(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/08 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 14/73 (06.01) C07K 14/47 (06.01) C07K 19/00 (06.01) A61P 37/06 (06.01) C07K 17/00 (06.01) C12N 1/62 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Multimeryczne polipeptydy receptora Fc () Pierwszeństwo: US 701 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/3 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/07 (73) Uprawniony z patentu: SuppreMol GmbH, Martinsried, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 PHILLIP MARK HOGARTH, Williamstown, AU BRUCE DAVID WINES, Melbourne, AU (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 P27764PL00 EP B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Przedmiotem niniejszego wynalazku są rozpuszczalne multimeryczne polipeptydy receptora Fc zdolne do hamowania interakcji receptorów leukocytowych Fcγ (FcγR) i immunoglobuliny G (IgG). Takie polipeptydy są użyteczne w leczeniu chorób zapalnych, zwłaszcza chorób zapalnych zależnych od kompleksów immunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów (RA), immunologiczna plamica małopłytkowa (ITP) i toczeń rumieniowaty układowy (SLE). Stan techniki [0002] Leczenie chorób autoimmunologicznych i innych chorób zapalnych, takich jak RA i SLE, weszło w nową, fascynującą fazę: większa wiedza o cząsteczkach odgrywających rolę w układzie immunologicznych umożliwiła uzyskanie swoistego hamowania kluczowych cząsteczek zapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworów α (TNFα) i interleukina 1β (IL-1β). W ostatnich badaniach wykazano na przykład, że przeciwciała mogą odgrywać ważną rolę w patogenezie RA; w badaniach klinicznych u ludzi dodatnia odpowiedź na zastosowanie terapii przeciwciałami monoklonalnymi (mab) anty-cd celem wyeliminowania wytwarzających przeciwciała komórek B dostarczyła przekonujących dowodów na istotną rolę przeciwciał w RA (Emery i wsp., 01). Jako że receptory Fc (FcR) odgrywają kluczową rolę w układach efektorowych opartych na immunoglobulinach, hamowanie czynności FcR może stać się podwaliną skutecznej terapii wielu różnych chorób.

3 4 1 2 Ponadto, ponieważ receptory Fcγ są kluczowe (FcγR) w układach efektorowych IgG, ukierunkowanie na interakcje między FcγR leukocytów a przeciwciałami zapewnia nowe możliwości interwencji terapeutycznej w RA (Nabbe i wsp., 03). Jednym ze sposobów przeprowadzenia takiej interwencji, interesującym z punktu widzenia Zgłaszającego, jest zastosowanie rozpuszczalnej postaci FcγR do działania jako wabik i zapobiegania aktywacji leukocytów przez przeciwciała. [0003] Receptory Fc (FcR) są to glikoproteiny powierzchni leukocytów, swoiście wiążące się z częścią Fc przeciwciał. Najpowszechniej występującymi i występującymi w rozmaitych formach takimi receptorami są receptory IgG, czyli FcγR; ich główne typy to FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16). Kompleksy immunologiczne (IC), jakie tworzą się in vivo w prawidłowej odpowiedzi immunologicznej, i kompleksy obserwowane w stanach patologicznych w chorobach autoimmunologicznych, takich jak RA, mogą angażować jednocześnie wiele FcR. U ludzi aktywowane makrofagi, neutrofile, eozynofile i komórki tuczne mogą na przykład wykazywać ekspresję PcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb i FcγRIII (Takai, 02). Spośród nich głównym inicjatorem zapalenia zależnego od IC jest FcγRIIa; jakkolwiek wszystkie typy FcγR angażują dolną część regionu zawiasowego domeny Fc IgG i domen CH2, tak że jakikolwiek rozpuszczalny wabikowy polipeptyd FcγR mógłby hamować wiązanie IgG z wszystkimi klasami FcγR, Zgłaszający odkrył, że, ponieważ FcγRIIa wykazuje najszerszą swoistość wiązania i największą wybiórczość wobec awidnego wiązania kompleksów immunologicznych

4 1 2 IgG, największy potencjał zapewniają prace i badania nad rozpuszczalnym FcγRIIa. [0004] W WO-A2 04/ i Li P i wsp. (01) opisano homodimeryczne białka fuzyjne regionów wiążących Fc, z których każde poddano fuzji z domeną zawiasową IgG 2. Do dimeryzacji tych białek fuzyjnych dochodzi poprzez mostki dwusiarczkowe między domenami zawiasowymi. [000] W istocie, uprzednie badania wykazały, że prosty, rekombinowany rozpuszczalny polipeptyd FcγRIIa (monomer rsfcγriia), złożony z ektodomen FcγRIIa (Ierino i wsp., 1993a), jest ewidentnie zdolny do hamowania zapalenia zależnego od IC. W tych badaniach rsfcγriia testowano z zastosowaniem reakcji Arthusa, w której w skórze właściwej tworzą się kompleksy immunologiczne wskutek biernego podawania przeciwciała i antygenu (Pflum i wsp., 1979), co jest modelem zapalenia naczyń (powikłanie pozastawowe zapalenia stawów); zjawisko to również występuje w SLE. Stwierdzono, że jakkolwiek monomer rsfcγriia hamuje zapalenie i naciek neutrofili, gdy podaje się go wraz z przeciwciałem i antygenem, niezbędne są duże ilości monomeru rsfcγriia ze względu na względnie niski poziom wybiórczości wobec kompleksów immunologicznych. W celu przezwyciężenia tego problemu Zgłaszający zaproponował zastosowanie multimerycznej postaci wabika rsfcγriia, po czym nieoczekiwanie odkrył, że można nie tylko z powodzeniem uzyskiwać taką postać multimeryczną, lecz wykazuje ona także zwiększoną wybiórczość wobec kompleksów immunologicznych. Takie multimeryczne polipeptydy rsfcγriia są zatem obiecujące w leczeniu zależnych od IC chorób zapalnych, takich jak RA i SLE.

5 6 1 2 Krótki opis wynalazku [0006] W pierwszym aspekcie zatem przedmiotem niniejszego wynalazku jest rozpuszczalne multimeryczne białko lub polipeptyd zdolne do hamowania interakcji receptorów leukocytowych Fcγ (FcγR) i immunoglobuliny G (IgG), przy czym to białko lub polipeptyd zawiera dwa sprzężone regiony wiążące Fc, z których co najmniej jeden pochodzi z receptora typu FcγR. [0007] Korzystnie, białko lub polipeptyd jest multimerem regionu wiążącego Fc, pochodzącego z receptora typu FcγRII, zwłaszcza FcγRIIa. Taką cząsteczkę można uznać za homomultimer; szczególnie korzystną cząsteczką tego rodzaju jest homodimer regionu wiążącego Fc, pochodzącego z receptora typu FcγRII. Zakres niniejszego wynalazku obejmuje jednak również sytuacje, gdy cząsteczka jest multimerem regionu wiążącego Fc, pochodzącego z receptora typu FcγR (na przykład receptora typu FcγRII) i regionu wiążącego Fc z innego źródła (na przykład region wiążący Fc z innego typu receptora Fc lub syntetyczny polipeptyd wiążący Fc). Cząsteczkę tego rodzaju można uznać za heteromultimer; szczególnie korzystną cząsteczką tego rodzaju jest heterodimer regionu wiążącego Fc, pochodzącego z receptora typu FcγRII i regionu wiążącego Fc pochodzący z receptora typu FcγRIII. [0008] Regiony wiążące Fc są sprzężone poprzez wiązanie peptydowe lub poprzez krótką sekwencję łącznikową (na przykład pojedynczy aminokwas lub krótki peptyd o długości na przykład od 2 do aminokwasów).

6 7 1 2 [0009] W drugim aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest cząsteczka polinukleotydu, zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą rozpuszczalne, multimeryczne białko lub polipeptyd według pierwszego aspektu. [00] Cząsteczka polinukleotydu może składać się z kasety ekspresyjnej lub wektora ekspresyjnego (na przykład plazmidu do wprowadzania do komórki gospodarza bakteryjnego lub wektora wirusowego, takiego jak wektor bakulowirusowy do transfekcji komórki gospodarza-owada albo plazmid lub wektor wirusowy, taki jak lentiwirus do transfekcji komórki gospodarza-ssaka). [0011] I tak, w trzecim aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest rekombinowana komórka gospodarza, zawierająca cząsteczkę polinukleotydu, zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą rozpuszczalne, multimeryczne białko lub polipeptyd według pierwszego aspektu. [0012] W czwartym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania białka lub polipeptydu, obejmujący następujące etapy: (i) zapewnienie rekombinowanej komórki gospodarza, zawierającej cząsteczkę polinukleotydu, w skład której wchodzi sekwencja nukleotydowa kodująca rozpuszczalne, multimeryczne białko lub polipeptyd według pierwszego aspektu, (ii) hodowla tej komórki gospodarza w odpowiedniej pożywce hodowlanej i w warunkach odpowiednich do ekspresji tego rozpuszczalnego, multimerycznego białka lub polipeptydu, i

7 8 1 2 (iii) izolowanie tego rozpuszczalnego, multimerycznego białka lub polipeptydu z pożywki hodowlanej. [0013] W piątym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób leczenia osobnika z choroby zapalnej, obejmujący podawanie osobnikowi rozpuszczalnego, multimerycznego białka lub polipeptydu według pierwszego aspektu ewentualnie w połączeniu z nośnikiem lub zaróbką dopuszczalną w farmacji lub medycynie weterynaryjnej. Krótki opis rysunków [0014] Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową (i poddaną translacji sekwencję aminokwasową) konstruktu homodimerowego w konfiguracji głowa do ogona dwóch regionów pozakomórkowych FcγRIIa, z których każdy zawiera obie ektodomeny FcγRIIa, a mianowicie ektodomeny 1 i 2. Ektodomeny FcγRIIa 1 i 2 składają się z aminokwasów sekwencji polipeptydowej FcγRIIa, przy czym aminokwasy 1-88 zawierają domenę 1, a aminokwasy zawierają domenę 2 (Hibbs i wsp., 1988; Homo sapiens fragment Fc of IgG, low affinity IIa receptor (CD32) (FCGR2A), mrna, ACCESSION NM_021642; i Powell i wsp., 1999). Na rysunku aminokwasy pochodzą z regionu pozakomórkowego FcγRIIa; spośród nich, aminokwasy zawierają ektodomeny 1 i 2 FcγRIIa, a aminokwasy zawierają proksymalny odcinek błonowy (który w FcγRIIa łączy ektodomeny 1 i 2 z sekwencją przezbłonową). Pierwszy z regionów pozakomórkowych FcγRIIa, zawierający dimer, składa się więc z aminokwasów 1-182, a drugi z regionów pozakomórkowych FcγRIIa składa się z aminokwasów 184-

8 (odpowiadających aminokwasom FcγRIIa). Podkreślony aminokwas odpowiada reszcie aminokwasowej łącznika innego niż FcγRII, natomiast aminokwasy pogrubione oznaczają C-końcowy tag His 6. Fig. 2 przedstawia analizę Western blot rekombinowanych, rozpuszczalnych (rs), multimerycznych postaci FcγRIIa. Dimer rsfcγriia okazał się w zasadzie stabilny: stwierdzono obecność tylko niewielkich ilości produktu rozpadu, a mianowicie monomeru rsfcγriia. Z drugiej strony postacie trimeru i tetrameru rsfcγriia były niestabilne i zasadniczo ulegały rozpadowi do postaci dimeru rsfcγriia. Temu rozpadowi można było zapobiec przez zastosowanie w czasie wytwarzania inhibitorów proteaz lub przez innego rodzaju modyfikację sekwencji postaci multimerowej celem usunięcia miejsca lub miejsc cięcia. Fig. 3 przedstawia zabarwiony metodą Coomassie SDS-PAGE (12% żel akryloamidowy, w warunkach nieredukujących) frakcji zebranych z oczyszczania monomeru rsfcγriia (ulegającego ekspresji z komórek ssaków) o oczekiwanej wielkości ~ kda (a) i dimeru rsfcγriia o oczekiwanej wielkości ~0 kda (b). Fig. 4 przedstawia graficznie reakcje wiązania równowagi monomeru rsfcγriia z unieruchomionym (a) monomerem IgG (Sandoglobulin) i (b) z modelowym kompleksem immunologicznym, IgG zagregowaną cieplnie (HAGG). Fig. przedstawia graficznie reakcje wiązania równowagi dimeru rsfcγriia z unieruchomionym (a) monomerem IgG (Sandoglobulin) i (b) z modelowym kompleksem immunologicznym, HAGG.

9 1 2 Fig. 6 przedstawia wykres wiązania monomeru rsfcγriia (a) i dimeru rsfcγriia (b) z unieruchomionym ludzkim monomerem IgG (Sandoglobulin) po uprzedniej reakcji w roztworze z ludzkim monomerem IgG (Sandoglobulin) i dimerem-igg (Wright i wsp., 1980), określony z zastosowaniem standardowego protokołu testowego BIAcore. Fig. 7 przedstawia wykresy (a) hamowania wiązania dimeru-igg (Wright i wsp., 1980) z ludzkimi neutrofilami (ochotnik V) przez oczyszczony monomer rsfcγriia i dimer rsfcγriia, obliczonego jako odsetek niezahamowanej aktywności wiązania dimeru-igg i (b) hamowania wiązania dimeru-igg z ludzkimi neutrofilami (ochotnik V1) przez oczyszczony dimer rsfcγriia, obliczone jako odsetek wiązania dimeru dimeru-igg. Fig. 8 przedstawia, w punkcie (a), wykres stymulowanego przez kompleks immunologiczny (dimer-igg) wydzielania TNF z poddanych 24-godzinnemu różnicowaniu ludzkich MDM (ochotnik V) w nieobecności i w obecności dimeru rsfcγriia (w nadsączu w stężeniu 2, µg/ml), natomiast w punkcie (b) wykres stymulowanego przez kompleks immunologiczny (dimer-igg) wydzielania TNF z poddanych 24-godzinnemu różnicowaniu ludzkich MDM (ochotnik V1), w nieobecności i w obecności dimeru rsfcγriia (2, µg/ml). Fig. 9 przedstawia wykres stymulowanej przez kompleks immunologiczny (HAGG) aktywacji ludzkich płytek krwi, mierzonej na podstawie średniej intensywności fluorescencji (MFI) ekspresji P-selektyny w nieobecności i w obecności dimeru rsfcγriia ( μg/ml).

10 Fig. przedstawia wyniki analizy dimeru rsfcγriia izolowanego ze stabilnie transfekowanych komórek CHO-S przez SDS-PAGE w warunkach (a) nieredukujących i (b) redukujących, (c) Western blotting z zastosowaniem przeciwciała anty-fcγriia i (d) HPLC. Dimer rsfcγriia migruje jako pojedynczy prążek przy oczekiwanej masie cząsteczkowej (~0 kd), reaguje z przeciwciałem anty- FcγRIIa, a jego czystość wynosi >96%, co określa się metodą analizy HPLC. Fig. 11 przedstawia wykres wiązania kompleksu immunologicznego (HAGG) z ulegającym ekspresji na powierzchni komórki ludzkim FcγRIIb (na mysiej linii komórkowej chłoniaka z komórek B IIA1.6) w obecności monomeru rsfcγriia lub dimeru rsfcγriia. Fig. 12 przedstawia wykres aktywowanych płytek krwi (dodatnich zarówno pod względem CD41, jak i CD62P) po potraktowaniu HAGG w obecności monomeru rsfcγriia lub dimeru rsfcγriia, jako odsetek aktywowanych płytek krwi po potraktowaniu samym HAGG. Fig. 13 przedstawia wykres uwalniania TNF-α z komórek MC/9 po inkubacji z kompleksami immunologicznymi OVA w obecności monomeru rsfcγriia lub dimeru rsfcγriia, jako odsetek TNF-α uwalnianego w obecności samych kompleksów immunologicznych OVA. Fig. 14 przedstawia analizę Western blot białek fuzyjnych rsfcγriia. (1) monomer rsfcγriia; (2) dimer rsfcγriia; (3) monomer rsfcγriia poddany fuzji z IgG 1 - Pcγ1 (L234A, L23A); (4) dimer rsfcγriia poddany fuzji z IgG 1 -Fcγ1 (L234A, L23A); () monomer rsfcγriia poddany fuzji z ludzką albuminą surowicy (HSA); (6) dimer rsfcγriia poddany fuzji z HSA; (7) oczyszczony

11 wzorzec monomeru rsfcγriia standard; i (8) oczyszczony wzorzec dimeru rsfcγriia. Fig. 1 przedstawia wyniki ELISA z wychwytem HAGG z fuzjami monomeru rsfcγriia i dimeru rsfcγriia. (a) wzorzec monomeru FcγRIIa (Powell i wsp., 1999), od stężenia 0,7 µg/ml (wzorzec monomeru); białko z komórek transfekowanych konstruktem monomeru rsfcγriia (transfekcja 426 (monomer)); białko z komórek transfekowanych fuzją monomeru rsfcγriia z konstruktem IgG-Fcγ1 (L234A, L23A) (monomer-fc); i białko z komórek transfekowanych fuzją monomeru rsfcγriia z konstruktem HSA (monomer-hsa); (b) wzorzec dimeru rsfcγriia od stężenia 0, µg/ml (wzorzec dimeru); nadsącz z komórek transfekowanych dimerem rsfcγriia (transfekcja 427 (dimer)); nadsącz z komórek transfekowanych fuzją dimeru rsfcγriia z IgG-Fcγ1 (L234A, L23A) (dimer-fc); i nadsącz z komórek transfekowanych fuzją dimeru rsfcγriia z HSA (dimer HSA). Fig. 16 przedstawia wyniki uzyskane z ELISA z wychwytem tagu (CAPTURE-TAG) na białkach fuzyjnych monomeru rsfcγriia i dimeru rsfcγriia, potwierdzające obecność epitopów i przez to prawidłowe sfałdowanie receptora. (A) wzorzec monomeru rsfcγriia od stężenia 0,7 µg/ml (wzorzec monomeru); nadsącz z komórek transfekowanych monomerem rsfcγriia (transfekcja 426 (monomer)); nadsącz z komórek transfekowanych fuzją monomeru rsfcγriia z IgG-Fcγ1 (L234A, L23A) (monomer-fc); i nadsącz z komórek transfekowanych fuzją monomeru rsfcγriia z HSA (monomer-hsa); (B) wzorzec dimeru rsfcγriia (sporządzony we własnym laboratorium) od

12 stężenia 0, µg/ml); nadsącz z komórek transfekowanych dimerem PcγRIIa (transfekcja 427 (dimer)); nadsącz z komórek transfekowanych fuzją dimeru rsfcγriia z IgG- Fcγ1 (L234A, L23A) (dimer-fc); i nadsącz z komórek transfekowanych fuzją dimeru rsfcγriia z HSA (dimer- HSA). Fig. 17 przedstawia schematyczny diagram (a) monomeru rsfcγriia; (b) dimeru rsfcγriia; (c) dimeru fuzji monomeru rsfcγriia z IgG-Fcγ1 (L234A, L23A), przy czym dimeryzacji dokonuje się poprzez domeny Fc polipeptydów fuzji monomeru rsfcγriia, uzyskując cząsteczkę z dwoma regionami wiązania Fc (to znaczy białko, które jest dimeryczne pod względem regionu wiążącego Fc lub na inny sposób ma wartościowość równą dwa ); (d) dimer fuzji dimeru rsfcγriia z IgG-Fcγ1 (L234A, L23A), przy czym dimeryzacji dokonuje się poprzez dwie domeny Fc polipeptydów fuzji dimeru rsfcγriia, uzyskując cząsteczkę z czterema regionami wiążącymi Fc (to znaczy białko, które jest tetrameryczne pod względem regionu wiążącego Fc lub na inny sposób ma wartościowość równą cztery ); (e) fuzja monomeru rsfcγriia z HSA; i (f) fuzja dimeru rsfcγriia z HSA. Na rysunku D1 i D2 oznaczają, odpowiednio, ektodomeny 1 i 2, zamalowany słupek obok D2 oznacza sekwencję łącznikową, ciemna pętla na górze dimeryzowanych domen Fc na (c) i (d) oznacza wiązania dwusiarczkowe, a H 6 oznacza tag His. Szczegółowy opis wynalazku [001] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest rozpuszczalne multimeryczne białko lub polipeptyd zdolne do hamowania interakcji receptorów leukocytowych Fcγ (FcγR) i immunoglobuliny G (IgG), zawierające dwa

13 regiony wiązania Fc, z których jeden pochodzi zasadniczo z receptora typu FcγR. Takie białko lub polipeptyd wykazuje zwiększoną wybiórczość wobec kompleksów immunologicznych w stosunku do wybiórczości uprzednio obserwowanej przy stosowaniu rozpuszczalnych polipeptydów monomerycznych, takich jak monomer rsfcγrii, i jest przez to bardzo obiecującą potencjalną cząsteczką wabikową do leczenia zależnych od IC chorób zapalnych, takich jak RA i SLE. [0016] W pierwszym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem rozpuszczalne multimeryczne białko lub polipeptyd zdolne do hamowania interakcji receptorów leukocytowych Fcγ (FcγR) i immunoglobuliny G (IgG), przy czym to białko lub polipeptyd zawiera dwa sprzężone regiony wiążące Fc, z których co najmniej jeden pochodzi z receptora typu FcγR. [0017] W rozumieniu niniejszego opisu, termin rozpuszczalny wskazuje, że białko lub polipeptyd nie są związane z błoną komórkową, zatem cechują się nieobecnością lub zakłóceniem czynności całej lub istotnej części domeny przezbłonowej (to znaczy lipofilowej), przez co rozpuszczalny receptor jest całkowicie pozbawiony funkcji kotwiczenia w błonie. Domeny cytoplazmatyczne mogą również być nieobecne. [0018] W rozumieniu niniejszego opisu, termin region wiążący Fc odnosi się do dowolnej części lub dowolnych części receptora Fc, zdolnych do wiązania z domeną Fc cząsteczki immunoglobuliny (takich jak na przykład fragment Fc wytworzony przez hydrolizę papainą cząsteczki immunoglobuliny), w tym do ich genetycznie

14 1 zmodyfikowanych wersji, jak również do syntetycznego 1 2 polipeptydu wiążącego Fcγ. [0019] Ten co najmniej jeden region wiążący Fc, pochodzący z receptora typu PcγR, może pochodzić na przykład z FcγR wykazującego małe powinowactwo do IgG, to znaczy powinowactwo do IgG mniejsze niż x 7 M -1. Do takich receptorów o małym powinowactwie należą receptory typu FcγRII (na przykład FcγRIIa, FcγRIIb i FcγRIIc), receptory typu FcγRIII (na przykład FcγRIIIa i FcγRIIIb), okrojone formy receptorów typu FcγRI (na przykład FcγRIa i FcγRIb), takie jak okrojone polipeptydy, zawierające pierwszą i drugą z trzech ektodomen receptora FcγRI (Hulett i wsp., 1991; Hulett i wsp., 1998), oraz genetycznie zmodyfikowane wersje FcγR, które normalnie wykazują duże powinowactwo do IgG, i które na skutek modyfikacji (takich jak na przykład substytucja, delecja i(lub) addycja jednego lub większej liczby aminokwasów) osiągają zmniejszone powinowactwo do IgG - poniżej x 7 M -1 ). [00] Korzystnie, białko lub polipeptyd jest homomultimerem regionu wiążącego Fc, pochodzącego z receptora FcγR, takiego jak FcγR o małym powinowactwie. Odpowiedni region wiążący Fc składa się z całej (jednej lub więcej) ektodomeny receptora FcγR lub z części (jednej lub więcej niż jednej) wiążącej Fc jednej lub więcej ektodomeny receptora FcγR. Specjalista będzie w stanie łatwo zidentyfikować ektodomeny receptorów FcγR wiążące Fc, ponieważ te domeny należą do nadrodziny domen IgG (Hulett i wsp., 1994, Hulett i wsp., 199, Hulett i wsp., 1998, i Tamm i wsp, 1996) i cechują się typowo sandwiczem tryptofanowym (na przykład reszty

15 W90 i W113 FcγRIIa) i innymi resztami (na przykład w FcγRIIa: reszty łącznika ektodomeny 1 i ektodomeny 2 oraz pętle BC (W113-V119), C E (F132-P137) i FG (G19- Y160) ektodomeny 2 (Hulett i wsp., 1994)) [0021] Korzystniej, białko lub polipeptyd jest homomultimerem regionu wiążącego Fc FcγRIIa. Odpowiedni region wiążący Fc z FcγRIIa składa się z całych ektodomen 1 i 2 FcγRIIa lub ich części wiążącej Fc (jednej lub więcej niż jednej). Ektodomeny 1 i 2 FcγRIIa znajdują się w obrębie aminokwasów sekwencji aminokwasowej FcγRIIa (Hibbs i wsp., 1988, i ACCESSION NM_021642). Przykładem części wiążącej Fc ektodomen 1 i 2 FcγRIIa jest fragment zawierający aminokwasy sekwencji aminokwasowej FcγRIIa, który obejmuje reszty łącznika ektodomeny 1 i ektodomeny 2 oraz pętle BC (W113-V119), C E (F132-P137) i FG (G19-Y160) ektodomeny 2. Badania metodą krystalografii rentgenowskiej ujawniły, że w obrębie tego fragmentu aminokwasy , 129, 131, 133, 134, 1, 16 i w istotny sposób przyczyniają się do powstania fragmentu powierzchni, zdolnego do wiązania się z domeną Fc IgG (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 0/0712). [0022] Białko lub polipeptyd może również być heteromultimerem regionu wiążącego Fc, pochodzącego z receptora typu FcγRII i regionu wiążącego Fc z innego źródła (na przykład region wiążący Fc z innego typu receptora Fc, na przykład z innego typu FcγR lub region wiążący Fc z receptorów innych immunoglobulin, takich jak receptory IgA i IgE). Jedną ze szczególnie korzystnych cząsteczek tego rodzaju jest heterodimer

16 regionu wiążącego Fc, pochodzącego z receptora typu FcγRII (zwłaszcza FcγRIIa), i regionu wiążącego Fc pochodzącego z receptora typu FcγRIII. [0023] Do regionów wiążących Fc, które uznaje się za pochodzące z danego receptora Fc, należą regiony wiążące Fc o sekwencji aminokwasowej równoważnej sekwencji receptora Fc, jak również regiony wiążące Fc, obejmujące jedną lub więcej niż jedną modyfikację aminokwasową sekwencji regionu wiążącego Fc, występującej w receptorze Fc. Takie modyfikacje aminokwasowe mogą obejmować substytucje, delecje, addycje jednego lub więcej niż jednego aminokwasu i dowolne kombinacje którychkolwiek z tych modyfikacji, i mogą zmieniać aktywność biologiczną regionu wiążącego Fc w stosunku do aktywności receptora Fc (na przykład modyfikacja lub modyfikacje aminokwasowe mogą zwiększać wybiórczość lub powinowactwo do kompleksów immunologicznych; takie modyfikacje aminokwasów 133, 134, opisano w międzynarodowym opisie patentowym WO 96/0812). Z drugiej strony, regiony wiążące Fc pochodzące z danego receptora Fc mogą obejmować jedną lub więcej niż jedną modyfikację aminokwasową, która w zasadzie nie zmienia aktywności biologicznej regionu wiążącego Fc w stosunku do aktywności receptora Fc. Tego typu modyfikacje aminokwasowe będą typowo polegać na konserwatywnych podstawieniach aminokwasowych. Przykładowe konserwatywne podstawienie aminokwasowe podano w tabeli 1 poniżej. Do szczególnie korzystnych według niniejszego wynalazku konserwatywnych podstawień aminokwasowych należą: G, A, V, I, L, M; D, E, N, Q; S,

17 18 C, T; K, R, H; i P, Nα-alkiloaminokwasy. Ogólnie, konserwatywne podstawienia aminokwasowe będą wybierane tak, aby nie wywierały żadnego istotnego wpływu: (a) na strukturę rdzenia polipeptydu regionu wiążącego Fc w miejscu podstawienia, (b) na ładunek ani hydrofobowość polipeptydu w miejscu podstawienia ani (c) na masę ani objętość łańcucha bocznego aminokwas w miejscu podstawienia. Gdy region wiążący Fc, obejmujący jedno lub więcej niż jedno konserwatywne podstawienie aminokwasowe, wytwarza się przez syntezę, region wiążący Fc może również zawierać aminokwas lub aminokwasy niekodowane przez kod genetyczny, takie jak kwas γ-karboksyglutaminowy, hydroksyprolina czy D- aminokwasy. Tabela 1. Przykładowe konserwatywne podstawienia aminokwasowe Podstawienia konserwatywne Ala Val*, Leu, Ile Arg Lys*, Gln, Asn Asn Gln*, His, Lys, Arg, Asp Asp Glu*, asn Cys Ser Gln Asn*, His, Lys, Glu Asp*, kwas γ-karboksyglutaminowy (Gla) Gly Pro His Asn, Gln, Lys, Arg* Ile Leu*, Val, Met, Ala, Phe, norleucyna (Nle) Leu Nle, Ile*, Val, Met, Ala, Phe Lys Arg*, Gln, Asn, ornityna (Orn)

18 19 1 Met Leu*, Ile, Phe, Nle Phe Leu*, Val, Ile, Ala Pro Gly*, hydroksyprolina (Hyp), Ser, Thr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp, Phe*, Thr, Ser Val Ile, Leu*, Met, Phe, Ala, Nle *wskazuje korzystne podstawienia konserwatywne [0024] Regiony wiążące Fc są połączone poprzez wiązanie peptydowe lub poprzez krótką sekwencję łącznikową (na przykład pojedynczy aminokwas lub krótki peptyd o długości na przykład od 2 do aminokwasów). [002] Korzystnie, białko lub polipeptyd według niniejszego wynalazku zawiera polipeptyd, przy czym regiony wiążące Fc są połączone w konfiguracji głowa do ogona. Oznacza to, że koniec C ( ogon ) pierwszego regionu wiążącego Fc będzie połączony z końcem N ( głową ) drugiego regionu wiążącego Fc. Dwa regiony wiązania Fc będą połączone w konfiguracji głowa do ogona. Regiony wiążące Fc będą połączone poprzez wiązanie peptydowe lub poprzez krótką sekwencję łącznikową (na przykład pojedynczy aminokwas lub krótki peptyd o długości na przykład od 2 do aminokwasów lub, korzystniej, o długości od 2 do 1 aminokwasów, od 2 do, od 2 do 8 aminokwasów, lub, najkorzystniej, od 2 do aminokwasów). Odpowiednie krótkie sekwencje łącznikowe mogą stanowić krótkie sekwencje dobrane losowo, lub mogą zawierać krótkie fragmenty niewiążących Fc regionów FcγR (na przykład krótkie fragmenty, zawierające lub mniej aminokwasów, z

19 1 2 proksymalnego regionu błonowego odcinka FcγR). Sekwencja łącznikowa może być syntetyczną sekwencją łącznikową, taką jak na przykład GGGGSGGGGS (SEQ ID nr 4), o małej podatności na proteolizę. Taka sekwencja łącznikowa może być stosowana w postaci o 2- tandemowych jednostek Gly4Ser. Sprzęganie regionów wiążących Fc poprzez wiązanie peptydowe lub krótką sekwencję łącznikową umożliwia wytwarzanie polipeptydu z wykorzystaniem rekombinowanych układów ekspresji. [0026] W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania polipeptydu według wynalazku polipeptyd zawiera dwa regiony wiążące Fc z FcγRIIa, sprzężone w konfiguracji głowa do ogona. [0027] W kolejnym szczególnie korzystnym przykładzie wykonania polipeptydu według wynalazku polipeptyd zawiera natomiast dwa pozakomórkowe regiony FcγRIIa, z których każdy zawiera ektodomeny 1 i 2, przy czym te regiony pozakomórkowe są sprzężone w konfiguracji głowa do ogona poprzez łącznik zawierający 1- aminokwasów. [0028] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może ponadto zawierać białko nośnikowe lub polipeptyd nośnikowy (polipeptyd jest fuzją białka nośnikowego lub polipeptydu nośnikowego i wspomnianych dwóch lub więcej sprzężonych regionów wiążących Fc). Białkiem nośnikowym może być dowolne odpowiednie białko nośnikowe lub polipeptyd nośnikowy, dobrze znane specjalistom, lecz korzystnie jest nim ludzka albumina surowicy (HSA) lub inne białko nośnikowe powszechnie stosowane w celu ulepszenia biodostępności (to znaczy poprzez zwiększenie czasu półtrwania polipeptydu w

20 surowicy po podaniu osobnikowi). Korzystnie, białko nośnikowe można poddawać fuzji z polipeptydem przez ekspresję polipeptydu jako białka fuzyjnego z białkiem nośnikowym dowolnym ze sposobów dobrze znanych specjalistom. [0029] Polipeptyd według niniejszego wynalazku może ponadto zawierać inne użyteczne, sprzężone cząsteczki, na przykład glikol etylenowy (tak, że powstaje polipeptyd PEGylowany) w celu ulepszenia biodostępności, cząsteczki regulujące dopełniacz, takie jak CD46, CD i CD9, cytokiny (w celu na przykład umożliwiania dostarczania cytokin do miejsc zapalenia) i receptory cytokin. [00] Ponadto, jak wspomniano powyżej, do wytwarzania białka lub polipeptydu według wynalazku można stosować poddane fuzji domeny polipeptydowe, zdolne do wzajemnego wiązania się ze sobą. [0031] Przez wykorzystanie na przykład polipeptydu zawierającego dwa regiony wiązania Fc poddane fuzji z domeną polipeptydową zdolną do wiązania się z inną domeną polipeptydową, które mogą być takie same lub różne, przy czym ten polipeptyd może być poddany fuzji z innym polipeptydem, zawierającym dwa regiony wiązania Fc, można więc wytworzyć białko, zawierające cztery regiony wiążące Fc (innymi słowy, dimeryczne białko, zawierające cztery sprzężone regiony wiążące Fc). Korzystnie, można to osiągnąć przez zastosowanie domeny Fc immunoglobuliny (na przykład IgG, takiej jak IgG 1 ), ponieważ taka domena Fc jest zdolna do dimeryzacji (z inną domeną Fc). Korzystnie, domena Fc jest zmodyfikowana (na przykład przez substytucję jednego

21 lub więcej niż jednego aminokwasu na resztach o kluczowym znaczeniu dla wiązania z receptorami Fc) w celu zapobieżenia samowiązaniu domen Fc ze sprzężonymi regionami wiążącymi Fc, jak również w celu zapobieżenia wiązaniu z receptorami Fc in vivo. W jednej ze szczególnie korzystnych zmodyfikowanych domen Fc do stosowania w ten sposób, domena Fc pochodzi z IgG 1 (Wines i wsp., 00) i zawiera modyfikację aminokwasową na aminokwasie 234 i(lub) 23, a mianowicie Leu 234 i(lub) Leu 23. Te reszty leucynowe znajdują się w obrębie dolnej części regionu zawiasowego IgG 1, przy czym receptor Fc łączy się z domeną Fc. Jedna lub obie reszty leucynowe mogą być podstawione lub poddane delecji celem uniemożliwienia łączenia z receptorem Fc (to znaczy wiązania); na przykład, Leu 234 i(lub) Leu 21 mogą być podstawione alaniną (to znaczy L234A i(lub) L23A) lub innym odpowiednim aminokwasem lub aminokwasami (Wines i wsp., 00). [0032] Podobnie, poprzez zastosowanie polipeptydu, zawierającego dwa lub więcej niż dwa regiony wiążące Fc sprzężone, na przykład, w konfiguracji głowa do ogona poprzez wiązanie peptydowe, krótką sekwencję łącznikową lub inne usieciowanie chemiczne, poddanego fuzji z domeną polipeptydową zdolną do wiązania się z inną domeną polipeptydową, która może być taka sama lub różna i która jest poddana fuzji z innym polipeptydem, zawierającym dwa lub więcej niż dwa sprzężone regiony wiążące Fc, można wytworzyć białko, zawierające co najmniej cztery region wiążące Fc (innymi słowy, multimeryczne białko, zawierające cztery sprzężone

22 regiony wiążące Fc). W drugim aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest cząsteczka polinukleotydu, zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą rozpuszczalne, multimeryczne białko lub polipeptyd według pierwszego aspektu. [0033] Cząsteczka polinukleotydu może składać się z kasety ekspresyjnej lub wektora ekspresyjnego (takiego jak na przykład plazmid do wprowadzania do komórki gospodarza bakteryjnego lub wektor wirusowy, taki jak wektor bakulowirusowy do transfekcji komórki gospodarza-owada, albo plazmid lub wektor wirusowy, taki jak lentiwirus, do transfekcji komórki gospodarzassaka). [0034] W trzecim aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem rekombinowana komórka gospodarza, zawierająca cząsteczkę polinukleotydu, zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą rozpuszczalne, multimeryczne białko lub polipeptyd według pierwszego aspektu. [003] Rekombinowaną komórkę gospodarza można dobierać spośród komórek bakteryjnych, takich jak E. coli, komórek drożdży, takich jak P. pastoris, komórek owadów, takich jak komórki Spodoptera Sf9, komórek ssaków, takich jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki nerki małpiej (COS) i ludzkiej nerki zarodkowej 293 (HEK 293), oraz komórek roślinnych. [0036] W czwartym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania białka lub polipeptydu, obejmujący następujące etapy: (i) zapewnienie rekombinowanej komórki gospodarza, zawierającej cząsteczkę polinukleotydu, zawierającą

23 sekwencję nukleotydową kodującą rozpuszczalne, multimeryczne białko lub polipeptyd według pierwszego aspektu, (ii) hodowla tej komórki gospodarza w odpowiedniej pożywce hodowlanej i w warunkach odpowiednich do ekspresji tego rozpuszczalnego, multimerycznego białka lub polipeptydu, i (iii) izolowanie tego rozpuszczalnego, multimerycznego białka lub polipeptydu z pożywki hodowlanej. [0037] Białko lub polipeptyd można izolować z wykorzystaniem dowolnego ze sposobów dobrze znanych specjalistom. Białko lub polipeptyd można na przykład łatwo izolować z wykorzystaniem technik chromatografii powinowactwa do unieruchomionego metalu lub z zastosowaniem technik chromatografii z unieruchomioną IgG lub IgG agregowaną cieplnie (HAGG). [0038] W piątym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób leczenia osobnika z choroby zapalnej, obejmujący podawanie osobnikowi rozpuszczalnego, multimerycznego białka lub polipeptydu według pierwszego aspektu ewentualnie w połączeniu z nośnikiem lub zaróbką dopuszczalnym w farmacji lub medycynie weterynaryjnej. [0039] Sposób nadaje się do leczenia chorób zapalnych, takich jak choroby zapalne zależne od IC, na przykład RA, ITP, SLE, zapalenie kłębuszków nerkowych i indukowany heparyną zespół małopłytkowości i zakrzepicy (HITTS). [0040] Osobnikiem typowo będzie człowiek, lecz sposób według piątego aspektu może również nadawać się do

24 2 1 2 stosowania u zwierząt, takich jak zwierzęta hodowlane (na przykład konie wyścigowe) i zwierzęta domowe. [0041] Termin nośnik lub zaróbka dopuszczalne w farmacji lub medycynie weterynaryjnej ma oznaczać dowolny dopuszczalny w farmacji lub medycynie weterynaryjnej rozpuszczalnik, środek zawieszający lub zaróbkę do podawania białka lub polipeptydu według niniejszego wynalazku osobnikowi. [0042] Białko lub polipeptyd można podawać osobnikowi dowolną z dróg dobrze znanych specjalistom, zwłaszcza poprzez podawanie dożylne (iv), śródskórne (id), podskórne (sc), doustne i donosowe. Przy podawaniu podskórnym podanie można przeprowadzić przez wstrzyknięcie lub z użyciem cewnika wprowadzonego pod skórę. Zamiast tego podawanie podskórne można prowadzić z użyciem kompozycji wszczepów o przedłużonym uwalnianiu lub wstrzykiwalnych kompozycji typu depot. [0043] Typowo, białko lub polipeptyd będzie się podawać w dawce w zakresie od 0, do 1 mg/kg masy ciała osobnika dziennie. Specjalista zda sobie jednak sprawę, że dawka skuteczna (to znaczy ilość substancji w dawce, która będzie skuteczna w leczeniu choroby zapalnej) będzie się zmieniać w zależności od wielu czynników, takich jak wiek i ogólny stan zdrowia osobnika oraz ciężkość leczonej choroby zapalnej. Specjalista jest w stanie określić lub zoptymalizować ilość środka odpowiednią do osiągnięcia dawki skutecznej u każdego osobnika. [0044] W kolejnych aspektach niniejszego wynalazku zapewnia się kompozycję, zawierającą rozpuszczalne multimeryczne białko lub polipeptyd według pierwszego

25 aspektu, ewentualnie w połączeniu z nośnikiem lub zaróbką dopuszczalną w farmacji lub medycynie weterynaryjnej, i zastosowanie rozpuszczalnego, multimerycznego białko lub polipeptydu do wytwarzania leku do leczenia choroby zapalnej. [004] Ponadto, białko lub polipeptyd według pierwszego aspektu jest również użyteczne w zastosowaniach innych niż leczenie osobnika z choroby zapalnej. Białko lub polipeptyd można więc także stosować w testach diagnostycznych, służących wykrywaniu krążących kompleksów immunologicznych (IC), występujących w stanach patologicznych w chorobach autoimmunologicznych, takich jak RA i SLE, przy czym białko lub polipeptyd można wykorzystywać w etapie wychwytywania IC (poprzez na przykład związanie białka lub polipeptydu z odpowiednim substratem, takim jak płytka ELISA) zamiast prowadzić typowy etap wytrącania (glikolem polietylenowym), wykorzystywany w takich testach. Po wychwyceniu IC z próbki (na przykład próbki surowicy lub płynu stawowego od osobnika), która ma być poddana badaniu, wychwycony IC można wykrywać poprzez zastosowanie białka lub polipeptydu w postaci, w której jest on sprzężony z cząsteczką, która może służyć jako marker lub reporter (na przykład cząsteczki wyznakowane radiologicznie, cząsteczki chemiluminescencyjne, cząsteczki bioluminescencyjne, cząsteczki fluorescencyjne lub enzymy, takie jak peroksydaza chrzanowa, które mogą generować wykrywalne sygnały). Zamiast tego wychwytywane IC mogłoby być wykrywane lub sondowane z zastosowaniem przeciwciał swoistych wobec pewnych autoantygenów (na przykład

26 cytrulenu w RA, DNA w SLE, La/SS-B w zespole Sjögrena i topoizomeraza DNA I w twardzinie skóry), żeby umożliwić oznaczenie poziomu swoistych autoantygenów w krążących IC, co mogłoby pozwolić na opracowanie testów w kierunku chorób autoimmunologicznych o ulepszonej wartości diagnostycznej lub prognostycznej. Ponadto, podobnie, IC wychwytywane przez białko lub polipeptyd według niniejszego wynalazku, związane z odpowiednim substratem, mogłoby być wykrywane lub sondowane z wykorzystaniem przeciwciał swoistych wobec pewnych antygenów zakaźnych patogenów (takich jak na przykład bakterie, takie jak gronkowce i paciorkowcem pasożyty, takie jak P. falciparum (malaria) i wirusy, takie jak wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus Epsteina- Barr (EBV), ludzki wirus braku odporności (HIV) i arbowirus powodujący dengę), celem dostarczenia informacji użytecznych w identyfikowaniu patogenu wywołującego zakażenie, określania rokowania w chorobie i(lub) postępowania w zakażeniu. [0046] Białko lub polipeptyd według niniejszego wynalazku jest również użyteczne w rozmaitych testach biologicznych, w których może korzystnie hamować uwalnianie czynnika martwicy nowotworów (TNF) z komórek, w tym z makrofagów, komórek dendrytycznych (DC) i neutrofili. Ponadto po sprzężeniu z cząsteczką, która mogłaby służyć jako marker lub reporter, taką jak cząsteczki wymienione powyżej, białko lub polipeptyd można stosować do obrazowania in vivo miejsc zapalenia. [0047] Białko lub polipeptyd według niniejszego wynalazku jest także użyteczne do usuwania krążących IC, związanych z chorobami zapalnymi zależnymi od IC,

27 przy czym białko lub polipeptyd jest związane z odpowiednim substratem, takim jak kulki, włókna lub inne powierzchnie z materiału obojętnego, i eksponowane na pochodzący od osobnika płyn biologiczny (zwłaszcza krew), zawierający kompleksy IC, tak że dochodzi do wychwytu IC i następnie do ich usunięcia z płynu biologicznego. Poddany obróbce płyn biologiczny, w zasadzie pozbawiony IC, można następnie ponownie podać osobnikowi, od którego został pobrany. [0048] W celu lepszego wyjaśnienia natury niniejszego wynalazku, jego korzystne postacie zostaną teraz opisane w odniesieniu do poniższych, nieograniczających przykładów. PRZYKŁADY Przykład 1 Wytwarzanie, oczyszczanie i określanie właściwości multimerycznych polipeptydów FcR Materiały i metody Wytwarzanie multimerycznych wektorów ekspresyjnych FcγRIIa [0049] Region wiążący Fc, zawierający ektodomeny 1 i 2 ludzkiego FcγRIIa, powielono z zastosowaniem jako matrycy cdna termostabilnej polimerazy Pwo (Roche), klon Hu3.0 (Hibbs i wsp., 1988, ACCESSION NM_021642) i primerów obw GTAGCTCCCCCAAAGGCTG (SEQ ID nr1) i obw11 CTACCCGGGTGAAGAGCT-GCCCATG (SEQ ID nr 2). Połowa miejsc SnaBI (wszystkie enzymy modyfikujące DNA pochodziły z New England Biolabs) i SmaI jest podkreślona. Tępy produkt PCR poddano ligacji, stosując ligazę DNA T4, do wektora ppic9 (Invitrogen, Life Technologies) na miejscu EcoRI wypełnionym fragmentami Klenowa

28 polimerazy I DNA, i uzyskano wektor pbar14. W celu uzyskania wektora pbar28, kodującego tandemowe ektodomeny FcγRIIa, pbar14 trawiono SnaBI, do którego poddano ligacji fragment SnaBI/SmaI pbar14. [000] Wektor bakulowirusowy do ekspresji multimeryzowanych ektodomen FcγRIIa wytworzono w następujący sposób: fragment kodujący sekwencję liderową FcγRIIa i ektodomeny 1 i 2 uzyskano z pvl-1392 (Powell i wsp., 1999, i Maxwell i wsp., 1999) przez trawienie EcoRI i XbaI, po czym poddano ligacji do miejsc EcoRI/XbaI zmodyfikowanego pbacpak9 (Invitrogen Life Tech), w których uprzednio miejsce BamHI w miejscu wielokrotnego klonowania wyeliminowano przez trawienie BamHI, wypełniono z zastosowaniem fragmentu Klenowa polimerazy DNA i ponownie poddano ligacji. Ten konstrukt, wektor pbar69, trawiono BamHI, do którego poddano ligacji fragment BamHI pbar28, uzyskując wektory pbar71, pbar72 i pbar73 kodujące, odpowiednio, dimer, trimer i tetramer rsfcγriia. Wielkości wstawek były zdefiniowane przez produkt trawienia EcoRI/XbaI, a poprawność orientacji multimeryzującego fragmentu BamHI badano przesiewowo produktem trawienia PvuII według standardowych protokołów. [001] Wektory ekspresyjne ssaków, kodujące monomer i dimer FcγRIIa, wytworzono w następujący sposób: klon cdna FcγRIIa Hu3.0 (Hibbs i wsp., 1988, i DEFINITION: Homo sapiens Fc fragment of IgG, low affinity IIa, receptor (CD32)(FCGR2A), mrna, ACCESSION NM_021642), powielono z zastosowaniem AccuPrime Pfx PCR (Invitrogen, Life Technologies) i klonowano do wektora Gateway pdonr 221 (Invitrogen, Life Technologies) z

29 1 2 wykorzystaniem reakcji klonazy (BP clonase ) według instrukcji producenta (Invitrogen Life Tech); uzyskano pnb6. W wyniku PCR z zastosowaniem polimerazy AccuPrime Pfx pnb6 z primerami obw11 i obw2 TCTCATCACCACCATCACCACGTCTAGAC-CCAGCTTTCTTGTACAAAG (SEQ ID nr 3), trawienia SmaI i ligacji z użyciem ligazy T4 uzyskano pbar390, kodujący rsfcγriia z C-końcowym tagiem heksahistydynowym. W wyniku trawienia pbar390 BamHI i ligacji fragmentu BamHI pbar28 uzyskano wektor pbar397, kodujący dimer rsfcγriia. Następnie zastosowano produkt trawienia PvuII do przesiewowego badania orientacji dimeryzującego fragmentu BamHI; sekwencjonowanie ABI BigDye3.1 (Applied Biosystems) potwierdziło sekwencję docelową. Następnie zastosowano reakcję klonazy Gateway LR (Invitrogen, Life Technologies) do przeniesienia monomeru FcγRIIa (pbar390) lub dimeru (pbar397) do adaptowanego ramką odczytu-kasetą A Gateway (Invitrogen, Life Technologies) wektora ekspresyjnego papex3p (Evans i wsp, 199, i Christiansen i wsp, 1996), uzyskując wektory ekspresyjne pbar426 i pbar427. Podobnie zastosowano reakcję klonazy Gateway LR do przeniesienia monomeru FcγRIIa (pbar390) lub dimeru (pbar397) do adaptowanego ramką odczytu-kasetą A Gateway (Invitrogen, Life Technologies) wektora ekspresyjnego piresneo (Clontech). Fig. 1 przedstawia sekwencję polinukleotydową (i sekwencję aminokwasową po translacji) konstruktu dimeru w konfiguracji głowa do ogona FcγRIIa w obrębie pbar397 używanego do skonstruowania wektora ekspresyjnego pbar427. Dwa powtórzenia przedstawiono jako aminokwasy (to

30 znaczy pierwszy region wiążący Fc) i (to znaczy drugi region wiążący Fc); są one połączone krótkim (sekwencja 8 aminokwasów: reszty ) fragmentem proksymalnego odcinka błony FcγRIIa z dodatkową resztą waliny (reszta 183, przedstawiona z podkreśleniem na Fig. 1). Aminokwasy od -31 do -1 sekwencji przedstawionej na Fig. 1 odpowiadają naturalnej sekwencji liderowej FcγRIIa. Wytwarzanie monomerycznych i dimerycznych polipeptydów rsfcγriia [002] Przeprowadzono ekspresję rekombinowanych rozpuszczalnych polipeptydów monomerycznych i dimerycznych FcγRIIa (rsfcγriia) w komórkach HEK 293E poprzez transfekcję μg plazmidu DNA (pbar426, pbar427) w studzienkach cm 2 i odczynnikiem Lipofectamine 00 (Invitrogen, Life Technologies) lub Transit (BioRad Laboratories) według instrukcji producenta. Po 48 godzinach transfekowane komórki selekcjonowano przez inkubację w 4µg/ml puromycyny. Komórki wyselekcjonowane w puromycynie hodowano następnie w pożywce CD293 uzupełnionej 1% FCS (Invitrogen, Life Technologies) do fazy stacjonarnej. Rekombinowany produkt oczyszczano następnie przez chromatografię na unieruchomionych kolumnach niklowych (Qiagen) lub kobaltowych (Clontech) i dalej oczyszczano z użyciem chromatografii z wykluczeniem ze względu na wielkość Superdex 0 lub Superdex G7 (Amersham/Pharmacia). Porównanie oznaczeń powinowactwa polipeptydów monomerycznych i dimerycznych rsfcγriia

31 [003] Przeprowadzono oznaczenia powinowactwa oczyszczonego monomeru i dimeru rsfcγriia z użyciem standardowego protokołu testowego BIAcore (Wines i wsp., 01; Wines i wsp., 03); monomer lub dimer rsfcγriia wstrzykiwano w różnym stężeniu nad unieruchomiony ludzki monomer IgG (Sandoglobulin, Novartis) lub IgG agregowaną cieplnie (HAGG, Wines i wsp., 1988; Wines i wsp., 03) przez 60 minut, po czym powierzchnię regenerowano (Wines i wsp., 03). Unieruchomienie ludzkiego monomeru IgG na powierzchni biosensora powoduje, że staje się ona zestawem multiwalentnym, naśladującym kompleks immunologiczny. Porównanie aktywności hamującej polipeptydów monomerycznych i dimerycznych rsfcγriia [004] Oczyszczony monomer i dimer rsfcγriia inkubowano z roztworem ludzkiego monomeru IgG (Sandoglobulin) i dimeru IgG (Wright i wsp., 198) w rosnącym stężeniu. Następnie oznaczano ilość wolnego polipeptydu receptora poprzez wstrzyknięcie nad unieruchomiony monomer ludzkiej IgG według standardowego protokołu testowego BIAcore. Hamowanie wiązania kompleksów immunologicznych z komórkami ludzkimi przez polipeptydy monomeryczne i dimeryczne rsfcγriia [00] Oznaczano wiązanie drobnych kompleksów immunologicznych (reprezentowanych przez dimer-igg) z ludzkimi neutrofilami (ochotników V1 i V) w nieobecności i w obecności oczyszczonych polipeptydów monomerycznych i dimerycznych rsfcγriia przez analizę metodą cytometrii przepływowej (Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience).

32 Hamowanie stymulowanego przez kompleks immunologiczny wydzielania TNF przez MDM (makrofagi pochodzące z monocytów) przez polipeptydy monomeryczne i dimeryczne rsfcγriia [006] W pierwszym doświadczeniu z krwi ludzkiej (ochotnik V) ekstrahowano za pomocą sortera automacs TM (Miltenyi Biotec) obwodowe komórki jednojądrzaste dodatnio sortujące się pod kątem ekspresji CD14 i umożliwiono im różnicowanie przez 24 godziny w obecności M-CSF do MDM (makrofagów pochodzących z monocytów) przed stymulacją drobnymi kompleksami immunologicznymi w różnym stężeniu (reprezentowanymi przez dimer-igg), w nieobecności i w obecności dimeru rsfcγriia (w nadsączu w stężeniu 2, μg/ml). Następnie oznaczano wydzielanie TNF z MDM przez ELISA ludzkiego TNF według protokołu producenta (BD Pharmingen). W drugim doświadczeniu podobnie wytworzono ex vivo MDM z krwi ludzkiej (tym razem od ochotnika V1) i umożliwiono im różnicowanie przez 24 godziny przed stymulacją drobnymi kompleksami immunologicznymi (to znaczy dimerem-igg) w różnym stężeniu, w nieobecności i w obecności dimeru rsfcγriia (w nadsącz w stężeniu 2, µg/ml). Hamowanie aktywacji kompleksów immunologicznych płytek krwi przez polipeptydy dimeryczne rsfcγriia [007] Sporządzono płukane płytki krwi przez odwirowanie krwi pełnej z małą prędkością (Thai i wsp., 03) i stymulowano je agregowaną cieplnie IgG (HAGG). Mierzono aktywację płytek krwi na podstawie zwiększonej ekspresji powierzchniowej P-selektyny (CD62P) metodą cytometrii przepływowej (Lau i wsp., 04).

33 Wyniki Ekspresja polipeptydów monomerycznych i multimerycznych rsfcγriia z komórek owadów [008] Analiza Western blot nadsączy z zakażonych komórek wykazała skuteczne wytwarzanie postaci dimerycznych i trimerycznych rekombinowanego, rozpuszczalnego FcγRIIa (Fig. 2). Jakkolwiek wykrywano pewną ilość polipeptydu trimerycznego, ulegał on w znacznym stopniu rozszczepianiu do postaci dimerycznej; tetramer natomiast nie był wykrywany, ponieważ ulegał w znacznym stopniu rozszczepianiu do postaci dimerycznej. Jako że dimer FcγRIIa wykazywał największą stabilność wewnętrzną, jego właściwości zostały dokładniej zbadane i podjęto jego rozwój w układach ekspresji ssaków (tzn. w komórkach HEK293E). [009] Ponieważ jednak natywny FcγRIIa można usuwać z powierzchni leukocytów przez proteolizę (Astier i wsp., 1994), jedną ze strategii minimalizacji proteolizy trimerów, tetramerów i większych multimerów byłaby eliminacja lub, korzystniej, zastąpienie proksymalnej wobec błony, tworzącej porównywany do łodygi odcinek sekwencji łącznikowej, sprzęgającej regiony pozakomórkowe FcγRIIa. Podatność na proteolizę proksymalnej wobec błony, tworzącej porównywany do łodygi odcinek sekwencji łącznikowej można na przykład zmniejszać poprzez jedną lub więcej niż jedną modyfikację aminokwasową (na przykład jedną lub więcej niż jedną substytucję, delecję i(lub) addycję aminokwasową lub innego rodzaju zastąpienie tej sekwencji łącznikowej syntetyczną sekwencją łącznikową,

34 3 1 2 taką jak na przykład GGGGSGGGGS (SEQ ID nr 4), która cechuje się małą podatnością na proteolizę. [0060] Inną strategią skutecznego wytwarzania trimerów, tetramerów i większych multimerów byłoby sprzęganie ulegającego ekspresji polipeptydu dimerycznego z jeszcze jednym lub więcej niż jednym polipeptydem monomerycznym lub innym polipeptydem dimerycznym przez sieciowanie chemiczne. Multimery dimerów FcγRIIa można również wytwarzać przez ekspresję polipeptydu dimerycznego jako białka fuzyjnego z domeną Fc (na przykład domeną IgG Fc), która jest sama w sobie dimeryczna, będzie zatem dimeryzować wszelkich partnerów fuzji. Ekspresja polipeptydów monomerycznych i dimerycznych rsfcγriia z komórek ssaków [0061] Wydajność wytwarzania białka w przypadku oczyszczonego monomeru rsfcγriia wynosiła 3 mg/l (konstrukt pbar 426), a w przypadku dimeru rsfcγriia do ~0, mg/l (konstrukt pbar 427). Fig. 3 przedstawia barwiony Coomassie SDS-PAGE (12% żel akryloamidowy, w warunkach nieredukujących) frakcji zebranej z oczyszczania monomeru i dimeru rsfcγriia. Oczekiwana wielkość monomeru rsfcγriia wynosi ~ kda (a), natomiast oczekiwana wielkość dimeru rsfcγriia wynosi ~60 kda (b). Porównanie oznaczeń powinowactwa polipeptydów monomerycznych i dimerycznych rsfcγriia [0062] Wyniki testów przedstawiono na Fig. 4 i. Testy wykazały, że monomer rsfcγriia zawiera miejsce pojedynczego wiązania o stałej dysocjacji powinowactwa (K D ) wynoszącej 1,7 μm dla ludzkiego monomeru IgG i