ĆWICZENIE L12 KWASY NUKLEINOWE - IZOLACJA DNA, HYDROLIZA ATP ORAZ ANALIZA SKŁADU DNA I RNA

Transkrypt

1 ĆWICZENIE L12 KWASY NUKLEINOWE - IZOLACJA DNA, HYDROLIZA ATP ORAZ ANALIZA SKŁADU DNA I RNA Wymagania: Właściwości fizykochemiczne kwasów nukleinowych Metody wykrywania składników strukturalnych kwasów nukleinowych Parametry wpływające na zachowanie struktury natywnej DNA Ogólna charakterystyka metodyki izolacji DNA Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym etapem większości procedur stosowanych w biologii molekularnej, diagnostyce i biochemii. Głównym celem tego etapu jest uzyskanie wysokiej jakości i czystości materiału biologicznego, niezależnie od źródła jego pochodzenia. Wybór odpowiedniej metody izolacji zależy od: rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyskać (DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.), pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne, wirusowe itd.), rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację (z tkanek, organu, hodowli komórkowej itd.), oczekiwanych rezultatów (czystość, jakość, czas izolacji itd.) przeznaczenia (PCR, klonowanie, itd.). Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje się DNA biologicznie aktywne, chemicznie stabilne oraz wolne od RNA i białek. Jednakże ze względu na wielkość i wrażliwość chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego izolacja w formie niezmienionej. Część DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom. Podczas izolacji DNA z komórki należy wziąć pod uwagę następujące parametry, warunkujące zachowanie natywnej struktury DNA: 1. ph: wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami są stabilne w środowisku o ph = 4 10, wiązania fosfodiestrowe w szkielecie DNA są trwałe w zakresie ph = 3 12, wiązania N-glikozydowe z zasadami purynowymi (adeniną i guaniną) ulegają hydrolizie przy ph < Temperatura: istnieją znaczne różnice w stabilności termicznej wiązań wodorowych w podwójnej helisie, ale większość DNA ulega rozpleceniu w temperaturze C, wiązania N-glikozydowe i fosfodiestrowe są trwałe do 100 C.

2 3. Siła jonowa: DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli, w stężeniu soli mniejszym niż 0,1M osłabiają się wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi łańcuchami. 4. Warunki komórkowe: Przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie ściany komórkowej (komórki grzybowe, bakteryjne i in.) i liza błon komórkowych (komórki zwierzęce i in.); łatwość rozbicia ściany zależy od rodzaju organizmu, w niektórych przypadkach konieczne jest intensywne ucieranie lub działanie ultradźwiękami (komórki drożdży, tytoniu), podczas gdy w innych (E. coli) możliwa jest enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej. W komórce występuje kilka enzymów, które hydrolizują DNA; najistotniejszymi z nich są deoksyrybonukleazy, które hydrolizują wiązania fosfodiestrowe. Ponadto natywny DNA występuje w komórkach w kompleksie z białkami (histony, helikazy, polimerazy i in.), białka te muszą być oddzielone podczas ekstrakcji. 5. Odporność mechaniczna DNA: Łagodne manipulowanie nie zawsze jest możliwe podczas izolacji DNA; ucieranie, wytrząsanie, mieszanie i inne czynności mechaniczne mogą spowodować rozszczepienie DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorzędowej struktury DNA, ale zmniejsza długość cząsteczki (fragmentacja). Ocena wydajności izolacji Ocena uzyskanego DNA polega na spektrofotometrycznym pomiarze ilości uzyskanego kwasu. Pomiar przeprowadza się długości fali = 260 nm i = 280 nm, jako odnośnik stosując wodę do PCR, a następnie wyznacza się stosunek A260nm/A280nm. Wartości prawidłowe mieszczą się w zakresie 1,6 do 1,8. Preparat powinien zawierać około 1 mg DNA w 1 ml. Wartości stosunku A260nm/A280nm < 1,6 świadczą o zanieczyszczeniu preparatu białkami, wartości > 1,8 - o zanieczyszczeniu używanymi odczynnikami. Zawartość DNA w roztworze określa wzór: gdzie: Zawartość DNA = A260nm x 50 x R A260nm wartość absorbancji przy długości fali = 260 nm 50 1 jednostka absorbancji = 50 g dwuniciowego DNA R rozcieńczenie. 1. Izolacja i badanie składu DNA Najczęściej wykorzystywanym do izolacji DNA materiałem jest pełna krew obwodowa. pobiera się od 1 do 5 ml krwi żylnej. Aby zapobiec krzepnięciu, krew powinna być pobierana na EDTA (sól dwudowa kwasu wersenowego), który chelatuje zarówno jony Ca 2+ (zapobiega

3 krzepnięciu krwi), jak i hemoglobinę (inhibitor polimeraz DNA) oraz zapobiega degradacji DNA powodowanej obecnością DNAz. Główne etapy izolacji DNA z krwi obwodowej to: liza komórek nieposiadających jąder takich jak erytrocyty i ich odrzucenie z surowicą jako zbędne zanieczyszczenia. zebranie interesujących nas leukocytów, ich liza, oczyszczanie RNA-zą w celu usunięcia jednoniciowych kwasów nukleinowych, głównie RNA, oraz odbiałczanie w celu usunięcia białek histonowych i niehistonowych. wytrącanie DNA alkoholem izopropylowym. Suszenie DNA na powietrzu. Uwodnienie DNA, czyli przygotowanie próbki do analizy bądź przechowywania Izolacja DNA z krwi Liza komórek 1. Wlać do probówki wirowniczej typu Falcon (poj. 15 ml) 4,5 ml Roztworu do lizy krwinek czerwonych. 2. Dodać 1,5 ml krwi. 3. Odwrócić probówkę w celu wymieszania zawartości. 4. Inkubować próbkę przez 3 min w temp. pokojowej. 5. Ponownie zamieszać przez odwrócenie. 6. Odwirować próbkę przy 2000 x g przez 10 min. 7. Usunąć supernatant pozostawiając ponad peletką białych krwinek ok. 100 l supernatantu. 8. Mocno wytrząsnąć próbkę w celu rozproszenia komórek w płynie. 9. Dodać 1,5 ml Roztworu do lizy krwinek białych aby rozproszyć komórki i pipetować góradół w celu wywołania lizy komórek. 10. Inkubować próbkę w 37 C przez 5 min. Oczyszczanie RNA-zą 1. Do poprzednio otrzymanej próbki dodać 5 l Roztworu RNAzy A i wymieszać zawartość przez 25-krotne obracanie probówki. 2. Inkubować próbkę w 37 C przez 15 min. Strącanie białek 1. Próbkę po inkubacji schłodzić do temperatury pokojowej; 2. Dodać 0,5 ml Roztworu strącającego białka i wytrząsać próbkę na wysokich obrotach przez 20 sekund. 3. Odwirować próbkę przy 2000 x g przez 10 min. Strącone białka tworzą brązową peletkę. Jeżeli nie jest ona wyraźna należy powtórzyć wytrząsanie, następnie inkubować w lodzie przez 5 min. i powtórnie odwirować próbkę.

4 Strącanie DNA 1. Przenieść supernatant zawierający DNA do czystej probówki wirowniczej o poj. 15 ml typu Falcon zawierającej 1,5 ml 100% izopropanolu i zamieszać przez 50-krotne obracanie probówki. 2. Odwirować próbkę przy 2000 x g przez 3 min. DNA widać w postaci małej białej peletki. 3. Wylać supernatant i szybko wysuszyć brzeg probówki poprzez zetknięcie z czystą bibułą filtracyjną. 4. Do probówki dodać 1,5 ml 70% etanolu i kilkakrotnie wymieszać DNA poprzez obracanie probówki. 5. Odwirować próbkę przy 2000 x g przez 1 min. i dokładnie usunąć etanol (Uwaga! Peletka może być luźna, więc etanol należy usuwać powoli). 6. Odwrócić i wysuszyć probówkę na czystej bibule filtracyjnej a następnie dosuszyć w otwartym falkonie, w bloku grzejnym w 37 C, przez około 10 min. Uwodnienie DNA 1. Do suchej pozostałości dodać 250 l Roztworu do uwodnienia DNA; 2. Inkubować próbkę w 65 C przez 20 min., okresowo stukając w probówkę w celu szybszego rozproszenia DNA Jakościowe oznaczanie deoksyrybozy Celem ćwiczenia jest wykrycie deoksyrybozy w DNA Preparat DNA w odczynniku Dische go (stęż. H2SO4, lodowaty CH3COOH i dwufenyloamina) w temperaturze 100 C ulega hydrolizie, następnie deoksyryboza tworzy z dwufenyloaminą produkt kondensacji o barwie niebieskofioletowej. Postępowanie: Przygotować 2 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) 1 2 H2O 0,1 - DNA - 0,1 Odczynnik Dische go 0,5 0,5 Uwaga: substancja żrąca i brudząca! Inkubacja w temp. 100 C 5 min.

5 2. Hydroliza ATP ATP związek makroergiczny Pierwsza reszta trójfosforanowa w ATP (AMP~P~P) przyłączona jest do rybozy wiązaniem estrowym. Dwie kolejne są przyłączone wiązaniami bezwodnikowymi. Są to wiązania wysokoenergetyczne, w tym znaczeniu, że podczas ich hydrolizy następuje zmiana energii swobodnej (ΔG o ' zmiana wzorcowej energii swobodnej). W wyniku przemian metabolicznych z ATP powstaje AMP i dwie reszty fosforanowe. AMP~P~P + H2O => AMP~P + reszta fosforanowa (Pi) + energia ΔG o ' = -7,3 kcal. mol -1 AMP~P + H2O => AMP + reszta fosforanowa (Pi) + energia ΔG o ' = -7,1 kcal. mol -1 Cel ćwiczenia to wykazanie obecności różnych wiązań przyłączających reszty fosforanowe w ATP. Wiązania bezwodnikowe ulegają hydrolizie w 1 M HCl w 100 o C (ciśnienie atmosferyczne) w ciągu 7 minut. Do oznaczenia ilości fosforu w próbie stosuje się metodę Fiskego i Subbarowa. W środowisku kwasowym jony fosforanowe(v) reagują z molibdenianem amonu tworząc żółtą sól fosforomolibdenian amonu. Eikonogen redukuje tę sól do błękitu molibdenowego. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia fosforu w próbie. Czułość metody 4-40 g w 1 ml analizowanego roztworu. Postępowanie: W celu przeprowadzenia kwaśnej hydrolizy do jednej probówki (nr 1) dodać 0,5 ml roztworu ATP i 0,5 ml 2 M HCl. Po zamieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 7 minut. Przygotować 3 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) Hydrolizat ATP 0,5 - - Nie hydrolizowane ATP 0,5 H2O - - 0,5 Molibdenian amonu* w 0,25 M H2SO4 0,5 - - Molibdenian amonu* w 1,5 M H2SO4-0,5 0,5 Eikonogen 0,2 0,2 0,2 H2O Inkubacja w temp. 37 o C 10 min. * - należy zachować ostrożność, ponieważ roztwór jest silnie brudzący.

6 Uwaga: do probówki nr 2 dodawany jest roztwór molibdenianu amonu w 0,25 M H2SO4, a do probówki nr 3 roztwór molibdenianu amonu w 1,5 M H2SO4, ponieważ roztwór ATP w probówce nr 1 zawiera już kwas solny. Po wyjęciu z łaźni próby ochłodzić i zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 660 nm Obliczenie stężenia ATP Obliczyć stężenie ATP (mmol/l) na podstawie zawartości fosforu w próbce, posługując się krzywą wzorcową. Masa cząsteczkowa fosforu wynosi Wykrywanie składników RNA Do dyspozycji jest gotowy, odpowiednio rozcieńczony, hydrolizat RNA. Hydrolizę prowadzono w 1 M HCl. Cel ćwiczenia to wykazanie występowania w RNA puryn, rybozy i reszty fosforanowej Wykrywanie puryn Puryny wykrywane są w hydrolizacie RNA doprowadzonym do ph 4, ponieważ w tym środowisku wodorosiarczan(iv) sodu (NaHSO3) (kwaśny siarczyn sodu) redukuje jony Cu 2+ do jonów Cu +. Nowo powstałe jony miedzi(i) tworzą nierozpuszczalne sole z purynami. Daje to w probówce zawierającej purynę opalizujący, żółtawy osad. Postępowanie: Przygotować 2 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce (ważna jest kolejność dodawania odczynników): Odczynniki (ml) 1 2 H2O 0,5 - Hydrolizat RNA ph 4-0,5 0,25 M CuSO4 0,1 0,1 Nasycony roztwór NaHSO3 0,1 0, Wykrywanie rybozy wg metody Biala Pentozy w środowisku stężonego kwasu solnego ulegają odwodnieniu i powstaje z nich furfural, który z orcynolem w obecności jonów żelaza(iii) tworzy zielony produkt. Ryboza połączona z zasadami purynowymi bierze udział w tej reakcji, a związana z pirymidynami nie.

7 Postępowanie: Przygotować 2 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) 1 2 H2O 0,5 - Hydrolizat RNA - 0,5 10% orcynol 0,2 0,2 FeCl3 w HCl 1,0 1,0 Inkubować w temp. 100 o C 5 min.