(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) IntCl7 C12P 19/62 Urząd Patentowy (22) Data zgłoszenia: Rzeczypospolitej Polskiej (54) Sposób biosyntezy erytromycyny A (73) Uprawniony z patentu: Tarchomińskie Zakłady Farmaceutyczne POLFA Spółka Akcyjna, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 22/98 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/02 (72) Twórcy wynalazku: Andrzej Dalewski, Warszawa, PL Stanisław Pracz, Warszawa, PL Janina Błońska, Warszawa, PL Wanda Brześkiewicz, Warszawa, PL Ludomir Kotala, Warszawa, PL Arkadiusz Ziarko, Warszawa, PL Sławomir Naperty, Warszawa, PL Jan Piorunowski, Łomianki, PL Anna Sokół, Warszawa, PL Wanda Rafalska, Warszawa, PL Kazimierz Dzięgielewski, Warszawa, PL Marek Szymczak, Warszawa, PL Mirosław Socha, Warszawa, PL Jacek Konarski, Warszawa, PL Anna Gałan, Puławy, PL Grzegorz Ościłowski, Warszawa, PL Alicja Suska-Szyłłejko, Warszawa, PL Tomasz Dąbrowski, Warszawa, PL Adam Ryszczuk, Hajnówka, PL (74) Pełnomocnik: Brodowska Iwona, LEX-PAT Biuro Prawno-Patentowe s.c. PL B1 (57) 1. Sposób biosyntezy erytromycyny A przy użyciu szczepu Streptomyces erythreus lub jego mutantów, polegający na przygotowaniu podłoża produkcyjnego, szczepieniu go materiałem posiewowym i prowadzeniu procesu biosyntezy erytromycyny A z dokarmianiem, znamienny tym, że przygotowuje się podłoże zawierające mąkę kukurydzianą w stężeniu g/l, które szczepi się odpowiednim materiałem posiewowym, a następnie przygotowuje się hydrolizat mąki kukurydzianej stosując dwustopniową hydrolizę, przy czym w pierwszym stopniu do zawiesiny mąki kukurydzianej w podwyższonej temperaturze dodaje się enzym proteolityczny, powodując rozkład dużych trudno przyswajalnych przez szczep Streptomyces erythreus, cząsteczek białka na peptydy i wolne aminokwasy, a w drugim stopniu dodaje się enzym amylolityczny, po czym prowadzi się biosyntezę erytromycyny A stosując tak przygotowany hydrolizat do dokarmiania.

2 Sposób biosyntezy erytromycyny A Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób biosyntezy erytromycyny A przy użyciu szczepu Streptomyces erythreus lub jego mutantów, polegający na przygotowaniu podłoża produkcyjnego, szczepieniu go materiałem posiewowym i prowadzeniu procesu biosyntezy erytromycyny A z dokarmianiem, znamienny tym, że przygotowuje się podłoże zawierające mąkę kukurydzianą w stężeniu g/l, które szczepi się odpowiednim materiałem posiewowym, a następnie przygotowuje się hydrolizat mąki kukurydzianej stosując dwustopniową hydrolizę, przy czym w pierwszym stopniu do zawiesiny mąki kukurydzianej w podwyższonej temperaturze dodaje się enzym proteolityczny, powodując rozkład dużych trudno przyswajalnych przez szczep Streptomyces erythreus, cząsteczek białka na peptydy i wolne aminokwasy, a w drugim stopniu dodaje się enzym amylolityczny, po czym prowadzi się biosyntezę erytromycyny A stosując tak przygotowany hydrolizat do dokarmiania. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas przygotowania hydrolizatu mąki kukurydzianej, reakcji hydrolizy poddaje się 10-30% wodną zawiesinę mąki kukurydzianej przy użyciu enzymów proteolitycznych działających w zakresie ph , w temperaturze C, w czasie godzin. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że dokarmianie hydrolizatem mąki kukurydzianej w procesie biosyntezy rozpoczyna się przy stężeniu cukru całkowitego w brzeczce poniżej 4.0%. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania erytromycyny A przy użyciu szczepu Streptomyces erythreus lub jego mutantów, polegający na zastosowaniu mąki kukurydzianej do przygotowania podłoża produkcyjnego i prowadzeniu procesu biosyntezy erytromycyny z zastosowaniem enzymatycznych hydrolizatów mąki kukurydzianej do dokarmiania w trakcie prowadzenia procesu. Z opisów patentowych Wlk. Bryt. nr i Francji nr znane są glukoza i skrobia jako dobrze przyswajalne składniki podłoża będące źródłem węgla. Z patentów rumuńskich nr nr , i wiadomo, że jako składniki podłoża stosuje się glukozę, melasę i skrobię ziemniaczaną. W opisie patentowym RP nr opisano zastosowanie w biosyntezie erytromycyny autolizatu otrzymanego z zawiesiny wodnej odpadowej grzybni promieniowców, który jest źródłem węgla, azotu i witamin, jednakże wydajności uzyskiwane z takiego podłoża były mało efektywne. Znane są metody wytwarzania erytromycyny A, gdzie jako źródło węgla w procesie biosyntezy używana jest skrobia ziemniaczana, skrobia kukurydziana, dekstryna i glukoza. Takie podłoża umożliwiają odpowiednią gospodarkę węglowodanową w czasie procesu, ale koszty wytwarzanej erytromycyny są wysokie, a obraz chromatograficzny uzyskiwanej brzeczki niezadowalający. Według opisu patentowego RP nr , proces biosyntezy erytromycyny prowadzi się na podłożu z hydrolizatem skrobi ziemniaczanej lub skrobi kukurydzianej uzyskanym w wyniku działania enzymów amylolitycznych. W znanych ze stanu techniki procesach biosyntezy erytromycyny dokarmianie prowadzi się źródłami węgla takimi jak skrobia ziemniaczana, skrobia kukurydziana czy dekstryna. W procesach tych transformacja erytromycyny C w erytromycynę A przebiega wolno, co w rezultacie daje zły obraz chromatograficzny brzeczek i zawartość erytromycyny C wynosi nawet do 15%.

3 Do biosyntezy erytromycyny nie stosowano dotychczas mąki kukurydzianej ani jej enzymatycznych hydrolizatów. Nieoczekiwanie okazało się, ze możliwe jest znaczne zdynamizowanie procesu biosyntezy oraz efektywne przedłużenie fazy intensywnego wytwarzania antybiotyku, a także podniesienie jakości wytwarzanego produktu, dzięki zastosowaniu sposobu według wynalazku. Sposób biosyntezy erytromycyny A przy użyciu szczepu Streptomyces erythreus lub jego mutantów, polegający na przygotowaniu podłoża produkcyjnego, szczepieniu go materiałem posiewowym i prowadzeniu procesu biosyntezy erytromycyny A z dokarmianiem, według wynalazku charakteryzuje się tym, że przygotowuje się podłoże zawierające mąkę kukurydzianą w stężeniu g/l, które szczepi się odpowiednim materiałem posiewowym, a następnie przygotowuje się hydrolizat mąki kukurydzianej stosując dwustopniową hydrolizę, przy czym w pierwszym stopniu do zawiesiny mąki kukurydzianej w podwyższonej temperaturze dodaje się enzym proteolityczny, powodując rozkład dużych trudno przyswajalnych przez szczep Streptomyces erythreus, cząsteczek białka na peptydy i wolne aminokwasy, a w drugim stopniu dodaje się enzym amylolityczny, po czym prowadzi się biosyntezę erytromycyny A stosując tak przygotowany hydrolizat do dokarmiania. W sposobie według wynalazku, korzystnie, podczas przygotowania hydrolizatu mąki kukurydzianej, reakcji hydrolizy poddaje się 10-30% wodną zawiesinę mąki kukurydzianej przy użyciu enzymów proteolitycznych działających w zakresie ph , w temperaturze C, w czasie godzin. W sposobie według wynalazku dokarmianie hydrolizatem mąki kukurydzianej w procesie biosyntezy korzystnie rozpoczyna się przy stężeniu cukru całkowitego w brzeczce poniżej 4.0%. W sposobie według wynalazku stosuje się optymalny dla procesu biosyntezy erytromycyny hydrolizat mąki kukurydzianej o lepkości nie wyższej niż 30 cp i stężeniu cukrów prostych nie wyższym niż 0.9%, który ma korzystny wpływ na dynamikę procesu, jego wydajność i jakość brzeczki erytromycynowej. Według wynalazku proces biosyntezy erytromycyny A prowadzi się, w ten sposób, że jako jedno ze źródeł węglowodanów i białek stosuje się mąkę kukurydzianą w stężeniach od g/l, a podczas przebiegu procesu biosyntezy składniki wyjściowego podłoża uzupełnia się hydrolizatem mąki kukurydzianej przygotowanym na drodze dwustopniowej hydrolizy przy użyciu enzymów proteolitycznych i amylolitycznych. Podczas prowadzonej sposobem według wynalazku hydrolizy enzymatycznej otrzymuje się między innymi wolny aminokwas - metioninę, który przez dostarczenie grup metylowych niezbędnych do transformacji erytromycyny C do erytromycyny A daje w konsekwencji doskonały produkt o wysokiej jakości potwierdzonej metodą chromatograficzną. Przygotowany w pierwszym etapie, przy użyciu enzymów proteolitycznych, hydrolizat mąki kukurydzianej ma dużą lepkość i jest niewygodny do stosowania. Dlatego wprowadzono drugi stopień hydrolizy z zastosowaniem enzymów amylolitycznych. W ten sposób przygotowany hydrolizat mąki kukurydzianej ma zwiększone właściwości użytkowe dla procesu biosyntezy erytromycyny w skali produkcyjnej. Przy stosowaniu tak przygotowanego hydrolizatu proces biosyntezy przebiega prawidłowo z wysoką wydajnością erytromycyny A na poziomie 8500 mcg/cm3 i zawartością erytromycyny C nie przekraczającą 2% w końcowych brzeczkach. Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające jego zakresu. Przykład I Biosyntezę erytomycyny A przeprowadzono w skali laboratoryjnej przy użyciu szczepu Streptomyces erythreus w następujący sposób: a) przygotowanie podłoża produkcyjnego o następującym składzie: 1. mąka kukurydziana 50,0 g 2. mąka sojowa 24,0 g 3. siarczan amonowy 1,5 g 4. sól kamienna 7,0 g 5. kreda Socal E2 6,0 g 6. WNK 50% 8,0 g

4 smalec wieprzowy 9,0 g 8. UCON LB-625 0,15 g 9. alkohol n-propylowy 10,0 g 10. woda technologiczna do 1 dm3 Mąkę kukurydzianą i mąkę sojową zawieszono w wodzie i podgrzewano do 90 C utrzymując w tej temperaturze przez 15 minut dobrze mieszając. Następnie po schłodzeniu do 60 C dodano zawieszone w wodzie: kredę, sól kamienną, siarczan amonowy, WNK 50% oraz środek przeciwpianowy UCON. Po dokładnym wymieszaniu i uzupełnieniu litrażu wodą do objętości 1 dm3 zmierzono ph, które wynosiło 6,4. Podłoże rozlano po 40 ml do kolb stożkowych o pojemności 500 ml, dodano do każdej kolby po 1,0 ml rozpuszczonego smalcu i sterylizowano w temperaturze 120 C przez 30 minut. Wartość ph podłoża po sterylizacji wynosiła 7,3. b) przygotowanie 20% hydrolizatu mąki kukurydzianej do dokarmiania Przygotowano 20% zawiesinę mąki kukurydzianej, której ph naturalne wynosiło 6,0. Podgrzano roztwór do 30 C mieszając przez 15 minut, a następnie dodano enzym proteolityczny o aktywności 0,5 j.ansona/g w ilości 0,5 ml/litr hydrolizatu. Proces hydrolizy prowadzono 0,5 godziny w temperaturze 60 C utrzymując ph w granicach Następnie dodano enzym amylolityczny w ilości 0,08 ml/litr i po wymieszaniu przez 5 minut hydrolizat sterylizowano w 120 C przez 30 minut. Otrzymany hydrolizat mąki kukurydzianej po sterylizacji charakteryzował się następującymi cechami: ph 6.1, stężenie cukru prostego 0.2%, stężenie cukru całkowitego 16.2%, lepkość 40 cp. c) biosynteza erytromycyny A Przygotowane w etapie a podłoże szczepiono odpowiednio przygotowanym materiałem posiewowym, do każdej kolby dodano 1% wysterylizowanego n-propanolu. Inkubację zaszczepionego podłoża prowadzono na trzęsawce obrotowej przy 240 obr/min, przez 168 godzin w temperaturze 33 C. W czasie procesu prowadzono dokarmianie 20% hydrolizatem mąki kukurydzianej przygotowanym zgodnie z przepisem w punkcie b. Dozowano po 3 ml hydrolizatu w 24, 48 i 72 godzinie fermentacji. Po zakończonej fermentacji, w 168 godzinie uzyskano wynik 6500 mcg erytromycyny A w 1 cm3, a brzeczka charakteryzowała się dobrą jakością. Przykład II a) przygotowanie podłoża produkcyjnego, prowadzono jak w przykładzie I punkt a, przy zastosowaniu następującego składu podłoża: g/l 1. mąka kukurydziana 15,0 2. mąka sojowa 24,0 3. mąka ziemniaczana 35,0 4. siarczan amonu 1,5 g 5. sól kamienna 7,0 g 6. kreda Socal E2 6,0 g 7. WNK 50% 8,0 g 8. smalec wieprzowy 9,0 g 9. UCON LB-625 0,15 g 10. alkohol n-propylowy 10,0 g 11. woda technologiczna do 1 dm3 b) przygotowanie 15% hydrolizatu mąki kukurydzianej do dokarmiania. Przygotowano 15% zawiesinę mąki kukurydzianej, następnie podgrzano do 30 C i po skorygowaniu ph do wartości 7,5, dodano enzym proteolityczny o aktywności 1,5 ja/g w ilości 0,3 ml/l i całość poddano reakcji hydrolizy w temperaturze 30 C, w ph 7,5 w czasie 3 godzin. Następnie dodano enzym amylolityczny w ilości 0,08 ml/l i sterylizowano w 120 C przez 30 minut. Otrzymany hydrolizat mąki kukurydzianej po sterylizacji charakteryzował się następującymi cechami: ph 6.8, stężenie cukru prostego 0.25%, stężenie cukru całkowitego 11.8%, lepkość 35 cp.

5 c) biosynteza erytromycyny A. Przygotowanym w etapie b hydrolizatem dokarmiano hodowlę szczepu przygotowaną zgodnie z przykładem I dozując po 4 ml hydrolizatu w 24, 48 i 72 godzinie fermentacji, dodając jednocześnie w tych samych godzinach po 0,4 ml oleju sojowego. Po zakończonej fermentacji uzyskano w 168 godzinie wynik 6000 mcg erytromycyny A w 1cm3, a brzeczka charakteryzowała się dobrą jakością. Przykład III Biosyntezę erytromycyny A prowadzono w fermentorze o pojemności 50 m3 przy użyciu szczepu Streptomyces erythreus w następujący sposób: a) przygotowanie podłoża produkcyjnego o następującym składzie: kg 1. mąka kukurydziana mąka sojowa mąka ziemniaczana smalec wieprzowy siarczan amonowy kreda Socal E sól biała warzona WNK 50% UCON LB Zawieszono w wodzie technologicznej 1050 kg mąki sojowej, 850 kg mąki kukurydzianej i 850 kg skrobi ziemniaczanej i po 30 minutach mieszania podgrzano do 90 C i utrzymywano w tej temperaturze przez 15 minut przy ciągłym mieszaniu, po czym schłodzono do 60 C, dodano 300 kg smalcu i pozostałe składniki podłoża uprzednio zawieszone w wodzie: 50 kg siarczanu amonowego, 20 kg kredy, 230 kg soli białej warzonej, 220 kg WNK 50% i 5 litrów UCONU LB-625. ph podłoża przed sterylizacją wynosiło 6.8. Podłoże sterylizowano w temperaturze 121 C przez 60 minut, po czym całość schłodzono do temperatury 34 C. Wartość ph podłoża po sterylizacji wynosiła 7.0. b) przygotowanie 15% hydrolizatu mąki kukurydzianej do dokarmiania. W dokarmiaczu o pojemności 5 m3, zawieszono w 2 m3 wody technologicznej 600 kg mąki kukurydzianej i uzupełniono litraż do objętości 2,5 m3. Zawiesinę ogrzewano do temperatury 30 C i utrzymywano w tej temperaturze przez 15 minut mieszając. ph zawiesiny wynosiło 6,2. Następnie zawiesinę mąki kukurydzianej podgrzano do 45 C i dodano 1 litr enzymu proteolitycznego, 12,5 kg smalcu i 3 litry UCONU LB-625. Całość poddawano hydrolizie w 45 C przez 1godzinę przy ciągłym mieszaniu. Następnie do dokarmiacza dodano 25 ml enzymu amylolitycznego i po ustawieniu litra żu do 3500 l, mieszano przez 5 minut i sterylizowano w temperaturze 121 C w ciągu 45 minut. Objętość hydrolizatu po sterylizacji wynosiła 4000 litrów. Hydrolizat mąki kukurydzianej po sterylizacji charakteryzował się następującymi cechami: ph 6,2, stężenie cukru prostego 0,3%, stężenie cukru całkowitego 11,5%, lepkość 50 cp. c) biosynteza erytromycyny A. Podłoże zaszczepiono 10% materiału posiewowego. Proces prowadzono przez 8 dni w temperaturze C, stosując zmienne napowietrzanie i mieszanie. W czasie procesu dodawano prekursor n-propanol, ph było utrzymywane w granicach W procesie biosyntezy stosowano dokarmianie hodowli 15% hydrolizatem mąki kukurydzianej, które rozpoczęto w 36 godz. biosyntezy przy stężeniu cukru całkowitego w brzeczce 3,3%. Hydrolizat dozowano w porcjach do 140 godziny. Całkowite zużycie hydrolizatu mąki kukurydzianej na szarżę wyniosło Po zakończeniu procesu biosyntezy w 188 godzinie fermentacji oznaczono w przesączu brzeczki zawartość erytromycyny A, która wynosiła 8500 mcgemc w 1 cm3 przesączu, oznaczono także: 2% erytromycyny C, 2% erytromycyny B, 5% anhydroerytromycyny P, 5% erytromycyny E, 1% erytromycyny D.

6 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.