TEMAT 8: Analiza mikrobiologiczna wody

Transkrypt

1 TEMAT 8: Analiza mikrobiologiczna wody Literatura uzupełniająca: A. Grabińska-Łoniewska Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej str Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: Wiedzieć, jakie są przyczyny skażenia wód i dlaczego kontrolujemy ich jakość mikrobiologiczną. Znać poszczególne organizmy wskaźnikowe wykorzystywane w analizie mikrobiologicznej wody i umieć scharakteryzować ich podstawowe cechy. Znać kryteria bakteriologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia w Polsce. Umieć oznaczyć liczebność organizmów wskaźnikowych w próbie wody i znać podstawowe pojęcia stosowane przy określaniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego wody (np. NPL) Dlaczego kontrolujemy jakość sanitarną wody? Możliwość zakażenia ludzi przez wodę zmusza do stałej kontroli higieniczno-sanitarnej, zarówno wody przeznaczonej do picia, jak też i wody w basenach kąpielowych, a nawet w zbiornikach wód powierzchniowych. Przyczyną zakażeń są mikroorganizmy chorobotwórcze wydalane przez ludzi chorych i nosicieli (osobnicy, którzy po przebyciu choroby wydalają zarazki jeszcze przez długi czas z kałem lub moczem). Zarazki występują w ściekach i w wodach powierzchniowych w znacznie mniejszych ilościach niż pozostałe drobnoustroje. Z tego też względu znacznie trudniej jest je wykryć niż występujące masowo w wodzie bakterie saprofityczne, tym bardziej, że w celu ich wykrycia konieczne jest stosowanie znacznie bardziej skomplikowanych metod diagnostycznych. Co to są mikroorganizmy wskaźnikowe? Obowiązujące normy oparte są na pośrednim wnioskowaniu o obecności mikroorganizmów chorobotwórczych na podstawie liczebności w wodzie bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych. Ich obecność w wodzie świadczy o jej zanieczyszczeniu fekalnym, a zatem również o niebezpieczeństwie zakażenia wody mikroorganizmami chorobotwórczymi. Bakterie pełniące rolę wskaźników sanitarnych powinny spełniać następujące warunki: muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka, co pozwala zawsze na wykrycie kałowego zanieczyszczenia wody

2 do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należeć także formy nie przetrwalnikujące, co umożliwia wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod długość życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym musi być większa niż długość życia gatunków chorobotwórczych liczebność bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka i kale powinna być duża nie powinny się one rozmnażać w środowisku wodnym. Jakie bakterie wskaźnikowe wykorzystywane są do oceny jakości zdrowotnej wody? W rutynowej pracy laboratoriów, prowadzących nadzór sanitarno - epidemiologiczny, niemożliwe jest stałe badanie wody w kierunku wykrywania wszystkich drobnoustrojów chorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych, które mogą w niej występować. Dlatego też badania rutynowe koncentrują się przede wszystkim na wykrywaniu bakterii wskazujących na kałowe zanieczyszczenie wody. Do oceny jakości sanitarnej wody wykorzystywana jest mikroflora saprofityczna zasiedlająca jelito grube człowieka. Przyjęto następujące wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody: -Escherichia coli -bakterie grupy coli, -paciorkowce kałowe (Enterokoki), -laseczki z rodzaju Clostridium ( Clostridium perfringens), redukujące siarczyny oraz w niektórych przypadkach gronkowce koagulazo-dodatnie Pseudomonas aeruginosa Legionella sp. Pałeczka okrężnicy (Escherichia coli) Fakultatywnie tlenowa, Gram-ujemna pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae. Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt stałocieplnych. W jelicie spełnia pożyteczną rolę, uczestnicząc w rozkładzie pokarmu, a także przyczyniając się do produkcji witamin z grupy B, C oraz K. E. coli spotyka się również w glebie i wodzie, gdzie trafiają z wydzielinami i kałem. Bakterie te, zwykle nieszkodliwe w jelicie, mogą jednak powodować groźne schorzenia przewodu pokarmowego, dróg moczowych, a ostatnio często dróg oddechowych.

3 Bakterie z grupy coli Bakterie grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella. Wykrywane są one na podłożach z laktozą po inkubacji w temperaturze 37 o C. Bakterie grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) to głównie szczepy Escherichia coli i tylko te nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają zdolność fermentacji laktozy w temperaturze 44 o C. Obecność w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub bakterii grupy coli typu kałowego świadczy o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody kałem, ściekami, glebą lub gnijącym materiałem roślinnym. W zasadzie dla większości rodzajów wód zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu grup coli. Paciorkowce kałowe Paciorkowce kałowe to grupa bakterii kulistych lub owalnych, występujących w postaci komórek pojedynczych, dwoinek lub krótkich łańcuszków. Obejmuje ona drobnoustroje z rodzajów: Enterococcus i Streptococcus należące do grupy serologicznej Lancefield D, m. in. Streptococcus faecalis, S. faecium, S. equinus i S. bovis. Występują one powszechnie w kale ludzi i zwierząt. Stwierdzenie obecności paciorkowców kałowych w badanej próbie świadczy o jej kontakcie z zanieczyszczeniami typu kałowego, podobnie jak obecność bakterii grupy coli. Występowanie enterokoków w liczbie znacznie przewyższającej liczbę bakterii grupy coli, sugerować może zanieczyszczenie wody kałem zwierzęcym lub ściekami, pochodzącymi z ferm hodowlanych. Paciorkowce fekalne na ogół charakteryzuje dłuższa przeżywalność w wodzie oraz większa odporność na działanie chloru niż bakterie grupy coli. Najważniejsze cechy charakterystyczne tej grupy bakterii to: - zdolność wzrostu w temperaturze 45 o C, w obecności 40% żółci oraz obecności azydku sodowego; - zdolność wzrostu w temperaturze 10 o C ( z wyjątkiem S. bovis i S. equinus) przy ph 9,6, w obecności 6,5% chlorku sodowego; - ujemny test na katalazę oraz barwienie dodatnie w metodzie Grama. Laseczki z rodzaju Clostridium O starym, odległym w czasie zanieczyszczeniu kałowym może świadczyć wykrycie w badanej próbce wody bakterii redukujących siarczyny (głównie szczepy Clostridium perfringens); ich przetrwalniki mogą zachować żywotność przez wiele lat w niesprzyjających warunkach. Clostridia redukujące siarczyny są też bardzo dobrym wskaźnikiem prawidłowości prowadzonych procesów uzdatniania wody, takich jak koagulacja, sedymentacja i filtracja. Przetrwalniki tych bakterii, a wraz z nimi również cysty pasożytniczych pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia)

4 powinny być wyeliminowane właśnie w tych etapach uzdatniania wody, gdyż są one bardzo oporne na działanie środków dezynfekcyjnych. Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie znacznie bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i daje dużą pewność, że woda uzdatniona jest wolna od pierwotniaków i jaj robaków chorobotwórczych (helmintów). Pseudomonas aeruginosa Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej proponuje się obecnie dodatkowo wykrywanie bakterii z gatunku Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i na potrzeby gospodarcze a także w wodzie dla zakładów kąpielowych oraz w wodach powierzchniowych. Przedstawicieli tego gatunku wyizolowano z kału ludzkiego oraz w przypadkach zakażeń organizmu z dróg moczowych, ucha środkowego, ropiejących ran itp. Bakterie te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i zwierząt. Poza tym występują one powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie. Warto także podkreślić, że mogą one bytować w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają się znaczną odpornością na zabiegi dezynfekcyjne. Bakterie z rodzaju Legionella Bakterie z rodzaju Legionella są to Gram ujemne pałeczki posiadające polarnie umieszczone wici w liczbie od 1 do 3. Do wzrostu potrzebują żelaza i cysteiny. Ich naturalnym rezerwuarem są wody śródlądowe i morskie. Licznie występują również w glebie i gorących źródłach wody. Wyizolowano do tej pory 46 gatunków z rodzaju Legionella, wśród których zidentyfikowano 70 grup serologicznych. Bakterie z rodzaju Legionella są wewnątrzkomórkowymi pasożytami pierwotniaków. Mogą również powodować nietypowe zapalenie płuc u ludzi, jak i gorączkę Pontiac. Szczególnie niebezpieczne dla człowieka są bakterie należące do gatunku Legionella pneumophila. Dostają się one do płuc w mikroaerozolach o średnicy 2,0 5,0 µm powstających np. w kabinach prysznicowych. Postaci płucnej legionellozy towarzyszy suchy kaszel, zaburzenia w oddychaniu, temperatura powyżej 40 C, zaburzenia świadomości. Śmiertelność wynosi 10-20% zachorowań. Rezerwuarem tych bakterii są systemy ciepłej wody i urządzenia wentylacyjne. Bakterie te mogą kolonizować wewnętrzne części rur z ciepłą wodą, zbiorniki na ciepłą wodę, wieże chłodnicze, perlatory zaworów czerpalnych (głowice natryskowe pryszniców). Ogólna liczebność bakterii W badaniach rutynowych określa się również ogólną liczbę bakterii, jako liczbę jednostek tworzących kolonie, w skrócie j.t.k.(odpowiednik angielski: cfu - colony forming units) obecnych w 1 ml wody, po wykonaniu posiewu próbki na agar odżywczy i inkubacji w temperaturach 22±2 o C przez 72 godz. (psychrofile), oraz w 36±2 o C przez 24 godz. (mezofile).

5 Ogólna liczebność bakterii psychrofilnych W niższej temperaturze rosną przede wszystkim nie chorobotwórcze bakterie wodne. Należy jednak mieć na uwadze fakt, że Gram-ujemne bakterie wodne wytwarzają lipopolisachardy ściany komórkowej mogące działać toksycznie tak jak endotoksyny bakterii chorobotwórczych. Z tego powodu ich liczba powinna być także monitorowana. Ponadnormatywny wzrost ich liczebności świadczyć może między innymi, o obecności w wodzie łatwo przyswajalnych związków organicznych. Teoretycznie, obecność w wodzie 0,1 mg węgla organicznego może spowodować wzrost liczby bakterii w 1 ml do 10 8 j.t.k. (cfu). Również fosfor jest czynnikiem stymulującym wzrost drobnoustrojów. Dodanie niewielkiej ilości tego pierwiastka (<50mg/l) powoduje nawet 10- krotne przyspieszanie rozwoju bakterii w wodociągach. Ogólna liczebność bakterii mezofilnych Ze względów zdrowotnych, bardziej niebezpieczna jest ponadnormatywna liczba bakterii rosnących w temperaturze 37 o C, ponieważ mogą wśród nich być również bakterie chorobotwórcze. Duża ich liczba w badanej próbce wody, może świadczyć, między innymi, o źle przebiegających procesach uzdatniania lub zasysaniu zanieczyszczonej wody. Co może być powodem zwiększenia ogólnej liczby bakterii w wodzie? Zwiększenie ogólnej liczby bakterii obecnych w próbce wody może świadczyć o namnażaniu się drobnoustrojów na wewnętrznych powierzchniach instalacji wodnych, szczególnie na złączach rur i uszczelkach oraz tworzeniu się warstwy tzw. biofilmu. Przekroczenie dopuszczanego poziomu ogólnej liczby bakterii powinno być zawsze sygnałem do znalezienia przyczyny zanieczyszczenia i do podjęcia odpowiedniego postępowania. Niekiedy może istnieć konieczność dodatkowego chlorowania, np. wody do picia, powyżej 0,2 mg Cl2/l. W niektórych przypadkach dopiero zmiany konstrukcyjne sieci wodociągowej i usunięcie biofilmu są w stanie skutecznie zabezpieczyć odbiorcę przed wzrostem liczebności drobnoustrojów w wodzie. Kryteria jakości sanitarnej wody do picia w Polsce. Jakość bakteriologiczna wody do picia w Polsce oceniana jest na podstawie liczebności dwóch grup bakterii wskaźnikowych: Escherichia coli i enterokoków (tabela 1). Dodatkowo dokonuje się analizy bakterii z grupy coli oraz klostridiów redukujących siarczyny (tabela 2).Według stosowanych w Polsce kryteriów w 100 ml wody podawanej do sieci wodociągowej nie może być ani jednej komórki bakterii uznanych za wskaźnikowe. Podobne normy jakości wody obowiązują w Unii Europejskiej. Dodatkowym ważnym kryterium jakości wody do picia jest także ogólna liczebność bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml wody. Według stosowanych w Polsce kryteriów w

6 wodzie do spożycia przez ludzi liczebność bakterii psychrofilnych nie powinna przekraczać 100 komórek w 1ml, natomiast bakterii mezofilnych 50 komórek w 1 ml wody (tabela 2). Osobne wymagania dotyczą wód wprowadzanych do jednostkowych opakowań (tabela 3) oraz wód w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego (tabela 4). Jakość wody ciepłej ocenia się na podstawie liczebności bakterii z rodzaju Legionella (tabela 5). Tabela 1. Podstawowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia Lp. Parametr Najwyższa dopuszczalna wartość Liczba mikroorganizmów Objętość próbki [ml] [jtk] 1 Escherichia coli Enterokoki Tabela 2. Dodatkowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia Lp. Parametr Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody Liczba mikroorganizmów Objętość próbki [ml] [jtk] 1 Bakterie grupy coli Ogółna liczba mikroorganizmów 50 1 w 36±2 o C po 48 h Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2 o C po 72 h 5 Clostridium perfringens Tabela 3. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda wprowadzana do opakowań jednostkowych. Lp. Parametr Najwyższa dopuszczalna wartość Liczba mikroorganizmów [jtk] Objętość próbki [ml] 1 Escherichia coli Enterokoki Pseudomonas aeruginosa Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2 o C po 48 h 5 Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2 o C po 72 h Dopuszcza się pojedyncze bakterie wykrywane sporadycznie 2 Należy badać w wodzie pochodzącej z ujęć powierzchniowych i mieszanych, a w przypadku przekroczenia dopuszczalnych wartości, należy zbadać czy nie ma zagrożenia zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności innych mikroorganizmów chorobotwórczych, np. Cryptosporidium.

7 Tabela 4. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego. Lp. Parametr Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody pobranej Liczba mikroorganizmów Objętość próbki [ml] [jtk] 1 Escherichia coli Enterokoki Pseudomonas aeruginosa Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2 o C po 48 h Tabela 5. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać ciepła woda użytkowa Lp. Parametr Najwyższa dopuszczalna wartość Liczba mikroorganizmów Objętość próbki [ml] [jtk] 1 Legionella sp. 3 < Należy badać w ciepłej wodzie w budynkach zamieszkania zbiorowego i zakładach opieki zdrowotnej zamkniętej

8 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie1. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych (FM) Metodę tę stosuje się do wykrywania bakterii grupy coli w wodzie wodociągowej uzdatnionej i nieuzdatnionej. Metody nie należy stosować do oznaczania liczby bakterii coli w wodach powierzchniowych o mętności wyższej niż 20 mg SiO2/dm 3, przy równocześnie niskiej liczbie bakterii grupy coli, tj. poniżej 10 kolonii w 100 cm 3 wody, a wysokiej liczbie (powyżej 100 komórek/cm 3 ) bakterii wodnych mogących rozwinąć się również na zastosowanym podłożu. Metoda ta nie nadaje się do oznaczania liczby bakteri coli w ściekach. W tych przypadkach należy wykonać oznaczenia metodą fermentacyjno-probówkową (FP). Zasada metody: Oznaczanie liczby bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych przez określenie tzw. wskaźnika coli jako wyniku ostatecznego polega na przesączeniu przez filtr membranowy odpowiednio dobranej objętości próbki wody. Bakterie zatrzymane na filtrze umieszczonym następnie na pożywce wybiórczej dyfundującej przez pory filtru, rozwijają się w czasie inkubacji, tworząc kolonie o typowym wyglądzie. Założono, że z jednej komórki bakteryjnej rozwija się jedna kolonia. Przez obliczenie typowych kolonii bakterii należących do grupy coli określa się następnie wskaźnik coli jako liczbę komórek bakterii grupy coli w 100 cm 3 próbki wody. Objętość próbki nie powinna być mniejsza niż 250 cm 3. Przed użyciem aparat filtracyjny należy wysterylizować w autoklawie w temp. 120 o C przez 15 min. Filtry membranowe (o średnicy ok. 50 mm i przeciętnej średnicy porów 0,45 μm) wysterylizować w przez dwukrotne wygotowanie w wodzie destylowanej, każdorazowo zmienianej w ciągu 20 min. Sposób postępowania: 1. Zmontować aparat filtracyjny. W tym celu lejek umieścić w kolbie ssawkowej, połączonej z pompą próżniową. Przy zamkniętym kranie aparatu nałożyć pincetą (wyjałowioną przez opalanie) filtr membranowy na porowatą płytkę, błyszczącą względnie kratkowaną stroną do góry, 2. Wlać odpowiednią ilość badanej wody do lejka, otworzyć kran i przefiltrować próbkę. Objetość próbki użytej do filtracji powinna wynosić odpowiednio: - dla wody wodociągowej cm 3 ; -dla wody powierzchniowej i wody z basenu kąpielowego 1 i 0,1 cm 3 ; Całkowita objętość filtrowanej wody nie powinna być mniejsza niż 20 cm Po przefiltrowaniu, ściany lejka spłukać dokładnie jałową wodą buforowaną; 4. Zamknąć kran i wyjałowioną pincetą przenieść filtr membranowy na powierzchnię podłoża agarowego Endo FM. Filtr powinien być położony do góry zawiesiną bakteryjną tak, aby nie było pęcherzyków

9 powietrza pomiędzy filtrem a podłożem; 5. Płytki Petriego z filtrami umieścić w cieplarce dnem ku górze i inkubować w temp. 37 o C w ciągu 20 godz. Okres inkubacji należy przedłużyć do 48 godz. w przypadku braku wzrostu po 20 godzinach lub wzrostu nielicznych, nietypowych kolonii. 6. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie typowe, tj. ciemnoczerwone z metalicznym, połyskiem (tzw. połysk fuksynowy). Do liczenia należy wybrać filtry, na których jest od 20 do 80 kolonii typowych, a ogólna liczba kolonii nie przekracza 200. Jeśli po 20 godz. nie stwierdza się obecności typowych kolonii, natomiast wyrosły kolonie czerwone, różowe z ciemnym środkiem i różowe, należy przeprowadzić badanie potwierdzające. Badania te należy również zastosować przy pojawieniu się kolonii z metalicznym połyskiem po przedłużonym okresie inkubacji. W tym celu od 3-6 kolonii z filtrów należy przeszczepić na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolowąi inkubować w temp. 37 o C w ciągu godz. Pojawienie się gazu w rurce Durhama oraz zmiana zabarwienia podłoża na żółte świadczy o dodatnim wyniku badania potwierdzającego. W przypadku ujemnego wyniku na podłożu laktozowym, należy przeprowadzić badanie potwierdzające, jak w etapie II metody fermentacyjno-probówkowej (FP). Zadanie 2. Oznaczanie Escherichia coli (bakterii grupy coli typu kałowego) metodą filtrów membranowych (FM) Badanie wstępne wykonać zgodnie z metodyką podaną przy oznaczaniu bakterii grupy coli (zadanie 1). Inkubację hodowli na podłożu agarowym Endo FM prowadzić w temp. 44 o C przez 24 godz.; W razie konieczności wykonania badania potwierdzającego, materiał z kolonii należy wyizolować na skos agarowy, a nastepnie wykonac barwienie metodą Grama oraz sprawdzić zdolność do wytwarzania oksydazy cytochromowej i fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu na pożywce ze wskaźnikiem Andrade lub na pożywce z zielenią brylantową w temp.44 o C w ciągu 24 godz. Obliczanie wyniku oznaczania Wynik badania należy podać w jednostkach tworzących kolonie (jtk)/ 100 cm 3 (wskaźnik coli) korzystając ze wzoru: X = a x 100/V gdzie: X wskaźnik coli, a liczba typowych kolonii, V objętość filtrowanej wody [cm 3 ]. Ostateczny wynik stanowi średnią arytmetyczną, z co najmniej dwóch filtracji różnych objętości wody. Na podstawie wartości wskaźnika można obliczyć miano coli lub miano coli typu kałowego

10 (E. coli) wg wzoru: miano coli = 100/X gdzie: X wskaźnik coli Zadanie 3. Oznaczanie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) metodą filtrów membranowych (FM) Metodę FM do oznaczania paciorkowców kałowych stosuje się do wszystkich wód, z wyjątkiem wód o dużej zawartości zawiesiny. Oznaczenie paciorkowców kałowych polega na przesączeniu określonej objętości próbki przez filtr membranowy i przeniesieniu filtru z bakteriami na pożywkę Slanetza i Bartleya (SB) z azydkiem sodu. Paciorkowce rozwijają się na tej pożywce tworząc charakterystyczne kolonie zabarwione na kolor czerwony i różowy; Postępowanie: 1. Przefiltrować wodę jakw zadaniu 1 i 2 2. Po filtracji (warunki sterylne), jałową pincetą przenieśc filtr membranowy na pożywkę SB i wstawić do cieplarki o temperaturze 37 o C na 48 h 3. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Ze względu na niewielkie rozmiary kolonii (0,2 do 1 mm średnicy), zaleca się liczyć je pod lupą. Liczba wyrosłych kolonii nie powinna być większa niż 100 i nie mniejsza niż 20, dlatego zaleca się wykonanie rozcieńczeń badanej próbki. Obliczanie wyniku oznaczania: liczbę paciorkowców kałowych (X) obliczyć wg wzoru: X = a x 100/V a liczba typowych kolonii na pożywce SB, V objętość filtrowanej wody [cm 3 ] Wynik należy podać jako jtk /100 cm 3 próbki

11 Zadanie 4. Oznaczanie liczby bakterii psychrofilnych i mezofilnych 1. Oznaczanie wykonać metodą płytkową Kocha, stosując posiew wgłębny na podłoże agarowe odżywcze. Posiewy wody wodociągowej wykonać z prób nierozcieńczonych (1 cm 3 ) oraz z rozcieńczenia 10-1 (1 cm 3 ); 2. Inkubację bakterii psychrofilnych prowadzić w temp. 20 o C w ciągu 72 godzin, a mezofilnych w temp. 37 o C przez 24 h; 3. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Do określenia liczby kolonii, przy posiewie wody powierzchniowej i ścieków, wybrać płytki,na których wyrosło od kolonii. W przypadku, gdy liczba kolonii wyrosłych na płytce jest większa niż 300 oznaczenie należy wykonać ponownie. Licząc kolonie z próby rozcieńczonej, należy liczbę koloni pomnożyć przez krotność rozcieńczenia; 4. Wynik oznaczenia podać jako jtk/1 cm 3