(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP97/05079 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO98/11909, PCT Gazette nr 12/98 (11) (13) B1 (51) IntCl7 A61K 38/17 C07K 14/47 A61P 37/00 (54) Zastosowanie białka do leczenia chorób autoimmunologicznych (30) Pierwszeństwo: ,IT,MI96A ,IT,MI96A ,IT,MI96A ,IT,MI96A (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/99 (73)Uprawniony z patentu: ZETESIS S.P.A., Mediolan, IT (72) Twórcy wynalazku: Alberto E. Panerai, Mediolan, IT Alberto Bartorelli, Mediolan, IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/05 (74) Pełnomocnik: Bartnik Urszula, PO LSERVICE Sp. z o.o. PL B1 (5 7) 1. Zastosowanie białka o następującej sekwencji: M et(1)-ser-glu-asn-ser(5)-glu-glu- Pro-V al-g ly(10)-g lu-a la-lys-a la-pro(15)-a la-a la-ile-g ly-pro(20)-t yr-ser-g ln- A la-v al(25)-leu-v al-asp-a rg-thr(30)-ile-tyr-ile-ser-g ly(35)-g ln-leu-g ly-m et- Asp(40)-Pro-Ala-Ser-Gly-Gln(45)-Leu-Val-Pro-Gly-Gly(50)-Val-Val-Glu-Glu-Ala(55)- Lys-Gln-Ala-Leu-Thr(60)-Asn-Ile-Gly-Glu-Ile(65)-Leu-Lys-Ala-Ala-Gly(70)-Cys-Asp- Phe-Thr-Asn(75)-Val-Val-Lys-Ala-Thr(80)-Val-Leu-Leu-Ala-Asp(85)-Ile-Asn-Asp-Phe- Ser(90)-A la-v al-a sn-asp-v al(95)-tyr-lys-g ln-tyr-phe(100)-g ln-ser-ser-phe- Pro(105)-Ala-A rg-a la-a la-tyr(110)-gln-val-ala-ala-leu(115)-pro-lys-gly-gly- A rg(120)-v al-g lu-ile-g lu-a la(125)-ile-a la-v al-g ln-g ly(130)-pro-leu-thr-thr- Ala(135)-Ser-Val do wytwarzania leku do leczenia chorób autoimmunologicznych.

2 Zastosowanie białka do leczenia chorób autoimmunologicznych Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie białka o następującej sekwencji: Met(l)-Ser-Glu-Asn-Ser(5)-Glu-Glu- Pro-Val-Gly(10)-Glu-Ala-Lys-Ala-Pro(15)-Ala-Ala-Ile-Gly-Pro(20)-Tyr-Ser-Gln-Ala- Val(25)-Leu-Val-Asp-Arg-Thr(30)-Ile-Tyr-Ile-Ser-Gly(35)-Gln-Leu-Gly-Met-Asp(40)-Pro- Ala-Ser-Gly-Gln(45)-Leu-Val-Pro-Gly-Gly(50)-Val-Val-Glu-Glu-Ala(55)-Lys-Gln-Ala-Leu- Thr(60)-Asn-Ile-Gly-Glu-Ile(65)-Leu-Lys-Ala-Ala-Gly(70)-Cys-Asp-Phe-Thr-Asn(75)-Val- Val-Lys-Ala-Thr(80)-Val-Leu-Leu-Ala-Asp(85)-Ile-Asn-Asp-Phe-Ser(90)-Ala-Val-Asn-Asp- Val(95)-Tyr-Lys-Gln-Tyr-Phe(100)-Gln-Ser-Ser-Phe-Pro(105)-Ala-Arg-Ala-Ala-Tyr(110)- Gln-Val-Ala-Ala-Leu(115)-Pro-Lys-Gly-Gly-Arg(120)-Val-Glu-Ile-Glu-Ala(125)-Ile-Ala- Val-Gln-Gly(130)-Pro-Leu-Thr-Thr-Ala(135)-Ser-Val do wytwarzania leku do leczenia chorób autoimmunologicznych. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosowane białko wykazuje przynajmniej 80% homologii do białka opisanego w zastrzeżeniu Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą jest miażdżyca tętnic po transplantacji. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą jest zapalenie stawów. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą jest stwardnienie rozsiane. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą jest cukrzyca. * * * Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie białka ekstrahowanego z organów zwierzęcych, zwłaszcza z wątroby ssaków, do wytwarzania leku, aktywnego przeciwko chorobom autoimmunologicznym, w szczególności aktywnego przeciwko miażdżycy tętnic, zapaleniu stawów, stwardnieniu rozsianemu i cukrzycy. Podawanie kompletnego adiuwanta Freund'a prowadzi do wywołania doświadczalnego zapalenia stawów, bardzo podobnego do reumatoidalnego zapalenia stawów u szczurów. Z drugiej strony podawanie tego adiuwanta królikom nie wywołuje patologii w postaci zapalenia stawów lecz miażdżycę tętnic. Przeprowadzone badania potwierdziły w obydwu zmianach chorobowych immunoreaktywność na czynnik endogenny, który zidentyfikowano jako białko szoku termicznego 60 (ang. Heat Shock Protein 60) HSP60. Następne badania potwierdziły te obserwacje, oraz stwierdziły, że podanie kompletnego adiuwanta Freund'a można zastąpić za pomocą podania HSP-60 uzyskując te same zmiany patologiczne. Ponadto, wstępne podawanie szczurom adiuwanta, HSP60 lub jego fragmentów prowadzi do zapobiegania początkowi zapalenia stawów, przy niewyjaśnionym jeszcze mechanizmie, podczas gdy następne podania adiuwanta pogarszają przebieg choroby. Zgodnie z ostatnimi doniesieniami, wstępne podawanie adiuwanta zapobiega również innym doświadczalnym zmianom patologicznym, które ogólnie można nazwać chorobami auto immunologicznymi, takimi jak, cukrzyca lub doświadczalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE). Na koniec, stwierdzono, że HSP60 wykazuje strukturalne analogie do dużej ilości autoantygenów, tym samym można przypuszczać, że związane jest z większą ilością patologicznych stanów niż określono to dotychczas. W opisie międzynarodowego zgłoszenia patentowego numer WO 92/10197 przedstawiono frakcje białkowe ekstrahowane kwasem nadchlorowym z organów ssaków i ich zastosowanie jako czynników przeciwnowotworowych. Wśród tych frakcji, za pomocą elektroforezy w żelu, zidentyfikowano trzy główne składniki o masie cząsteczkowej 50, 14 i 10 kda. Oczyszczony ekstrakt zawierający te trzy składniki poniżej oznaczono jako UK 101. Sekwencję składnika białkowego o 14 kda, który jest głównym, jeśli nie jedynym, odpowiedzialnym za wymienione aktywności, przedstawiono w poniższej tabeli i w opisie międzynarodowego

3 zgłoszenia patentowego numer WO 96/02567 i okazała się ona zgodna z opisaną przez innych autorów (Levy-Favatier i jego współpracownicy w Eur.Biochem., 1903,212(3), ), którzy zakładali, że nowo zidentyfikowane sekwencje należały do rodziny białek zwanych chaperoninami, do których należą białka HSP. Białka opisane w opisie międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 92/10197 oraz białka opisane w opisie międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 96/02567 (w niniejszym opisie zwane UK 114) wykazują właściwości nigdy nie obserwowane u chaperonin lub analogicznych białek. Bardziej szczegółowo, stwierdzono, że wymienione białka można stosować w celu zapobiegania i leczenia chorób autoimmunologicznych, w szczególności stanów miażdżycowych tętnic, takich jak, miażdżyca tętnic wywołana transplantacją organów, zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i cukrzyca. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka o następującej sekwencji: Met (1)-Ser-Glu-Asn-Ser(5)-Glu-Glu-Pro-Val-Gly(10)-Glu-Ala-Lys-Ala-Pro(15)-Ala- Ala-Ile-Gly-Pro(20)-Tyr-Ser-Gln-Ala-Val(25)-Leu-Val-Asp-Arg-Thr(30)-Ile-Tyr-Ile-Ser- Gly(35)-Gln-Leu-Gly-Met-Asp(40)-Pro-Ala-Ser-Gly-Gln(45)-Leu-Val-Pro-Gly-Gly(50)-Val- Val-Glu-Glu-Ala(55)-Lys-Gln-Ala-Leu-Thr(60)-Asn-Ile-Gly-Glu-Ile(65)-Leu-Lys-Ala-Ala- Gly(70)-Cys-Asp-Phe-Thr-Asn(75)-Val-Val-Lys-Ala-Thr( 8 0)-Val-Leu-Leu-Ala-Asp( 8 5)-Ile- Asn-Asp-Phe-Ser(90)-Ala-Val-Asn-Asp-Val(95)-Tyr-Lys-Gln-Tyr-Phe(100)-Gln-Ser-Ser- Phe-Pro(105)-Ala-Arg-Ala-Ala-Tyr(110)-Gln-Val-Ala-Ala-Leu(115)-Pro-Lys-Gly-Gly- Arg(120)-Val-Glu-Ile-Glu-Ala(125)-Ile-Ala-Val-Gln-Gly(130)-Pro-Leu-Thr-Thr-Ala (135)- Ser-Val do wytwarzania leku do leczenia chorób autoimmunologicznych. Korzystnie stosowane białko wykazuje przynajmniej 80% homologii do białka opisanego wyżej. Korzystnie chorobą jest miażdżyca tętnic po transplantacji. Korzystnie chorobą jest zapalenie stawów. Korzystnie chorobą jest stwardnienie rozsiane. Korzystnie chorobą jest cukrzyca. Aktywność przeciwko miażdżycy tętnic Stwierdzono, że obecnie częstszą przyczyną niepowodzenia przeszczepów organów nie jest odrzucenie, ale tworzenie płytek miażdżycowych w miejscu kontaktu pomiędzy naczyniami organu przeszczepianego i naczyniami biorcy. Patologię tą pogarszają zwykłe środki immunosupresyjne, takie jak, cyklosporyny, podczas gdy stosowanie AZT, który jest jednakże bardzo toksyczny, wydaje się być bardziej użyteczne. Aktywność białek UK 101 i UK 114 badano stosując zarówno konwencjonalny model miażdżycy tętnic, który jest modelem królika poddanego wstępnie działaniu kompletnego adiuwanta Freund'a oraz model miażdżycy tętnicy przeszczepowej. W pierwszym przypadku, podskórne działanie adiuwantem w czasie 2 1 dni powodowało tworzenie płytek miażdżycowych w rozwidleniu biodrowym i łuku aorty. Wstępne podawanie (7 dni przed) białek UK 101 lub UK 114 znacząco zapobiegało rozwojowi patologii u wysokiego procentu przypadków w porównaniu z działaniem tylko adiuwantem, które prowadziło do rozwoju choroby u wszystkich zwierząt. Z drugiej strony, doświadczalny model przeszczepowej miażdżycy tętnic opierał się na żylnych połączeniach omijających na poziomie tętnic u szczura. Po krótkim czasie, obserwowano tworzenie płytek miażdżycowych na poziomie naczynia biorcy, jak to się dzieje w patologii u ludzi. Wstępne działanie (7 dni przed) białkami UK 101 lub UK 114 znacząco zapobiegało rozwojowi patologii u wysokiego procentu przypadków w porównaniu z tym, co obserwowano u zwierząt nie poddawanych działaniu białek wstępnie przed przeszczepem. Aktywność przeciw zapaleniu stawów Aktywność tę badano przy użyciu konwencjonalnego modelu doświadczalnego zapalenia stawów, polegającego na wywoływaniu zapalenia stawów za pomocą adiuwanta. W modelu tym szczurom Lewis iniekcyjnie do nasady ogona podawano kompletny adiuwant Freund'a, co powodowało wystąpienie patologicznych zmian w tylnej łapie, charakteryzujących się opuchnięciem i zmianami w stawach. Patologia osiąga maksymalny poziom w czasie pomiędzy 14-tym i 21-tym dniem, po czym ustępuje i łapa powraca do normalnego stanu. Wstępne podawanie (7 dni przed) UK 101 lub UK 114 w znacznym stopniu zapobiega rozwojowi

4 zmian patologicznych w wysokim procencie przypadków, w porównaniu z przypadkami otrzymującymi tylko adiuwant, u których rozwój zmian patologicznych występował u 100% zwierząt. Działanie UK 101 lub UK 114 po podaniu adiuwanta obniżało rozwój zmian patologicznych. Tym samym stwierdzono, że UK 101 i UK 114 zdolne są do zmodyfikowania rozwoju lub zapobiegania zmianom patologicznym, takim jak, zapalenie stawów i reumatoidalne zapalenie stawów. Aktywność przeciwko stwardnieniu rozsianemu Badanie to przeprowadzano przy użyciu konwencjonalnego modelu stwardnienia rozsianego: doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Stan patologiczny wywoływano za pomocą podskórnej iniekcji szczurom Lewis, homogenatu rdzenia kręgowego świnek morskich z kompletnym adiuwantem Freund'a. Patologia objawiała się jako postępujący paraliż zaczynający się od tylnych kończyn, który rozpoczynał się około 12 dnia, osiągał maksimum w około 21 dniu i zanikał około 30 dnia od podania immunogenu. Wstępne działanie (7 dni przed) UK 101 lub UK 114 znacząco zapobiegało rozwojowi patologii u wysokiego procenta przypadków i przyczyniało się do zmniejszenia występującej patologii, w porównaniu z działaniem tylko homogenatem rdzenia i adiuwantem, które prowadziło do rozwoju patologii u 100% zwierząt. Z tego powodu UK 101 i UK 114 wydają się być zdolne do zmiany postępu choroby lub zapobiegania stanom patologicznym, takim jak, stwardnienie rozsiane. Aktywność przeciw cukrzycy Badanie to przeprowadzano przy użyciu konwencjonalnego modelu cukrzycy, reprezentowanego przez szczury BB, u których samorzutnie rozwinęła się cukrzyca około 45 dnia życia. Zwierzęta leczono od 30 dnia życia białkami UK 101 lub UK 114 i obserwowano rozwój patologii, w porównaniu z nieleczonymi zwierzętami kontrolnymi. Wstępne leczenie przeprowadzano w celu zmniejszenia występowania i ostrości patologii w modelu doświadczalnym. Kilku pacjentów dotkniętych nowotworami w różnych miejscach i także cierpiących na cukrzycę leczono UK 101 w czasie zwartego leczenia substancją. Wszyscy leczeni pacjenci, niezależnie od działania na patologię nowotworu, wykazywali remisję patologii przebiegającą tak daleko, jak przy przerwaniu terapii insulinowej. Z tego powodu UK 101 i UK 114 wydają się być zdolne do zmieniania przebiegu cukrzycy lub zapobiegania jej. Aktywność przeciw cukrzycy faktycznie potwierdzono, jakkolwiek dotychczas na ograniczonej liczbie przypadków, także w warunkach in vivo u pacjentów cierpiących na cukrzycę. Białka według niniejszego wynalazku mogą być podawane z zastosowaniem odpowiednich form, głównie iniekcyjnych. Sposób podawania (dawki, częstotliwość podawania i tym podobne) określa się zgodnie z warunkami, w zależności od czynników, takich jak, stan pacjenta, faza choroby i tym podobne, ale zwykle odpowiednia jest dzienna dawka wahająca się od 1 do 100 mg. Tabela M et(1)-ser-g lu-a sn-ser(5)-g lu-g lu-pro-v al-g ly(10)-g lu-a la-lys-a la-pro(15)-ala- A la-ile-gly-pro(20)-tyr-ser-gln-ala-val(25)-leu-val-asp-arg-thr(30)-ile-tyr-ile-ser- Gly(35)-Gln-Leu-Gly-Met-Asp(40)-Pro-Ala-Ser-Gly-Gln(45)-Leu-Val-Pro-Gly-Gly(50)-Val- Val-Glu-Glu-Ala(55)-Lys-Gln-Ala-Leu-Thr(60)-Asn-Ile-Gly-Glu-Ile(65)-Leu-Lys-Ala-Ala- Gly(70)-Cys-Asp-Phe-Thr-Asn(75)-Val-Val-Lys-Ala-Thr(80)-Val-Leu-Leu-Ala-Asp(85)-Ile- A sn-asp-phe-ser(90)-ala-val-asn-asp-val(95)-tyr-lys-gln-tyr-phe(100)-gln-ser-ser- Phe-Pro(105)-A la-a rg-a la.a la-t yr(1 10)-G ln-val-a la-a la-leu(115)-pro-lys-gly-gly- Arg(120)-Val-Glu-Ile-Glu-Ala(125)-Ile-Ala-Val-Gln-Gly(130)-Pro-Leu-Thr-Thr-Ala(135)- Ser-Val

5 Lista sekwencji (1) Informacje ogólne: (i) Zgłaszający: (A) Nazwa: Zetesis s.p.a. (B) Ulica: Galleria del Corso 2 (C) Miasto: Mediolan (E) Państwo: Włochy (F) Kod pocztowy (ZIP): (ii) Tytuł wynalazku: Zastosowanie białek jako czynników przeciwko chorobom autoimmunologicznym (iii) Liczba sekwencji : 1 (iv) Zapis komputerowy: (A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: PC kompatybilny z IBM (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1,0, wersja # 1,30 (EPO) (2) Informacja o sekwencji ID o numerze identyfikacyjnym: 1: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 137 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Ilość nici: (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczne: brak (iv) Anty-sensowne: brak

6 (xi) Opis sekwencji: sekwencja ID o numerze identyfikacyjnym: 1: Met( 1 ) -Ser-Glu-Asn-Ser( 5 ) -Glu-Glu-Pro-Val-Gly(10)-Glu-Ala-Lys- Ala-Pro(15)-Ala-Ala-Ile-Gly-Pro(20)-Tyr-Ser-Gln-Ala-Val(25)- Leu-Val-Asp-Arg-Thr(30)-Ile-Tyr-Ile-Ser-Gly(35)-Gln-Leu-Gly- Met-Asp(40)-Pro-Ala-Ser-Gly-Gln(45)-Leu-Val-Pro-Gly-Gly(50)- Val-Val-Glu-Glu-Ala(55)-Lys-Gln-Ala-Leu-Thr(60)-Asn-Ile-Gly- Glu-Ile(65)-Leu-Lys-Ala-Ala-Gly(70)-Cys-Asp-Phe-Thr-Asn(75)- Val-Val-Lys-Ala-Thr(80)-Val-Leu-Leu-Ala-Asp(85)-Ile-Asn-Asp- Phe-Ser(90)-Ala-Val-Asri-Asp-Val(95)-Tyr-Lys-Gln-Tyr-Phe(100)- Gln-Ser-Ser-Phe-Pro(105)-Ala-Arg-Ala-Ala-Tyr(110)-Gln-Val-Ala- Ala-Leu(115)-Pro-Lys-Gly-Gly-Arg(120)-Val-Glu-Ile-Glu- Ala(125)-Ile-Ala-Val-Gln-Gly(130)-Pro-Leu-Thr-Thr-Ala(135)- Ser-Val Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.