Prof. dr hab. E. K. Jagusztyn-Krynicka UNIWERSYTET WARSZAWSKI WYDZIAŁ BIOLOGII INSTYTUT MIKROBIOLOGII ZAKŁAD GENETYKI BAKTERII

Transkrypt

1 1 Prof. dr hab. E. K. Jagusztyn-Krynicka UNIWERSYTET WARSZAWSKI WYDZIAŁ BIOLOGII INSTYTUT MIKROBIOLOGII ZAKŁAD GENETYKI BAKTERII ul. MIECZNIKOWA 1, WARSZAWA TEL: (+48 22) , FAX: (+48 22) Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Dominika Lewandowskiego Strukturalne i funkcjonalne uwarunkowania oddziaływań pomiędzy kleszczem a patogenna bakterią na przykładzie białek TROSPA z Ixodes ricinus i OspA z Borrelia burgdorferi Promotor prof dr hab. Marek Figlerowicz Promotor pomocniczy dr Anna Urbanowicz Ludzkie choroby zakaźne będące rezultatem infekcji bakteriami, wirusami czy pierwotniakami, które do rozprzestrzeniania wymagają udziału tzw. nosiciela, zwanego inaczej wektorem, stanowią poważny problem medyczny. Jedną z nich jest borelioza będąca skutkiem infekcji krętkami Borrelia burgdorferi. Liczba przypadków boreliozy zarówno w USA jak i Europie stale wzrasta, a jej konsekwencje często wykluczają ludzi z aktywnej działalności na długi okres. Wektorem w wypadku krętków z rodzaju Borrelia są kleszcze, w Polsce głównie gatunek Ixodes ricinus. Wiedza dotycząca zarówno mechanizmów patogenezy boreliozy jak i oddziaływań z wektorem jest, choć coraz bardziej detaliczna, bez wątpienia niepełna. W przedstawionej do recenzji rozprawie doktorant analizował molekularne aspekty interakcji pomiędzy wektorem a mikroorganizmem. W oparciu o publikowane dane eksperymentalne do badań wybrano dwa białka kleszcza oraz dwa białka zlokalizowane na powierzchni krętków. Celem badań była strukturalna i funkcjonalna analiza tworzonego kompleksu (TROSPA/OspA) mającego wpływ na proces kolonizacji jelit kleszcza przez krętki. Rozprawa doktorska ma układ standardowy. Poza wstępem, rozdziałami opisującymi zastosowane materiały i metody, wyniki przeprowadzonych eksperymentów oraz ich dyskusję zawiera podsumowanie wyników, w którym doktorant przedstawił w punktach najistotniejsze według jego oceny osiągnięcia swojej rozprawy doktorskiej. Rozprawę uzupełnia streszczenie (w języku polskim i angielskim) oraz spis literatury (319 pozycji). Zamieszczony został wykaz prac naukowych powstałych w wyniku realizacji rozprawy oraz informacje dotyczące finansowania.

2 2 Wstęp do rozprawy, podzielony na szereg właściwie dobranych podrozdziałów wprowadza w tematykę badań. Przedstawia zarówno dane dotyczące cyklu rozwojowego wektora (kleszcza) jak i charakterystykę chorobotwórczego mikroorganizmu. Doktorant skupił się głównie na omówieniu interakcji pomiędzy wektorem a patogenem na poziomie molekularnym. Taka strategia ułatwia dalsze śledzenie badań zawartych w rozprawie. W mojej ocenie wstęp do rozprawy ma duże szanse zostać opublikowany w czasopiśmie Postępy Mikrobiologii lub po uproszczeniu w czasopiśmie popularnonaukowym Kosmos. Przedstawione zagadnienia na pewno są interesujące dla szerokiego grona czytelników nie tylko specjalistów w dziedzinie mikrobiologii. Celem badań było wyjaśnienie (na poziomie molekularnym) oddziaływań między wektorem a patogenem mających miejsce podczas zasiedlania przez krętki organów kleszcza. Zamierzony cel doktorant postanowił osiągnąć poprzez analizę struktur kompleksów tworzonych przez białka kleszcza i mikroorganizmu. W oparciu o dane literaturowe oraz przeprowadzone wstępne analizy do badań wybrano dwa białka kleszcza: białko TROSPA oraz białko Salp15, oba zaangażowane w oddziaływania z powierzchniowymi białkami Borrelia, odpowiednio OspA i OspC. Białko TROSP jest glikoproteiną występującą w przestrzeniach międzykomórkowych oraz na powierzchni komórek nabłonkowych jelit kleszcza a Salp15 w ślinie kleszcza. Ponieważ otrzymane w początkowych etapach badań rekombinowane białko Salp15 nie wykazywało aktywności biologicznej rozprawa poświęcona jest analizie kompleksu pomiędzy TROSPA a OspA. Rozprawa stanowi logiczny cykl wyjątkowo starannie przeprowadzonych eksperymentów. Już przeprowadzenie z sukcesem wstępnych eksperymentów dotyczących opracowania metodyki otrzymywania rekombinowanych białek, szczególnie białka TROSPA, było dużym wyzwaniem. Pomimo, ze dysponujemy dużą liczbą tzw. układów ekspresyjnych o różnym pochodzeniu oraz rekombinacyjnych wektorów do klonowania, otrzymanie aktywnych białek nie jest metodycznie proste. Następne etapy badań obejmowały otrzymanie kilku form delecyjnych białek TROSPA pozbawionych fragmentów lub całości domeny transbłonowej. Celem było otrzymanie wariantu białka zdolnego do wiązania OspA i o cechach ułatwiających przeprowadzenie analiz krystalograficznych; nie ulegającego agregacji oraz o dobrej rozpuszczalności w roztworach wodnych. Analizowano także aktywność i cechy biofizyczne wariantów białka o zmienionych aminokwasach. Dodatkowo doktorant przeanalizował właściwości wariantów delecyjnych TROSPA otrzymanych w eukariotycznym układzie ekspresyjnym, system owadzi, aby sprawdzić wpływ modyfikacji potranslacyjnych (glikozylacja) na aktywność białka zdolność do wiązania OspA. Na

3 3 podkreślenie zasługuje przejrzysty sposób opisu przeprowadzonych eksperymentów. Poszczególne podrozdziały poprzedzone są kilkoma zdaniami przedstawiającymi uzasadnienie przeprowadzenia opisywanych niżej eksperymentów. I tak np. białko otrzymywano także w układzie bakulowirusowym aby sprawdzić rolę modyfikacji potranslacynych (glikozylacja) a formy o zmienionej sekwencji aminokwasowej (zamiana aminokwasów kwaśnych na neutralne aby zweryfikować role oddziaływań elektrostatycznych w interakcjach pomiędzy TROSPA a OspA. Wszystkie eksperymenty oceny aktywności izolowanych wariantów białka TROSPA, głównie w testach ELISA, przeprowadzano w kilku powtórzeniach, co umożliwiło przeprowadenie analiz statystycznych otrzymanych danych. Ostatnim etapem prac przedstawionych w rozprawie doktorskiej mgr inż. D. Lewandowskiego jest próba określenia struktury delecyjnych wariantów białka TROSPA oraz jego kompleksu z OspA. Ponieważ pomimo wielu prób nie udało się otrzymać kryształów wariantów białka TROSPA, dla osiągnięcia zamierzonego celu wykorzystano kilka metod biofizycznych pozwalających na scharakteryzowanie struktur biomolekuł w roztworze oraz metody bioinformatyczne. W konsekwencji stworzono in silico dwa prawdopodobne modele kompleksu. Na każdym etapie przewidywań korelowano właściwości tworzonych modeli z wynikami badań genetyczno/biochemicznych ustalających role poszczególnych aminokwasów w wiązaniu obu białek. Z zaproponowanych modeli jeden w większym stopniu korelował z danymi otrzymanymi metodami biofizycznymi, tak więc uznany został za bardziej prawdopodobny. Podczas wykonywania eksperymentów doktorant, do rozwiązywania wytyczonych zagadnień, posługiwał się wieloma metodami zarówno genetycznymi (praca z DNA i białkami) jak i bioinformatycznymi i biofizycznymi. Interpretacja uzyskiwanych wyników wymagała głębokiej wiedzy z różnych dziedzin nauk przyrodniczych. Dyskusja wyników została przeprowadzona w sposób profesjonalny. W pierwszym fragmencie doktorant przedstawia potencjalne przyczyny niepowodzeń w uzyskaniu aktywnej, oddziałującej z OspC formy białka Salp15. Chciałabym zaspokoić własną ciekawość, więc zapytam czy stosując zaproponowane w dyskusji zmiany w metodyce udało się uzyskać białko Salp15. Z dużym zainteresowaniem przeczytałam dwa ostatnie rozdziały dyskusji dotyczące struktury TROSPA oraz struktury kompleksu TROSPAxOspA. Ten fragment podkreśla wysoką wartość naukową rozprawy doktorskiej mgr inż. Dominika Lewandowskiego oraz ukazuje dojrzałość naukową doktoranta. Kilka ogólnych pytań: 1. Co dalej??

4 4 2. Jak często białka o nieuporządkowanej strukturze biorą udział w interakcjach z białkami mikroorganizmów? Większość receptorów rozpoznawanych przez różne adhezyny bakteryjne ma raczej uporządkowaną strukturę stabilną strukturę. Rozumiem, ze TROSPA to pierwsze opisane tego typu białko kleszcza. 3. Czy uzyskane dane mogą mieć zastosowanie w zapobieganiu boreliozie poprzez ograniczenie liczy komórek mikroorganizmów namnażających się w jelicie kleszcza? Jak praktycznie zastosować tego typu terapie? Zauważyłam też kilka błędów stylistycznych, czy żargonu laboratoryjnego, co nie umniejsza wartości naukowej rozprawy. Podaję je z obowiązku recenzenta. 1. Zamiast mutanty delecyjne białka wolałabym delecyjne warianty/formy białka; 2. Co oznacza sformułowanie powtórzenia techniczne w odróżnieniu od powtórzeń biologicznych? 3. Słowo sekwencja znaczy kolejność w kilku miejscach rozprawy winno być sekwencja aminokwasowa lub sekwencja nukleotydowa 4.W kilku miejscach rozprawy słowo ilość winno być zastąpione słowem liczba 5. Kolejność autorów podana dla publikacji PLos One 2013 jest inna niż ta występująca w Pubmed W posumowaniu chciałam stwierdzić, że recenzowaną rozprawę doktorską uważam za wartościową z kilku powodów. Po pierwsze prowadzone badania mają charakter pionierski. Analiza procesów oddziaływań pomiędzy wektorem (kleszczem) a patogenem na poziomie analiz strukturalnych to badania unikatowe. Równocześnie na podkreślenie zasługuje różnorodność stosowanych strategii badawczych oraz staranność w opracowywaniu danych eksperymentalnych. Przedstawiona rozprawa doktorska spełnia wszelkie wymogi stawiane rozprawom doktorskim i wnoszę do Rady Naukowej Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN o dopuszczenie mgr inż. Dominika Lewadowskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Uznaję rozprawę doktorska za godną nagrodzenia stosowną nagrodą pod warunkiem opublikowania drugiego fragmentu prezentowanych danych eksperymentalnych. Manuskrypt po drugiej rundzie recenzji został już wysłany do redakcji. Warszawa

5 5