(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FI02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. G01N 33/564 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FI02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/86509 Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób wykrywania celiakii (CD) lub opryszczkowego zapalenia skóry w próbce krwi pacjenta lub w zhemolizowanej próbce krwi pacjenta i zastosowanie transglutaminazy tkankowej (ttg) uwolnionej z czerwonych krwinek (RBC) z próbki krwi (30) Pierwszeństwo: , FI, (73) Uprawniony z patentu: Mäki Markku, Tampere, FI Korponay-Szabo Ilma, Budapeszt, HU (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/05 (72) Twórca(y) wynalazku: MARKKU MÄKI, Tampere, FI ILMA KORPONAY-SZABO, Budapeszt, HU (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania celiakii (CD) lub opryszczkowego zapalenia skóry w próbce krwi pacjenta lub w zhemolizowanej próbce krwi pacjenta i zastosowanie transglutaminazy tkankowej (ttg) uwolnionej z czerwonych krwinek (RBC) z próbki krwi. Niniejszy wynalazek dotyczy diagnozy, skriningu i dalszego badania chorób związanych z nietolerancją glutenu, takich jak celiakia i inne jednostki chorobowe glutenozależne. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy sposobu wykrywania chorób indukowanych glutenem w próbce krwi osobnika. Glutenozależna enteropatia jest genetycznie uwarunkowaną nietolerancją na gluten pokarmowy, szkodliwe prolaminy zawarte w pszenicy, życie i jęczmieniu. Allele HLA DQA1*0501 oraz DQB1*0201 kodujące heterodimer HLA DQ2 nadają genetyczną podatność zarówno na celiakię jak i opryszczkowe zapalenie skóry, najczęściej diagnozowane formy chorób należące do tej grupy. Jeden lub kilka nieznanych do tej pory genów w loci niepołączonych z HLA bardzo prawdopodobnie także predysponuje do celiakii, choroby, w której przyjmowanie glutenu prowadzi do zaniku kosmków w jelicie cienkim. Enteropatia jest wynikiem wyzwalanych glutenem procesów autoimmunologicznych i samoutrwala się przy spożywaniu glutenu. Gdy gluten eliminowany jest z diety, odpowiedź odpornościowa zmniejsza się i widoczne jest zdrowienie błony śluzowej. Typowym objawem klinicznym celiakii jest wyraźne złe wchłanianie u małych dzieci lub ostre wyniszczenie organizmu u dorosłych. Podczas ostatnich dziesięcioleci stało się jasne, że celiakia jest niedostatecznie zdiagnozowana, cechy kliniczne tej choroby zmieniły swe formy na łagodniejsze, a diagnoza jest często stawiana w starszym wieku. Także u dorosłych pacjentów istnieje zmiana w kierunku łagodniejszych symptomów. Prawdziwe rozpowszechnienie celiakii w różnych populacjach może być tak wysokie jak 1 na 100. Haplotyp DR3-DQ2 jest typowy dla wielu zaburzeń autoimmunologicznych i można go znaleźć u około 25% populacji europejskiej. Typowe zaburzenia powiązane z celiakią to cukrzyca insulinozależna, syndrom Sjogrena, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, reumatyczne zapalenie stawów, ogólnoustrojowy toczeń rumieniowaty oraz bielactwo nabyte. Co więcej, rozpowszechnienie zaburzeń autoimmunologicznych przy celiakii związane jest z czasem trwania ekspozycji na gluten. U pacjentów z nieleczoną celiakią większe jest także ryzyko nowotworów złośliwych oraz chłoniaków jelita cienkiego. Pozajelitowymi objawami wyzwalanymi przez gluten są opryszczkowe zapalenie skóry, trwałe uszkodzenia szkliwa zębów, osteopenia, zaatakowanie wątroby, kardiomiopatia, bezpłodność, ataksja oraz epilepsja z uwapnieniami mózgowymi. Biopsja jelita cienkiego jest podstawą w diagnozowaniu celiakii. Oprócz zaniku kosmków i ukrytej hiperplazji, typową cechą zmian patologicznych śluzówki jelita wywoływanych glutenem jest duża gęstość wewnątrznabłonkowych limfocytów T γδ+. Jednakże biopsja jest inwazyjnym narzędziem diagnostycznym i nie nadaje się dla celów skriningu. Pewne autoprzeciwciała surowicy, tzn. przeciwciała retikulinowe i endomysialne, są indukowane glutenem i skierowane przeciwko własnej tkankowej pozakomórkowej macierzy pacjenta i są one wysoce swoiste dla celiakii. Typowo przeciwciała te znajduje się w klasie IgA, ale pacjenci z celiakią z selektywnym niedoborem IgA produkują podobne przeciwciała w klasie IgG (Collin P e i in. Scand J Gastroenterol 1992;27:367-71). Ostatnio, zidentyfikowano enzym transglutaminazę typu tkankowego lub komórkową (ttg, EG , określaną dalej, jako transglutaminaza), jako docelowy autoantygen dla zarówno autoprzeciwciał endomysialnych jak i retikulinowych. Test serologiczny oparty na wykrywaniu tych przeciwciał może być zastosowany do identyfikacji pacjentów z umiarkowanymi lub nietypowymi objawami oraz pośród pacjentów cierpiących na choroby pokrewne, a nawet w całej populacji. Znajdowanie przypadków przez skrining stało się kluczowe w diagnozowaniu enteropatii glutenowej w ostatnich latach, a niektóre kraje rozpoczęły nawet masowy skrining populacji w wieku szkolnym. Gromadzą się dowody, że spektrum chorób glutenozależnych jest szersze niż klasyczna enteropatia glutenowa i może przedstawiać powszechny problem opieki zdrowotnej. Wiarygodne i powtarzalne wykonanie tych testów na przeciwciała osiągnięto obecnymi sposobami jedynie w wyspecjalizowanych laboratoriach. Oznaczenia przeciwciał retikulinowych i endomysialnych wymagają substratów zamrożonej tkanki, sprzętu immunofluorescencyjnego oraz wysoko wykwalifikowanego personelu do wzrokowej oceny wyników wiązania przeciwciał. Ważne jest, że testy ELISA oparte na transglutaminazie dają obserwatorowi niezależne i ilościowe wyniki. Jednakże, ich najważniejszym składnikiem jest antygen transglutaminazy, który korzystnie powinien być możliwie najbardziej podobny do naturalnego ludzkiego autoantygenu. Indukowana Ca 2+ katalitycznie aktywna konformacja wydaje się być korzystnym antygenem rozpoznawanym przez większość autoprzeciwciał

3 PL B1 3 pacjentów, ale swoistość epitopowa indywidualnych pacjentów może się różnić. Trudno jest utrzymać prawidłowe pofałdowanie enzymu podczas oczyszczania z tkanek zwierzęcych lub uzyskiwać je podczas wytwarzania białek rekombinowanej transglutaminazy. W dodatku transglutaminaza jest bardzo wrażliwa na przechowywanie nawet w -40 C i stąd ciągła potrzeba odpowiednich i świeżych partii antygenu może spowodować, że test na przeciwciała przeciwko transglutaminazie będzie bardzo drogi. Komercyjnie jest dostępna jedynie oczyszczona tkankowa transglutaminaza z wątroby świnki morskiej (Sigma), ale ta transglutaminaza gryzonia okazała się mniej wrażliwa przy wykrywaniu przeciwciał w celiakii niż naturalny ludzki enzym przygotowany z ludzkich czerwonych krwinek (Hansson i in., J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000; 30: ). Istnieje potrzeba prostego serologicznego testu skriningowego dla celiakii i pokrewnych glutenozależnych jednostek chorobowych. Taki test byłby korzystnie wykonywany przy powstaniu pierwszego podejrzenia stanu celiakii lub innej glutenozależnej jednostki chorobowej, więc w początkowym stadium lub przy skriningu masowym. Powinien być także możliwy do zastosowania w dalszym postępowaniu z już zdiagnozowanymi pacjentami. Niniejszy wynalazek dostarcza teraz szybkiego, taniego i dokładnego sposobu diagnozowania chorób glutenozależnych. Właśnie nieoczekiwanie stwierdzono, że antygen ttg transglutaminazy nienaruszonej ludzkiej tkanki znajduje się w próbkach pełnej krwi wewnątrz czerwonych krwinek (RBC) w ilości wystarczającej, żeby służyła, jako antygen w oznaczaniu autoprzeciwciał przeciwko ttg. Stąd nie ma potrzeby dodawania zewnętrznej transglutaminazy dla mierzenia krążących autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie w krwiobiegu. Antygen musi tylko być uwolniony z RBC przez hemolizę, która umożliwia transglutaminazie i swoistych przeciwciałom przeciw transglutaminazie reakcję w fazie ciekłej samej próbki w celu utworzenia kompleksów autoantygen-autoprzeciwciało. Inną korzyścią uzyskaną przez stosowanie autoantygenów w oznaczeniu jest to, że test nie jest wrażliwy na osobnicze zmiany w antygenach ttg u różnych osób. Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania celiakii (CD) lub opryszczkowego zapalenia skóry w próbce krwi pacjenta, w którym (i) hemolizuje się próbkę krwi zawierającą czerwone krwinki (RBC) w celu uwolnienia transglutaminazy tkankowej (ttg) z czerwonych krwinek (RBC) w próbce, (ii) hemolizowaną próbkę pozostawia się przez czas wystarczający do uwolnienia ttg w celu przereagowania z autoprzeciwciałami anty-ttg w próbce z wytworzeniem kompleksu antygen-przeciwciało, (iii) (iv) kontaktuje się próbkę z białkiem wychwytującym ttg i wykrywa się wychwycony kompleks antygen-przeciwciało w teście immunologicznym, przy czym obecność kompleksu wskazuje na tę chorobę. Korzystnie kompleks antygen-przeciwciało jest wychwytywany do stałego podłoża przez białko wychwytujące ttg, a wychwycony kompleks wykrywa się za pomocą testu immunologicznego. Korzystnie białko wychwytujące ttg jest przeciwciałem anty-ttg. Korzystnie kompleks antygen-przeciwciało jest wychwytywany przez ludzką IgG anty-ttg. Korzystniej przeciwciało wychwytujące jest mieszaniną, co najmniej dwóch ludzkich przeciwciał IgG o różnej swoistości epitopowej uzyskanych od pacjentów z niedoborem IgA chorujących na celiakię. Korzystnie też kompleks antygen-przeciwciało jest wychwytywany przez fibronektynę, przeciwciało przeciwko fibronektynie lub żelatynę. Korzystnie test immunologiczny jest płytkowym testem immunoenzymatycznym fazy stałej (ELISA). Korzystnie w sposobie i) próbkę krwi pełnej hemolizuje się przez zamrażanie i rozmrażanie, ii) iii) iv) próbkę pozostawia się na czas wystarczający na wytworzenie kompleksu antygen-przeciwciało, próbkę kontaktuje się z IgG anty-ttg na stałym podłożu, i kompleksy antygen-przeciwciało wychwycone przez IgG anty-ttg na podłożu stałym wykrywa się za pomocą ELISA stosując anty-przeciwciała przeciwko ludzkim IgA. Wynalazek dalej obejmuje zastosowanie transglutaminazy tkankowej (ttg) uwolnionej z czerwonych krwinek (RBC) próbki krwi w oznaczeniu do wykrywania w tej próbce autoprzeciwciał anty- -ttg, przy czym obecność tych autoprzeciwciał wskazuje na chorobę glutenozależna.

4 4 PL B1 W zakres wynalazku wchodzi również sposób wykrywania celiakii (CD) lub opryszczkowego zapalenia skóry w zhemolizowanej próbce krwi pacjenta, w którym (i) kontaktuje się zhemolizowaną próbkę krwi pacjenta z białkiem wychwytującym transglutaminazę tkankową (ttg) w celu wychwycenia kompleksu antygen- -przeciwciało wytworzonego między ttg uwolnioną z czerwonych krwinek krwi podczas hemolizy i autoprzeciwciałami anty-ttg w próbce, i (ii) wykrywa się wychwycony kompleks antygen-przeciwciało w teście immunologicznym, przy czym obecność kompleksu antygen-przeciwciało wskazuje na tę chorobę. Krótki opis rysunków Na figurze 1 przedstawiono IgA pacjenta specyficzne wobec transglutaminazy mierzone za pomocą testu krwi pełnej, w którym stosuje się hemolizowane próbki krwi oraz przeciwciała wychwytujące klasy IgG anty-ttg unieruchomione na płytce do testu ELISA. Związane IgA zmierzono za pomocą przeciwciał anty-iga skoniugowanych z peroksydazą. Wyniki podano w jednostkach arbitralnych (AU), jako procent gęstości optycznej zmierzonej z dodatnią próbką odniesienia i przedstawiono wykres dla pacjentów z nieleczoną, leczoną lub latentną celiakią (CD) oraz dla grupy kontrolnej. Na figurze 2 przedstawiono wyniki uzyskane dla próbek krwi pełnej pacjentów z celiakią (CD) i kontroli z użyciem króliczych przeciwciał wychwytujących przeciw fibronektynie. Wyniki podane są, jako gęstość optyczna. Na figurze 3 przedstawiono ilości transglutaminazy wychwycone na płytce ELISA z próbek testowych krwi pełnej przez przeciwciała IgG anty-ttg występujące przy celiakii. Transglutaminazę zmierzono stosując monoklonalne przeciwciała CUB Wyniki podane są, jako gęstości optyczne. Na figurze 4 przedstawiono badanie układu wychwytywania na swoistość wobec transglutaminazy. Zastosowano przeciwciała wychwytujące (ludzkie IgG lub monoklonalne mysie IgG) specyficzne i niespecyficzne wobec transglutaminazy i przeprowadzono inkubację typu kanapkowego z normalnym antygenem transglutaminazy z czerwonych krwinek i próbkami surowicy pacjenta (15 pacjentów z opryszczkowym zapaleniem skóry i 15 z grupy kontrolnej). Tabela wskazuje, które składniki były zawarte w różnych układach wychwytywania, a znajdujące się odpowiednio powyżej słupki pokazują wartości gęstości optycznej uzyskane dla każdego z układów. Na figurze 5 przedstawiono korelację wartości gęstości optycznej uzyskanych z zastosowaniem próbek krwi pełnej (osocze z dodatkiem cytrynianu + rekonstytuowane własne RBC z dodatkiem cytrynianu) i antygenu transglutaminazy czerwonych krwinek w układzie typu kanapkowego z następującą inkubacją z próbkami osocza pacjenta. W jednym układzie rekonstytuowano osocze pacjentów i lizat czerwonych krwinek i dodano razem do występujących w celiakii przeciwciał wychwytujących anty-ttg. W innych układach dodano normalny lizat czerwonych krwinek lub lizat własnych czerwonych krwinek pacjenta na płytki opłaszczone tym samym rodzajem przeciwciał wychwytujących. Do celów kontrolnych dodano próbki osocza bez czerwonych krwinek. Wyniki podane są, jako gęstość optyczna. Na figurze 6 przedstawiono wyniki testu kapilarnego z heparyną (1-2), lamininą (3-4), kolagenem (5-6) i żelatyną (7-8) jako związkami wychwytującymi i gęstości optyczne uzyskane przy użyciu zhemolizowanych próbek krwi pełnej od pacjentów z celiakią (n = 10, kolumny 1,3,5,7) i grupy kontrolnej (n = 12, kolumny 2,4,6,8), gdy heparynę (1-2), lamininę (3-4), kolagen (5-6) i żelatynę (7-8) unieruchomiono na płytkach do testu ELISA i zastosowano jako związki wychwytujące. Związane IgA zmierzono stosując sprzężone z peroksydazą przeciwciała anty-iga. Te same symbole oznaczają te same próbki w różnych testach. Stosowany tu termin choroba glutenozależna, dotyczy dowolnej glutenozależnej jednostki chorobowej lub zaburzenia, które są związane z autoprzeciwciałami przeciwko transglutaminazie tkankowej ttg. Choroby glutenozależne często powodują enteropatię, a najbardziej znanymi chorobami glutenozależnymi są celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry. Jednak, obecnie wiadomo, że istnieją również choroby glutenozależne bez objawów enteropatii. Stąd, lepszym wskaźnikiem choroby glutenozależnej jest występowanie autoprzeciwciał przeciw ttg. Białko wychwytujące ttg wspomniane tutaj oznacza dowolne białko zdolne do wiązania kompleksu ttg-anty-ttg lub związek związany z tym kompleksem, taki jak fibronektyna. Korzystnie, białko wychwytujące ttg jest przeciwciałem przeciwko ttg lub fibronektyną, o której wiadomo, że wiąże ttg. Może to być nawet przeciwciało przeciwko fibronektynie, które jest zdolne do wychwytywania kompleksu ttg-anty-ttg, ponieważ ten kompleks wiąże również fibronektynę obecną w próbce.

5 PL B1 5 Zatem przeciwciało przeciwko fibronektynie wiąże się z fibronektyną z utworzonego kompleksu fibronektyna-ttg-anty-ttg. Powyższy kompleks może być także wychwycony przez żelatynę. Dobre rezultaty uzyskuje się przy użyciu ludzkiej IgG anty-ttg otrzymanej od pacjentów z niedoborem IgA jako białka wychwytującego ttg. Korzystnie, stosuje się mieszaninę, co najmniej dwóch takich przeciwciał IgG o różnej swoistości epitopowej. Środki do oznaczania kompleksu antygen-przeciwciało obejmują dowolne reagenty konieczne do wskazania tworzących się kompleksów. Środki te mogą zasadniczo składać się ze środków do wychwytywania kompleksu i środków do wykrywania wychwyconego kompleksu. Środki do wykrywania kompleksu są korzystnie reagentami koniecznymi do płytkowego testu immunoenzymatycznego fazy stałej (ELISA). W jednym wykonaniu wynalazku środki wychwytujące obejmują przeciwciała anty- -ttg przyłączone do stałego podłoża, a środki wykrywające obejmują znakowane przeciwciała anty- -IgA oraz reagenty konieczne do wykrywania znacznika. Próbkę krwi pobiera się od pacjenta podejrzanego o nietolerancję glutenu. Próbka krwi do testowania powinna zawierać czerwone krwinki, które są zhemolizowane. Hemoliza może być przeprowadzona w dowolny konwencjonalny sposób, w którym czerwone krwinki są rozrywane tak, że uwalnia się ttg. Zamrażanie i rozmrażanie jest jedną możliwością, a zastosowanie roztworu hipotonicznego, np. wody, jest innym rozwiązaniem. Wynalazek dotyczy udoskonalonego oznaczania wiązania przeciwciała do diagnozy, diagnozy różnicującej, skriningu oraz dalszego badania genetycznej nietolerancji glutenu, w tym celiakii, opryszczkowego zapalenia skóry, jednostek chorobowych, którym towarzyszy wrażliwość na gluten oraz cech celiakii charakteryzowanych przez wytwarzanie przeciwciał przeciwko transglutaminazie. Nienaruszony ludzki antygen transglutaminazy można znaleźć wewnątrz czerwonych krwinek (RBC) w próbkach krwi pełnej pacjenta i nie ma potrzeby dodawania transglutaminazy z zewnątrz w celu zmierzenia autoprzeciwciał przeciw transglutaminazie w krwiobiegu. Antygen musi być tylko uwolniony z RBC przez hemolizę, która umożliwia reakcję transglutaminazy i przeciwciał specyficznych wobec transglutaminazy w fazie ciekłej samej próbki. Następnie kompleksy antygen-przeciwciało są wychwytywane na podłożu stałym przez odpowiednie przeciwciała wychwytujące, białka (np. fibronektynę) lub substancje chemiczne skierowane na antygen transglutaminazy tkankowej. Po wymyciu składników niezwiązanych, składniki związane mogą być zmierzone sposobami immunochemicznymi. W innym wykonaniu wynalazku zawartość transglutaminazy w czerwonych krwinkach pacjenta lub jednego z innych związków związanych z transglutaminazą, takich jak na przykład fibronektyną, mierzono w oparciu o tę samą zasadę. Oznaczenie wiązania białek jest korzystnie oznaczeniem immunologicznym wybranym spośród następujących: test radio-immunologiczny (RIA), płytkowy test immunoenzymatyczny fazy stałej (ELI- SA), test fluoroimmunologiczny (FIA), test radiometryczny (IRMA), test immunoenzymometryczny (lema), test immunoluminescencji i test immunofluorescencji (Madersbacher S, Berger P. Antibodies and immunoassays. Methods 2000;21:41-50). Sposób według niniejszego wynalazku może być stosowany także do prostych układów wykrywania koloru (na przykład Nunc-Immuno Stick), które można stosować przy łóżku pacjenta lub w gabinetach lekarskich. Wymaga on tylko mikrolitrów pełnej krwi i dlatego może być przeprowadzony także z krwi kapilarnej uzyskanej przez nacięcie palca i nie ma potrzeby otrzymywania krwi żylnej lub surowicy. P r z y k ł a d 1 Materiały i sposoby Pacjenci Próbki pobrano w Heim Pal Children's Hospital, Budapeszt, od pacjentów poddawanych biopsji jelit z powodu podejrzenia celiakii (CD) lub opryszczkowego zapalenia skóry (DH), jak również od leczonych pacjentów, u których wcześniej zdiagnozowano te choroby. CD zdiagnozowano według aktualnych kryteriów Europejskiego Stowarzyszenia Pediatrycznej Gastroenterologii, Hepatologii i Żywienia, obejmujących demonstrację zaniku kosmków jelitowych w histologii i wyraźną poprawę kliniczną na diecie bezglutenowej oraz wykluczenie innych enteropatii. DH zdiagnozowano za pomocą bezpośredniego badania immunofluorescencyjnego biopsji skóry przez obecność złogów ziarnistej IgA w brodawkach warstwy skóry właściwej nieobjętej procesem chorobowym przyległej do skóry z widocznymi zmianami patologicznymi. W pierwszym doświadczeniu zbadano próbki od 84 pacjentów wrażliwych na gluten (51 nieleczonych, w tym 5 nieleczonych z DH, 6 z postacią latentną choroby, 27 na diecie bezglutenowej) ze średnią wieku 4,7 lat (przedział 1-31) oraz od 10 pacjentów bez celiakii

6 6 PL B1 z grupy kontrolnej z normalną strukturą kosmków jelitowych. Dla celów kontrolnych użyto przypadkowych próbek szpitalnych dostarczonych do badania gazometrii we krwi (n = 38). Wiek grupy kontrolnej wynosił 0,4-13 lat. Dalsze doświadczenia przeprowadzono na próbkach od dodatkowych 15 pacjentów z CD, 15 z DH i 42 z grupy kontrolnej. Manipulowanie próbkami Próbki krwi pełnej zebrano do heparynizowanych rurek kapilarnych (Clinitubes Radiometer A/S, Kopenhaga, Dania), zamieszano mieszadłem magnetycznym i uszczelniono na obu końcach nakładkami. Następnie próbki hemolizowano przez zamrażanie i przechowywano aż do badania w temperaturze -20 C lub poniżej. Do początkowego badania napełniano kapilary zarówno krwią żylną jak i krwią kapilarną uzyskaną przez nakłucie palca. Badania kontrolne przeprowadzono na krwi żylnej zebranej w probówkach (Vacutainer, Becton Dickinson, Meylan, Francja) z EDTA lub cytrynianem sodu. Te próbki także zamrożono, albo po pobraniu, albo osocze i czerwone krwinki zamrożono oddzielnie po odwirowywaniu przez 5 minut przy 4000 obr./min. Wychwytywanie przeciwciał w celiakii oraz badanie za pomocą ELISA W czasie badania, zamrożone próbki krwi pełnej rozmrożono, ponownie zamieszano, pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut i rozcieńczono w 0,15 M solą fizjologiczną zbuforowaną 0,05 M TRIS ph 7,4 zawierającą 10 mm EDTA i 0,1% Tween-20 (TTBS). Doświadczenia przeprowadzono stosując do rozcieńczania inne roztwory, włącznie z wodą destylowaną, zbuforowaną TRIS-em solą fizjologiczną z 2,5 lub 5 mm CaCl 2 oraz roztwory zawierające albuminę lub zwykłą surowicę gatunku (królik), w którym wytworzono drugorzędowe przeciwciała. Płytki mikrotitracyjne (Nunc Immuno-Plate Maxisorp, Nunc A/S Roskilde, Dania) opłaszczono mieszaniną dwóch przeciwciał klasy IgG występujących w celiakii o różnej swoistości epitopowej, uzyskanych od pacjentów z aktywną celiakią z niedoborem IgA i wysoce dodatnimi przeciwciałami klasy IgG endomysjalnymi i przeciw transglutaminazie. Odpowiednie rozcieńczenia próbek surowic wychwytujących z celiakią wynosiły 1:1000 oraz 1:2000 w 0,03 M buforze wodorowęglanowym, ph 9,6 i naniesiono je na płytkę na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemyto trzykrotnie w TTBS. Nie zastosowano dalszego blokowania płytek za pomocą albuminy surowicy bydlęcej. Płytki inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z rozcieńczonymi próbkami krwi pełnej. Po dokładnych przemyciach w TTBS, zmierzono związane przeciwciała pacjenta klasy IgA stosując znakowane peroksydazą królicze przeciwciała przeciwko ludzkiej IgA (DAKO A/S, Glostrup, Dania) rozcieńczone 1:2000 w TTBS. Kolor wywołano stosując 1 mg/ml dichlorowodorku o-fenyloenodiaminy (DAKO) z 0,06% H 2 O 2 w 0,1 M cytrynianie sodu, ph 4,2 i odczytano spektrofotometrycznie przy 450 nm. W niektórych doświadczeniach, reakcję ELISA zatrzymywano stosując 2,5 M H 2 SO 4, a absorbancję mierzono również przy 492 nm. Próbki przebadano w dwóch powtórzeniach. Każde podejście obejmowało znaną próbę dodatnią i ślepe próbki. Stężenie przeciwciała podano zarówno w postaci gęstości optycznej jak i w jednostkach arbitralnych obliczonych, jako procent dodatniej próbki odniesienia. W dalszych doświadczeniach zbadano również inne przeciwciała wychwytujące, w tym, kozie przeciwciała poliklonalne przeciwko transglutaminazie tkankowej (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) i różne mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko transglutaminazie tkankowej (CUB7402 i TG 100 z Neomarkers Fremont, CA) jak również inne przeciwciała klasy IgG od pacjentów. Dla unieruchomienia przeciwciał monoklonalnych, najpierw płytkę opłaszczono króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko mysiej IgG1 (ICN Biomedicals Inc. Aurora, OH) rozcieńczonym w stosunku 1:500 w buforze wodorowęglanowym, a monoklonalne przeciwciała dodano w TTBS. Transglutaminaza ma miejsce wiążące fibronektynę w części N-końcowej i może być nawet oczyszczona z RBC przez zastosowanie fibronektyny (Radek i in. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:3152-6). Dlatego płytki ELISA opłaszczone ludzką fibronektyną (z Sigma F 2006, rozcieńczoną w stosunku 1:1000 w buforze wodorowęglanowym, ph 9,6) również przebadano na wychwytywanie. Ponieważ ludzkie osocze już zawiera trochę fibronektyny, jako przeciwciał wychwytujących użyto także króliczych przeciwciał przeciwko ludzkiej fibronektynie (z DAKO, rozcieńczone w stosunku 1:2000 w buforze wodorowęglanowym, ph 9,6). Zastosowanie przeciwciał wychwytujących innych niż ludzka IgG wprowadzono, aby umożliwić badanie przeciwciał klasy IgG przeciwko transglutaminazie stosując tę samą zasadę przy użyciu drugorzędowych przeciwciał przeciwko ludzkim IgG zamiast ludzkich IgA.

7 PL B1 7 Badanie obecności i ilości transglutaminazy wychwyconej na płytkach ELISA Ilość transglutaminazy z czerwonych krwinek związanej na płytce sprawdzono w oddzielnych studzienkach opłaszczonych przeciwciałami wychwytującymi i inkubowano ze zhemolizowanymi rozcieńczeniami krwi pełnej. Związaną transglutaminazę mierzono stosując CUB7402, TG-100 monoklonalne lub poliklonalne mysie przeciwciała przeciwko transglutaminazie tkankowej, a następnie przeciwciała królicze przeciw mysim immunoglobulinom skoniugowane z peroksydazą (DAKO). Kolor wywołano podobnie jak przy wykrywaniu związanego IgA. Badanie swoistości wychwytywania antygenu/przeciwciała Testy kontrolne dla testu komórek krwi pełnej przeprowadzono stosując próbki osocza lub surowicy (rozcieńczone do podobnych końcowych stężeń) od pacjentów bez lub z dodanym lizatem normalnych czerwonych krwinek rozcieńczonym w stosunku 1:20. Do dalszego badania swoistości wychwytu jako antygen zastosowano surowy lizat czerwonych krwinek z normalnych czerwonych krwinek krwi dawców rozcieńczony 1:20-1:40, a próbki surowicy pacjenta dodano w postaci kanapkowego ELISA po przemyciu lizatu niezwiązanych czerwonych krwinek. Wykrycie związanego IgA przeprowadzono jak w ELISA krwi pełnej. Kanapkowy typ ELISA surowicy opisano w abstrakcie przedstawionym na ósmym Międzynarodowym Sympozjum na Temat Celiakii w Neapolu w 1999 r. Swoistość układu kanapkowego ELISA dla pomiarów transglutaminazy zbadano dalej stosując 15 próbek DH i 15 kontrolnych. Jako przeciwciała wychwytujące zastosowano IgG występujące przy celiakii, IgG nie związane z celiakią od pacjenta z niedoborem IgA, monoklonalne mysie przeciwciała przeciwko transglutaminazie i nieswoiste mysie przeciwciała monoklonalne klasy IgG1 (DAKO). IgG pacjentów z celiakią także wybiórczo naniesiono na płytkę stosując mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu IgG (Roztwór Enzym-anty-IgG do zestawu Pharmacia Gluten IgA EIA, Pharmacia Diagnostics AB; Uppsala, Szwecja). W celu unieruchomienia przeciwciał monoklonalnych najpierw płytkę opłaszczono poliklonalnym króliczym przeciwciałem przeciwko mysiej IgG1 (ICN) rozcieńczonych w stosunku 1:500 w buforze wodorowęglanowym, a przeciwciała monoklonalne dodano w TTBS. Badanie przeciwciała przeciw transglutaminazie z surowicy za pomocą antygenu gryzonia Wykrywanie przeciwciała przeciw transglutaminazie z surowicy za pomocą antygenu transglutaminazy gryzonia (Sigma) przeprowadzono według Sulkanen i in., Gastroenterology 1998;115: Badanie EMA Przeciwciała przeciwendomysialne z surowicy zmierzono za pomocą testu immunofluorescencji pośredniej stosując nieutrwalone zamrożone skrawki małpiego przełyku 5-7 mikrometrowej grubości (Korponay-Szabo i in. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1997; 25:56-63). Próbki surowicy najpierw badano przy rozcieńczeniu 1:2,5 i 1:10 w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) i, jeśli wynik był dodatni, miareczkowano dalej w rozcieńczeniach 1:20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, Skrawki inkubowano z rozcieńczeniami surowicy i po przemyciu PBS, wykrywano związane przeciwciała IgA pacjenta za pomocą króliczych przeciwciał znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny swoistych dla ludzkiej IgA (DAKO). Wynik dodatni oceniał wykwalifikowany obserwator na podstawie obecności IgA związanej ze strukturami endomysialnymi i włóknami tkanki łącznej podepidermalnej. Wyniki Wykonanie testu na celiakię z krwi pełnej Test przeprowadzono na próbce krwi pełnej pacjenta rozcieńczonej w stosunku 1:10-1:50. Rozcieńczenie 1:25 wybrano do dalszych badań. Wartości absorbancji dla IgA pacjenta związanej na płytce były znacząco wyższe u pacjentów z nieleczonym CD (gęstość optyczna przy 450 nm 0,417±0,245) niż w grupie kontrolnej (0,094+0,045), p<0,001. Pacjenci leczeni oraz pacjenci w latentnej fazie choroby mieli nieco zwiększone średnie wartości, odpowiednio 0,145±0,060 i 0,141±0,043. Wyniki te nie różniły się znacząco od grupy kontrolnej. Biorąc pod uwagę, że przeprowadzono kilka kolejek badań, dla ustalenia dodatniego poziomu odcięcia, wyniki podano w jednostkach arbitralnych (AU) wyliczonych dla dodatniej próbki odniesienia. Poziom odcięcia, który oznaczał wszystkich pacjentów z nieleczonym CD, wynosił 23 AU. Tylko dla jednego pacjenta z grupy kontrolnej wartości AU przekroczyły ten poziom odcięcia. Stąd swoistość testu wynosiła 97,9% i wyraźnie odróżniono pacjentów z aktywną chorobą od grupy kontrolnej (fig. 1). Średnia AU dla pacjentów nieleczonych wynosiła 66,3 AU (przedziały zaufania 95%, Cl: 55,1-77,4) i dla pacjentów leczonych 15,6 AU (Cl:11,9-19,3), dla pacjentów z fazą latentną 17,9 AU (Cl:11,8-23,8). Średnia dla grupy kontrolnej wynosiła 7,2 AU (Cl:4,8-9,7).

8 8 PL B1 Badania pilotażowe na 12 próbkach od pacjentów pokazały, że również królicze przeciwciała przeciwko fibronektynie są zdolne do skutecznego wychwytywania przeciwciał przeciwko transglutaminazie pacjenta przypuszczalnie przez antygen transglutaminazy i fibronektynę w próbce (fig. 2). Jeden z pacjentów z grupy kontrolnej (nie poddany biopsji) wykazał wysokie O.D. i będzie dalej badany na możliwe CD. Płytki opłaszczone fibronektyną także dały wynik dodatni, ale wartości absorbancji były niższe i mniej swoiste. Badanie ilości związanej na płytce transglutaminazy Przeciwciało monoklonalne CUB 7402 wykryło porównywalne ilości transglutaminazy w studzienkach inkubowanych z próbkami od pacjentów z celiakią lub z grupy kontrolnej (fig. 3). Wartość P wyniosła 0,16 i była nieistotna. Badanie swoistości antygenu i wychwytywania przeciwciał Próbki surowicy lub osocza pacjentów dodane do przeciwciał wychwytujących bez czerwonych krwinek nie dały swoistego wyniku dodatniego. Gdy do płytek opłaszczonych przeciwciałami wychwytującymi dodano lizat erytrocytów, a próbki surowicy lub osocza tylko dodano po wymyciu niezwiązanych składników komórek krwi (ELISA typu kanapkowego), zaobserwowano swoisty wynik dodatni w przypadku próbek od pacjentów z enteropatią glutenozależną. Kanapkowy układ ELISA wykorzystano następnie do badania 15 próbek z opryszczkowym zapaleniem skóry i 15 próbek kontrolnych. Nie zaobserwowano żadnych swoistych wartości absorbancji, jeśli pominięto albo lizat erytrocytów albo przeciwciała wychwytujące swoiste dla transglutaminazy oraz zastąpiono nieswoistymi przeciwciałami monoklonalnymi lub ludzką surowicą z niedoborem IgA nie związaną z celiakią (fig. 4). Selektywne opłaszczenie płytki frakcją IgG z surowicy przy celiakii charakteryzującej się niedoborem IgA przez monoklonalne przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG, dało podobny wynik dodatni (gęstość optyczna: 0,538±0,233) jak przy opłaszczaniu wysoce rozcieńczoną całkowitą surowicą przy celiakii (0,735±0,304, nie istotne, p = 0,07). Porównanie wyników testu krwi pełnej z wynikami testu typu kanapkowego W jednym układzie zamrożone oddzielnie osocze z cytrynianem i czerwone krwinki pacjenta (n = 15) rekonstytuowano w podobnych proporcjach jak w zwykłym hematokrycie (60:40) i dodano razem na płytki opłaszczone przeciwciałami IgG występującymi przy celiakii. W innych układach dodano najpierw na płytkę prawidłowe RBC lub RBC pacjentów, a próbki osocza inkubowano po wymyciu niezwiązanych RBC (test typu kanapkowego). Wyniki w obu rodzajach układów dobrze korelowały (fig. 5). Porównanie wyników testu krwi pełnej przy celiakii z wynikami konwencjonalnego testu przeciwciała Dodatnie wyniki testu krwi pełnej silnie korelowały z wynikami testu EMA i wynikami testu transglutaminazy gryzonia otrzymanymi dla tych samych nieleczonych pacjentów z celiakią i kontroli. Jeden pacjent z celiakią miał niejednoznaczne wyniki EMA i graniczne wyniki badania transglutaminazy gryzonia testem ELISA. Pacjent ten miał wyraźnie dodatni wynik testu krwi pełnej przy zastosowaniu jej własnego antygenu. Dodatnie dla EMA surowicy Dodatnie dla przeciwciał surowicy reagujących z transglutaminaza gryzonia Dodatnie w teście krwi pełnej Nieleczona CD lub DH 50/51 51/51 51/51 Leczona CD 0/27 3/27 5/27 Latentna CD 5/6 4/6 2/6 Grupa kontrolna 0/26* 1/26* 1/48 *Przebadano tylko pacjentów z grupy kontrolnej z dostępnymi próbkami surowicy P r z y k ł a d 2 Zastosowanie alternatywnych białek wychwytujących Przebadano, czy inne białka, o których wiadomo, że wiążą się z fibronektyną osocza, również nadawałyby się do wychwytywania endogennych kompleksów fibronektyna-transglutaminaza-auto- -przeciwciała pacjenta z celiakią znalezionych w hemolizowanych próbkach od pacjenta. Zatem, w dodatkowych doświadczeniach, płytki ELISA opłaszczono heparyną (Noparin 5000 lu/ml, Novo Nordisk A/S, Dania, rozcieńczoną w stosunku 1:5000)/lub lamininą (Upstate, Lake Placid, NY, rozcieńczoną w stosunku 1:120, 12,5 µg/ml) lub kolagenem I (przygotowanym ze ścięgien ogona

9 PL B1 9 szczura według Halttunen i in. Gastroenterology 1996;111: , rozcieńczonym w stosunku 1:20, 80 µg/ml) albo 0,025-0,05% żelatyną (Rousselot, Paryż, Francja) rozpuszczoną w 0,03M buforu wodorowęglanowego, ph 9,6. Następne etapy testów przeprowadzono tak, jak w teście krwi pełnej z ludzkimi przeciwciałami wychwytującymi IgG przeciw transglutaminazie, jak opisano w przykładzie 1. Wyniki przedstawiono na figurze 6. Płytki pokryte heparyną nie dały swoistego wyniku dodatniego z próbkami od pacjentów z celiakią. Wydaje się, że lamininą i kolagen I wychwytują kompleksy przeciwciał związanych z celiakią, ale rozróżnienie między wynikami próbek od pacjentów z celiakią i grupy kontrolnej nie było satysfakcjonujące. Stwierdzono, że żelatyna skutecznie wychwytuje z wysoką gęstością optyczną i swoistością kompleksy autoprzeciwciało-antygen występujące w celiakii. Gęstości optyczne były niezmiennie wyższe od tych zaobserwowanych w teście krwi pełnej, w którym stosowano ludzkie przeciwciała wychwytujące klasy IgG od pacjentów z niedoborem IgA i z celiakią. Badając płytki po wychwyceniu za pomocą monoklonalnego przeciwciała przeciw ttg CUB7402 stwierdzono, że większe ilości transglutaminazy wychwycono na płytki z tych samych próbek krwi pełnej za pomocą żelatyny niż za pomocą ludzkich przeciwciał IgG przeciw transglutaminazie (średnia gęstość optyczna 1,485+/-0,727 versus 0,729+/-0,343). Stąd, mogło być stosowane większe rozcieńczenie próbki, co później zwiększyło rozróżnienie między próbkami od pacjentów z celiakią i kontrolnymi.w dalszych badaniach próbek krwi pełnej od 21 IgA-właściwych pacjentów z celiakią i 62 z grupy kontrolnej z zastosowaniem rozcieńczenia próbek 1:80, gęstości optyczne dla próbek od pacjentów z celiakią wynosiły 0,908±0,0561, a dla grupy kontrolnej wynosiły 0,061±0,0480 gdy mierzono związaną na płytce ludzką IgA przy 492 nm. U pacjentów z leczoną celiakią (n = 21) wykazano średnią wartość 0,198±0,248. Przy poziomie odcięcia, gdzie test ten wykrywał wszystkich nieleczonych pacjentów z celiakią, zaobserwowano 93,5% swoistość. P r z y k ł a d 3 Wykrywanie pacjentów chorych na celiakię z niedoborem IgA Zastosowanie żelatyny, jako związku wychwytującego umożliwiło również pomiar kompleksów antygen-autoprzeciwciało wychwyconych z próbek krwi pełnej od pacjentów z niedoborem IgA mających celiakię, ponieważ to białko wychwytujące nie przeszkadzało w wykrywaniu kompleksów transglutaminaza-autoprzeciwciało, które mogą zawierać tylko IgG, a nie zawierają IgA. Zatem, test krwi pełnej z wychwytywaniem za pomocą żelatyny również został przeprowadzony z reakcją końcową wykrywającą ludzkie przeciwciała klasy IgG związane z płytką za pomocą monoklonalnych przeciwciał przeciwko ludzkiemu IgG (z zestawu Pharmacia Gluten EIA) i anty-mysim przeciwciałom króliczym sprzężonym z peroksydazą (DAKO). W takim układzie, próbki krwi uzyskane od pacjentów z niedoborem IgA z aktywną celiakią (n = 8) z wysoko dodatnimi wynikami testów (średnia gęstość optyczna 0,824±0,284), podczas gdy średnia gęstość optyczna dla grupy kontrolnej w wykrywaniu IgG wynosiła 0,118±0,053. P r z y k ł a d 4 Korelacja z wartościami hematokrytu krwi W celu oceny, czy na przeprowadzenie testu krwi pełnej ma wpływ obecność anemii, co mogłoby zmniejszyć ilości autoantygenu celiakii w próbkach krwi pełnej, podczas pobierania próbek krwi do innych testów klinicznych, zmierzono odpowiednie wartości hematokrytu pacjenta. Gęstości optyczne uzyskane w teście pełnej krwi nie wykazały korelacji z wartościami hematokrytu, ani u pacjentów z celiakią (R = 0,076) ani w całym materiale (R = 0,068). Nawet przy wartościach hematokrytu tak niskich jak 0,277 (ostra anemia) dla próbek od pacjentów z celiakią uzyskano wyniki dodatnie. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wykrywania celiakii (CD) lub opryszczkowego zapalenia skóry w próbce krwi pacjenta, znamienny tym, że (i) hemolizuje się próbkę krwi zawierającą czerwone krwinki (RBC) w celu uwolnienia transglutaminazy tkankowej (ttg) z czerwonych krwinek (RBC) w próbce, (ii) hemolizowaną próbkę pozostawia się przez czas wystarczający do uwolnienia ttg w celu przereagowania z autoprzeciwciałami anty-ttg w próbce z wytworzeniem kompleksu antygen-przeciwciało, (iii) kontaktuje się próbkę z białkiem wychwytującym ttg i

10 10 PL B1 (iv) wykrywa się wychwycony kompleks antygen-przeciwciało w teście immunologicznym, przy czym obecność kompleksu wskazuje na tę chorobę. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kompleks antygen-przeciwciało jest wychwytywany do stałego podłoża przez białko wychwytujące ttg, a wychwycony kompleks wykrywa się za pomocą testu immunologicznego. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że białko wychwytujące ttg jest przeciwciałem anty-ttg. 4. Sposób według zastrz. 1-3, znamienny tym, że kompleks antygen-przeciwciało jest wychwytywany przez ludzką IgG anty-ttg. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało wychwytujące jest mieszaniną, co najmniej dwóch ludzkich przeciwciał IgG o różnej swoistości epitopowej uzyskanych od pacjentów z niedoborem IgA chorujących na celiakię. 6. Sposób według zastrz. 1-2, znamienny tym, że kompleks antygen-przeciwciało jest wychwytywany przez fibronektynę, przeciwciało przeciwko fibronektynie lub żelatynę. 7. Sposób według zastrz. 2-6, znamienny tym, że test immunologiczny jest płytkowym testem immunoenzymatycznym fazy stałej (ELISA). 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że i) próbkę pełnej krwi hemolizuje się przez zamrażanie i rozmrażanie, ii) próbkę pozostawia się na czas wystarczający na wytworzenie kompleksu antygen-przeciwciało. iii) próbkę kontaktuje się z IgG anty-ttg na stałym podłożu, i iv) kompleksy antygen-przeciwciało wychwycone przez IgG anty-ttg na podłożu stałym wykrywa się za pomocą ELISA stosując anty-przeciwciała przeciwko ludzkim IgA. 9. Zastosowanie transglutaminazy tkankowej (ttg) uwolnionej z czerwonych krwinek (RBC) z próbki krwi w teście do wykrywania autoprzeciwciał anty-ttg w powyższej próbce, przy czym obecność tych autoprzeciwciał wskazuje na chorobę glutenozależna. 10. Sposób wykrywania celiakii (CD) lub opryszczkowego zapalenia skóry w zhemolizowanej próbce krwi pacjenta, znamienny tym, że (i) (ii) kontaktuje się zhemolizowaną próbkę krwi pacjenta z białkiem wychwytującym transglutaminazę tkankową (ttg) w celu wychwycenia kompleksu antygen-przeciwciało wytworzonego między ttg uwolnioną z czerwonych krwinek krwi podczas hemolizy i autoprzeciwciałami anty-ttg w próbce, i wykrywa się wychwycony kompleks antygen-przeciwciało w teście immunologicznym, przy czym obecność kompleksu antygen-przeciwciało wskazuje na tę chorobę.

11 PL B1 11 Rysunki

12 12 PL B1

13 PL B1 13

14 14 PL B1

15 PL B1 15

16 16 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)