Sposób wytwarzania preparatu standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d.

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. G01N 33/49 ( ) G01N 33/96 ( ) (54) Sposób wytwarzania preparatu standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 16/04 (73) Uprawniony z patentu: Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa,Katowice,PL Wieczorek Krystyna,Siewierz,PL Grzywak-Kołodziejczyk Teresa,Katowice,PL Grajewska Anna,Katowice-Ochojec,PL Fedczyszyn Wiktor,Studzienice,PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/09 (72) Twórca(y) wynalazku: Krystyna Wieczorek,Siewierz,PL Teresa Grzywak-Kołodziejczyk,Katowice,PL Anna Grajewska,Katowice-Ochojec,PL Wiktor Fedczyszyn,Studzienice,PL PL B1 (74) Pełnomocnik: Stefan Zieliński (57) 1. Sposób wytwarzania preparatu standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d, w którym w jałowo prowadzonym procesie pobraną krew grup: ORh+ i ORh- umieszczoną w płynie konserwującym przechowuje się przez 3-5 dób w temperaturze od +4 C do +10 C w pozycji umożliwiającej sedymentację, po czym znad osadzonych krwinek ściąga się płyn, krwinki przepłukuje się solą fizjologiczną oraz poddaje się procesowi uczulenia za pomocą standaryzowanej surowicy anty-d dodanej, dogodnie w objętości 4:1 a bezpośrednio po tym krwinki inkubuje się, następnie odwirowuje się, ściąga nadsącz i pobiera próbki do badań serologicznych i po uzyskaniu prawidłowego wyniku krwinki zalewa się płynem do przechowywania krwinek z dodatkiem ludzkiej surowicy oraz adeniny i w końcu ampułkuje, znamienny tym, że pobraną krew umieszcza się w płynie zawierającym dodatkowo płyn wzbogacający, który zawiera chlorek sodowy, mannitol, glikozę i adeninę a opłaszczanie krwinek prowadzi się dwuetapowo, przy czym w pierwszym etapie sporządza się szereg rozcieńczeń surowicy wyjściowej zawierającej niekompletne przeciwciała anty-d w zbuforowanej soli fizjologicznej PBS, po czym uczula się krwinki ORh+ 4-krotnie przepłukane roztworem PBS kolejnymi rozcieńczeniami surowicy wyjściowej dogodnie w stosunku 5 objętości surowicy i 2 objętości krwinek w ciągu około 1 godziny w temperaturze 37 C, a w drugim etapie koncentrat krwinek czerwonych ORh+ ORh- w postaci osadu krwinek zalewa się 4-objętościami wystandaryzowanej surowicy anty-d o ustalonej zawartości około 0,3 lu/ml przeciwciał anty-d klasy G i po tym krwinki inkubuje się w łaźni wodnej co najmniej przez 10 min, ale nie dłużej niż 15 min.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d przeznaczonych do kontroli ujemnych testów antyglobulinowych, kontroli aktywności surowicy antyglobulinowej dla wykonania bezpośredniego testu antyglobulinowego zwanego BTA oraz kontroli prawidłowości pracy wirówek samopłuczących. W połowie dwudziestego wieku do serologii grup krwi został wprowadzony test antyglobulinowy, tak zwany test Coombsa, służący do wykrywania auto- i alloprzeciwciał, który do dnia dzisiejszego pozostaje nadal testem z wyboru ze względu na swoją czułość i swoistość. Rozróżniamy dwa rodzaje testu antyglobulinowego: pośredni (PTA) i bezpośredni test antyglobulinowy (BTA). Pośredni test antyglobulinowy stosuje się przed każdym przetoczeniem krwi, w badaniach mających na celu profilaktykę choroby hemolitycznej noworodka (ChHN) oraz w wykrywaniu alloprzeciwciał odpornościowych u biorców i dawców krwi. Bezpośredni test antyglobulinowy przeprowadza się u noworodków podejrzanych o ChHN, u chorych z podejrzeniem niedokrwistości autoimmunohemolitycznej (NAIH), u biorców krwi z powikłaniami poprzetoczeniowymi. Zarówno w BTA jak i PTA dochodzi do aglutynacji przeciwciał zawartych w odczynnikach antyglobulinowych z globulinami zaabsorbowanymi in vivo lub in vitro na powierzchni krwinek czerwonych. Ze względu na swoją czułość BTA i PTA obarczony może być błędem technicznym, dlatego niezbędne są kontrole, które przeprowadza się równolegle z badaniami. Znany jest z polskiego opisu zgłoszenia nr P sposób wytwarzania standaryzowanych krwinek wzorcowych uczulonych surowicą o swoistości anty-d obejmujący uczulanie, inkubowanie i ampułkowanie krwinek, charakteryzujący się tym, że w jałowo prowadzonym procesie pobraną w jednakowej ilości krew grup: ORh+ i ORh- po umieszczeniu w znanym płynie do konserwacji zwanym CPDA wprowadzonym w nadmiarze dogodnie 50% przechowuje się przez 3-5 dób w temperaturze od +4 C do +10 C w pozycji umożliwiającej swobodną sedymentację, po czym znad osadzonych krwinek ściąga się płyn, krwinki dokładnie przepłukuje się solą fizjologiczną oraz poddaje się procesowi uczulenia za pomocą standaryzowanej surowicy anty-d dodanej, dogodnie w objętości 4:1. Bezpośrednio po tym krwinki inkubuje się przez co najmniej 1 h, ale nie dłużej niż 1 h 15', następnie odwirowuje się, ściąga nadsącz i pobiera próbki krwinek do znanej kontroli badań serologicznych. Po uzyskaniu prawidłowego wyniku krwinki obu grup zalewa się płynem do przechowywania krwinek z dodatkiem ludzkiej surowicy i adeniny użytym w proporcji nie mniejszej niż 1:5, a na końcu - ampułkuje mieszając. Krwinki przepłukuje się dogodnie 3-krotnie, dogodnie 10-krotną objętością soli fizjologicznej, inkubuje ze standaryzowaną surowicą anty-d, stanowiąca roztwór o zawartości około 0,5 jm/ml przeciwciał anty-d klasy G. Inkubowanie krwinek prowadzi się dogodnie w łaźni wodnej stosując 3-krotne delikatne poruszenie butelką. Otrzymywane znanym sposobem standaryzowane krwinki wzorcowe uczulone surowicą o swoistości anty-d przeznaczone są do przeprowadzania kontroli aktywności surowicy antyglobulinowej dla wykonania bezpośredniego testu antyglobulinowego. Te krwinki wzorcowe zachowują ważność przez okres 3 miesięcy od daty produkcji. Korzystanie z krwinek pozwala na ułatwienie, skrócenie czasu pracy wykonywania badań i wystandaryzowania testu. W rezultacie uzyskuje się taki sam wynik kontrolny: z krwinkami ORh + (++), a z krwinkami ORh - (-). Niedogodnością znanego sposobu wytwarzania standaryzowanych krwinek wzorcowych uczulonych surowicą o swoistości anty-d jest otrzymywanie krwinek zbyt mocno opłaszczonych przez co zastosowanie ich było ograniczone tylko do przeprowadzania kontroli aktywności surowicy antyglobulinowej dla wykonywania bezpośredniego testu antyglobulinowego. Kontrolę aktywności swoistości odczynnika antyglobulinowego przeprowadza się przy użyciu standardu anty-d, uzyskiwanego w postępowaniu według opatentowanego za nr wynalazku, którym uczula się krwinki Rh+ i Rh- dla wykonania pośredniego testu antyglobulinowego. Stosowanie tych kontroli nie w pełni zabezpiecza przed wynikami fałszywie ujemnymi, które są najczęściej następstwem niedokładnego przemywania krwinek. Używanie w laboratoriach automatycznych wirówek samopłuczących narzuca konieczność sprawdzenia każdego ujemnego wyniku antyglobulinowego. W większości laboratoriów na świecie wprowadzono metodykę, która ma na celu kontrolę ujemnych wyników testów antyglobulinowych. Zasada metody polega na wykazaniu, że w reakcji nieużyty został odczynnik antyglobulinowy, a jego obecność ujawniona jest poprzez dodatnią reakcję z krwinkami słabo uczulonymi przeciwciałami anty-d. Metodyka przygotowania odpowiednio słabo uczulonych krwinek jest skomplikowana, a codzienne ich przygotowanie trwa kilka godzin. W dotychczasowej

3 PL B1 3 praktyce badań serologicznych z uwagi na brak gotowych, słabo uczulonych krwinek wzorcowych nadających się do weryfikacji ujemnych testów antyglobulinowych, kłopotliwość i czasochłonność codziennego ich przygotowania, badań tych przeważnie nie wykonywano. Celem wynalazku jest wyeliminowanie wymienionych niedogodności, a zadaniem opracowanie sposobu wytwarzania preparatu standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d o kilku tygodniowym okresie przechowywania i umożliwiającym ich używanie nie tylko do kontroli aktywności surowicy antyglobulinowej w teście BTA, ale przede wszystkim do kontroli wiarygodności ujemnych wyników wszystkich testów antyglobulinowych, a tym samym zwiększenie bezpieczeństwa leczenia krwią. Wytyczone zadanie rozwiązuje sposób wytwarzania preparatu standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d w którym w jałowo prowadzonym procesie pobraną krew grup: ORh+ i ORh- umieszczoną w płynie konserwującym przechowuje się przez 3-5 dób w temperaturze od +4 C do +10 C w pozycji umożliwiającej sedymentację, po czym znad osadzonych krwinek ściąga się płyn, krwinki przepłukuje się solą fizjologiczną oraz poddaje się procesowi uczulenia za pomocą standaryzowanej surowicy anty-d dodanej, dogodnie w objętości 4:1 a bezpośrednio po tym krwinki inkubuje się, następnie odwirowuje się, ściąga nadsącz i pobiera próbki do badań serologicznych i po uzyskaniu prawidłowego wyniku krwinki zalewa się płynem do przechowywania krwinek z dodatkiem ludzkiej surowicy oraz adeniny i w końcu ampułkuje, charakteryzujący się tym, że pobraną krew umieszcza się w płynie zawierającym dodatkowo płyn wzbogacający, który zawiera chlorek sodowy, mannitol, glikozę i adeninę a opłaszczanie krwinek prowadzi się dwuetapowo, przy czym w pierwszym etapie sporządza się szereg rozcieńczeń surowicy wyjściowej zawierającej niekompletne przeciwciała anty-d w zbuforowanej soli fizjologicznej PBS, po czym uczula się krwinki ORh+ 4-krotnie przepłukane roztworem PBS kolejnymi rozcieńczeniami surowicy wyjściowej dogodnie w stosunku 5 objętości surowicy i 2 objętości krwinek w ciągu około 1 godziny w temperaturze 37 C, a w drugim etapie koncentrat krwinek czerwonych ORh+ ORh- w postaci osadu krwinek zalewa się 4-objętościami wystandaryzowanej surowicy anty-d o ustalonej zawartości około 0,3 lu/ml przeciwciał anty-d klasy G i po tym krwinki inkubuje się w łaźni wodnej co najmniej przez 10 min, ale nie dłużej niż 15 min. Do rozcieńczenia wyjściowej surowicy anty-d stosuje się zbuforowany roztwór soli fizjologicznej PBS o ph 6,6-7 z dodatkiem adeniny w ilości 0,55 g/l. Do wybranego w pierwszym etapie rozcieńczenia surowicy anty-d używa się jałowy zbuforowany roztwór soli fizjologicznej. Otrzymany preparat standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d sposobem według nadaje się bezpośrednio po 3-krotnym przepłukaniu do badań bez skomplikowanej długotrwałej standaryzacji, dzięki temu może być powszechnie stosowany we wszystkich labolatoriach. Preparat uzyskiwany sposobem według wynalazku umożliwia wprowadzenie metody weryfikacji testu antyglobulinowego, który stosowany jest w istocie obowiązkowo w badaniach poprzedzających przetoczenie krwi i w profilaktyce choroby hemolitycznej noworodka (ChHN). Sposób wytwarzania preparatu według wynalazku nieoczekiwanie eliminuje zjawisko alucji, czyli odrywania się przeciwciał stosunkowo słabo opłaszczających krwinki czerwone co pozwala na korzystanie z preparatu do badań przynajmniej przez okres 7 tygodni. Stosowanie preparatu uzyskiwanego sposobem według wynalazku wpływa na podniesienie jakości badań, przez co bezpieczne jest pod względem immunologicznym leczenia krwią i prawidłowość wykonania badań w profilaktyce ChHN. Sposób według wynalazku w praktyce umożliwia kontrolowane opłaszczenie krwinek co powoduje rozszerzenie zastosowania wytworzonych krwinek także do kontroli badań ujemnego testu antyglobulinowego oraz sprawdzania prawidłowej pracy wirówek automatycznych. Przedmiot wynalazku jest bliżej przedstawiony w przykładzie wykonania. P r z y k ł a d: Od dawcy krwi grupy ORh + wlewa się po 100 ml krwi do pięciu worków z płynem konserwującym zwanym CPDA i płynem wzbogacającym zwanym ADSOL. Płyn konserwujący CPDA zawiera cytrynian trójsodowy - Na 2 C 6 H 5 O 7, kwas cytrynowy -C 6 H 8 O 7, dwuwodorofosforan sodowy - NaH 2 PO 4, glukozę i adeninę. Płyn wzbogacający zawiera adeninę, glikozę, chlorek sodowy i mannitol. W worku znajdują się od ml płynu konserwującego CPDA oraz od ml płynu wzbogacającego ADSOL w tym 900 mg chlorku sodowego, 750 mg mannitolu, 27 mg adeniny i 2,2 g jednowodnej dekstrozy. Od dawcy krwi grupy ORh - wlewa się 100 ml krwi do jednego worka z płynem konserwującym CPDA i płynem wzbogacającym ADSOL. Cały proces prowadzi się w warunkach jałowych. Worki z krwią przechowuje się przez 4 doby w temperaturze +6 C w pozycji wiszącej, co pozwala na swobodną sedymentację osadu. Po upływie tego okresu ściąga się płyn znad osadu krwinek, czyli nadsącz i zalewa się roztworem soli fizjologicznej wprowadzonej w 8-krotnej objętości względem objętości

4 4 PL B1 osadu krwinek. Następnie ściąga się nadsącz i operację powtarza się 3-krotnie. Przepłukany osad krwinek poddaje się procesowi uczulenia czyli opłaszczenia krwinek, który jest dwuetapowy. W pierwszym etapie, w dniu poprzedzającym produkcję, przygotowuje się w sposób jałowy wystandaryzowaną surowicę anty-d o ilości od 0,3-0,4 IU/ml przeciwciał anty-d klasy IgG. W tym celu sporządza się szereg rozcieńczeń surowicy wyjściowej zawierającej niekompletne przeciwciała anty-d w zbuforowanej soli fizjologicznej PBS. Następnie uczula się krwinki ORh+ o fenotypie DccEe 4- -krotnie przepłukane roztworem PBS kolejnymi rozcieńczeniami surowicy wyjściowej w stosunku 5 objętości surowicy i 2 objętości krwinek. Proces uczulenia przeprowadza się w ciągu 1 godz. w temperaturze 37 C. Właściwy wybór rozcieńczenia surowicy potwierdza prawidłowy wynik kontroli polegającej na zahamowaniu reakcji uczulonych krwinek ORh+ o fenotypie DccEe z surowicą antyglobulinową i surowicą bez nieregularnych przeciwciał aglutynujących rozcieńczonej 1:1000 roztworem PBS. Badania przeprowadza się w dwóch próbkach dla każdego rozcieńczenia ocenianego na dwa lub trzy plusy. Wynik jest prawidłowy jeżeli: probówka nr 1 krwinki opłaszczone + surowica antyglobulinowa + surowica dawcy rozcieńczona 1: wynik ujemny - probówka nr 2 krwinki opłaszczone + surowica antyglobulinowa + PBS zbuforowany roztwór soli fizjologicznej - wynik dodatni Surowica wyjściowa, natywna ma znaną, wyrażoną w lu/ml ilość przeciwciał anty-d klasy IgG. Na podstawie znanej ilości przeciwciał IgG anty-d w surowicy natywnej ustala się ilość przeciwciał IgG IU/ml w wybranym rozcieńczeniu surowicy, które następnie używa się do uczulenia krwinek ORh+. Do rozcieńczenia surowicy przygotowuje się roztwór PBS o ph 6,6-7, dodaje adeniny w ilości 0,55 g/l i wyjaławia w autoklawie przez 15 min w temp.121 C. Standaryzowaną surowicę anty-d inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Do 1 litra wyjałowionego zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej PBS-A dodaje się określoną ustaloną według pierwszego etapu objętość surowicy natywnej oraz celem stabilizacji surowicę ludzką grupy krwi AB w ilości 10% objętościowego. Przed opłaszczaniem krwinek wykonuje się kontrolę aktywności i swoistości wystandaryzowanej surowicy anty-d z 4% krwinkami ORh+ o fenotypie DccEe i ORh- zawieszonymi w roztworze NaCl o niskiej sile jonowej 0,03 mol/l LISS. Mieszaniny inkubuje się 20 min. w temperaturze 37 C. Po 4-krotnym przepłukaniu probówek z krwinkami ORh+ i ORh- i dokładnym odsączeniu soli fizjologicznej dodaje się surowicy antyglobulinowej i wiruje się s, przy 1000 do 1500 obr./min. Aglutynacja w probówce z krwinkami ORh+ oceniana na ++ świadczy o prawidłowej aktywności standaryzowanej surowicy anty-d. Brak aglutynacji w probówce z krwinkami ORh - świadczy o prawidłowej swoistości standaryzowanej surowicy anty-d. W drugim etapie produkcyjnym wystandaryzowaną surowicą anty-d opłaszcza się koncentrat krwinek czerwonych ORh + i ORh -. Osad krwinek zalewa się 4 objętościami wystandaryzowanej surowicy anty-d o ustalonej zawartości 0,3 lu/ml przeciwciał anty-d klasy G i bezpośrednio po tym inkubuje się w łaźni wodnej przez min. Po inkubacji krwinki odwirowuje się i ściąga nadsącz. Następnie pobiera się próbkę krwinek do oznaczonej probówki i poddaje się dwóm rodzajom kontroli serologicznej. Pierwsza kontrola polega na sprawdzeniu aktywności i swoistości krwinek w BTA z surowicą antyglobulinową i solą fizjologiczną w której za prawidłowy wynik uważa się: w probówce nr 1 krwinki opłaszczone + surowica antyglobulinowa - wynik dodatni na ++ w probówce nr 2 krwinki opłaszczone + roztwór NaCl - wynik ujemny Druga kontrola polega na sprawdzeniu prawidłowego opłaszczenia krwinek przez zahamowanie reakcji z odczynnikiem antyglobulinowym. Badanie przeprowadza się w dwóch probówkach, wynik jest prawidłowy jeżeli: w probówce nr 1 krwinki opłaszczone + surowica antyglobulinowa + roztwór NaCl ze śladem białka - wynik jest ujemny w probówce nr 2 krwinki opłaszczone + surowica antyglobulinowa + roztwór NaCl - wynik jest dodatni na ++ Jeżeli kontrole serologiczne w toku produkcji są prawidłowe to opłaszczone krwinki zalewa się płynem do przechowywania krwinek z dodatkiem ludzkiej surowicy wzbogaconej adeniną w proporcji 1:7.

5 PL B1 5 Wytworzony sposobem według wynalazku preparat standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d przeznaczony jest do wykonywania oznaczenia bezpośredniego testu antyglobulinowego BTA, kontrolnego badania ujemnego testu antyglobulinowego i sprawdzania prawidłowości pracy wirówek automatycznych. Wykonanie oznaczenia bezpośredniego testu antyglobulinowego za pomocą standaryzowanych krwinek wzorcowych ORh+ opłaszczonych przeciwciałami anty-d dokonuje się następująco. Krwinki badane a oraz standaryzowane krwinki wzorcowe opłaszczone (SKWO) b przepłukuje się 4-krotnie większą objętością roztworu soli fizjologicznej. Następnie sporządza się 4% zawiesinę krwinek badanych i krwinek SKWO. Do opisanych probówek a i a 1 wprowadza się po 2 krople 4% zawiesiny krwinek badanych, a do probówek b i b 1 po 2 krople 4% zawiesiny krwinek SKWO. Do probówek a i b dodaje się po 2 krople surowicy antyglobulinowej, a probówki a 1 i b 1 po 2 krople roztworu NaCl. Zawartość probówek inkubuje się przez 5 min. w temperaturze pokojowej, a następnie wiruje się przez 30 sek. z prędkością 150 g (około 1000 obr./min.). Reakcję odczytuje się mikroskopowo poprzez delikatne potrząsanie probówkami. Wynik badania BTA uważa się za prawidłowy (ujemny), jeżeli w oznaczanych probówkach uzyska się: a (-) badanie właściwe a 1 (-) b (++) kontrola b 1 (-) Kontrola badania ujemnego testu antyglobulinowego polega na tym, że pobiera się z ampułki kilka kropel krwinek SKWO, które przepłukuje się 4-krotnie solą fizjologiczną i sporządza się 4% zawiesinę w tym roztworze. Do probówki w której stwierdzono uprzednio ujemny pośredni test antyglobulinowy dodaje się 2 krople 4% zawiesiny krwinek SKWO, odwirowuje się mieszaninę reagentów i odczytuje wynik. Wynik jest prawidłowy, jeżeli w badanej probówce stwierdza się dodatnią + tak zwaną mieszaną aglutynację. Potwierdzony został w tym przypadku ujemny wynik pośredniego testu antyglobulinowego. W postępowaniu sprawdzenia prawidłowej pracy wirówek automatycznych pobiera się z ampułki kilka kropel krwinek SKWO do opisanej probówki, przepłukuje ją 4-krotnie solą fizjologiczną i sporządza 4% zawiesinę w tym roztworze. Przygotowuje się 12 oznakowanych probówek i do każdej dodaje się po 2 krople następujących reagentów: 4% zawiesiny krwinek wzorcowych w roztworze LISS, surowicy dawcy bez przeciwciał nieregularnych. Mieszaniny w probówkach przepłukuje się 4-krotnie w wirówce automatycznej na przykład typu IEC Centra W. Dodaje się po 2 krople surowicy antyglobulinowej, odwirowuje się i odczytuje wynik. Do każdej probówki z ujemnym wynikiem testu antyglobulinowego dodaje się po 2 krople 4% zawiesiny krwinek SKWO. Probówki odwirowuje się i odczytuje wynik. Obecność aglutynacji - dwie populacje krwinek - we wszystkich probówkach świadczy o całkowitym wypłukaniu globulin i prawidłowej pracy wirówki. Brak aglutynacji wskazuje na błędy natury technicznej i wymaga kontroli procesu płukania wirówki. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania preparatu standaryzowanych krwinek wzorcowych opłaszczonych wystandaryzowaną ilością przeciwciał anty-d, w którym w jałowo prowadzonym procesie pobraną krew grup: ORh+ i ORh- umieszczoną w płynie konserwującym przechowuje się przez 3-5 dób w temperaturze od +4 C do +10 C w pozycji umożliwiającej sedymentację, po czym znad osadzonych krwinek ściąga się płyn, krwinki przepłukuje się solą fizjologiczną oraz poddaje się procesowi uczulenia za pomocą standaryzowanej surowicy anty-d dodanej, dogodnie w objętości 4:1 a bezpośrednio po tym krwinki inkubuje się, następnie odwirowuje się, ściąga nadsącz i pobiera próbki do badań serologicznych i po uzyskaniu prawidłowego wyniku krwinki zalewa się płynem do przechowywania krwinek z dodatkiem ludzkiej surowicy oraz adeniny i w końcu ampułkuje, znamienny tym, że pobraną krew umieszcza się w płynie zawierającym dodatkowo płyn wzbogacający, który zawiera chlorek sodowy, mannitol, glikozę i adeninę a opłaszczanie krwinek prowadzi się dwuetapowo, przy czym w pierwszym etapie sporządza się szereg rozcieńczeń surowicy wyjściowej zawierającej niekompletne przeciwciała

6 6 PL B1 anty-d w zbuforowanej soli fizjologicznej PBS, po czym uczula się krwinki ORh+ 4-krotnie przepłukane roztworem PBS kolejnymi rozcieńczeniami surowicy wyjściowej dogodnie w stosunku 5 objętości surowicy i 2 objętości krwinek w ciągu około 1 godziny w temperaturze 37 C, a w drugim etapie koncentrat krwinek czerwonych ORh+ ORh- w postaci osadu krwinek zalewa się 4-objętościami wystandaryzowanej surowicy anty-d o ustalonej zawartości około 0,3 lu/ml przeciwciał anty-d klasy G i po tym krwinki inkubuje się w łaźni wodnej co najmniej przez 10 min, ale nie dłużej niż 15 min. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do rozcieńczenia wyjściowej surowicy anty-d stosuje się zbuforowany roztwór soli fizjologicznej PBS o ph 6,6-7 z dodatkiem adeniny w ilości 0,55 g/l. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że do wybranego w pierwszym etapie rozcieńczania surowicy anty - D używa się jałowy zbuforowany roztwór soli fizjologicznej. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.