istotny statystycznie wpłynąć na liczebność mikroorganizmów. O ile w ocenie aktywności enzymów wyeliminowano ten wpływ, podając wyniki w przeliczeniu na mg białka, to liczebność mikroorganizmów była podawana w przeliczeniu na 1 g mokrej masy kału. Proszę o ustosunkowanie się do tego faktu. Moim zdaniem w opisie pożywek hodowlanych użytych do analiz mikrobiologicznych (podrozdział 3.2) powinna się znaleźć dodatkowo informacja jakie kolonie uznawano za pozytywne, tzn. czy liczono wszystkie kolonie wyrosłe na danym podłożu czy tylko te spełniające odpowiednie (jakie?) kryteria. Przykładowo, czy przeprowadzano jakieś dodatkowe czynności mające na celu usunięcie innych mikroorganizmów redukujących siarczyny, które mogą rosnąć na podłożu DRCM, a nie należą do Clostridium? Zwyczajowo podgrzewa się próbkę przed posiewem, przez co pozostają w niej tylko formy przetrwalne, a poprzez inkubację w warunkach beztlenowych eliminowane są bakterie z rodzaju Bacillus (B. cereus może rosnąć na tym podłożu choć nie powoduje czernienia, podobnie jak E. coli). Posiewy, z których rozcieńczeń uwzględniano do obliczeń, czy tylko te, z których wyrosło między 30 a 300 kolonii? W opisie metody HPLC wykorzystywanej do określenia stężenia kwasu mlekowego i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA, BCFA), podrozdział 3.4, brakuje wielu istotnych dla tej metody informacji, m.in. co było fazą ruchomą, jakie było stężenie eluenta, czy rozdział był izokratyczny czy gradientowy, jaki był czas rozdziału, jaki rozpuszczalnik zastosowano 3

4 do wzorców, jakie długości fali zastosowano do detekcji poszczególnych związków (detektor UV). Moje wątpliwości budzą również równania krzywych podane w tabeli 9 (str. 53, np. y=2e-07), na podstawie których wyznaczano stężenia poszczególnych kwasów. W tej postaci uniemożliwiają wyliczenie jakiegokolwiek stężenia. Proszę także o uściślenie jakie związki posłużyły do wykreślenia krzywych wzorcowych wykorzystywanych następnie do oznaczania aktywności β-glukozydazy i β-glukuronidazy (str. 54) oraz stężenia białka (str. 55). W podrozdziale 3.7, dotyczącym analizy statystycznej, podano, że wyniki przedstawiane są w postaci średniej arytmetycznej z serii powtórzeń. Nie znalazłam nigdzie informacji na temat liczby powtórzeń, jakie wykonano dla poszczególnych analiz. Co więcej, sposób prezentacji wyników każe przypuszczać, że oceny liczebności bakterii metodą hodowlaną dokonano tylko raz dla każdej próby. Natomiast w analizie metodą FISH wyznaczano co prawda średnią liczbę komórek z 20 pól widzenia, ale analizowano tylko po jednym preparacie dla każdej próby kału, co również daje tylko jedną wartość. Nie ma więc mowy o średniej arytmetycznej z serii powtórzeń. Analogicznie, brak informacji o liczbie powtórzeń w analizie stężeń kwasów i białka oraz w ocenie aktywności enzymów. Proszę o wyjaśnienie, czy jest to tylko niewłaściwie sformułowany opis metodyki zastosowanej w analizie statystycznej czy brakuje w pracy tych danych. Ocena sposobu prezentacji oraz interpretacji i dyskusji wyników Doktorantka przedstawiła uzyskane wyniki w sposób niezwykle przejrzysty i bardzo pomocny podczas czytania pracy, a całość jest opracowana bardzo ładnie graficznie, z dużym wyczuciem estetyki. Początkowo zastanawiała mnie celowość wielokrotnego przedstawiania, w sumie tych samych wyników w różnej postaci, jednak w trakcie czytania doceniłam, że każdy ze sposobów prezentacji umożliwia spojrzenie na te wyniki pod innym kątem i zauważenie zależności, które w innej postaci są niewidoczne. Podejrzewam, że przygotowanie aż 47 różnorodnych wykresów zawierających bardzo liczne i różnie zestawione dane było niezwykle czasochłonne, jednak dzięki temu przedstawiona przez Doktorantkę analiza uzyskanych rezultatów została przeprowadzona bardzo wnikliwie i starannie. Uzyskane rezultaty badań podzielono na 3 części, pierwsza dotyczyła liczebności oraz składu mikrobioty jelitowej, które oznaczano dwiema metodami, kolejno u dzieci na diecie 4

5 wegetariańskiej i tradycyjnej. Druga część dotyczyła oznaczonych stężeń kwasu mlekowego, krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz ph wody kałowej, a trzecia aktywności enzymów w kale badanych grup dzieci. Każda partia wyników została opatrzona krótkim podsumowaniem, na podstawie którego sformułowano następnie wnioski. Mimo że nie ma konieczności powtarzania metody oznaczania poszczególnych parametrów w opisie uzyskanych rezultatów, to krótkie przypomnienie, podane przez Autorkę na początku każdej z wymienionych części, znacząco ułatwiło dalszą lekturę. Moim zdaniem, dodatkowym ułatwieniem dla czytelnika byłoby zaznaczenie kontrastowym kolorem w odpowiednich tabelach (np. tabela 10) wyników odstających, które uległy odrzuceniu wskutek przeprowadzonych testów statystycznych (t. Grubbsa). Wydaje się, że na stronach 60-61, podano błędne wartości średniej liczebności poszczególnych grup bakterii w kale dzieci na diecie wegetariańskiej, oznaczonej metodą płytkową, hodowlaną Kocha (nie są zgodne z wartościami podanymi w tabeli 10, do której autorka się odwołuje), natomiast w tabeli 12 zamienione są podpisy wierszy zawierających dane dla Lactobacillus i Enterococcus (dla diety pescowegetariańskiej oraz wegańskiej). Istotny problem w interpretacji uzyskanych wyników rodzi fakt, że grupy dzieci na diecie owowegetariańskiej i wegańskiej była tak małe (po 2 osoby), co znacząco utrudnia jakiekolwiek wnioskowanie o wpływie tych diet na badane parametry. Tym bardziej nie rozumiem dlaczego i na jakiej zasadzie wykluczono po jednym z wyników (tabela 15). Fakt odstawania od średniej, obliczonej dla wszystkich typów diet wegetariańskich, nie wydaje się wystarczającym uzasadnieniem, gdyż to właśnie te bardzo restrykcyjne diety, jak wegańska, mogły dawać odstające wyniki. Nie rozumiem też skąd w tabeli 15 wzięły się wartości minimum (5,8E+08) i maksimum (6,5E+09) ogólnej liczby bakterii dla diety wegańskiej oznaczane metodą FISH, skoro tylko 2 dzieci było na tej diecie, a uzyskane dla prób ich kału wyniki podane w tabeli 13 były zupełnie inne i wynosiły odpowiednio 3,3E+09 i 1,6E+10. Jeśli jeden z pomiarów został wykluczony po teście Grubbsa, powinna zostać któraś z tych dwóch wartości, podczas gdy w tabeli 15 są one zupełnie inne. Analogiczna sytuacja dotyczy wyników OLB prób z diety owowegetariańskiej. Na stronie 117 (Wyniki) zdanie dotyczące stężenia molowego dominujących kwasów SCFA, w którym jednostką tego stężenia jest mg/g budzi mój zdecydowany sprzeciw. Bardzo proszę o poprawienie tego przed opublikowaniem wyników. 5

6 Inne drobne błędy, które zauważyłam przekażę Doktorantce podczas obrony, gdyż w żaden sposób nie wpływają one na moją wysoką ocenę tej pracy ani nie umniejszają jej wartości naukowej, natomiast świadomość ich istnienia pomoże w rzetelnym przygotowaniu publikacji. Dyskusja wyników przeprowadzona przez Doktorantkę świadczy o dużej wiedzy oraz o umiejętności dostrzegania pewnych zależności i precyzyjnego formułowania spostrzeżeń i wniosków. Wstępną analizę uzyskanych rezultatów Autorka zamieściła jeszcze w rozdziale Wyniki. Następnie, na 14 stronach osobnego rozdziału, Doktorantka przeprowadziła obszerną, rzetelną i bardzo szczegółową dyskusję, w której nie tylko poddała wnikliwej interpretacji własne wyniki, ale także odniosła się do rezultatów badań uzyskanych przez innych badaczy. Świadczy to o doskonałej znajomości tematu i dużej dojrzałości naukowej. Ocena wnioskowania Wnioski w sposób jasny i czytelny przedstawiają najważniejsze rezultaty badań w odniesieniu do założonego celu. Na podstawie otrzymanych wyników sformułowano 11 uzasadnionych wniosków, które wskazują na istotny wpływ stosowania diety wegetariańskiej na skład i aktywność mikroorganizmów jelitowych u dzieci. Jedynie we wniosku nr 10 zostały pomylone proporcje SCFA do BCFA w kale dzieci na diecie wegetariańskiej i tradycyjnej, powinny one wynosić odpowiednio 10:1 oraz 14:1, a nie jak podano 1:10 i 1:14. Ocena bibliografii W pracy wykorzystano 198 pozycji piśmiennictwa, z czego tylko 10 jest w języku polskim (pozostałe anglojęzyczne), a znakomitą większość stanowią oryginalne prace twórcze z ostatnich 10 lat. Zebrana bibliografia została prawidłowo wykorzystana zarówno we wstępie pracy, jak i podczas dyskusji uzyskanych wyników, z zastosowaniem czytelnych i prawidłowo zastosowanych odnośników. Jedyny dyskomfort Recenzenta w tym obszarze spowodował brak numeracji wymienionych w spisie pozycji literatury, co wymusiło ich ręczne liczenie. 6

7 OCENA FORMALNA PRACY Zastosowany układ pracy jest typowy dla dysertacji o charakterze doświadczalnym. Praca liczy 192 strony o typowym układzie edytorskim, zawiera 34 tabele i 77 ilustracji. Treść została prawidłowo podzielona na 10 rozdziałów o układzie, kolejności i nazwach typowych dla prac naukowych, tj. Wstęp, Cel pracy, Materiały i metody, Wyniki, Dyskusja, Wnioski, Literatura. Zgodnie z wymogami ustawy praca została opatrzona również streszczeniem, zarówno w języku polskim, jak i w języku angielskim. Ponadto do pracy dołączono osobny rozdział z załącznikami. Na podkreślenie zasługuje fakt, że pani Anna Goszkiewicz włada piękną i poprawną polszczyzną, a praca jest prawie wolna od błędów literowych, stylistycznych i interpunkcyjnych, co świadczy o jej bardzo starannym przygotowaniu. Jest również bardzo ładnie opracowana edytorsko i graficznie, z naciskiem na estetykę i czytelność prezentowanych danych. Tabele, zawierające zestawienia wyników z poszczególnych analiz zostały przygotowane prawidłowo i bardzo starannie, z zastosowaniem układu ułatwiającego ich ocenę oraz wyszukiwanie danych, które są następnie poruszane w rozdziale Wyniki oraz Dyskusja. Podobnie należy podkreślić bardzo starannie przygotowane ilustracje, na których zestawiono uzyskane wyniki w sposób ułatwiający ich porównanie, z właściwie i czytelnie naniesionymi wynikami analizy statystycznej. Jako recenzent szczególnie doceniam ciężką pracę Doktorantki, która niemal każdy wątek poruszony w trakcie omawiania i szczegółowych porównań uzyskanych wyników zilustrowała czytelnym wykresem lub tabelą, co niezmiernie ułatwiło analizę danych i ocenę pracy. Mimo złożonego problemu, licznych badań i analiz statystycznych uzyskane wyniki i ich dyskusja zostały przedstawione w sposób czytelny, przejrzysty, w znakomitej większości jednoznaczny. WNIOSEK KOŃCOWY Przedstawiona do oceny rozprawa stanowi bardzo wartościowe opracowanie naukowe, a uzyskane wyniki są oryginalne i wnoszą wiele nowych informacji istotnych dla nauki polskiej i światowej. Szczególnie istotny jest fakt podjęcia przez panią Annę Goszkiewicz badań obejmujących populację polską i przeprowadzonych na trudnej do oceny grupie wiekowej, jaką stanowią dzieci. 7

8 Autorka jasno określiła stan wiedzy i wynikające z niego problemy badawcze, sformułowała cel pracy i opisała metodologię badań. W efekcie uzyskała wiele wartościowych wyników, które poddała wnikliwej analizie i rzetelnej interpretacji, co wraz z obszerną i dojrzałą dyskusją świadczy o doskonałym przygotowaniu merytorycznym i warsztatowym Doktorantki. Uwagi zawarte w tej recenzji w żaden sposób nie umniejszają wartości merytorycznej rozprawy. Biorąc powyższe pod uwagę, stwierdzam, że rozprawa doktorska Pani mgr Anny Goszkiewicz, pt. Mikroorganizmy jelitowe i ich aktywność u dzieci na diecie wegetariańskiej, spełnia wszystkie wymagania stawiane dysertacjom doktorskim przez art. 13 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki, z późniejszymi zmianami (tekst jednolity Dz.U. 2017, poz. 1789) i wnioskuję do Wysokiej Rady Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej o dopuszczenie Pani mgr Anny Goszkiewicz do dalszych etapów przewodu doktorskiego. 8