dr Aleksandra Smyłła Zakład Mikrobiologii i Biotechnologii Akademia Jana Długosza Częstochowa Zagrożenia bakteryjne wód powierzchniowych

Transkrypt

1 dr Aleksandra Smyłła Zakład Mikrobiologii i Biotechnologii Akademia Jana Długosza Częstochowa Zagrożenia bakteryjne wód powierzchniowych Związek między odprowadzaniem ścieków do Tamizy a powtarzającymi się epidemiami cholery zaobserwował John Snow. W 1855 roku wykazał on po raz pierwszy, że przyczyną wystąpienia epidemii cholery w Londynie była woda z miejskiej studni, usytuowanej poniżej odpływu ścieków [15]. Wydaje się, że minęły czasy masowych zakażeń przenoszonych drogą wodną, jak np. epidemia cholery w 1892, zaistniała na skutek awarii, która spowodowała wprowadzenie do sieci wody z Łaby. Zachorowało wtedy 17 tys. osób, z czego 8 tys. zmarło [24]. Postęp w gospodarce wodno - ściekowej, wyeliminował epidemie o takim zasięgu, jednak zagrożenie bakteryjne nie minęło, ponieważ nie został rozwiązany problem skutecznego unieszkodliwiania ścieków [13]. Ścieki są nadal odprowadzane do wód powierzchniowych i do ziemi. W Polsce w 2003 r oczyszczalnie ścieków obsługiwały tylko 58% ludności kraju. Nadal 44 miasta i 15% zakładów przemysłowych odprowadza ścieki bezpośrednio do środowiska. Tylko 343 miasta posiadały oczyszczalnie z podwyższonym poziomem usuwaniem biogenów, co stanowi 46% ogólnej liczby ścieków [17]. W Unii Europejskiej (dane przed rozszerzeniem) oczyszczalnie obsługują 90% ludności jednak z 527 miast o liczbie powyżej 150 tys. mieszkańców, 37 miast odprowadzało swoje ścieki bez należytego oczyszczenia [13]. Jako odbiorniki ścieków od lat są wykorzystywane rzeki i zbiorniki wodne, co doprowadziło do ich degradacji. Ścieki, szczególnie komunalne, są tym czynnikiem stwarzającym zagrożenia bakteriami, wnoszą bowiem do wód powierzchniowych ogromne ilości drobnoustrojów: bakterii, wirusów, grzybów, pierwotniaków nazywanych florą allochtoniczną, czyli naniesioną. Większość flory allochtonicznej należy do typowej mikroflory, żyjącej w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt wyższych tworzącej tzw. florę fizjologiczną organizmu. Należą do niej głównie pałeczki Escherichia coli, paciorkowce kałowe Enterococcus faecalis i laseczki przetrwalnikujące Clostridium perfringens, które są wydalane wraz z odchodami. [15, 30, 38]. Wraz z kałem człowiek i zwierzęta wydala bakterie w olbrzymich ilościach np. średnio w 1 g odchodów człowieka znajduje się ok. 1,3 x 10 7 komórek E.coli i 3,0 x 10 6 komórek E. faecalis, podczas gdy w 1 g odchodów kota występuje 7,9 x 10 6 E.coli i 2,7 x 10 7 paciorkowców; krowa wydala 2,3 x 10 4 E.coli i 1,3 x 10 6 paciorkowców; a kaczka 3,3 x 10 7 E.coli i 5,4 x 10 7 paciorkowców na 1 g wydalin [15,31]. Tak duże ilości bakterii w odchodach skutkują zanieczyszczeniem bakteryjnym ścieków, a spektrum gatunkowe mikroorganizmów w ściekach zależy od stanu zdrowia mieszkańców zamieszkujących w zlewni ścieków [23], dominuje w nich flora fizjologiczna ale mogą też występować organizmy chorobotwórcze i potencjalnie chorobotwórcze. Liczebność bakterii w ściekach ulega znacznym wahaniom ale zależy głównie od ilości mieszkańców zlewni [5, 23]. Dlatego też występuje znaczne zróżnicowanie w ilości bakterii w ściekach; zwykle liczebność bakterii coli fekalnych (termotolerancyjnych) w ściekach surowych waha się od 10 6 do 10 8 w 100 cm 3 [5]. W surowych ściekach w Częstochowie stwierdzono 10 6 coli fekalnych w 100cm 3 wody [32], natomiast w ściekach w Gdyni stwierdzono aż 1,8 x /100 cm 3 coli typu kałowego a w Gdańsku 9,3 x /100 cm 3 [34]. Większość ścieków trafia obecnie do oczyszczalni, ale i tak nie rozwiązuje to problemu zanieczyszczenia bakteryjnego wód powierzchniowych. Klasyczne oczyszczalnie ścieków, nie prowadzące specyficznej dezynfekcji, redukują liczebność bakterii kałowych o 1 3 rzędy wielkości [5]. W badaniach oczyszczalni ścieków w Gdańsku Olańczuk-Neyman [23] stwierdziła na odpływie liczbę bakterii coli typu kałowego rzędu / 100 cm 3 a w Dębogórze 1

2 2,4 x10 4 2,5x 10 5 w 100 cm 3. W badaniach prowadzonych w oczyszczalni w Częstochowie liczebność bakterii coli fekalnych na odpływie była rzędu / 100 cm 3 [32]. Ponieważ skażenie wyjściowe (ścieków surowych), jest bardzo wysokie, bakterie kałowe są w olbrzymich ilościach odprowadzane z oczyszczonymi ściekami do środowiska [5]. Nawet wysokoefektywne oczyszczanie ścieków, z usuwaniem substancji biogennych, azotu i fosforu, nie zapewnia jednoczesnego efektywnego usunięcia mikroorganizmów [23]. Skuteczność redukcji liczebności bakterii podczas oczyszczania ścieków zależy bowiem, w dużej mierze, od ilości bakterii w ściekach surowych. Szumilas [34] stwierdziła 99,999% redukcji coli typu kałowego po oczyszczaniu, jednak pomimo tak efektywnej pracy oczyszczalni, przy początkowym skażeniu rzędu , liczebność tych bakterii w odprowadzanych do środowiska oczyszczonych ściekach pozostawała nadal olbrzymia. Niektóre z krajów europejskich wprowadziły już, przynajmniej częściową, dezynfekcję ścieków odprowadzanych z oczyszczalni; Niemcy dezynfekują ścieki odprowadzane na tereny rekreacyjne, Francje dezynfekuje zrzuty ścieków na obszarach chronionych, jak kąpieliska i tereny hodowli mięczaków, w Hiszpanii dezynfekowane są ścieki do nawodnień rolniczych, drzew owocowych, pól sportowych i ogrodów [23]. Ocena stanu sanitarnego wód Jako wskaźniki czystości wód zostały przyjęte, z uwagi na miejsce ich występowania i liczebność, tak zwane wskaźniki sanitarne, do których należą Escherichia coli, Enterococcus faecalis i Clostridium perfringens, przy czym w większości krajów wskaźnikiem obligatoryjnym jest Escherichia coli. Jest też ona najbardziej wiarygodnym wskaźnikiem, ponieważ jej obecność wskazuje na świeże zanieczyszczenie kałowe i możliwość wystąpienia towarzyszących im bakterii chorobotwórczych pochodzenia jelitowego [15, 23, 30]. Paciorkowce kałowe (enterokoki) przeżywają dłużej w środowisku niż Escherichia, są bardziej oporne na działanie chloru, ale zdają egzamin jako wskaźnik czystości kąpielisk. Stwierdzono zależność pomiędzy stężeniem paciorkowców kałowych w wodzie a zachorowaniami osób kąpiących się [23]. Obecność Clostridium perfringens, z uwagi na przetrwalnikowanie tych bakterii jest wskazówką, że zanieczyszczenie fekaliami miało kiedyś miejsce [15, 23, 30]. Uważa się, że gatunek ten może być dobrym wskaźnikiem zanieczyszczenia wód pierwotniakami Giardia i Cryptosporidium [23]. Od lat wskaźniki sanitarne spełniają swoją rolę ostrzegawczą przed zakażeniami, ponieważ występuje istotna zależność pomiędzy liczebnością bakterii wskaźnikowych w wodzie a ilością mikroorganizmów chorobotwórczych [15, 23, 31]. Klasyfikacja wód powierzchniowych jest oparta głównie na czynnikach fizyko-chemicznych (40 parametrów), biologicznych (4 parametry) i bakteriologicznych (2 oznaczenia) [46]. Wskaźnikiem mikrobiologicznym, obligatoryjnym, decydującym o klasie wód powierzchniowych jest obecność bakterii coli typu kałowego. Wg rozporządzenia z 1991 r było to miano coli fekalnych [43], a wg rozporządzenia z 2004 r jest to ilość bakterii grupy coli i coli fekalnych w 100 ml wody [46]. Na podstawie tych wskaźników wody powierzchniowe klasyfikuje się do odpowiednich klas czystości. Obecnie zgodnie Zarządzeniem Ministra Środowiska wprowadzono pięć klas czystości wód dla prezentowania stanu wód powierzchniowych i podziemnych. Pod względem bakteriologicznym podział ten opiera się na liczbie bakterii grupy coli w 100 ml i liczbie bakterii grupy coli typu kałowego w 100ml wody [ 46]. Tab. 1. Porównanie stanu czystości rzek w Polsce w latach 2001 i 2002 wg wskaźników fizyko-chemicznych i bakteriologicznych. (w %) [17] Rok kryterium I klasa II klasa III klasa non 2002 bakteriologiczne 0 6,3 52,9 40,8 fiz-chemiczne 7,3 34,0 39,4 19, bakteriologiczne 0 4,4 43,2 52,4 fiz-chemiczne 8,6 32,2 39,5 19,7 2

3 Z uwagi na zanieczyszczenia bakteriologiczne, od lat w Polsce nie klasyfikuje się rzek do I klasy czystości, niewiele jest też rzek w klasie II. W 2001 r dominowały w rzekach wody pozaklasowe, w 2002 roku nastąpiła poprawa stanu rzek, zmniejszyła się ilość wód pozaklasowych a wzrosła ilość wód klasy II i III [17]. Stan sanitarny wód jezior jest nieco lepszy; w 2002 roku na 23 skontrolowane jeziora stwierdzono około 4% jezior w I klasie czystości, 59% jezior w II klasie, 26% w III klasie i 11% wód pozaklasowych [17]. Na podstawie wyników można stwierdzić, że jakość wód w Polsce jest bardzo niska, wody zanieczyszczone są bakteriami a wykorzystywanie tych wód do celów rekreacyjnych jak i zaopatrzenia ludności w wodę stanowi pewne zagrożenie dla zdrowia. W 2003 r pobór wód powierzchniowych w Polsce stanowił około 86% całego poboru wód na potrzeby gospodarki [17]. Wykorzystanie zanieczyszczonych wód powierzchniowych do uzdatniania stwarza niebezpieczeństwo występowania różnych zakażeń, ponieważ np. w wodach I i II klasy stwierdzono w 33% próbek obecność bakterii z rodzaju Campylobacter a w wodach III klasy bakterie te były obecne w 100% badanych próbek [4, 11]. W wodzie Wisły bakterie Yersinia były obecne w 36% próbek [10]. Podstawowe badania mikrobiologiczne wody w kąpieliskach obejmują: liczbę bakterii grupy coli i coli typu kałowego w 100 ml wody oraz liczbę paciorkowców kałowych w 100 ml i obecność bakterii z rodzaju Salmonella w 1000 ml wody [45]. Stwierdzono korelację pomiędzy stężeniem paciorkowców kałowych w wodzie, mierzonym na głębokości sięgającej poziomu klatki piersiowej kąpiących się a prawdopodobieństwem wystąpienia u nich zaburzeń żołądkowych [23]. W wymaganiach sanitarnych wartość pożądana wynosi 100 komórek enterokoków w 100 ml wody a dopuszcza się do 400 komórek/100 ml [45], chociaż badania wskazują, że 32 JTK (jednostek tworzących kolonie) w 100 cm 3 wody jest granicznym stężeniem paciorkowców kałowych w wodzie kąpieliska, powyżej którego mogą wystąpić zachorowania o charakterze żołądkowo- jelitowym [23]. Wydaje się więc, że ocena stanu kąpieliska oparta na ilości paciorkowców może być niewystarczająca dla bezpieczeństwa użytkowników. Obecnie coraz częściej zadaje się pytanie, na ile obowiązujące wskaźniki pozwalają ocenić, czy woda uznana za nadającą się do kąpieli czy też do picia jest wodą bezpieczną. W badaniach wody studziennej, uznanej za przydatną do picia na podstawie wskaźnika kałowego ( Tab. 2) stwierdzono obecność bakterii z rodzaju Yersinia, które są przyczyną wielu zachorowań na jersiniozę. Wskaźnik coli nie jest więc wystarczająco bezpiecznym wskaźnikiem przypadku wystąpienia bakterii z rodzaju Yersinia, która jak podaje Sails i wsp. [cyt. za 26] może przeżywać w wodzie powyżej 7 miesięcy. Tab. 2. Obecność pałeczek Yersinia w 59 próbach wody studziennej wg [10] NPL coli typu kałowego Obecność Yersinia w próbach [ %] > Obecność bakterii z rodzaju Legionella stwierdzono w 24,2 % próbach wody używanej do chłodzenia turbin dentystycznych [18]. W 12 punktach systemy rozprowadzającego wodę w Paryżu izolowano prątki z rodzaju Mycobacterium, przy czym wśród nich potencjalnie chorobotwórczych było aż 16,3%, saprofitycznych 41,3% i niezidentyfikowanych prątków 54,8% [14]. Przyczyną choroby wrzodowej żołądka jest odkryta w 1988 roku bakteria Helicobacter pylori [ 28, 38]. Stwierdzono, że bakterie te występują u około 50% populacji na świecie, występuje zróżnicowanie geograficzne, środowiskowe i sezonowe [39]. Nie znana była droga rozprzestrzeniania się zakażeń, uważano, że bakterie przenoszone są przez osobisty kontakt, ponieważ dużo zachorowań występowało w rodzinach [28, 38,]. Okazuje się, że przyczyną tak dużej ilości zakażeń może być przenoszenie tych bakterii drogą wodną. Park [ 25 ], dzięki zastosowaniu nowych metod badania PCR, stwierdzili występowanie bakterii Helicobacter pylori w biofilmie rur systemu dystrybucji wody pitnej. 3

4 Bakterie chorobotwórcze występujące w wodzie Woda nie jest dla bakterii chorobotwórczych naturalnym środowiskiem. Trafiają one bezpośrednio do wody z chorego organizmu ludzi lub zwierząt, lub pośrednio poprzez ścieki [15,23], a także poprzez spływy z gleby skażonej bakteriami patogennymi [ 26]. Woda jest jedynie przenośnikiem bakterii i to tylko w okresie, w jakim organizmy te mogą w wodzie utrzymywać się przy życiu. Jednak dane epidemiologiczne wskazują, że woda może być nadal przyczyną wielu zachorowań charakterze żołądkowo-jelitowym [15, 24,39, 40,42]. W Europie najczęściej występującym czynnikiem etiologicznym zakażeń przenoszonych drogą wodną są pałeczki duru brzusznego Salmonella typhi oraz pałeczki wywołujące czerwonkę Shigella sonnei, Shigella boydii, Shigella dysenteriae. Doniesienia ostatnich lat sugerują, że coraz częstszą przyczyną tzw epidemii wodnych w Europie Zachodniej i Skandynawii są bakterie z rodzajów Yersinia i Campylobacter [15]. Zachorowania mogą być przenoszone drogą oralną, przez picie nieuzdatnionej lub zanieczyszczonej wody, ale również na skutek kąpieli w wodzie zanieczyszczonej odchodami [23, 40]. Stwierdzono też korelację pomiędzy zachorowaniami spowodowanymi pałeczkami E. coli O157, a silnymi deszczami wypłukującymi tę pałeczkę ze skażonej gleby [ 26]. Bakteriami patogennymi, które wraz z odchodami i ściekami, a także spływami z pól, mogą dostać się do wody, są głównie mikroorganizmy związane z chorobami przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt jak również bakterie występujące u nosicieli, szczególnie dotyczy to nosicielstwa stwierdzonego u zwierząt. Tab. 3. Bakterie chorobotwórcze wg [15, 30,36] Drobnoustroje Występowanie Aeromonas hydrophila Woda, wilgotne miejsca Campylobacter Nosicielstwo u ludzi i zwierząt, ścieki, woda Enterococcus Przewód pokarmowy zwierząt i ludzi, ścieki, woda Escherichia Przewód pokarmowy ludzi i zwierząt, gleba, ścieki, woda Francisella Studnie, wody powierzchniowe skażone odchodami gryzoni, Helicobacter pylori Odchody ludzi, woda Legionella Zbiorniki wodne, systemy grzewcze i klimatyzacyjne Leptospira Woda skażona wydalinami gryzoni, Listeria Gleba, woda, rośliny, ścieki, zwierzęta hodowlane i dziko żyjące Mycobacterium Ścieki, woda Pseudomonas aeruginosa Woda, rośliny, zwierzęta, odchody ludzi Salmonella Odchody ludzi i drobiu, ścieki, woda, zakażona żywność Shigella Wydaliny, ścieki, woda, gleba, zakażona żywność Staphylococcus Skóra ludzi, zwierząt, woda, ścieki Vibrio Woda, ścieki, skorupiaki wodne Yersinia Woda, nosicielstwo u ludzi i zwierząt Rodzaj Campylobacter Chorobotwórcze są gatunki C. jejuni i C. coli. Bakterie te są jedną z największych przyczyn zachorowań jelitowych w Stanach Zjednoczonych powyżej miliona ludzi każdego roku zapada na kampylobakteriozę, w Polsce takich danych nie ma. Choroba częściej występuje latem niż zimą co związane jest prawdopodobnie z faktem, że Campylobacter doskonale rośnie w temperaturze ciała ptaków [40]. Campylobacter jejuni występują u zwierząt hodowlanych (90% świń i bydła) i domowych, nosicielami są młode psy i koty oraz kurczaki i ptactwo wodne. Zachorowania związane są z piciem niepasteryzowanego mleka i zanieczyszczonej wody, jedzeniem surowego mięsa kurcząt, przy czym minimalna dawka infekcyjna, powodująca chorobę jest mniejsza niż 500 komórek [40,41]. 4

5 Wody powierzchniowe i górskie potoki są zanieczyszczone C.j. pochodzących z odchodów bydła i dzikiego ptactwa [40]. Zasadniczym źródłem zakażeń są ścieki bytowe i gospodarcze [15] oraz wody powierzchniowe jak jeziora, rzeki [ 41]. Rodzaj Escherichia Są to bakterie występujące stale w przewodzie człowieka i zwierząt. Nie są uważane za typowo chorobotwórcze, chociaż wiele szczepów dostawszy się do organizmu człowieka powodują różne schorzenia. Wyróżnia się 5 głównych grup serologicznych szczepów E. coli wywołujących biegunki przenoszone przez żywność i wodę. Są wśród nich szczepy enteropatogenne (EPEC), enterotoksyczne (ETEC) powodujące 90% zakażeń dróg moczowych i tzw. biegunkę podróżną; enteroinwazyjne (EIEC) oraz enterokrwotoczne (EHEC) [28, 30]. Woda pitna i woda do celów rekreacyjnych była wielokrotnie drogą szerzenia się infekcji spowodowanej przez pałeczki E.coli O157:H7 należącej do grupy EHEC enterokrwotocznych [38]. Rozległą epidemię (243 przypadki) związaną z awarią rur wodociągowych, odnotowano na przełomie 1989 / 1990 w Kabulu. Nieco mniej rozległa epidemia (21 przypadków) miała miejsce w Portland USA, gdzie źródłem infekcji była woda z miejscowego jeziora skażona fekaliami [15]. E.coli O157: H7 jest często elementem naturalnej mikroflory przewodu pokarmowego bydła, stąd częste są zakażenia surowym mięsem, ale znalezioną ją w wielu produktach a nawet w wodzie z kranu. Dawka zakaźna tej bakterii jest bardzo niska i wynosi około 10 komórek [16]. Francisella Francisella tularensis wywołuje tularemię, która przenoszona jest drogą pokarmową oraz przez owady kłujące (kleszcze). Rezerwuarem są gryzonie, myszy i szczury, bytujące w pobliżu wód [38]. Epidemie wodne mogą wystąpić w wyniku zanieczyszczenia studni lub wód powierzchniowych wydalinami lub rozkładem padłych zwierząt. Pałeczki te są chorobotwórcze dla zwierząt domowych i dzikich, ptaków a także dla ludzi, jako choroby odzwierzęce [15, 30]. Zakażenie ludzi następuje najczęściej przez picie zanieczyszczonej wody studziennej, lub nieuzdatnianych wód powierzchniowych. Stwierdzono także możliwość zakażenia tularemią w czasie kąpieli. Bakterie te mogą przetrwać w wodzie ponad 3 miesiące a zakażenie może wywołać już 50 komórek bakteryjnych, które przeniknęły przez uszkodzoną skórę, błony śluzowe lub wskutek inhalacji [15, 30, 38]. Helicobacter pylori Połowa dorosłej ludności Stanów.Zjednoczonych jest zakażona bakterią H. pylori. Rozprzestrzenianie bakterie następuje na skutek przenoszenia bezpośrednio drogą ustną, stąd często zakażenie przenoszone jest w rodzinach, lub przez zanieczyszczoną fekaliami żywność czy wodę [39] Stwierdzono występowanie Helicobacter w 75% próbek wody powierzchniowej 20, 39]. Źródłem zakażenia może być też woda pitna [25,39], szczególnie ze studni ponieważ 67% prywatnych studni zawiera H.pylori [39]. Legionella Pałeczki Legionella występują powszechnie w wodzie w jeziorach, rzekach, ściekach studniach ale też izolowane są z wody w prysznicach, przemysłowych obiegach wody jak i klimatyzacji w szerokim zakresie temperatury (od 5-63 C). Z uwagi na zakażenia następujące wyłącznie drogą inhalacyjną niebezpieczna dla zdrowia są szczególnie bakterie występujące w aerozolach wodnych. Chorobotwórcza jest Legionella pnemoniae będąca przyczyną tzw. choroby legionistów [15,30, 38] Leptospira interrogans Leptospiroza wywoływana przez krętki Leptospira interrogans, dostające się do organizmu człowieka drogą pokarmową przez zanieczyszczoną wodę, rzadziej przez błony śluzowe lub uszkodzoną skórę [15,30]. Jest to choroba odzwierzęca, która podobnie jak tularemia, występuje na skutek styczności z wodą lub spożywania wody zawierającej wydaliny zakażonych gryzoni, głównie szczurów [15,30]. Stwierdzono liczne zachorowania po kąpielach w otwartych zbiornikach wodnych, w Holandii na 337 przypadków leptospirozy 18% spowodowane było wpadnięciem do wody a 60% - skutek kąpieli w zakażonych wodach [24]. W Polsce w 2004 r stwierdzono 9 przypadków leptospirozy [ 42], ale jako przypadków przy 5

6 zestawieniu dotyczącego zatruć pokarmowych (Tab. 4). Krętki, których naturalnym rezerwuarem są gryzonie polne, przeżywają w wodach stojących przez wiele tygodni [ 15,30,38]. Listeria Zachorowania na listeriozę wywołaną przez Listeria monocytogenes są powodowane zanieczyszczoną żywnością lub bezpośrednim przeniesieniem z gleby, skażonych roślin, wody lub ścieków. Pałeczki listerii występują powszechnie u zwierząt dziko żyjących i hodowlanych; źródłem są często krowy, owce, trzoda, króliki, psy, ptaki, drobne gryzonie i owady, jak również niewłaściwej jakości kiszonki. Może namnażać się w warunkach chłodniczych [16]. Bakterie te w glebie przeżywają 295 dni [15, 30, 38]. Mycobacterium W ściekach bardzo często występują prątki gruźlicy Mycobacterium zarówno typu ludzkiego (M. tuberculosis) i bydlęcego (M. bovis) i ptasiego (M. avium). Prątki bardzo długo przeżywają w ściekach; formy wirulentne mogą przeżyć 124 dni, a subwirulentne dni. Mycobacterium avium (gruźlicy ptasiej) dotychczas uważane za niechorobotwórcze dla ludzi, obecnie zakażenia wywołane przez M. avium intracellulare należą do najczęstszych zakażeń prątkowych u chorych z AIDS i u innych pacjentów z obniżoną odpornością. Gruźlicę ryb morskich powoduje Mycobacterium marinum, zwany również balnei, który u ludzi jest przyczyną schorzeń skórnych [ 15, 30, 38]. Rodzaj Salmonella Pałeczki gramujemne, powodujące wiele schorzeń jak: ostre choroby zakaźne: dur brzuszny wywołany przez Salmonella typhi oraz dur rzekomy wywołany przez Salmonella paratyphi A, B i C, zatrucia pokarmowe typu zakaźnego ( salmonellozy). W przeszłości pałeczki te były przyczyną wielu epidemii. Od lat siedemdziesiątych dominującym szczepem jest Salmonella enteritidis. W 2004 r w Polsce odnotowano tylko 6 przypadków durów, ale aż 15 tysięcy salmonelloz. Po przebyciu choroby bardzo często pozostaje tzw. nosicielstwo. Rezerwuarem zarazka jest chory człowiek lub nosiciel, materiałem zakaźnym są wydaliny, ścieki, lub zakażona żywność, głównie jaja, drób i mięso, soki owocowe, mleko. Dawka zakaźna wynosi około 20 komórek [16] Gastroenteritis to najczęstsza postać kliniczna salmonelloz, epidemie pokarmowe i wodne występują w postaci ostrych zaburzeń żołądkowo jelitowych związanych ze spożyciem wody lub pokarmu skażonego pałeczkami Salmonella [15,38] Rodzaj Shigella Duża epidemia czerwonki wystąpiła w Piszu w 1967, kiedy zachorowało 1115 osób. W 2004 r odnotowano 74 przypadki shigellozy [42]. Dawka zakaźna wynosi około 10 komórek [16]. Zakażenie bakteriami Shigella może być spowodowane przez picie lub kąpiel w zakażonych wodach, oraz przez zainfekowną żywność. Woda może być skażona przez ścieki wpływające do niej, pałeczki Shigella wydalane z kałem dostają się do gleby, skąd przedostają się do wody studziennej. W wodzie przeżywają od 6 39 dni [15,30] Yersinia enterocolitica Y. enterocolitica występuje w środowisku naturalnym (jeziora, strumienie, gleba); w pokarmach (ryby, mleko, produkty mięsne), u wszystkich zwierząt bezkręgowych i kręgowców. Rezerwuarem jest człowiek, zwierzęta hodowlane i domowe oraz ścieki zawierające bakterie pochodzące od chorych i nosicieli. Wykazano nosicielstwo u psów, świń, kotów, szczurów. Jersinioza jest zaliczana do chorób zakaźnych człowieka i zwierząt. Do zakażenia najczęściej dochodzi droga pokarmową. Dane z niektórych krajów wykazują, że częstość zachorowań żołądkowo-jelitowych wywołanych przez pałeczki Yersinia przekracza, zwłaszcza w okresie zimowym, liczbę zachorowań wywołanych przez pałeczki Shigella i Salmonella. Yersinia enterocolitica charakteryzują się wysoką przeżywalnością w wodzie. Czas przeżycia tych bakterii w wodzie powierzchniowej i wodociągowej zależy od pory roku i stopnia zanieczyszczenia innymi bakteriami i wynosi od 87 do 300 dni [15, 35], a nawet stwierdzono przeżycie pałeczek Yersinia w wodzie aż 400 dni [26, 35]. Wśród bakterii chorobotwórczych, szczególne niebezpieczeństwo stwarzają te bakterie, które należą do klasycznych wewnątrzkomórkowych patogenów, mogących przetrwać w makrofagach. Należą do nich m. in. Legionella, 6

7 Francisella, Salmonella i Yersinia. Bardzo niebezpieczna jest też pozornie niegroźna pałeczka Escherichia coli O157:H7, która jest przyczyną kilkunastu epidemii rocznie [16]. W wyniku produkcji toksyny SLT u około 10% zakażonych dochodzi do poważnego uszkodzenia nerek [16]. W Polsce bakteryjne zatrucia pokarmowe były przyczyną w 2004 roku ponad 19 tysięcy zachorowań (Tab.3), ale nie jest prowadzona statystyka dotyczących zakażeń przenoszonych drogą wodną. Wynika to prawdopodobnie z faktu nie zgłaszania się chorych z dolegliwościami żołądkowymi do lekarza, lekceważenie przez lekarzy tych dolegliwościami jak i stosunkowo słabo postawioną diagnostyką. W Stanach Zjednoczonych stosuje się specjalne systemy polegające na szybkiej i dokładnej identyfikacji z wykorzystaniem metod biologii molekularnej. Od 1997 r tropi się epidemie wywołane przez E.coli O157:H7 za pomocą odcisku palca czyli porównania DNA bakterii [16]. Tab. 3. Zachorowania w Polsce w roku 2004 wg [42] Bakteryjne zatrucia pokarmowe ogółem Dur brzuszny 3 Dur rzekomy 3 Salmonellozy ogółem w tym pokarmowe Shigellozy 74 Inne bakteryjne zatrucia jelitowe Leptospiroza 9 Listerioza 10 Również mikroorganizmy, nie będące patogenami człowieka, występujące naturalnie w środowisku, mogą w pewnych warunkach być przyczyną chorób. Dotyczy to głownie osób o osłabionym mechanizmie odpornościowym, osób w podeszłym wieku i niemowląt, chorych na AIDS, pacjentów z ranami oparzeniowymi. U osób tych przyczyną infekcji może być woda do picia lub kąpieli, zawierająca liczne bakterie z rodzajów: Pseudomonas, Flavobacterium, Acinetobacter, Aeromonas i innych [15]. Liczebność bakterii w wodach powierzchniowych W przypadku braku dezynfekcji ścieków, istotne znaczenie ma stopień rozcieńczania ścieków w odbiorniku oraz czas przeżycia mikroorganizmów pochodzenia ściekowego w środowisku wodnym. Liczebność bakterii w wodzie powierzchniowej jest zróżnicowana i zależy od stanu troficznego oraz dostających się zanieczyszczeń. Liczebność bakterioplanktonu w 1 ml wody waha się od 10 2 do 10 9 w wodach zanieczyszczonych ściekami [12,32]. Wody powierzchniowe, a zwłaszcza wody płynące i zbiorniki z wodą przepływającą cechuje znaczna zdolność do samooczyszczania, w miarę od oddalania się od źródła zanieczyszczenia. Na proces samooczyszczania wpływa przede wszystkim rozcieńczanie wodą odbiornika i sedymentacja zawiesin. Sedymentacja uzależniona jest od prędkości przepływu i zachodzi w miejscach, gdzie woda płynie na tyle wolno, że zawieszone cząsteczki mogą opaść na dno [8]. W badaniach zbiornika Dzierżno Duże zasilanego zanieczyszczoną ściekami wodą Kłodnicy stwierdzono, że zmniejszenie liczebności bakterii w wodzie po przejściu przez zbiornik z ok. 1 mln komórek/ 1 cm 3 do 660/cm 3 na wypływie ze zbiornika. Obniżeniu ulegly też wszystkie wskaźniki sanitarne, od kilku do kilkudziesięciu razy [8]. Podobną redukcję liczebności bakterii obserwowano na rzece Warcie, po przejściu zbiornika Poraj [33] a także na Wiśle za zbiornikiem we Włocławku [37]. Jedną z przyczyn tak znacznego zmniejszania liczby bakterii w wodzie może być ich adsorpcja na cząsteczkach zawiesiny. Około 25% bakterii z grupy coli, odprowadzanych ze ściekami, jest zaadsorbowanych na cząsteczkach zawiesiny o wielkości > 3-5 mm i razem z nimi przechodzą do osadów dennych [ 5]. Stwierdzono istotną zależność między liczbą bakterii, przezroczystością wody zbiornika a opadaniem zawiesiny [ 8]. 7

8 Przechodzenie bakterii do osadów dennych zbiorników powoduje, że liczebność bakterii w osadach jest kilkukrotnie wyższa, niż w wodzie [12]. Bakterie są najliczniej występującymi i najbardziej aktywnymi organizmami w osadach dennych, występują tam jako wolne komórki lub zaadsorbowane na cząsteczkach [27]. Osady denne nie tylko chronią bakterie przed działaniem światła i innymi niekorzystnymi czynnikami środowiskowymi, a także są źródłem substancji pokarmowych [23, 27]. Również liczba wskaźnikowych bakterii coli w osadach może być od 1 do 3 rzędów wielkości wyższa niż w wodzie [23]. Czynniki mające wpływ na liczebność bakterii w wodach W wodach powierzchniowych występuje szereg czynników biotycznych i abiotycznych wpływających bezpośrednio na liczebność bakterii. Obniżenie liczebności bakterii allochtonicznych w środowisku wodnym może być spowodowane atakiem ze strony drapieżnych bakterii. Przykładem jest Bdellovibrio bacteriovorus, powodujący lizę wielu bakterii [6, 12]. Ta niewielka pałeczka przyczepia się do podatnych na jej atak komórek bakterii gramujemnych, głównie z rodzaju Pseudomonas oraz grupy bakterii jelitowych,przedziurawia ścianę komórkową i wnika do peryplazmy. Wewnątrz rośnie i dzieli się dwa, trzy razy, wykorzystując prawie całą zawartość komórki gospodarza jako pokarm. Po śmierci gospodarza i rozpadzie jego komórki, Bdellovibrio wydostaje się na zewnątrz [12]. Jednym z czynników regulujących wielkość biomasy bakterii w ekosystemach wodnych jest aktywność organizmów odżywiających się bakteriami tzw. bakteriożerców. Za najważniejszych bakteriożerców uważa się heterotroficzne nanowiciowce (HNF), mikrowiciowce i orzęski oraz miksotroficzne glony. Liczebność eliminowanych bakterii w ciągu godziny wynosi od 10 1 do 10 4 [9]. Intensywność wyżerania bakterii zależy od temperatury, zmniejsza się poniżej 18 o C, dlatego zimą odgrywa niewielką rolę w kontrolowaniu liczebności bakterii. Presja pokarmowa bakteriożerców ma wpływ nie tylko na całkowitą liczebność bakterii, ale także na strukturę populacji bakterii w wodzie. Większość wiciowców nie potrafi wykorzystać zarówno bakterii większych od 1µm, bakterii nitkowatych, bakterii zaadsorbowanych na cząsteczkach oraz tworzących kolonie czy agregaty, jak też o wymiarach mniejszych niż 0, 3 [6] czy 0,4µm [9]. Organizmy odżywiające się bakteriami wykazują pewne preferencje pokarmowe i szybciej zjadane są bakterie gramujemne. Bakterie gramdodatnie stanowią gorszą zdobycz dla pierwotniaków, ze względu na budowę ściany komórkowej i trudności w jej strawieniu [6]. Selektywne wyżeranie bakterii powoduje więc zmiany w strukturze zespołów bakterii w wodzie. Istotnymi czynnikami ograniczającymi liczebność bakterii, szczególnie allochtonicznych w wodzie są bakteriofagi, powodujące lizę komórek. Bakteriofagi są specyficzne dla bakterii, ich występowanie w wodzie zależy od występowania określonego gatunku bakterii. Liczebność specyficznych bakteriofagów w wodzie wykazuje korelację z liczbą bakterii i są one proponowane do oceny stanu skażenia wody bakteriami grupy coli [35]. U ujścia Kłodnicy do zbiornika Dzierżno Duże stwierdzono od 10 8 do 10 9 bakteriofagów specyficznych dla szczepu E.coli K12 w 1 cm 3 wody i ilość ta uległa zmniejszeniu na odległości 3 km o ok. 1 rząd wielkości [21]. Z uwagi na wysoką szczepową specyficzność bakteriofagów oznaczenia te nie są powszechnie stosowane [35] Temperatura Wśród flory dostającej się do wód powierzchniowych tzw. allochtonicznej występują bakterie pochodzące ze spływów powierzchniowych, głównie z gleby i powietrza. Są to najczęściej bakterie zaliczane, podobnie jak bakterie wodne czyli mikroflora autochtoniczna wód, do grupy bakterii psychrofilnych [23], dla których optymalna temperatura wzrostu nie przekracza 25 o C [12]. Naturalna mikroflora autochtoniczna wód nie stanowi zagrożenia dla zdrowia człowieka. Bakterie wodne właściwe są przeważnie psychrofilne, giną w temperaturze powyżej 25 o C, nie stanowią więc zagrożenia epidemiologicznego, ponieważ nie namnażają się w temperaturze ciała człowieka 37 o C [30]. Wraz ze ściekami, wprowadzane są bakterie występujące stale w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt jak i bakterie będące przyczyną chorób o charakterze żołądkowo jelitowym. Bakterie te należą do grupy bakterii mezofilnych, przystosowanych do wzrostu w temperaturze około o C i do dużej zawartości substancji odżywczych w środowisku 8

9 [12]. W środowisku wodnym, o temperaturze rzadko przekraczającej 20 o C, bakterie mezofilne przeżywają stres związany z temperaturą. Temperatura poniżej minimalnej powoduje spowolnienie tempa rozmnażania bakterii i wydłużenie czasu generacji, spowolnieniu ulegają również inne procesy życiowe komórki [12]. W sytuacji równoczesnego stresu, związanego z mniejszą zawartością substancji organicznych w środowisku, spowolnienie procesów życiowych komórki może pozwalać bakteriom na dłuższe przeżycie w wodzie. W przypadku gwałtownego obniżenia temperatury u wielu bakterii allochtonicznych występuje szok zimna, który np. u E. coli stymuluje powstanie licznych białek charakterystycznych dla tego stanu, tzw. cold shock proteins [12, 22]. Białka te, poprzez zmiany w lipidach błonowych, powodują przystosowanie bakterii do niższych temperatur i w efekcie obniżeniu ulegają wówczas wartości temperatur kardynalnych, w granicach których zachodzi działalność życiowa bakterii [29]. W rezultacie tych zmian minimalna temperatura do wzrostu u Escherichia coli może obniżyć się z 7,5 C nawet do 1,8 C, natomiast temperatura optymalna zmniejsza się z 37 C do 20 C [29] co może to pozwolić na przeżywanie tych bakterii w chłodnych wodach Z uwagi na to, że temperatura wody w zbiornikach przyjmujących wody i ścieki ulega często podwyższeniu [33] te środowiska wodne mogą być zasiedlane coraz częściej przez mikroorganizmy mezofilne. Troficzność środowiska Niedobór substancji pokarmowych jest normalnym zjawiskiem w ekosystemach naturalnych. W środowisku wodnym stężenie składników odżywczych wynosi często poniżej 10 µg/l. Z tego względu większość autochtonicznej mikroflory wodnej należy do oligotrofów, zdolnych do wykorzystywania nawet śladowych ilości pożywienia [12]. Jednak w przypadku bakterii allochtonicznych sytuacja jest odmienna. Po wprowadzeniu ich do środowiska ubogiego w substraty organiczne można w krótkim czasie zaobserwować zwolnienie tempa wzrostu w wyniku wydłużenia okresu międzypodziałowego i czasu generacji. Faza zastoju stanowi okres przygotowawczy, w trakcie którego bakterie przystosowują się do nowego środowiska. Długość tego etapu wzrasta w przypadku wyższego stopnia oligotroficzności środowiska, a związane jest to z przebudową aparatu enzymatycznego [7, 12]. Zwolnieniu wzrostu towarzyszą też inne zmiany. Średnia masa komórki zmniejsza się wówczas parokrotnie. W niesprzyjających warunkach tylko dzięki wstrzymaniu wzrostu i syntezy ściany komórkowej bakterie uzyskują szansę przeżycia [12, 3]. Jednocześnie u głodzonych bakterii wzrasta hydrofobowość i adhezyjność komórek. Stwierdzono również zmiany w budowie błonowych kwasów tłuszczowych, aminokwasów w ścianie komórkowej oraz kształcie chromosomów. Najważniejszą odpowiedzią na brak substancji odżywczych jest rozwój stanu zwiększonej oporności komórki na szkodliwe parametry środowiska, jak np. szok termiczny, stres osmotyczny i oksydacyjny [1, 3]. W warunkach braku substratów odżywczych zawartość procentowa białek i DNA w komórce zmniejsza się nieznacznie, natomiast ilość RNA maleje blisko czterokrotnie. Spadek zawartości RNA wynika przede wszystkim ze zmniejszenia ilości rrna, a więc dochodzi do ograniczenia liczby rybosomów [1, 12]. Śmierć bakterii, która następuje po pewnym czasie absolutnego głodu, jest powodowana następuje na skutek stopniowego rozregulowania metabolizmu jak i stopniowym rozpadem struktur wskutek narastającego braku substratów [12]. Niejednokrotnie na skutek zanieczyszczenia wód powierzchniowych bakterie allochtoniczne mogą znaleźć w tym środowisku substancje organiczne białka i ich pochodne, polisacharydy, tłuszcze i inne. Dzięki tym zanieczyszczeniom przynajmniej przez pewien czas saprofityczne mikroorganizmy allochtoniczne mogą się w takim środowisku rozwijać [24]. Strategie przeżycia bakterii w wodach powierzchniowych W niesprzyjających warunkach środowiska, dzięki wstrzymaniu wzrostu i syntezy ściany komórkowej oraz spowolnieniu metabolizmu, bakterie uzyskują szansę przeżycia [12]. Roszak i Colwell w 1987 r stwierdzili, że w sytuacji stresu głodowego komórki zmniejszają swoją wielkość i są niewykrywalne standardowymi, hodowlanymi metodami, ale można je zaobserwować w preparatach bezpośrednich [2]. Zjawisko to nazwano viable but nonculturable (VBNC) lub dormant czyli uśpione). Jest to stan charakterystyczny dla żywych, ale niehodowlanych komórek, które są wykrywane przy 9

10 zastosowaniu technik bezpośredniego oznaczania liczebności [1, 2]. Przechodzenie w stan VBNC może stanowić genetycznie zaprogramowaną odpowiedź bakterii zapewniającą przetrwanie niekorzystnych warunków [3, 19]. Komórki bakteryjne wchodzące w stan VBNC podlegają zmianom, które pozwalają im przetrwać w środowisku przez dłuższy okres czasu. Zmniejszają swoją objętość zależnie od zawartości substratów w środowisku od razy, pałeczki mogą przybierać formy ziarniakopodobne, a średnia masa komórki zmniejsza się wówczas parokrotnie. Takie zmiany obserwowano w przypadku pałeczek Campylobacter jejuni, Yersinia i przecinkowców Vibrio cholerae [1, 2, 3 ] Oprócz zmniejszenia wielkości komórki występują pewne zmiany w metabolizmie. Zmiany te obejmują m.in. stabilizację ściany i błony komórkowej i tym samym zapewniają zwiększenie stabilności komórek. Wraz ze zmniejszeniem ilości lipidów i białek wzrasta także gęstość cytoplazmy. W pewnych przypadkach stwierdzono również spadek zawartości kwasów nukleinowych i rybosomów [19]. Stwierdzono również, że bakterie w stanie VBNC są wirulentne [1, 2, 3]. Różne strategie przeżycia bakterii allochtonicznych mogą być też przyczyną różnego czasu ich przeżywania w środowisku wodnym, przy czym wyraźnie zaznacza się wpływ temperatury. Obniżenie temperatury poniżej 10 o C znacznie wydłuża ich przeżywalność, np.e.coli w temp o C przeżywa 10 dni a w 4 o 43 dni [23, 29, 30]. Procedura oceny stanu sanitarnego wód zarówno powierzchniowych jak i wody pitnej przewiduje hodowlę bakterii zatrzymanych na filtrach membranowych, a zalecana średnica por filtra wynosi 0,45 µm [46]. Jest to wielkość otworów przez które przejdą bakterie nie tylko znajdujące się w stanie VBNC, ale też poddane stresowi głodowemu, kiedy to następuje zmniejszenie wielkości bakterii do ok. 0, 2 µm [2,3]. Aby nie wyeliminować z badania tych bakterii do izolacji należałoby używać filtrów o średnicy por nie większych niż 0,22 µm [3]. Bakterie w środowisku wodnym, znajdujące się w stanie VBNC, stanowią niewątpliwe zagrożenie dla zdrowia publicznego, gdyż wykazując pewną aktywność metaboliczną, zachowują również wirulencję, a nie są wykrywane w rutynowych badaniach mikrobiologicznych wód, opartych na metodzie hodowlanej. Posługując się tradycyjnymi metodami izolacji drobnoustrojów, poznajemy jedynie niewielką liczbę gatunków wchodzących w skład danej biocenozy, ponieważ w metodach hodowlanych wykrywa się około 1% gatunków bakterii występujących w środowisku [3, 31]. Związane to jest z jednej strony z metodami detekcji i stworzeniem odpowiednich warunków hodowli, z drugiej strony ze stanem fizjologicznym mikroorganizmów. Do tak zwanych szybkich testów wykorzystywanych obecnie do detekcji bakterii w wodach powierzchniowych i ściekach należy metoda bezpośredniego liczenia bakterii w próbkach zabarwionych fluorochomami ( oranż akrydynowy, DAPI, CTC i in.). Liczebność bakterii wykrywanych tą metodą jest kilkukrotnie wyższa, niż przy stosowaniu,metod hodowlanych [ 3, 26,35]. Metody te wymagają jednak użycia mikroskopu fluorescencyjnego, co wiąże się z pewnymi nakładami, ale z kolei pozwalają nie tylko na liczenie komórek, ale także na określenie ich stanu fizjologicznego np. można odróżnić w próbkach bakterie aktywnie oddychające [ 27,35]. Metody biologii molekularnej pozwoliły na wprowadzenie sond kwasów nukleinowych ukierunkowanych na rrna umożliwiających identyfikację grup bakterii. FISH czyli fluorescencyjna hybrydyzacja in situ umożliwia ilościową charakterystykę struktury taksonomicznej bakterii bez konieczności stosowania metod hodowlanych [26, 35]. Do wykrywania i identyfikacji bakterii patogennych wykorzystuje się coraz częściej techniki amplifikacji PCR, w których analizowany jest zarówno DNA jak i RNA. Zastosowanie tych metod pozwoliło na wykrycie wielu bakterii dotychczas tzw. niehodowalnych, szczególnie patogenów np. pozwoliło na wykrycie w wodzie pitnej i powierzchniowej bakterii Helicobacter pylori. Klasyczne metody pozwalające określić liczebność i żywotność komórek w środowisku są czasochłonne i obdarzone pewnym błędem natomiast metody molekularne są szybkie, czułe i specyficzne, dlatego wydaje się koniecznym wprowadzenie ich do badań środowiskowych. 10

11 Literatura 1. Barcina I., Lebaron P., Vives Rego J. Survival of allochthonous bacteria in aquatic systems: a biological approach. FEMS Microbiology Ecology, 1997,23: Colwell R. R. Viable but nonculturable bacteria: a survival strategy. J. of Infection and Chemotherapy, 2000, 6(2): Dahm H., E. Strzelczyk. Żyjące lecz nie dające się hodować bakterie. Post. Microbiol. 2004, 43,3: Drzewiecka B., J. Sinkiewicz. Występowanie bakterii z rodzaju Campylobacter w wodach powierzchniowych, wykorzystywanych na potrzeby komunalne na terenie województwa bydgoskiego. Roczniki PZH. 2000, 51(1): George I., P. Crop, P. Servai. Faecal removal in wastewater treatment plants studied by plate counts and enzymatic methods. Water Res. 2002, 36: Gonzalez J., Iriberri J., Egea L., Barcina I. Characterization of culturabity, protistan grazing, and death of enteric bacteria in aquatic ecosystem. Applied and Environmental Microbiology, 1992, 58: Jones T., C.O.Gill, L. M. McMullen. The behavior of log phase Escherichia coli at temperatures below the minimum for sustained growth. Food Microbiology, 2002, 19: Kostecki M., A.Smyłła, A. Starczyńska. Ocena stanu sanitarnego wody antropogenicznego zbiornika wodnego Dzierżno Duże. Arch. Ochr. Środ. 2000, 26/4 : Koton-Czarnecka M., R. Chróst. Konsumpcja bakterii przez pierwotniaki w ekosystemach wodnych. Post. Mikrobiol. 2001, 40, 2: Krogulska B., J. Maleszewska, Występowanie bakterii z rodzaju Yersinia w wodach powierzchniowych. Roczniki PZH, 1992, 43 (3/4): Krogulska B., J. Maleszewska. Zanieczyszczenie bakteriami z rodzaju Campylobacter wód powierzchniowych ujmowanych dla celów wodociągowych i po różnych etapach ich uzdatniania. Roczniki PZH, 1994, 45(4): Kunicki Goldfinger W.J.H. Życie bakterii. Wyd. Naukowe PWN, Langergraber G., E.Muellegger. Ecological Sanitation- a way to solve global sanitation problems? Evironmental International : Le Dantec C., J-P. Duguet, A. Montiel, N.Dumoutier, S. Dubrou, V. Vincent. Occurence of Mycobacteria in Water Treatment lines and in Water Distribution Systems. Appl. Environm. Microbiol. 2002, 68/11 : Libudzisz Z., K. Kowal (ed), Mikrobiologia techniczna, T.1. Politechnika Łódzka, Łódź Łęski T. Mikroskopijni truciciele. Wiedza i Życie, 1999,7 17. Mały Rocznik Satystyczny GUS Matuszewska R., B. Krogulska. Występowanie bakterii z rodzaju Legionella w wodzie z turbin dentystycznych. Mag. Stom.2000, 10(10): McDougald, S. A. Rice, D. Weichart, S. Kjellerberg Nonculturability: adaptation or debilitation? FEMS Microbiology Ecology. 25: Mazari-Hiriart M., Y. Lopez-Vidal, G.Castillo-Rojas de Leon S.P.A. Cravioto. Helicobacter pylori and Other Enteric Bacteria in Freshwater Environments in Mexico City. Arch. Medical Res., 2001, 32(5): Nadgórska A., A. Smyłła, M. Kostecki, Przeżywalność szczepu Escherichia coli K12 J62-1 w wodzie zbiornika Dzierżno Duże. Arch. Ochr. Środ., 2002, 28/4: Nedwell D. B.Effect of low temperature on microbial growth: lowered affinity for substrates limits growth at low temperatur. FEMS Microbiology Ecology, 1999, 30: Olańczuk-Neyman K., Mikrobiologiczne aspekty odprowadzania ścieków do przybrzeżnych wód morskich, Inżynieria Morska i Geotechnika, 2003, 2: Paluch J (red.). Mikrobiologia wód. PWN Warszawa, Park S. R., W.G Macay, D. C. Reid. Helicobacter sp. recovered from drinking water biofilm sampled from a water distribution system,water Res., 2001, 35(6): Pickup R.W., G.Rhodes, J. Hermon-Taylor. Monitoring bacterial pathogens in the environment: advantages of multilayered approach. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14: Proctor L.M., A.C. Souza. Method for enumeration of 5-cyano-2,3-ditoyl tetrazolium chloride (CTC)-active cells and cell-specific CTC activity of benthic bacteria in riverine, estuarine and coastal sediments. Journal of Microbiological Methods : Singleton P., Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie, Wyd. Naukowe PWN, Warszawa,

12 29. Smith J. J., Howington J. P., McFeters G. A. Survival, physiological response, and recovery of enteric bacteria exposed to a polar marine environment. Appl. Environm. Microbiol : Smyłła A., Analiza sanitarna wody, Wyd. WSP, Częstochowa, Smyłła A., Z. Piotrowska-Seget, A. Tyflewska. Pathogenic bacteria hazard in surface waters. AUMC Limnological Papers, Toruń, XIII, z. 110: Smyłła A. K. Karpińska, M. Bawor. Zmiany liczebności bakterii mezofilnych w trakcie oczyszczania ścieków. Zeszyty Naukowe WSP. Seria Chemia i Ochrona Środowiska, 2003,z.VII: Smyłła A., B. Bobek. Ocena stanu sanitarnego wody górnej Warty. Zeszyty Naukowe WSP. Seria Chemia i Ochrona Środowiska, 2004, z.ix ( przyjęte do druku) 34. Szumilas T., M. Michalska, M. Bartoszewicz. Charakterystyka bakteryjnego zanieczyszczenia ścieków komunalnych z dużej aglomeracji miejskiej i ocena stopnia redukcji tego zanieczyszczenia w procesie biologicznego oczyszczania ścieków. Roczniki PZH /2 : Toranzos G.A., G. McFeters, Detection of indicator microorganisms in environmental freshwaters and drinking waters. in: Manual of Environmental Microbiology. Hurst C.J., Knudsen G.R.,Walter M.V.,(eds).ASM Press, Washington, D.C Thorsen B.K., O. Enger, S. Norland, K.A.Hoff. Long-term starvation survival of Yersinia ruckeri at different salinities studied by microscopical and flow cytometric methods. Appl. Environm. Microbiol. 1992, 58, 5: Wilk I., T.Adamczewski, W. Donderski. Ocena mikrobiologiczna wód dolnej Wisły na podstawie wybranych wskaźników bakteriologiczno-sanitranych. Metody biologii molekularnej w badaniach hydromikrobiologicznych. II Ogólnopolska Konferencja Hydromikrobiologiczna. Zielona Góra-Łagów Zaremba M. L., Borowski J. Mikrobiologia lekarska. Wyd. Lekarskie PZWL Warszawa Dz.Ustaw 1991, Nr 116. poz Dz.Ustaw 2000, Nr 82. poz Dz.Ustaw 2002, Nr 183. poz Dz.Ustaw 2004, Nr 32. poz