Zastosowanie analizy genów markerowych do badań zakwitów toksycznych cyjanobakterii w jeziorach

Transkrypt

1 AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ Aleksandra Bukowska Zakład Ekologii Mikroorganizmów i Biotechnologii Środowiskowej, Instytut Botaniki, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Zastosowanie analizy genów markerowych do badań zakwitów toksycznych cyjanobakterii w jeziorach Promotor: prof. dr hab. Ryszard J. Chróst Promotor pomocniczy: dr hab. Iwona Jasser Recenzenci: prof. dr hab. Barbara Pawlik-Skowrońska Katedra Hydrobiologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie prof. dr hab. Joanna Mankiewicz-Boczek Katedra Ekologii Stosowanej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki Warszawa, czerwiec 2017

2 W ostatnich dekadach coraz częściej obserwuje się zakwity cyjanobakterii w wodach śródlądowych oraz przybrzeżnych morskich. Środowiska wodne opanowane przez masowy rozwój cyjanobakterii charakteryzują się przede wszystkim znaczącym spadkiem różnorodności biologicznej, albowiem obecność i aktywność ekofizjologiczna tych mikroorganizmów negatywnie wpływa na występowanie i aktywność życiową szeregu wodnych biota (m.in. doprowadzając do zaburzenia funkcjonowania sieci troficznych na różnych poziomach w ekosystemie). Wysoka produktywność biologiczna cyanobakterii doprowadza do drastycznego zwiększenia ilości detritusu, zmniejszenia przezroczystości wody, powstawania stref beztlenowych w głębszych partiach wód i osadach dennych. Ich masowa obecność skutkuje obniżeniem walorów gospodarczych i rekreacyjnych zbiornika wodnego. Bardzo często zakwitom cyjanobakterii towarzyszy obecność uwalnianych z ich komórek cyjanotoksyn, spośród których hepatotoksyczne mikrocystyny stanowią największe zagrożenie w ekosystemach słodkowodnych. Metabolity te są toksyczne zarówno dla wielu organizmów wodnych, jak i zwierząt lądowych oraz człowieka. Problemy zdrowotne, w tym również śmiertelne zatrucia, może powodować nie tylko spożycie skażonej toksynami wody, ale także kontakt z nimi w wodzie, np. podczas rekreacji. Najważniejszymi czynnikami promującymi powstawanie zakwitów sinic są wysokie stężenia biogenów i materii organicznej (sprzyjające eutrofizacji) i podwyższona temperatura wody. W środowiskach silnie zeutrofizowanych zakwity stają się częstsze, mogą trwać dłużej oraz być bardziej toksyczne. Tak więc prognozowane dalsze ocieplanie się klimatu może sprawić, że zakwity cyjanobakterii staną się coraz ważniejszym problemem globalnym. System Wielkich Jezior Mazurskich (SWJM) stanowi zespół jezior połączonych ze sobą, zlokalizowany w północno-wschodniej części Polski. W jego skład wchodzą największe polskie jeziora, jest to obszar niezwykle cenny pod względem przyrodniczym i turystycznym, jak również ważny z punktu widzenia lokalnej gospodarki. W jeziorach mazurskich występuje duża różnorodność taksonomiczna cyjanobakterii, zwykle również to one dominują w okresie letnim w całkowitej biomasie fitoplanktonu. Poszczególne jeziora SWJM różnią się znacznie między sobą pod względem ich statusu troficznego, pomimo, że wszystkie są połączone w sposób naturalny lub sztuczny. Sprawia to, że SWJM stanowi znakomity model do badania wpływu różnych czynników biologicznych i fizykochemicznych na zespoły cyjanobakterii. Celem niniejszej pracy była kompleksowa analiza, z zastosowaniem metod biologii molekularnej, różnorodności zespołów cyjanobakterii, w tym cyjanobakterii potencjalnie toksycznych, w wybranych jeziorach SWJM. Celem badań było także określenie czynników

3 środowiskowych, które mogą wpływać na występowanie i różnorodność zespołów sinic w badanych jeziorach. Ważnym aspektem pracy było zbadanie, czy na podstawie udziału toksycznych genotypów w zespołach cyjanobakterii możliwe jest przewidywanie występowania toksycznego zakwitu we wczesnej fazie sezonu wegetacyjnego. Dla pełnego obrazu zależności środowiskowych związanych z toksycznymi zakwitami, zbadano również potencjał do degradacji cyjanotoksyn (mikrocystyn) w wybranych jeziorach przez naturalne zespoły bakterii. Przeprowadzono analizę porównawczą dwóch metod badania składu taksonomicznego cyjanobakterii w próbkach wody jeziornej klasycznej metody mikroskopowej i metody molekularnej, opartej na elektroforezie w gradiencie denaturującym (DGGE) i sekwencjonowaniu DNA. Wykazano, że do pełnej identyfikacji składu taksonomicznego nadal niezbędne jest stosowanie metod mikroskopowych. Metoda molekularna może być jednakże zastosowana do określenia występowania taksonów dominujących w zakwicie cyjanobakterii, a jej zaletą jest znacznie krótszy czas uzyskania wyników, zwłaszcza w przypadku konieczności analizy licznych próbek. Analiza DGGE pozwoliła również na stworzenie profili prążkowych, charakterystycznych dla danej próbki wody jeziornej, dzięki którym można było prześledzić zmiany sezonowe zachodzące w zespołach cyjanobakterii, oraz określić, jakie czynniki wpływają na podobieństwa i różnice pomiędzy nimi. Wyniki analiz pokazały, że w badanych jeziorach mazurskich najbardziej zróżnicowana struktura taksonomiczna cyjanobakterii występuje w miesiącach letnich. Najważniejszym czynnikiem wpływającym na podobieństwo zespołów cyjanobakterii pomiędzy analizowanymi próbkami wody z poszczególnych jezior nie jest ich bezpośrednie połączenie albo zbliżony stan troficzny, ale sezon pory roku, w którym pobierano próbki do badań. W większości jezior istnieje też podobny potencjał występowania poszczególnych taksonów cyjanobakterii, a tylko ich aktualna liczebność zależna jest od aktualnie panujących warunków środowiskowych. Oznacza to, że nawet jeziora o stosunkowo niskim statusie troficznym, w odpowiednich warunkach środowiska (takich jak np. podwyższona temperatura wody lub wysokie nasłonecznienie), mogą pojawiać się zakwity tych mikroorganizmów. W niniejszej pracy opracowano procedurę rozpoznawania toksycznych rodzajów cyjanobakterii w próbkach środowiskowych z zastosowaniem analizy DGGE, w której użyto fragment genu mcya z klastra kodującego enzymy syntetyzujące mikrocystyny. Wyniki tej analizy wskazują, że pomimo bardzo dużego zróżnicowania struktury taksonomicznej zespołów cyjanobakterii w badanych jeziorach SWJM, jedynie przedstawiciele dwóch

4 rodzajów z nich - Microcystis spp. i Planktothrix spp. mogą wytwarzać mikrocystyny. Toksyczne genotypy znajdowano we wszystkich badanych jeziorach, jednak najczęściej wykrywano te należące do Planktothrix spp. Prawdopodobne jest, że w czasie trwania badań uchwycono moment rozprzestrzeniania się toksycznego Planktothrix spp. do mezotroficznego jeziora Mamry, w którym wcześniej nie wykrywano toksycznych genotypów tego taksonu. Ponieważ doniesienia ostatnich lat wskazują, że do potencjalnie toksycznych cyjanobakterii należą również taksony pikocyjanobakterii, sprawdzono czy wśród szczepów Synechococcus spp., wyizolowanych we wcześniejszych latach z jezior mazurskich, znajdują się takie, które posiadają geny kodujące wytwarzanie mikrocystyn. Wykazano, że w jednym ze szczepów, wyizolowanym z jeziora Bełdany, obecne były geny z klastra mcy. Trzy sekwencje: mcya, mcyd i mcye, są wykazanymi po raz pierwszy w świecie sekwencjami genów mcy,występującymi u pikocyjanobakterii. Badania z zastosowaniem real-time PCR pozwoliły na prześledzenie zmian w udziale toksycznych genotypów w całkowitej liczebności populacji Microcystis i Planktothrix spp. w okresie sezonu wegetacyjnego. Stwierdzono, że średnie całkowite liczebności komórek Planktothrix spp. były o rząd wielkości wyższe, niż liczebności komórek Microcystis spp. Udział toksycznych genotypów w całkowitej liczebności Microcystis spp. był zmienny, ale w większości próbek niski, tylko w trzech z nich przekraczał 30%. Nie zaobserwowano żadnej tendencji, z jaką udział toksycznych komórek Microcystis spp. zmieniałby się w okresie sezonu wegetacyjnego. Natomiast w populacjach Planktothrix spp., udział toksycznych genotypów był zawsze bardzo wysoki (>75%), choć zaobserwowano też tendencję do nieznacznego zmniejszania się udziału toksycznych komórek cyjanobakterii w populacji w czasie sezonu. Stwierdzono, że na podstawie udziału toksycznych komórek w całkowitej liczebności Planktothrix spp. w próbkach pobieranych wiosną, można prognozować zagrożenie wystąpieniem toksycznego zakwitu w badanym jeziorze w późniejszych miesiącach. Wyniki badań wykazały także, że w przypadku osiągnięcia dużej biomasy przez mazurskie populacje Planktothrix spp. zawsze będzie istniało duże ryzyko skażenia wody mikrocystynami. Analizując stężenia mikrocystyn w badanych próbkach stwierdzono, że gdy liczebność dwóch potencjalnie toksycznych rodzajów cyjanobakterii osiąga 6,6 x 10 6 kom/l, całkowite stężenie mikrocystyn przekracza graniczne bezpieczne stężenie dla wód wykorzystywanych jako woda pitna (1 µg/l). Wykazano korelację pomiędzy liczebnością toksycznych komórek Planktothrix spp. a stężeniem toksyn w próbce. Takich zależności nie znaleziono natomiast w przypadku Microcystis spp. Oznacza to, że głównym taksonem cyjanobakterii

5 odpowiedzialnym za wytwarzanie mikrocystyn w badanych jeziorach mazurskich jest rodzaj Planktothrix. W prezentowanej pracy zbadano też, czy w wybranych jeziorach SWJM występują bakterie posiadające geny mlr odpowiedzialne za degradację mikrocystyn. Potwierdzono, że w badanych jeziorach występują bakterie mogące rozkładać mikrocystyny, a badania filogenetyczne zaklasyfikowały te bakterie do rodziny Sphingomonadaceae, w której wcześniej opisywano taksony bakterii posiadające zdolność rozkładu toksyn. Stwierdzono również, że bakterie te w jeziorach mazurskich występują przede wszystkim w osadach dennych, a do wód powierzchniowych mogą rozprzestrzeniać się w sprzyjających warunkach środowiska.