AUTOREFERAT. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych.

Transkrypt

1 AUTOREFERAT 1. ANNA RYMASZEWSKA 2. Posiadany stopień naukowy doktor nauk biologicznych uzyskany na Wydziale Nauk Przyrodniczych (obecnie Wydział Biologii) Uniwersytetu Szczecińskiego w 2003 roku. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych stanowisko: młodszy asystent w Zakładzie Patomorfologii, zatrudniona w PSK2 w Szczecinie stanowisko: asystent w Katedrze Genetyki Uniwersytetu Szczecińskiego obecnie stanowisko: adiunkt w Katedrze Genetyki Uniwersytetu Szczecińskiego. 4. Osiągnięcie wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): cykl jednotematycznych publikacji pt. Charakterystyka molekularna patogenów odkleszczowych z rodzaju Anaplasma i Rickettsia występujących w Polsce a) na cykl publikacji składają się następujące pozycje: 1. Rymaszewska A., Skotarczak B Evidence and molecular analysis of Rickettsia helvetica and novel α-proteobacterium from the tick Ixodes ricinus in Poland, Ekologija, 2: (udział własny 80%) - PKT MNISW Rymaszewska A Symbiotic bacteria in oocyte and ovarian cell mitochondria of the tick Ixodes ricinus: biology and phylogenetic position. Parasitology Research 100: PKT MNISW ; If -1, Rymaszewska A Divergence within the marker region of the groesl operon in Anaplasma phagocytophilum. Europ. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27: PKT MNISW - 15, If - 2, Rymaszewska A Variability within the msp2 gene in population of Anaplasma phagocythopilum. Folia Biologica Pragha, 56: PKT MNISW - 20; IF ,729 1

2 5. Rymaszewska A., Piotrowski M Use of DNA sequences for Rickettsia identification in Ixodes ricinus ticks: the first detection of Rickettsia monacensis in Poland. Microb. Infect. 15: (udział własny 80%) - PKT MNISW (2012) - 25 pkt; IF (2012)- 2, Rymaszewska A Genotyping of Anaplasma phagocytophilum strains from wild ruminants by selected genes. Folia Biologica - Kraków, 62(1), doi: /fb62_ PKT MNISW (2012) 15 pkt, IF (2012)- 0,657; Sumaryczny Impact Factor wymienionych publikacji (zgodny z rokiem opublikowania, z wyjątkiem pozycji 5-6,opublikowanych w roku, dla których podano najnowszy IF, tj. z 2012 roku) wynosi Sumaryczna liczba punktów MNiSW (zgodnie z rokiem opublikowania, z wyjątkiem pozycji 5-6, dla których podano najnowszą wartość z 2012 roku) wynosi 92. Dwie prace wchodzące w skład jednotematycznych publikacji stanowią publikacje dwuautorskie. Oświadczenia współautorów i opis indywidualnego wkładu habilitanta w powstanie każdej z tych publikacji znajduje się z załączniku 6. b) omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników Znaczną część pracy zawodowej poświęciłam badaniu patogenów odkleszczowych z rodzaju Anaplasma i Rickettsia, tj. Anaplasma phagocytophilum, Rickettsia helvetica oraz, na mój stan wiedzy, po raz pierwszy w Polsce opisanej przez ze mnie R. monacensis i symbiotycznej bakterii bytującej w komórkach jajowych kleszczy, która obecnie została w Banku Genów skalsyfikowana jako Candidatus Midichloria mitochondria. Detekcja patogenów z rodzaju Anaplasma i Rickettsia w kleszczach Ixodes ricinus i we krwi zwierząt kręgowych metodami molekularnymi, skierowała moją uwagę na genomy bakteryjne. Nowym celem, jaki sobie postawiłam było scharakteryzowanie polskich populacji tych bakterii na podstawie sekwencji nukleotydowych genów markerowych. W konsekwencji mogłoby to stanowić podstawę oceny poprzez porównanie z sekwencjami z bazy danych, czy szczepy Anaplasma występujące w Polsce są chorobotwórcze dla ludzi i zwierząt domowych oraz umożliwić identyfikację gatunków Rickettsia występujących na terenie Pomorza Zachodniego (Polska). Tym samym moje badania wpisują się w część dyskusji międzynarodowej toczonej na łamach czasopism naukowych. Anaplasma phagocytophilum jest bezwzględnie wewnątrzkomórkową bakterią, pasożytująca we krwi kręgowców. Ten gatunek anaplazm wykazuje tropizm do granulocytów, w których tworzy mikrokolonie zwane morulami. A. phagocytophilum jest chorobotwórcza dla ludzi i zwierząt hodowlanych, głównie małych przeżuwaczy, jak owce, cielęta czy kozy. U człowieka zakażonego bakteriami A. phagocytophilum występują objawy grypopodobne i z reguły u osób ze sprawnym 2

3 układem odpornościowym zachorowania mają przebieg łagodny. Bezobjawowe lub łagodne przypadki anaplazmozy granulocytarnej (granulocytic anaplsmosis GA) opisuje się głównie w Europie. W USA przebieg choroby jest cięższy, często wymaga hospitalizacji i zdarzają się przypadki śmiertelne anaplazmozy. U zwierząt gospodarskich A. phagocytophilum jest przyczyną ciężkich zachorowań i może prowadzić do śmierci. Wektorem ułatwiającym krążenie bakterii w środowisku są kleszcze m. in. z rodzaju Ixodes, w Polsce najczęściej występujący I. ricinus. Gatunkiem rezerwuarowym są drobne gryzonie i zwierzyna płowa, jak sarna Capreolus capreolus czy jeleń szlachetny Cervus elaphus. Różnice w przebiegu i konsekwencjach GA w Europie i USA nasunęło przypuszczenie, że w Ameryce Północnej występują szczepy anaplazm bardziej zjadliwe niż na Starym Kontynencie. Dlatego wiele niezależnych ośrodków naukowych w świecie podjęło próbę scharakteryzowania A. phagocytophilum pod względem zmienności nukleotydowej kilku znaczących genów, m. in. konserwatywnego operonu groesl oraz unikalnych genów msp2, msp4, anka i wykazania zależności między występowaniem określonych alleli w populacji anaplazm a chorobotwórczością bakterii. Wśród markerów molekularnych stosowanych do identyfikacji A. phagocytophiulm jednym z częściej wykorzystywanych jest GroESL operon szoku termicznego. Operon ten tworzą dwa geny: groes, kodujący białko o ciężarze kda oraz groel, kodujący białko o ciężarze kda, rozdzielone sekwencją niekodującą. Wykorzystując dwustopniową reakcję PCR amplifikowałam groesl o dł. ok pz A. phagocytophilum z izolatów z krwi zwierząt łownych uznawanych za rezerwuar tych bakterii, sarny C. capreolus oraz jelenia szlachetnego Ce. elaphus (3, 6). Na podstawie analizy molekularnej wyróżniłam 12 oryginalnych wariantów, 11 występujących u saren i 2 u jeleni szlachetnych, przy czym jeden wariant występował u obu gatunków rezerwuarowych. Mimo wysokiej zmienności na poziomie DNA wśród sekwencji własnych i pochodzących z Banku Genów, tylko dwa podstawienia nukleotydowe nie miały charakteru synonimicznego i potencjalnie mogłyby wpływać na funkcjonowanie białka (substytucja w pozycji 497 i 839 operonu groesl). Według badaczy ze Słowenii transwersja T G w pierwszej pozycji kodonu (839), prowadząca do zamiany w białku alaniny na serynę, a obecna u wszystkich pacjentów ze zdiagnozowaną anaplazmozą, mogłaby charakteryzować szczepy A. phagocytophilum chorobotwórcze dla ludzi. Analiza podobieństwa na podstawie uzyskanych sekwencji nukleotydowych wykonana w programie DNAMAN oraz MEGA 5 wykazała wysokie pokrewieństwo między sekwencjami pochodzącymi z polskich populacji A. phagocytophilum a sekwencjami pozyskanymi z izolatów z dzikiej zwierzyny ze Słowenii i Szwajcarii, przy czym w przypadku wariantu białka z alaniną (Vgro-A) grupa była bardziej jednorodna i stanowiły ją 3

4 przede wszystkim sekwencje izolowane od C. capreolus. W swoich badaniach wykazałam, że bakterie z wariantem genu kodującego serynę, potencjalnie chorobotwórcze dla ludzi, występują na Pomorzu Zachodnim (Polska) (3, 6). Prace austriackich autorów z ostatnich lat oparte na badaniach klinicznych poddają dyskusji tą hipotezę. Biorąc pod uwagę fakt, że na Pomorzu Zachodnim nie odnotowywano zachorowań na anaplazmozę granulocytarną, można przychylić się do opinii badaczy z Austrii. Wśród unikalnych genów służących do wykrywania i identyfikacji A. phagocytophilum najczęściej wykorzystuje się gen msp2 i msp4, które należą do superrodziny OMP-1/MSP-2/P44, charakterystycznej dla Anaplasmataceae. W obrębie sekwencji nukleotydowej genu msp2 zaobserwowano wysoką zmienność intraspecyficzną, stąd sądzi się, że w konsekwencji fenotypowa zmienność białka i tworzenie różnych wariatów antygenów sprzyja utrzymaniu się bakterii u różnych gospodarzy. Sugeruje się także, że występowanie różnych wariantów białka MSP2 jest związane z rozprzestrzenieniem geograficznym. Analizując zmienność w obrębie genu msp2 posłużyłam się izolatami DNA z różnych gatunków zwierząt, m. in. I. ricinus, C. capreolus, Canis lupus familiaris (4). W badaniach wykazałam, że na Pomorzu Zachodnim w środowisku naturalnym krążą bakterie A. phagocytophilum reprezentujące kilka odmiennych genotypów, ustalonych na bazie fragmentu genu msp2, unikalnych w stosunku do porównywanych sekwencji pochodzących z USA, jedynych ujawnionych w tym okresie w bazie danych. Wszystkie warianty są wynikiem mutacji punktowych typu substytucja. Większość obserwowanych zmian w obrębie sekwencji polskich to transwersje A T. Biorąc pod uwagę tylko mutacje typu missens, które w konsekwencji mogłyby wpływać na właściwości białka, wśród polskich sekwencji można wyznaczyć dwa warianty, nie wykazano jednak ich specyficzności gatunkowej w stosunku do żywiciela. Średni dystans genetyczny między sekwencjami nukleotydowymi genu msp2 A. phagocytophilum izolowanymi z materiału zwierzęcego (Pomorze Zachodnie, Polska) a sekwencjami pochodzącymi z prób od pacjentów (USA) wynosi 1,2%. Wysoka zmienność obserwowana m. in. w obrębie genu msp2 może świadczyć o dużej plastyczności ewolucyjnej bakterii, ich zdolności adaptacyjnej, a tym samym zdolności do szybkiego rozprzestrzeniania się w środowisku. Na podstawie analizy molekularnej DNA A. phagocytophiulm izolowanego z krwi zwierzyny łownej (C. capreolus i Ce. elaphus) w obrębie genu msp4 wykazałam obecność 15 różnych alleli i tylko pięć z nich zostało już wcześniej zdeponowanych w Banku Genów (6). Wysoka zmienność obserwowana na poziomie DNA jest charakterystyczna także dla innych populacji A. phagocytophilum w Europie. W porównywanych sekwencjach polskich i zdeponowanych w Bazie Genów zaobserwowałam 72 podstawienia nukleotydowe, w tym 42 4

5 dotyczyły także sekwencji anaplazm pochodzących z Pomorza Zachodniego. Wśród obserwowanych substytucji przeważały tranzycje. W jedenastu przypadkach zaobserwowano substytucje dotyczące dwóch nukleotydów w kodonie, pozostałe podstawienia to pojedyncze zmiany, przy czym najczęściej ulegał podstawieniu 3 nukleotyd w kodonie (90,6%). Substytucje w DNA dla badanego obszaru genu msp4 dały w konsekwencji 15 podstawień aminokwasowych w badanym fragmencie. Na drzewie filogenetycznym większość sekwencji nukleotydowych A. phagocytohilum grupowało się z sekwencjami pochodzącymi od małych przeżuwaczy hodowlanych (owce, kozy), natomiast jedna sekwencja izolowana od Ce. elaphus była najbliżej spokrewniona z sekwencją Bos taurus (Niemcy). Gen anka koduje białko antygenowe o średnim ciężarze cząsteczkowym kda, różnice wynikają z odmiennej długości genu u szczepów europejskich i pochodzących z USA. Analiza białka AnkA wykazała, iż jest ono zlokalizowane w cytoplazmie komórek bakteryjnych, a podczas infekcji zostaje transportowane do komórek eukariotycznego gospodarza, gdzie znajdowano je w pobliżu jądra granulocytów. Sugeruje się, że A. phagocytophilum poprzez białko AnkA może manipulować neutrofilami gospodarza. Fragment genu anka amplifikowałam wykorzystując dwustopniową reakcję PCR, a produkt sekwencjonowałam (6). W trakcie szczegółowej analizy zaobserwowałam w porównywanych sekwencjach pozyskanych z polskich izolatów i sekwencjach z bazy danych 33 substytucje nukleotydowe, przy czym w jednym przypadku dotyczyły trzech pozycji w kodonie, a w pięciu dwóch. Pozostałe substytucje to podstawienia jednego nukleotydu w kodonie. Najczęściej wymianie ulegał drugi nukleotyd w kodonie, takich zmian zaobserwowano 14, tj. 42.4% wszystkich substytucji obserwowanych w tym fragmencie, w pierwszej i trzeciej pozycji zmiany były porównywalne, odpowiednio 27,3% oraz 30,3%. Sekwencje nukleotydowe genu anka A. phagocytophilum, pozyskane z polskich izolatów zakwalifikowałam do dwóch grup reprezentujących dwa warianty genetyczne. Jeden z nich występował w DNA A. phagocytophilum izolowanym z krwi C. capreolus i Ce. elaphus, drugi- tylko u Ce. elaphus i był rzadki (6, 67%). Analiza porównawcza sekwencji nukleotydowych genu anka dokonana w oparciu o program MEGA5 wykazała, że pierwszy wariant charakteryzowało wysokie podobieństwo do sekwencji pozyskanych z chorobotwórczych szczepów A. phagocytophilum izolowanych od pacjentów z USA, natomiast drugi (obecny tylko u Ce. elaphus) do sekwencji europejskich szczepów anaplazm izolowanych z krwi zwierząt domowych, m. in. cieląt i koni. Analiza molekularna genu 16S rrna dla polskich populacji A. phagocytopilum (Pomorze Zachodnie) nie wykazała zmienności (6). W porównaniu do wariantów europejskich i amerykańskich opisano 4 substytucje charakterystyczne dla rodzimych anaplazm. Sekwencje 5

6 nukleotydowe genu 16S rrna A. phagocytophilum na drzewie filogenetycznym zostały zgrupowane w jednym kladzie wraz z sekwencjami pochodzącymi m. in. z izolatów z dzikich i hodowlanych przeżuwaczy oraz sekwencją wzorcową A. phagocytohiulm (U02521; USA, izolat od pacjenta). Z moich analiz poszczególnych fragmentów genów markerowych i konfrontacji wyników własnych z wynikami innych autorów dostępnymi w Banku Genów (homologiczne sekwencje nukleotydowe) i literaturze światowej wynika, że wymienione markery molekularne (groesl, msp2, msp4, anka, 16S rrna) nie są wystarczającym wskaźnikiem, aby zaszeregować daną populację A. phagocytophilum jako szczepy chorobotwórcze dla ludzi. Jedyna możliwość potwierdzenia to badania kliniczne w oparciu o materiał pochodzący od pacjentów ze zdiagnozowaną anaplazmozą, co w Polsce jest trudne do zrealizowania ze względu na nieliczne bądź nierozpoznane zachorowania na GA. Kosmopolityczny I. ricinus, jest wektorem dla wielu patogenów, m.in. różnych gatunków Rickettsia, które rozszerzają zasięg występowania. Obecne głównie w krajach Europy Południowej, coraz częściej wykrywane są w krajach o chłodniejszym klimacie, znajdujących się w Centrum i na wschodzie Europy. Stąd coraz większe zainteresowanie gatunkami Rickettsia wśród badaczy monitorujących środowisko naturalne pod kątem zagrożenia patogenami odkleszczowymi. Moje pierwsze analizy dotyczące poszukiwania Rickettsia w populacji I. ricinus przyniosły niespodziewany efekt. Wykorzystując jako marker fragment genu kodującego 16S dla małej podjednostki rybosomu wykryłam w kleszczach DNA R. helvetica, ale także gatunek bakterii (1-2), opisany dotychczas tylko w jednym ośrodku naukowym we Włoszech (Beninati i wsp. 2004). Gatunek ten został obecnie skalsyfikowany w Banku Genów jako Candidatus Midichloria mitochondria (wcześniej obowiązywała nazwa ogólna Rickettsiales bacterium i takiej nomenklatury używałam w prezentowanych pracach). Na podstawie sekwencji genu 16S rrna bakterii wykrytych w izolatach kleszczy, symbionty wykryte przez mnie w kleszczach I. ricinus można sklasyfikować do α - subdivision Proteobacteria (1-2). Do wykrywania DNA i identyfikacji gatunkowej patogenów odkleszczowych z rodzaju Rickettsia wykorzystałam gen glta, kodujący syntazę cytrynianową oraz sekwencję niekodującą ITS (internal transcribed spacer): 23S-5S ITS (rrl-rrf spacer) (5). Syntaza cytrynianowa jest enzymem występującym we wszystkich komórkach żywych i bierze udział w jednej z głównych przemian metabolicznych tj, cyklu kwasu cytrynowego. Gen kodujący syntazę cytynianową, glta, należy do konserwatywnych genów i w analizach 6

7 molekularnych jest jednym z lepszych narzędzi wykorzystywanych do analiz filogenetycznych w obrębie rodzaju. Geny kodujące rybosomalny RNA są wysoce konserwatywne i u większości Procaryota tworzą operon, w którym porządek genów jest stały, tj. 16S-23S-5S (rrs-rrl-rrf). Pomiędzy genami rrs rrl-rrf znajdują się krótkie regiony niekodujące, które określane są jako internal transcribed spacer (ITS). Fragmenty te różnicują bakterie w obrębie gatunków i podgatunków. Bakteryjne operony rybosomalne są wykorzystywane w analizach taksonomicznych i filogenetycznych i służą jako molekularny zegar. Obecność DNA Rickettsia wykryłam u 9,5% badanych kleszczy I. ricinus zebranych z roślinności w Szczecińskim Parku Krajobrazowym. Na podstawie sekwencji nukleotydowych analizowanych fragmentów genomu większość patogenów zidentyfikowałam jako R. helvetica, natomiast w jednym przypadku jako R. monacensis. Na mój stan wiedzy po raz pierwszy w Polsce zidentyfikowałam molekularnie i opisałam ten gatunek Rickettsia (5). Wykonałam analizę statystyczną składu zasad w analizowanych fragmentach dla sekwencji uzyskanych w badaniach własnych i przyrównałam je do sekwencji DNA odpowiednich fragmentów pozyskanych z Banku Genów. Dla genu białkowego glta skład nukleotydowy u poszczególnych gatunków Rickettsia był porównywalny i nie zaobserwowałam odchyleń między grupą R. helvetica (do której włączyłam także sekwencje własne) a grupą, w której znajdowały się inne gatunki Rickettsia, zaliczane do SFG (spotted group fever), w tym R. monacensis (Pomorze Zachodnie). W przypadku sekwencji ITS można zauważyć duże zróżnicowanie zarówno między grupami, jak i w obrębie grupy. W celu identyfikacji molekularnej i oszacowania pokrewieństwa między bakteriami występującymi na Pomorzu Zachodnim (Polska), a pochodzącymi z innych regionów świata wykonałam w oparciu o sekwencje nukleotydowe genu glta i ITS 23S-5S analizy filogenetyczne. Na dendrogramie skonstruowanym w oparciu o sekwencje obu analizowanych fragmentów genomu R. helvetica z Pomorza Zachodniego grupowała się sekwencjami tego gatunku pochodzącymi z innych krajów europejskich. Natomiast druga sekwencja uzyskana w badaniach własnych, R. monacensis, na drzewie skonstruowanym w oparciu o sekwencję genu kodującego synatzę cytrynianową grupowała się m. in. z sekwencjami R. monacensis, pochodzącymi z Serbii i z Chin. Na dendrogramie wykonanym w oparciu o sekwencje nukleotydowe ITS, analizowana sekwencja własna łączyła się z grupą zawierającą R. montanesis, R. massiliae oraz R. slovaca, przy czym wartość bootstrap dla tego rozgałęzienia dla każdego wykonanego drzewa była powyżej 70 (w trakcie wykonywania analiz w bazie danych nie były dostępne sekwencje ITS dla R. monacensis). 7

8 W badaniach Rickettsia wykorzystałam dwa markery molekularne i oba okazały się skuteczne do klasyfikacji gatunkowej R. helvetica. Nowo zidentyfikowany w Polsce gatunek R. monacensis można oznaczyć na podstawie genu białkowego, natomiast sekwencje nukleotydowe ITS okazały się niewystarczające. Wszystkie oryginalne, uzyskane przeze mnie sekwencje nukleotydowe badanych genów zgłosiłam do Międzynarodowej Bazy Genów (GenBank). Za moje osiągnięcie uważam: 1. Charakterystykę molekularną Anaplasma phagocytophilum pochodzącej z Pomorza Zachodniego na podstawie wybranych markerów 2. Identyfikację Rickettsia helvetica w populacjach kleszcza pospolitego Ixodes ricinus na Pomorzu Zachodnim i charakterystykę molekularną dwóch regionów markerowych polskich populacji tego patogenu 3. Identyfikację molekularną bakterii endosymbiotycznych występujących w I. ricinus z Pomorza Zachodniego (jako pierwsza w Polsce) 4. Molekularną detekcję R. monacensis (jako pierwsza w Polsce) i charakterystykę molekularną dwóch regionów markerowych tych bakterii pochodzącej z izolatów I. ricinus na Pomorzu Zachodnim (Polska) 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo badawczych W drugiej połowie XX wieku zaczęto coraz częściej opisywać u pacjentów przypadki zachorowań na choroby odkleszczowe, które wcześniej nie były rozpoznawane. Wzrost zachorowalności na niektóre z tych chorób może być tylko pozorny i wynikać m. in. z tego, że nowoczesne rozwijające się techniki molekularne dały narzędzia do identyfikacji czynników chorobotwórczych. Nowe metody umożliwiły poznanie cyklu krążenia w środowisku wielu mikroorganizmów, a także wykrywanie ich u pacjentów wcześniej nie diagnozowanych. W połowie lat 80-tych ubiegłego wieku opisano krętka Borrelia burgdorferi sensu lato przenoszonego przez kleszcze, a 1994 zwrócono uwagę na możliwość zakażenia tych stawonogów ehrlichami i anaplazmami. Opis kolejnych przypadków zachorowań wśród ludzi, a także doniesienia o poszukiwaniu wektorów dla poszczególnych patogenów, najczęściej różnych gatunków kleszczy, jak i rezerwuaru bakterii zaczęły pojawiać się w prasie naukowej. Zakażeniom odkleszczowym sprzyjały m.in. sportowy model życia, aktywny wypoczynek na łonie natury, które stanowią powszechnie obowiązujący styl życia na przełomie XX/XXI wieku. Taka forma aktywności naraża na kontakt z kleszczami bezpośrednio człowieka, ale i towarzyszących mu 8

9 ulubieńców, jak psy czy koty. Jednocześnie swoboda przemieszczania się po świecie czy hodowla egzotycznych zwierząt sprzyja zawlekaniu na dany teren obcych gatunków kleszczy, a tym samym ludzkich i zwierzęcych patogenów wcześniej nieobecnych w tej szerokości geograficznej. W Polsce na przełomie lat tych w pojedynczych ośrodkach naukowych rozpoczęto badania związane z zoonozami, których czynniki etiologiczne są transmitowane przez kleszcze. Pionierskie prace dotyczące molekularnej identyfikacji B. burgdorferi, której wektorem jest kosmopolityczny gatunek kleszcza pospolitego Ixodes ricinus prowadziła m. in. prof. Bogumiła Skotarczak, kierująca Katedrą Genetyki Uniwersytetu Szczecińskiego. W roku 1998 zostałam zatrudniona na Uniwersytecie Szczecińskim i podjęłam pracę w zespole kierowanym przez prof. B. Skotarczak. Początkowo uczestniczyłam w pracach zespołu, których celem było określenie występowania DNA krętka B. burgdorferi w kleszczach I. ricinus na terenie Pomorza Zachodniego. Wyniki zostały zaprezentowane na sesji plakatowej na Konferencji Parazytologicznej w Dreźnie oraz na Zjeździe Towarzystwa Genetycznego w Warszawie, w Kolejnym zadaniem zespołu było określenie ekstensywności występowania kleszczy I. ricinus w Parkach Leśnych, znajdujących się w granicach administracyjnych miasta Szczecina jak i na terenie woj. zachodniopomorskiego (poprzednio szczecińskiego). Wytypowane miejsca są uznawane za tereny rekreacyjne przez mieszkańców miasta (II.2.a.-1). Jednocześnie podjęliśmy próbę wstępnej identyfikacji innych patogenów przenoszonych przez kleszcze, a rzadziej opisywanych w literaturze światowej, m. in. pierwotniaków z rodzaju Babesia (II.2.a.-3) czy bakterii z rodzaju Ehrlichia. W latach 90-tych obowiązywał podział systematyczny, według którego do rodzaju Ehrlichia zaliczano gatunki monocytarne jak E. chaffensis, E. canis, E. ewingi oraz pasożytujące w granulocytach E. phagocytophila, E. equi, czy czynnik ludzkiej ehrlihiozy granulocytarnej (ang. human granulocytic ehrlichiosis agent, in. HGE agent). Wszystkie wymienione gatunki występowały w Ameryce Północnej, gdzie były transmitowane przede wszystkim przez kleszcze z rodzaju Ixodes, Dermacentor i Ammblyoma, w Europie poszukiwano wektorów tych bakterii. Badania prowadzono wykorzystując metody serologiczne (testy immunofluorescencji pośredniej - IFA) oraz molekularne (II.2.a-2) Nasz zespół wybrał do detekcji patogenów techniki molekularne opierając się na amplifikacji wybranych fragmentów DNA bakterii metodą PCR. Z badań autorów europejskich, jak i moich wynikało, że E. chaffensis, wywołująca u ludzi monocytarną postać ehrlichiozy, nie jest obecna na Starym Kontynencie (rezultaty przedstawiono w sesji plakatowej na konferencji). Jednocześnie podjęłam próbę określenia, czy drugi z patogenów zaliczanych do Ehrlichia, czynnik ludzkiej ehrlichiozy granulocytranej (obecnie Anaplasma phagocytophilum, której to nazwy będę używała w dalszej części mojego referatu; 9

10 zmiany w klasyfikacji bakterii dokonano w 2000 r. na podstawie badań wielu niezależnych ośrodków) jest obecny w kleszczach I. ricinus zebranych na terenach województwa zachodniopomorskiego. Wstępne badania wykonałam wykorzystując materiał z trzech stanowisk w mieście Szczecinie i okolicach, w dwóch sezonach, wiosennym i jesiennym. DNA bakterii wykazałam w kleszczach zebranych ze stanowisk znajdujących się na obrzeżach miasta (Park Leśny Dąbie) oraz poza nim (Iński Park Krajobrazowy). W I. ricinus odłowionych na terenie kompleksu leśnego znajdującego się w sąsiedztwie dużych osiedli mieszkaniowych w pobliżu centrum miasta Szczecina (Kąpielisko Głębokie) nie wykryłam DNA A. phagocytophilum (II.2.a - 4). W tych badaniach, podobnie jak i we wcześniejszych, niepublikowanych, wykorzystywałam wszystkie stadia rozwojowe I. ricinus do analiz, tj, larwy, nimfy i imago. W przypadku larw nie wykrywałam zakażenia, co potwierdzało hipotezę, że A. phagocytophilum w populacji kleszczy jest przekazywana transstadialnie, natomiast przekaz transowarialny nie jest skuteczny w przypadku tych bakterii. Stąd w kolejnych analizach do poszukiwania DNA anaplazm nie wykorzystywałam stadium larwy. Przygotowując pracę doktorską pod kierunkiem prof. B. Skotarczak prześledziłam występowanie Anaplasma na 6-ciu stanowiskach w przeciągu trzech lat, badając populacje I. ricinus odławiane wiosną, jak i jesienią. Na tym etapie materiał do badań stanowiły kleszcze I. ricinus w fazie niepasożytniczej, zebrane z roślinności. Monitoring prowadzony przez lata , jak i badania wcześniejsze pozwoliły na scharakteryzowanie poszczególnych biotopów pod względem obecności anaplazm w populacjach kleszcza pospolitego. Uzyskane wyniki potwierdziły moje wstępne analizy, z których wynikało, że populacja I. ricinus odłowiona na stanowisku Kąpielisko Głębokie, miejsce często odwiedzane przez spacerowiczów czy osoby uprawiające sport, była wolna od DNA A. phagocytophilum. Na pozostałych terenach objętych badaniami, zarówno w parkach podmiejskich, jak i w kompleksach leśnych na terenie województwa, w izolatach z kleszcza pospolitego stwierdziłam obecność materiału genetycznego anaplazm. Zakażenie kleszczy było porównywalne do występującego w wielu innych krajach europejskich i wynosiło średnio 2,65% wiosną i 1,23% jesienią, przy czym na jednym z wytypowanych miejsc odłowu kleszczy, znajdującym się w pobliżu dużego osiedla mieszkaniowego (Park Leśny Dąbie) średni procent zakażenia I. ricinus przez A. phagocytophilum z trzech lat był wyższy. Obecność anaplazm w kleszczach świadczy o występowaniu kompetentnego rezerwuaru dla tych patogenów w środowisku. Wysokie zakażenie I. ricinus w Parku Leśnym Dąbie w porównaniu do innych badanych miejsc może wynikać z zaburzenia naturalnej struktury żywicieli kleszczy i rezerwuaru dla A. phagocytophilum, wynikające z bliskiego sąsiedztwa osiedli ludzkich. Obecność DNA anaplazm w I. ricinus na terenie 10

11 województwa szczecińskiego wskazuje, że potencjalnie istnieje zagrożenie nabycia anaplazmozy granulocytarnej przez osoby przebywające na terenach rekreacyjnych Szczecina i okolic. W badaniach przeprowadziłam dodatkowo porównanie skuteczności dwóch markerów, służących do identyfikacji anaplazm, fragmentu genu 16S rrna oraz fragmentu genu anka (wcześniej stosowano w literaturze nazwę epank 1). Z badań wynika, że fragment unikalnego genu anka jest użytecznym markerem, charakteryzującym się wysoką czułością i specyficznością gatunkową. Jednocześnie analizy pokazały, że sekwencje obu genów wykazują wysokie podobieństwo do sekwencji genów u gatunków chorobotwórczych dla człowieka w Europie i USA. Wyniki opublikowałam w czasopismach naukowych i monografiach oraz zreferowałam na konferencjach (II.1.b.-3; II.2.b.-1, 2, 5, 10, 11). Poznanie stopnia zakażenia kleszczy przez czynniki chorobotwórcze niesie ze sobą kolejne pytanie, które ze stadiów rozwojowych stanowi największe zagrożenie dla człowieka i zwierząt domowych. Doniesienia w literaturze naukowej nie dawały jednoznacznej odpowiedzi. Przeanalizowałam populację I. ricinus liczącą osobników, odłowionych przez trzy lata w sezonach wiosennym i jesiennym. Uzyskane wyniki wskazują na nieznacznie wyższe zakażenie imago przez A. phagocytophilum w porównaniu do nimf (średnio dla trzech lat i dwóch sezonów wynosiło odpowiednio 2,4% i 1,6%). Jednocześnie zaobserwowałam, że jesienią procent zakażonych kleszczy jest niższy niż w przypadku osobników odłowionych sezonie wiosennym (II.2.b.-6). Doniesienia zespołu wykonującego analogiczne badania na terenie północno wschodniej Polski, również wskazały, że u imago częściej wykrywano DNA A. phagocytophilum niż wśród nimf, przy czym w tym regionie Polski ogólne zakażenie kleszczy przez anaplazmy jest wyższe. Z wyników badań własnych, jak i na podstawie literatury można wnioskować, że zarówno stopień zakażenia kleszczy przez A. phagocytophilum, jak i częstość występowania tego patogenu w różnych stadiach rozwojowych I. ricinus są charakterystyczne dla badanego regionu. Ta zmienność wynika z obecności i dostępu pasożytów do gospodarzy, jak i występujących na danym terenie gatunków rezerwuarowych dla bakterii. W parkach czy kompleksach leśnych, znajdujących się w pobliżu osiedli mieszkaniowych zostaje zaburzona naturalna struktura żywicieli kleszczy, pojawiają się żywiciele przypadkowi, jak człowiek, pies czy kot, którzy odgrywają istotną rolę w utrzymaniu licznej populacji krwiopijnych pajęczaków i znacząco wpływają na przeżywalność poszczególnych stadiów. Budowanie nowych osiedli wtopionych w naturalne kompleksy leśne może się pośrednio wiązać także ze zwiększeniem liczebności naturalnych żywicieli kleszczy, jak drobnych gryzoni i ptaków. Stąd takie parametry, jak stopień zakażenia kleszczy, czy stadia stanowiące szczególne zagrożenie, powinny być określane każdorazowo dla lokalnych populacji żerujących na kręgowcach ektopasożytów. Tym samym można stworzyć charakterystykę danego 11

12 regionu pod kątem epidemiologicznym. Jednak stopień zakażenia kleszczy patogenami, jak np. wykazano dla wirusa kleszczowego zapalenia mózgu (KZM), nie zawsze jest wskaźnikiem zachorowań na daną jednostkę zakaźną w regionie (II.1.b 16; II.2.b.-25). Po przebadaniu osobników I. ricinus z Polski i z Niemiec (analizowanych w pulach) nie wykazano obecności wirusa KZM, choć opisywano na tych terenach przypadki kleszczowego zapalenia mózgu wśród mieszkańców. Przeciwną zależność zaobserwować można dla A. phagocytophilum, odnotowuje się obecność DNA tych bakterii w kleszczach, natomiast rzadko, bądź w ogóle nie diagnozuje się anaplazmozy granulocytarnej wśród ludzi. Obecność DNA anaplazm w kleszczach na terenie Pomorza Zachodniego wskazywałaby na potencjalną możliwość transmisji bakterii na człowieka czy towarzyszące mu zwierzęta. W Polsce opisano trzy przypadki anaplazmozy u ludzi w 2001 r. (Tylewska- Wierzbanowska i wsp.). Również w doniesieniach europejskich rzadko informowano o występowaniu ludzkiej anaplazmozy granulocytarnej czy zachorowaniach zwierząt domowych bądź gospodarskich i z reguły opisane przypadki przebiegały łagodniej w porównaniu do analogicznych przypadków z USA. Przypuszcza się, że w Europie występują szczepy A. phagocytophilum, które mogą być mniej zjadliwe niż szczepy z Ameryki Północnej. W przypadku chorób transmisyjnych takich jak borelioza, babesioza czy anaplazmoza, dla których wspólnym wektorem są kleszcze, może dojść do współzakażenia różnymi patogenami. W takiej sytuacji, przy niewielkiej populacji analazm w porównaniu do populacji przenoszonych do gospodarza np. krętków Borellia, istnieje prawdopodobieństwo, że Anaplasma nie wytrzymuje konkurencji i jest eliminowana z organizmu żywiciela. Problem konkurencji między patogenami odkleszczowymi na poziomie wektora czy gospodarza od niedawna jest analizowany, a pojawiające się w literaturze światowej nowe hipotezy wymagają weryfikacji. Wyjaśnienie eliminacji patogenu w wyniku konkurencji międzygatunkowej w badaniach biologii patogenów odkleszczowych jest istotne z punktu widzenia epidemiologii i ekonomii. W literaturze pojawiały się informacje o koinfekcji kleszczy dwoma patogenami, nasz zespół jako pierwszy w świecie podał informację o możliwości współwystępowania w kleszczu aż trzech różnych patogenów: B. burgdorferi sensu lato, A. phagocytophilum i Babesia microti na poziomie 0,6% (II.1.b.-1). Zjawisko to jest niezwykle rzadkie i do dziś opisano niewiele takich przypadków w świecie. Zaobserwowaliśmy również podwójną koinfekcję, przy czym najczęściej współwystępowały B. burgdorferi i A. phagocytophilum (1,3%) oraz B. burgdorferi oraz B. microti (1,1%). Obecność kilku patogenów u wektora niesie ze sobą niebezpieczeństwo transmisji ich do żywiciela, a tym samym występowanie u pacjenta zakażenia mieszanego, sprawiającego problem z 12

13 diagnostyką i leczeniem. Pojedyncze, polietiologiczne przypadki zakażeń krwi pacjentów patogenami odkleszczowymi opisano dopiero pod koniec lat 90-tych. W Europie zdecydowanie częściej niż anaplazmy wykrywa się w kleszczach obecność DNA bakterii z rodzaju Rickettsia. Należą one również do bezwzględnie wewnątrzkomórkowych bakterii Gram-ujemnych przenoszonych głównie przez kleszcze oraz pchły. W obrębie rodzaju Rickettsia wyróżniono dwie podgrupy, tj. grupę bakterii wywołujących gorączki plamiste (SFG - spotted fever group) oraz grupę bakterii wywołujących tyfus (TG - typhus group). Ricketsje należące do obu tych grup są obecne w Europie, przy czym w naszej szerokości geograficznej występują bakterie należące do SFG. W przeciwieństwie do anaplazm rickettsje utrzymują się w obrębie populacji kleszczy zarówno dzięki przekazowi transstadialnemu, jak i transowarialnemu. Zakażenie potomstwa na drodze transowarialnej rzutuje na wszystkie pozostałe stadia w cyku życiowym kleszczy, przekaz transstadialny jest bowiem w przypadku rickettsji z grupy SFG w 100% skuteczny. Ponadto u dwóch gatunków kleszczy, I. ricinus oraz Dermacentor andersoni opisano przypadki przekazu transspermalnego rickettsii z grupy SFG. Transmisja patogenów drogą seksualną między osobnikami obu płci jest stosunkowo rzadka, mimo to ma istotne znaczenie w utrzymaniu i rozprzestrzenianiu się rickettsji w środowisku (II.2b.23). W populacji kleszczy z Pomorza Zachodniego wykryłam obecność DNA R. helvetica (II.2.b. 24), jak i opisałam symbiotyczne bakterie żyjące w komórkach jajowych kleszczy oraz R. monacensis, które według mojej wiedzy opisałam po raz pierwszy w Polsce (I.1, I.2, II.2.b.22) Nasz zespół podjął się również się zadania określenia obecności DNA anaplazm i Babesia sp. u pacjentów podejrzanych o boreliozę oraz w grupie psów z terenów endemicznych dla choroby z Lyme w północno-zachodniej Polsce. Temat ten był realizowany we współpracy z Kliniką Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku, w ramach grantu celowego, zamawianego (nr PCZ ). Wszystkie choroby odkleszczowe we wstępnej fazie charakteryzują się niespecyficznymi, grypopodobnymi objawami, dlatego też rozpoznanie ich jest trudne. Wysoka czułość metod molekularnych pozwala na wykrycie patogenów nawet przy bardzo niewielkim zakażeniu, wtedy, kiedy zawodzą inne metody, jak np. badanie rozmazów krwi (w celu poszukiwania wtrętów A. phagocytophilum czy B. microti) bądź wyniki fałszywie dodatnie w testach serologicznych, które mogą być konsekwencją reakcji krzyżowych. Opracowanie protokołu wykrywania i identyfikacji gatunkowej Borrelia było głównym celem grantu. Dodatkowo w izolatach z krwi pacjentów i psów podejrzanych o boreliozę lub już ze stwierdzoną chorobą, poszukiwałam DNA A. phagocytophilum wykorzystując jako marker molekularny fragment genu anka (II.1.b - 2, 5, 8, 11; II.2.b.-3, 4, 12). Materiał genetyczny anaplazm wykryłam 13

14 wyłącznie u pacjentów, u których wcześniej stwierdzono boreliozę (80% przypadków) lub kleszczowe zapalenie mózgu (20% przypadków). Kolejnym zadaniem w ramach grantu celowego zamawianego (nr PCZ ), jakiego podjął się zespół pod kierunkiem prof. B. Skotarczak było badanie izolatów pochodzących z krwi psów z podejrzeniem boreliozy, babesiozy, jak i w grupie kontrolnej, w których poszukiwano DNA patogenów: B. burgdorferi s.l., Babesia sp., A. phagocytophilum, R. helvetica oraz Bartonella sp. Poszukując DNA anaplazm i riketsji badania prowadziłam wykorzystując różne markery molekularne. Bez względu na zastosowany marker (16S rrna i glta) we krwi psów nie wykryłam obecności DNA R. helvetica, w przeciwieństwie do anaplazm. Wykorzystanie jako markera genetycznego fragmentu genu msp2 dla A. phagocytophilum wykazało zdecydowanie wyższy stopień zakażenia psów przez anaplazmy niż dla konserwatywnego genu 16S rrna (II.1.b.-11, 12, II.2.b.-4). We krwi psów odnotowałam koinfekcję DNA B. burgdorferi s.l. i A. phagocytophilum (3,3%). Stwierdziłam także pojedyncze przypadki zakażenia jedynie anaplazmą, przy czym dotyczyły one psów starszych o słabszej kondycji. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że u osobników młodych, ze sprawnie działającym układem odpornościowym anaplazmoza granulocytarna ma przebieg łagodny lub bezobjawowy. We krwi psa, ze zdiagnozowaną boreliozą tylko w jednym przypadku stwierdzono obecność DNA Bartonella sp., nie stwierdzono natomiast współzakażenia Babesia sp. i pozostałych patogenów (II.1.b.- 12). W tym okresie zespół pod kierownictwem prof. B. Skotarczak podjął próbę poszukiwania organizmów, które stanowiłby rezerwuar bakterii przenoszonych przez kleszcze, biorąc tym samym udział w międzynarodowej dyskusji na łamach czasopism naukowych. Projekt wykonywaliśmy we współpracy z Zakładem Morfologii Zwierząt Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Jako organizmy potencjalnie stanowiące rezerwuar bakterii czy pierwotniaków chorobotwórczych wybrano żywicieli kleszczy I. ricinus. Materiałem do badań była krew pobrana od gryzoni (Apodemus flavicollis i Clethrionomys glareolus) oraz ptaków (Coccothraus coccothraustes, Erithacus rubecula, Fringilla coelebs, Parus caeruleus, P. major, Sitta europaea, Sturnus vulgaris, Turdus philomelos, T. merula) odłowionych w Wielkopolskim Parku Narodowym, a także kleszcze infestujące badane zwierzęta oraz kleszcze odłowione z roślinności na terenach objętych badaniami (II.1.b.4, 6; sesje plakatowe na konferencjach). Zarówno we krwi ptaków, jak i w zebranych z nich kleszczach nie wykryłam obecności DNA A. phagocytophilum, choć w kleszczach zebranych z roślinności wykazałam jego obecność na stosunkowo niskim poziomie (1,1% zakażonych I. ricinus). Ptaki nie są kompetentnym rezerwuarem dla A. phagocytophilum, co wynika również z prac innych badaczy publikujących w tym czasie. We krwi gryzoni nie wykryłam obecności DNA anaplazm, natomiast w infestujących 14

15 je kleszczach u niewielkiej liczby osobników (0,4% nimf) stwierdziłam materiał genetyczny tych bakterii (materiały konferencyjne). Zakażenie gryzoni przez A. phagocytophilum w różnych regionach świata utrzymuje się na niskim poziomie, choć ta grupa drobnych ssaków jest żywicielem głównie dla larw i nimf kleszczy. Wynika to prawdopodobnie z tego, że bakteriemia utrzymuje się przez krótki okres czasu, stąd we krwi trudno jest wykryć DNA anaplazm. Zarówno u ptaków, jak i gryzoni odłowionych w Wielkopolskim Parku Narodowym oraz w zebranych z nich kleszczach wykryto tylko DNA Borrelia, natomiast nie zamplifikowano DNA Babesia. Kontynuując powyższe badania zespół Katedry Genetyki podjął się próby określenia, czy inne roztocza pasożytujące na ptakach mogą być potencjalnym żywicielem dla anaplazm i innych bakterii przenoszonych przez kleszcze. W tym celu od 14 ptaków, reprezentujących 4 gatunki (E. rubecula, T. philomelos, T. merula, S. vulgaris), odłowionych w Wielkopolskim Parku Narodowym pozyskano z piór niewielkie, pasożytujące w dudkach roztocza z rodziny Syringophilidae. Ponieważ roztocza przebijają ścianę dudki i odżywiają się tkanką otaczającą calamus, potraktowano je jako potencjalny wektor patogenów transmitowanych przez kleszcze, m. in. Borrelia s.l, A. phagocytophilum i Babesia sp. Ze względu na niewielkie rozmiary pasożytów ( mm szerokości i 0,7-1,4 mm długości) osobniki połączono w pule, z których następnie izolowano DNA. Wykorzystując dwa markery molekularne, fragment genu msp2 i anka, wykazałam obecność DNA A. phagocytophilum w 3 z 14 analizowanych pul dudkowców (Syringophilidae) (II.1.b.7). Wyniki badań mogą wskazywać na dodatkowy cykl krążenia anaplazm wśród ptaków, jednak nie tak skuteczny, jak w przypadku kleszczy. W literaturze światowej są zaledwie pojedyncze informacje o wykryciu DNA anaplazm we krwi ptaków, choć rezerwuar ten był dokładnie analizowany jako potencjalne źródło bakterii. W badanym materiale nie wykryto DNA Borrelia s.l. i Babesia sp. Potencjalnym rezerwuarem dla bakterii przenoszonych przez kleszcze jest również dzika zwierzyna. Zespół nasz badał obecność DNA patogenów odkleszczowych we krwi zwierzyny łownej, saren (Capreolus capreolus), jelenia szlachetnego (Cervus elaphus) oraz dzika (Sus scrofa). W sumie DNA anaplazm wykryto u 12,5% saren i 9% jeleni. Stwierdzono również podwójną koinfekcję A. phagocytophilum i Babesia spp. oraz A. phagocytophilum i Theileria spp. na niskim poziomie (II.1.b.10). Wyniki badań wskazują, że dzikie przeżuwacze, tj. C. capreolus i Ce. elaphus, mogą odgrywać istotną rolę w cyklu życiowym A. phagocytophilum, Bartonella schoenbuchensis, B. bovis i Theileria sp. We krwi dzika nie wykryto DNA żadnego z poszukiwanych patogenów. Nowym wątkiem w badaniach naszego zespołu jest identyfikacja molekularna żywicieli I. ricinus (II.1.b.17). Metoda ta opiera się na wykrywaniu DNA organizmów żywicielskich z 15

16 resztek krwi obecnych w nimfach, która pozostała po pasożytowaniu kleszcza w stadium larwy. Informacja ta może być również wskazówką przydatną do identyfikacji rezerwuaru patogenów odkleszczowych. Do badań zespół nasz odłowił nimfy kleszcza pospolitego I. ricinus z czterech stanowisk, dwóch stanowiących parki podmiejskie i dwóch rekreacyjnych na terenie województwa zachodniopomorskiego. Wytypowane miejsca były wcześniej monitorowane pod kątem występowania patogenów odkleszczowych. W celu identyfikacji molekularnej żywicieli I. ricinus amplifikowano gen 12S rrna metodą nested PCR, a następnie trawiono produkt czterema enzymami restrykcyjnymi. Na podstawie zróżnicowanych wzorów restrykcyjnych ustalono, że larwy I. ricinus żerowały przede wszystkim na ssakach (C. capreolus, Ce. elaphus, Sus scrofa, Vulpes vulpes) i ptakach (Turdus merula, T. philomelos, Perdix, perdix), rzadziej na gadach. Dodatkowo badaną grupę nimf przetestowano na obecność DNA patogenów odkleszczowych. DNA bakterii z rodzaju Borrelia wykryto u kleszczy żerujących na ssakach i ptakach bez wyraźnej przewagi dla wybranego gatunku żywiciela. Materiał genetyczny Rickettsia był obecny głównie w kleszczach żerujących na C. capreolus, Ce. elaphus i S. scrofa. DNA A. phagocytophilum nie wykryłam w badanej populacji kleszczy. Powyższe wyniki mogą świadczyć o tym, że rezerwuarem Rickettsia są zwierzęta łowne, jak sarny, jelenie czy dziki. Niestety w przypadku bakterii z rodzaju Rickettsia określenie gatunków rezerwuarowych w oparciu o metodę identyfikacji żywicieli kleszczy jest utrudnione. Występujący u I. ricinus transowarialny przekaz bakterii jest skuteczny w 100%, stąd interpretacja wyników nie jest jednoznaczna. Aktualnie prowadzę prace nad poznaniem krążenia R. helvetica i R. monacensis w środowisku analizując występowanie DNA tych bakterii we krwi zwierząt. Wektory, rezerwuar jak i metody służące do detekcji DNA A. phagocytophilum oraz Rickettsia sp. opisałam w artykułach przeglądowych i rozdziałach w monografiach (II.1.b. 9, 13; II.2.b. 7-10, 13 15, 22, 23). Byłam również współautorem monografii redagowanej przez prof. B. Skotarczak Biologia molekularna patogenów przenoszonych przez kleszcze, do której przygotowałam część poświęconą bakteriom A. phagocytophilum (II.2.b ). W roku 2007 zaproszono mnie do współpracy w realizacji grantu Mitogenomiczna charakterystyka polskich słodkowodnych gatunków małży (N ) wykonywanego przez dwa ośrodki: Katedrę Genetyki Uniwersytetu Szczecińskiego (dr hab. Marianna Soroka) oraz Instytut Oceanologii PAN w Sopocie (dr hab. Artur Burzyński). Celem grantu było poznanie sekwencji całego genomu mitochondrialnego DNA u kilku gatunków małży z rodziny Unionidae (Unio pictorum, U. tumidus, Anodonta anatina i Sinanodonta woodiana) oraz Dreissenidae (Dreissena polymorpha i D. bugennsis). Wyniki naszych analiz zostały przedstawione na 16

17 krajowych i międzynarodowych konferencjach (sesje plakatowe), a publikacja jest aktualnie przygotowywana do druku. Od kilku lat współpracuję z zespołem dr hab. Małgorzaty Piaseckiej z Samodzielnej Pracowni Histologii i Biologii Rozwoju, Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie. Badania nasze związane są z niepłodnością małżeńską. Dane statystyczne z ostatnich lat wskazują, że w 50-60% to czynnik męski jest powodem nieudanej prokreacji. Powodów, dla których plemniki nie są zdolne do zapłodnienia komórek jajowych jest bardzo dużo i mają one różnorodne podłoże. W naszej pracy skupiliśmy uwagę m. in. na poszukiwaniu pojedynczych zmian nukleotydowych (SNP - Single Nucleotide Polimorphism) w genach kodujących protaminę 1 i 2 (PRM1 i PRM2). Oba te białka odpowiadają za kondensację chromatyny w plemnikach. Badania wykonywaliśmy na ejakulowanych plemnikach pacjentów Kliniki Medycyny Rozrodu i Ginekologii PUM w Szczecinie oraz mężczyzn z grupy kontrolnej. Startery do reakcji były tak dobrane, aby w przypadku PRM1 amplifikować miejsce promotorowe genu, natomiast dla PRM2 amplifikowana sekwencja obejmowała na końcu 3 fragment nie podlegający translacji (3 UTR 3 untranslated region). Zmiany w rejonach genów mają istotne znaczenie dla prawidłowego przebiegu transkrypcji i translacji. Wykryte przez nas SNP-y w sekwencji poromotorowej oraz w egzonie 2 genu PRM1, jak i obserwowane u nielicznych mężczyzn zmiany SNP w sekwencji 3 UTR dla PRM2 mogą mieć wpływ na płodność badanych. Wyniki uzyskane w pracowni molekularnej Katedry Genetyki US będą poddane analizie wraz z innymi parametrami ocenianymi przez Samodzielną Pracownię Histologii i Biologii Rozwoju PUM. Dotychczasowe rezultaty zostały przedstawione na sesji plakatowej na zjazdach krajowych i międzynarodowych. Dotychczas ukazała się dwuczęściowa praca przeglądowa dotycząca niepłodności męskiej i jej przyczyn (II.1.b 14, 15), uznana za najlepszy artykuł roku 2012 w Postępach Biologii Komórki. Praca oryginalna jest w przygotowaniu. 17

18 18