IZOLACJA CHROMOSOMALNEGO DNA Z KOMÓREK BAKTERYJNYCH

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt IZOLACJA CHROMOSOMALNEGO DNA Z KOMÓREK BAKTERYJNYCH Organizacja DNA u Procaryota Procaryota są organizmami haploidalnymi, choć w pewnych sytuacjach mogą stać się przejściowo diploidalne (krótki okres w cyklu podziałowym komórki). W większości przypadków rozmnażają się przez podział komórki, zsynchronizowany z podwojeniem materiału genetycznego zawartego w genoforze. W wyniku podziału każda komórka potomna otrzymuje jedną kopię chromosomu (szybkie, bezpłciowe rozmnażanie). Częstotliwość podziałów zależy od warunków środowiskowych i wielkości materiału genetycznego. Na przykład Escherichia coli replikuje i dzieli się w ciągu od 20 do 60 minut. Większość informacji genetycznej zawiera się w pojedynczej, nieoddzielonej od reszty protoplastu błoną cytoplazmatyczną, cząsteczce DNA. Genofor nie tworzy klasycznego chromosomu. Jednakże nie jest to struktura zupełnie naga. Nić DNA nawinięta jest na rdzeń zbudowany z RNA i białek histonopodobnych (np. białko HU i H-NS). Chromosom złożony jest z domen (pętli) o długości kpz, których końce przyłączone są do białkowo-błonowego rusztowania. Wielkość chromosomu prokariotycznego mieści się w zakresie od 0,6 0, pz (u Mycoplasma) do 9, pz (u Myxococcus xanthus); u E. coli wynosi 4, pz. Dotychczas przyjmowano, że chromosom bateryjny jest koliście zamkniętą cząsteczką dwuniciowego DNA (jak u E. coli), co zazwyczaj różni go od liniowego chromosomu eukariotycznego. Jednakże wykryto u bakterii również chromosomy w formie liniowej, występujące obok form kolistych (np. u Agrobacterium tumefaciens, Borrelia burgdorferi). Zawartość guaniny i cytozyny jest gatunkowo swoista i waha się od 30 % (niektóre gronkowce oraz bakterie z grupy Cytophaga) do 70 % (Micrococcus i bakterie śluzowe). Genomy prokariotyczne są znacznie mniejsze i mają mniej genów niż u Eucaryota (np. E. coli ma tylko 4397). Natomiast prawie cały DNA genoforu to geny kodujące (rys. 1). Geny prokariotyczne są genami ciągłymi, brak w nich intronów (wyjątek stanowią geny niektórych przedstawicieli Archea). Zapis w nich jest odczytywany kolejno, od miejsca startu do zakończenia. Większość genów zgrupowana jest w operony, mające wspólny region regulatorowy, wspólnie podlegające ekspresji. W tym samym fragmencie DNA może znajdować się informacja dla więcej niż jednego białka. W genomie prokariotycznym niezmiernie rzadko występują sekwencje powtarzające się. Mogą natomiast pojawiać się sekwencje insercyjne IS, będące transpozonami, czyli sekwencjami zdolnymi do przemieszczania się w genomie i przenoszenia z jednego organizmu do drugiego, czasem nawet dwóch odrębnych gatunków.

2 Rys. 1 Porównanie genomów człowieka, drożdży, kukurydzy i E. coli [1] Komórki prokariotyczne mogą posiadać dodatkowe pozachromosomalne elementy genetyczne plazmidy, których wielkość mieści się w granicach od 2 do kilkuset tysięcy par zasad. Prawie wszystkie plazmidy występują w komórkach w postaci superzwiniętej kolistej dwuniciowej cząsteczki DNA (choć mogą przyjmować formę zrelaksowaną kolistą czy też liniową). Są replikonami, mogą się replikować autonomicznie, niezależnie od chromosomu gospodarza. Są zdolne do przekazywania swoich genów innym komórkom. Plazmidy są nośnikami genów warunkujących m.in. inaktywację antybiotyków, metabolizm niektórych naturalnych produktów, wytwarzanie toksyn, specyficznych bakteriocyn oraz zdolność komórki do koniugacji (plazmid koniugacyjny E. coli, zawierający czynnik płciowy F). Ogólne zasady izolacji DNA Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje się DNA biologicznie aktywny, chemicznie stabilny oraz wolny od RNA i białek. Jednakże ze względu na wielkość i wrażliwość chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego izolacja w formie niezmienionej. Część DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom. Opracowanie procedury izolacji DNA wymaga szerokiej wiedzy na temat jego chemicznej stabilności i warunków w jakich znajduje się w swoim naturalnym środowisku (komórka). Czynniki eksperymentalne, które muszą być wzięte pod uwagę i ich wpływ na różne aspekty strukturalne natywnego DNA są zestawione w tabeli 1.

3 Tabela. 1 Parametry warunkujące zachowanie natywnej struktury DNA podczas izolacji Lp. Czynniki Wpływ na strukturę DNA 1. ph wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi niciami są stabilne w środowisku o ph = 4 10, wiązania fosfodiestrowe w szkielecie DNA są trwałe w zakresie ph = 3 12, wiązania N-glikozydowe z zasadami purynowymi (adeniną i guaniną) ulegają hydrolizie przy ph < 3; 2. temperatura istnieją znaczne różnice w stabilności termicznej wiązań wodorowych w podwójnej spirali, ale większość DNA ulega rozpleceniu w temperaturze C, wiązania N-glikozydowe i fosfodiestrowe są trwałe do 100 C; 3. siła jonowa DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli; w stężeniu soli mniejszym niż 0,1 M osłabiają się wiązania wodorowe pomiędzy komplementarnymi niciami; 4. warunki komórkowe 5. odporność mechaniczna DNA Etapy izolacji DNA z komórek bakteryjnych przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie bakteryjnej ściany komórkowej; łatwość rozbicia ściany zależy od rodzaju drobnoustroju, w niektórych przypadkach konieczne jest intensywne ucieranie lub działanie ultradźwiękami, podczas gdy w innych (E. coli) możliwa jest enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej, w komórce występuje kilka enzymów, które hydrolizują DNA; najistotniejszymi z nich są deoksyrybonukleazy, które hydrolizują wiązania fosfodiestrowe, natywny DNA występuje w komórkach w kompleksie z białkami; białka te muszą być oddzielone podczas ekstrakcji; łagodne manipulowanie nie zawsze jest możliwe podczas izolacji DNA; ucieranie, wytrząsanie, mieszanie i inne czynności mechaniczne mogą spowodować rozszczepienie DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorzędowej struktury DNA, ale zmniejsza długość cząsteczki (fragmentacja). Etap 1. Rozbicie ściany i błony komórkowej oraz uwolnienie DNA do roztworu, w którym jest on rozpuszczalny i zabezpieczony przed degradacją Procedura opisana w ćwiczeniu wymaga użycia lizozymu, enzymu rozbijającego ścianę komórkową. Lizozym katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych w polisacharydach ściany komórkowej. Powoduje to destrukcję błony zewnętrznej i uwolnienie DNA oraz innych komponentów wewnątrzkomórkowych. Do rozpuszczenia DNA służy roztwór NaCl zawierający EDTA. DNA będąc związkiem jonowym jest bardziej stabilny i rozpuszczalny w roztworze soli niż w wodzie destylowanej. EDTA wiąże jony metali (Cd 2+, Mg 2+, Mn 2+ ), które mogłyby tworzyć sole z anionowymi grupami fosforanowymi DNA oraz hamuje deoksyrybonukleazy, które wymagają dla swojej aktywności obecności jonów Mg 2+ lub Mn 2+. Sporadycznie jako czynnika kompleksującego przy izolacji DNA używa się cytrynianu, jednakże nie jest on dobrym czynnikiem chelatującym w stosunku do jonów Mn 2+. Łagodnie alkaliczne środowisko (ph = 8) zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy DNA a zasadowymi histonami i polikationowymi aminami, sperminą i spermidyną. Stosunkowo

4 wysokie ph przyczynia się także do zmniejszenia aktywności nukleaz i denaturacji innych białek. Etap 2. Dysocjacja kompleksów DNA-białko Celem zniesienia oddziaływań jonowych pomiędzy naładowanymi dodatnio histonami i ujemnie naładowanym szkieletem DNA stosuje się detergentów. Sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) wiąże się z białkami i nadaje im silnie anionowy charakter, a także działa jako czynnik denaturujący deoksyrybonukleazy i inne białka. Dysocjacja kompleksów DNAbiałko jest dodatkowo wspomagana przez alkaliczne środowisko, które zmniejsza dodatni ładunek histonów. Dla zapewnienia całkowitej dysocjacji kompleksów DNA-białko i dla usunięcia związanych kationowych poliamin dodaje się sól w wysokich stężeniach (NaCl, NaClO 4 lub inną sól). Sole niwelują oddziaływania jonowe pomiędzy DNA a kationem. Etap 3. Oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych komponentów komórkowych Przed wytrąceniem DNA roztwór musi być odbiałczony. Przeprowadza się to poprzez działanie mieszaniną chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie odwirowanie. W rezultacie powstają trzy warstwy: górna faza wodna, dolna faza organiczna i wąskie pasmo zdenaturowanego białka na granicy faz. Chloroform powoduje powierzchniową denaturację białek. Alkohol izoamylowy redukuje pienienie i stabilizuje granicę fazową, gdzie koncentruje się białko. Górna, wodna faza, zawierająca kwasy nukleinowe jest następnie oddzielana i DNA jest wytrącany poprzez dodanie etanolu. Dodając rozpuszczalnik organiczny zmniejsza się polarność środowiska, co powoduje zmniejszenie rozpuszczalności DNA, posiadającego strukturę jonową. DNA tworzy włoskowate, nitkowate osady, które można zebrać "nawijając" na bagietkę szklaną. Wyizolowany DNA może być nadal zanieczyszczony białkami i RNA. Białka można usunąć rozpuszczając DNA w roztworze soli i powtarzając traktowanie mieszaniną chloroform : alkohol izoamylowy aż do zaniku pasma białek na granicy faz. RNA zwykle nie strąca się tak jak DNA, ale może występować jako drobne zanieczyszczenie. RNA można zhydrolizować działaniem rybonukleazy po pierwszym lub drugim odbiałczaniu. Alternatywnie, DNA można wytrącać izopropanolem, który pozostawia RNA w roztworze. Jeżeli wymagany jest wysoki stopień oczyszczenia DNA można przeprowadzić kilka kolejnych odbiałczeń i wytrąceń. Szacuje się, że dzięki omawianej procedurze można wyizolować do 50 % komórkowego DNA. Średnio otrzymuje się 1 2 mg z grama wilgotnej masy komórek. Wyizolowany w ten sposób DNA posiada masę cząsteczkową rzędu Charakterystyka spektroskopowa DNA DNA wykazuje znaczną absorpcję w zakresie UV z uwagi na obecność aromatycznych zasad. Stwarza to możliwość badania struktury DNA. Zmiany strukturalne, takie jak rozplecenie nici zmieniają absorpcję. Oprócz tego pomiary absorpcji wykorzystuje się dla określenia czystości DNA. Główne pasmo absorpcji dla oczyszczonego DNA znajduje się przy 260 nm. Białka, stanowiące główne zanieczyszczenia preparatów DNA absorbują przy 280 nm. Stosunek A 260 /A 280 jest często stosowany jako relatywna miara wzajemnej zawartości DNA i białek w preparacie. Typową wartością dla izolowanego DNA jest 1,9. Mniejszy stosunek wskazuje na większe zanieczyszczenie białkami.

5 Wykonanie ćwiczenia UWAGA! Praca z bakteriami oraz odczynnikami chemicznymi może stwarzać zagrożenie dla zdrowia. Wszystkie roztwory należy pipetować z użyciem pipet automatycznych. Materiały i sprzęt 1. Komórki bakteryjne w postaci mokrej; E. coli, B. subtilis lub inne [0,5 1,5 g] 2. Bufor NaCl-EDTA; 0,15 M NaCl, 0,1 M EDTA, ph 8 [25 ml] 3. Roztwór lizozymu w wodzie; 10 mg/ml [l ml] 4. Roztwór SDS (siarczanu dodecylu sodu) w wodzie; 25 % [1,5 ml] 5. Roztwór NaClO 4 (nadchloranu sodu) w wodzie; 5 M [5,5 ml] 6. Mieszanina chloroform : alkohol izoamylowy; 24 : l [22 ml] 7. Roztwór alkoholu etylowego; 96 % [50 ml] 8. Bufor NaCl-cytrynian; 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodu, ph 7 [8 ml] Wszystkie roztwory przygotowuje prowadzący 1. Probówka wirówkowa 50 ml z korkiem [l] 2. Kolba Erlenmeyer'a 125 ml [l] 3. Probówka wirówkowa 50 ml [l] 4. Zlewka 125 ml [l] 5. Kolba Erlenmeyer'a 25 ml [l] 6. Bagietka szklana [l] 7. Probówki szklane 12 x 75 mm [2] 8. Pipety automatyczne; 5 ml, 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml [4] 9. Spektrofotometr UV-Vis 10. Kiuwety kwarcowe [4] Izolacja chromosomalnego DNA z komórek bakterii Wilgotne komórki bakteryjne (około 1 g) zawiesić dokładnie w 14 ml buforu NaCl- EDTA w 50 ml probówce. Dodać 0,7 ml roztworu lizozymu i inkubować mieszaninę przez 45 minut w temperaturze 37 C. Po inkubacji dodać do probówki 1,4 ml roztworu SDS i ogrzewać przez 10 minut w temperaturze 60 C (w celu uniknięcia pienienia mieszaninę należy mieszać bardzo łagodnie). W miarę uwalniania kwasu nukleinowego z komórek roztwór powinien wykazywać wzrastającą lepkość i malejące zmętnienie. Po zakończeniu ogrzewania ochłodzić probówkę zimną wodą do temperatury pokojowej. Dodać 5,4 ml roztworu NaClO 4 (końcowe stężenie soli będzie wynosić około l M). Wymieszać dokładnie, a następnie dodać równą objętość mieszaniny chloroform : alkohol izoamylowy (21,5 ml). Wytrząsać energicznie przez 30 minut w szczelnie zamkniętej kolbie. Przelać zawartość kolby do probówki wirówkowej i odwirować przez 20 minut przy 3000 rpm. W wyniku wirowania powinny powstać trzy warstwy: dolna organiczna,

6 środkowa zawierająca zdenaturowane białko i górna warstwa wodna zawierająca kwasy nukleinowe. Warstwę wodną delikatnie przenieść do zlewki 125 ml. Następnie wytrącić kwasy nukleinowe ostrożnie nawarstwiając dwie objętości etanolu (około 50 ml). Etanol powinno się wlewać po ściankach naczynia używając bagietki szklanej. Zebrać nitki wytrąconego DNA, ostrożnie obracając szklaną bagietkę w palcach; co pewien czas dociskać pałeczkę z DNA do ścianek naczynia w celu usunięcia etanolu. Charakterystyka wyizolowanego DNA Zebrany DNA rozpuścić w 10 ml buforu NaCl-EDTA w kolbie Erlenmeyer'a 25 ml. Rozcieńczyć 1:10 roztwór DNA przy pomocy buforu NaCl-cytrynian (0,5 ml roztworu DNA + 4,5 ml buforu NaCl-cytrynian); w razie potrzeby przygotować rozcieńczenie 1:100. Zmierzyć z użyciem kiuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy długości fali 260 i 280 nm, stosując bufor NaCl-cytrynian jako odnośnik. Opracowanie wyników 1) Zapisać wszystkie obserwacje dotyczące procedury oczyszczania. Wyjaśnić w skrócie cel każdego etapu i rolę każdego czynnika. 2) Obliczyć stosunek absorpcji roztworu DNA przy 260 i 280 nm (A 260 /A 280 ). Skomentować różnicę pomiędzy otrzymaną wartością a wielkością 1,9 charakterystyczną dla wysoce oczyszczonego DNA. 3) Obliczyć stężenie DNA (mg/ml) w roztworze sól-cytrynian i na tej podstawie całkowitą ilość otrzymanego DNA i wydajność oczyszczania. Założyć, że A 260 dla natywnego DNA o stężeniu l mg/ml wynosi około * ) Zaproponować modyfikacje metody w przypadku izolacji DNA z komórek eukariotycznych. Literatura uzupełniająca [1] Brown T. A.: Genomy, Warszawa: PWN 2001; [2] Bryszewska M., Leyko W.: Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów, Warszawa: PWN 2000; [3] Stryer L.: Biochemia, Warszawa: PWN 2000.