OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY)

Transkrypt

1 Ćwiczenie 8 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Część doświadczalna obejmuje: - sączenie Ŝelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy - oznaczanie aktywności alkalicznej difosfatazy w bielmie niedojrzałych nasion kukurydzy w warunkach zróŝnicowanego stęŝenia jonów dwuwartościowych w środowisku reakcyjnym WPROWADZENIE Uniwersalnym środkiem wymiany energii swobodnej w układach biologicznych jest ATP. Adenozynotrifosforan jest cząsteczką bogatą w energię, poniewaŝ jego jednostka trifosforanowa zawiera dwa bezwodnikowe wiązania fosforanowe (Ryc. 1). Stosunkowo duŝa ilość energii swobodnej uwalniana jest podczas jego hydrolizy do ADP i fosforanu (-30,5 kj x mol -1 ; -7,3 kcal x mol -1 ) (ryc. 1), a jeszcze większa zmiana energii swobodnej towarzyszy hydrolizie ATP do AMP i difosforanu (pirofosforanu; PPi) (-45,6 kj x mol -1 ; 10,9 kcal x mol -1 ) (Ryc. 2). W komórce, energia swobodna tych reakcji jest jeszcze wyŝsza, gdyŝ przebiega w nieco odmiennych warunkach siły jonowej i stę- Ŝenia jonów Mg 2+ w środowisku. Inne nukleotydy trifosforanowe (GTP, CTP, UTP) równieŝ mają dwa bezwodnikowe wiązania fosforanowe i wykazują właściwości podobne do ATP, lecz spełniają inne funkcje w przemianie materii. Ryc. 1. Wzajemne przekształcanie ATP i ADP (Alberts i wsp. 1999) 1

2 Energetycznie korzystna reakcja hydrolizy ATP do ADP i nieorganicznego fosforanu (HPO -2 4 ) jest sprzęŝona z wieloma reakcjami energetycznie niekorzystnymi. Ponadto, wiele reakcji biosyntezy zaleŝy od alternatywnej drogi hydrolizy ATP, w której uwalniany jest difosforan i AMP (Ryc. 2). Powstający w tym wypadku difosforan (pirofosforan; PPi) jest natychmiast hydrolizowany przez difosfatazę do dwóch cząsteczek ortofosforanu. Cały proces wyzwala całkowitą energię swobodną o wartości około 108 kj/mol, dzięki czemu reakcje biosyntezy stają się nieodwracalne. Ryc. 2. Alternatywna droga hydrolizy ATP. A W dwóch następujących po sobie reakcjach hydrolizy atomy tlenu z cząsteczek wody są wiązane przez produkty, natomiast atomy wodoru oddysocjowują tworząc wolne jony wodorowe H +. B Całkowita reakcja przedstawiona w postaci skróconej (Alberts i wsp. 1999) PoniŜej przedstawione są przykładowe reakcje biosyntezy, których przebieg w prawą stronę zaleŝy od obecności w środowisku difosfatazy (pirofosfatazy). Synteza DNA i RNA (DNA) n reszt + trifosforan deoksyrybonukleozydu (DNA) n+1 reszt + PPi 2

3 (RNA) n reszt + trifosforan rybonukleozydu (RNA) n+1 reszt + PPi Aktywacja aminokwasów: aminokwas + ATP aminoacylo-amp + PPi aminoacylo-amp + trna aminoacylo-trna + AMP Aktywacja kwasów tłuszczowych: kwas tłuszczowy + ATP acylo-amp + PPi acyloadenylan + HS-CoA acylo-coa + AMP Biosynteza di- i oligosacharydów: glukozo-6-fosforan glukozo-1-fosforan glukozo-1-fosforan + UTP UDP-glukoza + PPi UDP-glukoza + fruktozo-6-fosforan fosfosacharoza + UDP fosfosacharoza + H 2 O sacharoza + Pi Biosynteza glikogenu i skrobi: glukozo-6-fosforan glukozo-1-fosforan glukozo-1-fosforan + UTP UDP-glukoza + PPi UDP-glukoza + gliokogen n glikogen n+1 + UDP UDP-glukoza + amyloza n amyloza n+1 + UDP Difosfataza (pirofosfataza) cechuje się wysoką specyficznością względem difosforanu jako substratu (nie hydrolizuje wiązań bezwodnikowych w nukleotydach ani wiązań fosfoestrowych) i wymaga jonów magnezu jako aktywatora. Aktywność difosfatazy moŝna oznaczać na podstawie ilości enzymatycznie uwalnianego ortofosforanu, który moŝna oznaczać m. in. metodą Fiske- Subbarowa. P 2 O H 2 O 2PO 4 + 2H + 3

4 WYKONANIE Odczynniki: - 50mM bufor Tris HCl, ph 8,6, - 2mM roztwór difosforanu (V) sodu w 50mM buforze Tris-HCl, ph 8,6, - roztwory MgCl 2 w 50mM buforze Tris-HCl, ph 8,6, - 5mM roztwór CaCl 2 w 50mM buforze Tris-HCl, ph 8,6, - 12,5M roztwór EDTA w 50mM buforze Tris-HCl, ph 8,6,, - 5mM roztwór NaF w 50mM buforze Tris-HCl, ph 8,6,, - 10% roztwór TCA, - 10M H 2 SO 4, - roztwór molibdenianu (VI) amonu, - eikonogen, Materiał: ZamroŜone bielmo (endosperm) z niedojrzałych nasion kukurydzy Oznaczanie aktywności difosfatazy (pirofosfatazy) w warunkach zróŝnicowanego stęŝenia jonów dwuwartościowych w środowisku reakcyjnym Przygotowanie ekstraktu białkowego: Z zamroŝonego bielma zdrapać metalową szpatułą 2 g zamroŝonej tkanki i po rozmroŝeniu rozetrzeć w małym moździerzu. Dobrze roztarty materiał przelać do dwóch probówek wirówkowych Eppendorfa i wirować 5 min. przy obr/min. Ściągnięty pipetą z obu probówek nadsącz poddać rozdziałowi na krótkiej (15 cm x 1,5 cm) kolumnie Sephadex G-15 (sączenie Ŝelowe) w celu oddzielenia frakcji białkowej (zawierającej m. in. difosfatazę!) od endogennego fosforanu, jonów magnezu, wapnia i innych związków niskocząsteczkowych, które mogą wpływać na aktywność enzymu. W tym celu, przy zamkniętym wypływie kolumny, nanieść ostroŝnie na powierzchnię Ŝelu całą objętość nadsączu po wirowaniu, a następnie otworzyć wylot kolumny. Po wniknięciu całej próbki do Ŝelu (UWAGA! nie dopuścić do zapowietrzenia kolumny!) pipetą Pasteura nanieść ostroŝnie na powierzchnię Ŝelu ok. 4-5 ml buforu do elucji (50mM Tris-HCl, ph 8,6), a następnie podłączyć butlę z roztworem elucyjnym i prowadzić rozdział, śledząc przesuwanie się wzdłuŝ kolumny Ŝółto zabarwionej frakcji białek. Kiedy białka będą na wysokości ok. 2-3 cm od wylotu 4

5 kolumny rozpocząć zbieranie frakcji o objętości około 1 ml. Frakcję o najintensywniejszym Ŝółtym zabarwieniu zachować do oznaczeń, natomiast pozostałe zebrane frakcje wylać. Przed rozpoczęciem oznaczeń zebraną (odsoloną!) próbę rozcieńczyć 20-krotnie buforem uŝywanym do elucji. Przygotowanie środowiska reakcyjnego: Do prób od 1 do 9 napipetować podane w Tabeli I objętości roztworu substratu (2mM difosforan czterosodowy w 50 mm buforze Tris-HCl, ph 8,6) oraz kolejnych roztworów zawierających jony Mg 2+ o rosnącym stęŝeniu, Mg 2+ + wersenian czterosodowy (EDTA), Ca 2+ oraz fluorku sodu. Wszystkie mieszaniny reakcyjne przygotować w dwóch powtórzeniach! Wszystkie probówki (18 probówek; w kaŝdej po 0,9 ml roztworu) umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 30 0 C co najmniej 5 minut przed rozpoczęciem dodawania enzymu. Tabela I. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych do oznaczania aktywności difosfatazy w warunkach zróŝnicowanego stęŝenia jonów dwuwartościowych Skład próby mM PP i w 50mM Tris- 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml -HCl, ph 8,6 50mM Tris-HCl, ph 8,6 0,4 ml 2,5 mm MgCl 2 0,4 ml 5 mm MgCl 2 0,4 ml 10 mm MgCl 2 0,4 ml 12,5 mm MgCl 2 0,4 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,4 ml 5 mm CaCl 2 0,4 ml 12,5 mm EDTA 0,2 ml 5 mm NaF 0,2 ml 5

6 Wykonanie oznaczenia Do prób umieszczonych w łaźni i podgrzanych do 30 0 C dodawać w odstępach co 30 sekund po 0,1 ml 20-krotnie rozcieńczonego roztworu odsolonych na kolumnie białek w kolejności: 1, 1 ; 2, 2 ; 3, 3 itd., z pominięciem prób 9 i 9 (próby zerowe!). Nie wyłączając stopera, inkubować wszystkie próby 30 min w łaźni wodnej (temp. 30 o C), po czym dokładnie po 30 min rozpocząć hamowanie reakcji dodając co 30 s po 0,5 ml 10% roztworu TCA (denaturacja białek!) w kolejności: 1, 1 ; 2, 2 ; 3,3 itd., tak jak dodawano enzym. Postępując w ten sposób wszystkie próby będą inkubowane z enzymem dokładnie 30 minut. Uwaga! Na końcu, do 9 i 9 (próby kontrolne!) dodać najpierw po 0,5 ml 10% roztworu TCA, a następnie po 0,1 ml enzymu! (dodanie najpierw TCA spowoduje, Ŝe wprowadzony do próby enzym będzie natychmiast denaturowany przez TCA). Wszystkie próby wyjąć z łaźni wodnej, a następnie do kaŝdej dodać kolejno odczynniki potrzebne do oznaczaniu ortofosforanu metodą Fiske-Subbarowa: 0,4 ml mieszaniny zawierającej H 2 SO 4, molibdenian amonu i H 2 O zmieszanych w stosunku 1:2:1, a po dokładnym wytrząśnięciu kaŝdej próby, po 0,1 ml eikonogenu (redukcja kompleksu fosfomolibdenowego). Wszystkie próby ponownie umieścić w łaźni wodnej na 10 min w celu przyspieszenia w 30 0 C reakcji tworzenia barwnego kompleksu błękitu molibdenowego. Po 10 min., próby wyjąć z łaźni i zmierzyć absorbancję przy 660 nm względem próby zerowej (połączone próby 9 i 9 ). Korzystając z przygotowanej uprzednio krzywej kalibracyjnej (ćwiczenie 6) obliczyć ilość uwolnionego enzymatycznie ortofosforanu, (ilość wyrazić w µmolach) w czasie 30 min inkubacji enzymu w środowisku reakcyjnym o odpowiednim składzie. Aktywność difosfatazy, wyraŝona jako ilość µmoli ortofosforanu powstałego w ciągu 1 min inkubacji enzymu z substratem, przedstawić w postaci histogramów. Pod kaŝdym prostokątem podać końcowe stęŝenie substratu (PPi) oraz stęŝenie badanego jonu w środowisku reakcyjnym (0,9 ml mieszaniny reakcyjnej + 0,1 ml enzymu). Zagadnienia do przygotowania: - reakcje produkujące nieorganiczny difosforan (pirofosforan) w komórce - rola enzymu hydrolizującego difosforan - zasada oznaczania aktywności enzymatycznej alkalicznej difosfatazy - aktywatory i inhibitory reakcji enzymatycznej (hamowanie kompetycyjne i niekompetycyjne) Piśmiennictwo: Biochemia JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005 Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa,