Dr inż. Barbara Sokołowska

Transkrypt

1 Szacowanie niepewności pomiaru w znormalizowanych metodach mikrobiologicznych badania żywności i pasz jako element sprawdzania w warunkach laboratorium Dr inż. Barbara Sokołowska Zakład Technologii Przetworów Owocowych i Warzywnych Pracownia Badania Jakości Mikrobiologicznej sokolowska@ibprs.pl KT nr 3 ds. Mikrobiologii Żywności

2 Certyfikaty akredytacji laboratoriów IBPRS

3 Laboratoria badawcze IBPRS Zakład Analizy Żywności Zakład Mikrobiologii Zakład Przetwórstwa Zbóż i Piekarstwa Zakład Technologii Fermentacji Zakład Technologii Przetworów Owocowych i Warzywnych Zakład Technologii Piwa, Słodu i Żywności Prozdrowotnej Samodzielna Pracownia Gorzelnicza z siedzibą w Bydgoszczy Oddział Koncentratów Spożywczych i Produktów Skrobiowych z siedzibą w Poznaniu Oddział Chłodnictwa i Jakości Żywności z siedzibą w Łodzi Oddział Technologii Mięsa i Tłuszczu z siedzibą w Warszawie Oddział Cukrownictwa z siedzibą w Lesznie

4 Dokumenty odniesienia w procesie akredytacji PN-EN ISO 7218:2008 Mikrobiologia żywności i pasz. Ogólne wymagania i zasady badań mikrobiologicznych EA 04/10:2002 Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych

5 EA-04/10:2002 p.5 Badania mikrobiologiczne należą do kategorii, która uniemożliwia stosowanie ścisłego, metrologicznie i statystycznie uzasadnionego wyliczenia niepewności pomiaru Zazwyczaj właściwe jest oparcie oszacowania niepewności na samej powtarzalności i odtwarzalności, ale najlepiej włączając obciążenie (bias) z wyników programów badania biegłości Dokument zaleca określenie poszczególnych składników niepewności, ocenę ich wpływu na zmienność wyników oraz wykazanie, że są one nadzorowane

6 Komitety ISO prace związane z akredytacją laboratoriów mikrobiologicznych W ISO/TC 34 Produkty spożywcze /SC 9 Mikrobiologia i CEN/TC 275 Analiza żywności /WG 6 Zanieczyszczenia mikrobiologiczne, prowadzone są prace związane z opracowaniem bądź nowelizacją norm dotyczących: badań biegłości walidacji metod mikrobiologicznych, w tym także na poziomie laboratorium zastosowania statystyki w sterowaniu jakością badań mikrobiologicznych szacowania niepewności metod jakościowych kontroli jakości pożywek

7 ISO/TS 19036:2006 ISO/TS 19036:2006/Amd.1:2009(E) Microbiology of food and animal feeding stuffs- Guide on estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations AMENDMENT 1: Measurement uncertainty for low counts Oba te dokumenty przetłumaczono na język polski jako Specyfikację Techniczną PKN Mikrobiologia żywności i pasz. Wytyczne do szacowania niepewności pomiaru w metodach ilościowych Dokument przywołany w PN-EN ISO 7218:2008

8 PKN-ISO/TS 19036:2011 Wprowadzenie ISO/TC/SC 9 bierze pod uwagę, że w przypadku analiz mikrobiologicznych podejście krok po kroku (podejście EURACHEM/CITAC do szacowania niepewności pomiaru) nie jest zadawalające, ponieważ trudno jest stworzyć uniwersalny model procesu pomiaru. Ponadto w mikrobiologii wydaje się trudnym dokładne określenie udziału każdego z indywidualnych kroków procesu analitycznego, gdzie: analitem jest żywy drobnoustrój, którego stan fizjologiczny może być zmienny docelowy analit zawiera różne szczepy, różne rodzaje i gatunki drobnoustrojów

9 PKN-ISO/TS 19036:2011 Wprowadzenie Innymi słowy, analizy mikrobiologiczne nie pozwalają na szacowanie niepewności w sposób zgodny z zasadami metrologii i w sposób statystycznie istotny Dlatego ISO/TC/SC 9 do szacowania niepewności pomiaru (MU) wybrało podejście określane jako góra dół lub całościowe, które oparte jest na odchyleniu standardowym odtwarzalności wyniku końcowego w procesie pomiaru Takie podejście bazujące na uzyskanych wynikach z powtórzonych analiz tej samej próbki, w przypadku analiz mikrobiologicznych wydaje się być bardziej właściwe niż podejście krok po kroku

10 PKN-ISO/TS 19036:2011 Zakres Przedstawiony sposób szacowania niepewności pomiaru ma zastosowanie w metodzie płytkowej oraz w alternatywnych metodach instrumentalnych w badaniach: produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi i stosowanych w żywieniu zwierząt w badaniach próbek środowiskowych z obszaru produkcji i obrotu żywnością Nie ma natomiast zastosowania do metod NPL

11 PKN-ISO/TS 19036:2011 Definicje - niepewność pomiaru Parametr związany z wynikiem pomiaru, charakteryzujący rozrzut wartości, który można w uzasadniony sposób przypisać wielkości mierzonej Parametrem tym może być na przykład odchylenie standardowe (lub jego wielokrotność), albo połowa szerokości przedziału ufności mającego ustalony poziom

12 Główne źródła niepewności pomiaru w analizach mikrobiologicznych i podejście czarnej skrzynki Pobieranie próbek Wyposażenie, pożywki i odczynniki Przygotowanie próbki analitycznej/zawiesina wyjściowa Obciążenie Próbka laboratoryjna Wynik Matryca Analityk/czas Resztowe błędy przypadkowe

13 PKN-ISO/TS 19036:2011 Wyodrębniono trzy różne możliwości oszacowania odchylenia standardowego odtwarzalności: wewnątrzlaboratoryjne odchylenie standardowe odtwarzalności (opcja priorytetowa) odchylenie standardowe odtwarzalności metody uzyskane w porównaniach międzylaboratoryjnych odchylenie standardowe odtwarzalności uzyskane w międzylaboratoryjnych badaniach biegłości

14 PKN-ISO/TS 19036:2011 Ogólne zasady Szacowana niepewność pomiaru odnosi się do laboratorium i łączy daną niepewność z określonym wynikiem badania uzyskanym w określonych warunkach, które obejmują analityków, procedury postępowania, wyposażenie, odczynniki itd. Oszacowana niepewność nie charakteryzuje metody analitycznej jako takiej, niezależnie od laboratorium, które ją stosuje

15 PKN-ISO/TS 19036:2011 Ogólne zasady Stały monitoring szacowania niepewności jest niezbędny, aby wykazać, że to szacowanie pozostaje istotne oraz, że wyniki badań znajdują się pod kontrolą Ponowne oszacowanie niepewności jest wymagane po wprowadzeniu zmian do jakiegokolwiek czynnika krytycznego Przykładami czynników krytycznych są: pochodzenie i rodzaj pożywki i /lub innego odczynnika (np. stosowane do potwierdzania) techniki liczenia (ręczne lub zautomatyzowane) analityk lub grupa analityków, itd.

16 PKN-ISO/TS 19036:2011 Ogólne zasady Dla każdego mikroorganizmu (lub grupy mikroorganizmów) oraz dla określonego typu matrycy, należy zbadać co najmniej 10 próbek Liczba typów matryc do badań zależy od zróżnicowania matryc analizowanych rutynowo przez laboratorium Badania powinny być przeprowadzone na różnych próbkach tej samej matrycy w różnych dniach, w celu uwzględnienia zmian występujących w warunkach działania w czasie

17 PKN-ISO/TS 19036:2011 Ogólne zasady c.d. Obliczanie odchylenia standardowego po przekształceniu wyników w postać logarytmiczną stabilizuje zmienność odtwarzalności w całym zakresie poziomów zanieczyszczenia, przy założeniu że wyniki stanowiące małe liczby nie są uwzględniane w obliczeniach Jeżeli to możliwe powinno się stosować próbki naturalnie zanieczyszczone Warunki badania powinny być jak najbardziej zbliżone do warunków spotykanych w badaniach rutynowych (zestresowanie drobnoustrojów)

18 PKN-ISO/TS 19036:2011 Wykonanie Z każdej próbki, każdy analityk pobiera próbkę analityczną (naważkę) Przygotowuje zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesięciokrotne Wykonuje posiewy (na 1 lub 2 płytki z każdego rozcieńczenia) i identyfikacje jak w rutynowych badaniach Zaleca się aby warunki A i B były jak najbardziej odmienne Do obliczeń zestawiamy wyniki badań tych samych próbek wykonane przez różnych analityków

19 Sposób postępowania przy wyznaczaniu wewnątrzlaboratoryjnego odchylenia standardowego odtwarzalności Próbka żywności I Analityk / warunki A II Analityk / warunki B Zawiesina początkowa Zanieczyszczenie (jeśli potrzebne) Zawiesina wyjściowa Analiza Analiza Różne warunki

20 PKN-ISO/TS 19036:2011 Obliczenia Wyniki uzyskane z płytek na których urosło w sumie mniej niż 10 kolonii należy pominąć Wyniki uzyskane z płytek na których urosło w sumie więcej niż 10 a mniej niż 30 kolonii mogą być uwzględnione jedynie wtedy, gdy oczekiwane odchylenie standardowe odtwarzalności będzie większe niż 0,2 log (jtk/g lub jtk/ml)

21 PKN-ISO/TS 19036:2011 Typy matryc do oszacowania niepewności Produkty płynne i sypkie (mleko, mleko kokosowe, mleko w proszku itp.) Dobrze rozdrobnione produkty stałe (mięso mielone, mięso oddzielane mechanicznie, lody, mleko sojowe, bita śmietana itp.) Drobne lub bardzo drobne cząstki produktów stałych (suszona pietruszka, suszone pieczarki, starta marchewka/seler, sałatki, krewetki, zboża, pasze, siekane orzechy itp.) Inne produkty stałe (kawałki mięsa, ryby, sery, ciasta itp.) Większość produktów reprezentujących matryce typu 3 i 4 może być rozdrobniona i rozpatrywana jako matryca 2 typu

22 PKN-ISO/TS 19036:2011 Niepewność pomiaru podajemy jako (generalnie): Gdzie: 0,18861 C U 2 2 0, s R C jest składową wariancji wynikającą z rozkładu Poissona C jest liczbą kolonii policzonych na płytkach Powyższy wzór stosujemy zawsze lub jeżeli: gdzie 1,75 C C lim C lim 2 S R

23 PKN-ISO/TS 19036:2011 Niepewność pomiaru podajemy w sposób uproszczony jako: U 2 S R Jeżeli: Gdzie: C C C lim jest liczbą kolonii policzonych na płytkach

24 PKN-ISO/TS 19036:2011 Przedstawianie wyniku Wynik badania może być przedstawiony jako jedna z następujących możliwości: przedział dla wyniku wyrażonego jako log: y U [log 10 (jtk/g)] wynik wyrażony jako log z oszacowanymi granicami: y [log 10 (jtk/g)] [y U, y U] wynik w liczbach bezwzględnych z oszacowanymi granicami: x jtk/g [10 y U, 10 y U ] wynik z oszacowanymi granicami względnymi: x jtk/g [ (1 10 U ) 100 %, ( 1 10 U ) 100 %]

25 Szacowanie niepewności w oznaczaniu liczby drożdży w produktach płynnych o a w > 0,95 wg PN-ISO :2009 x ia x ib y ia =log x ia y ib =log x ib y ia - y ib s ,623 3,568 0,055 0, ,041 4,000 0,041 0, ,903 4,903 0,000 0, ,903 4,845 0,058 0, ,903 4,845 0,058 0, ,785 4,944-0,159 0, ,785 4,813-0,028 0, ,944 4,813 0,132 0, ,477 3,491-0,014 0, ,556 3,519 0,038 0, ,362 4,531-0,170 0, ,279 4,544-0,265 0,03520 SUMA 0,07785 ŚREDNIA 0,00649 s R 0,081

26 Szacowanie niepewności w oznaczaniu liczby pleśni w produktach płynnych o a w > 0,95 wg PN-ISO :2009 x ia x ib y ia =log x ia y ib =log x ib y ia - y ib s ,903 3,875 0,028 0, ,550 3,556-0,006 0, ,550 3,756-0,206 0, ,556 3,756-0,200 0, ,380 3,785-0,405 0, ,380 3,778-0,389 0, ,785 3,778 0,007 0, ,556 3,792-0,236 0, ,613 3,826-0,213 0, ,462 3,342 0,120 0, ,279 3,146 0,133 0,00879 SUMA 0,26934 ŚREDNIA 0,02449 s R 0,156

27 Aktualizacja 2010 szacowania niepewności w oznaczaniu liczby drożdży w produktach płynnych o a w > 0,95 wg PN-ISO :2009 x ia x ib y ia =log x ia y ib =log x ib y ia - y ib s ,914 3,792 0,121 0, ,732 3,869-0,137 0, ,690 3,613 0,077 0, ,519 3,602-0,084 0, ,279 5,301-0,022 0, ,301 5,322-0,021 0, ,462 5,342 0,120 0, ,462 5,301 0,161 0,01302 SUMA 0,04391 ŚREDNIA 0,00549 s R 0,074

28 Przedstawianie niepewności pomiaru w sprawozdaniach z badań Z posiewów próbki soku buraczkowo-jabłkowego w kierunku oznaczania liczby drożdży uzyskano następujące wyniki: 10-2 ml - 50, 52 jtk 10-3 ml - 3, 4 jtk C = 109 jtk C lim dla s R = 0,074 odczytane z tablic wynosi 356 jtk, a więc do obliczenia niepewności pomiaru stosujemy wzór (1) Wynik: 3,7 ± 0,1 [log (jtk/ml)] lub 3,7 [log (jtk/ml)] [3,5, 3,8] lub 5,0 x 10 3 jtk/ml [3,5 x 10 3, 6,9 x 10 3 ] lub 5,0 x 10 3 jtk/ml [-29%, +41%]

29 Przedstawianie niepewności pomiaru w sprawozdaniach z badań Z posiewów próbki soku buraczkowo-jabłkowego w kierunku oznaczania liczby pleśni uzyskano następujące wyniki: 10-2 ml - 28, 24 jtk 10-3 ml - 4, 9 jtk C = 65 jtk C lim dla s R = 0,156 odczytane z tablic wynosi 68 jtk, a więc do obliczenia niepewności pomiaru stosujemy wzór (1) Wynik: 3,5 ± 0,3 [log (jtk/ml)] lub 3,5 [log (jtk/ml)] [3,2, 3,8] lub 3,0 x 10 3 jtk/ml [1,4 x 10 3, 6,1 x 10 3 ] lub 3,0 x 10 3 jtk/ml [-51%, +104%]

30 Wyniki uzyskiwane w PT

31 Raport Techniczny EUROLAB 2007 Niepewność pomiaru raz jeszcze: Różne podejścia do szacowania niepewności Dane otrzymane z PT mogą stanowić podstawę do wiarygodnego oszacowania obciążenia, jeżeli spełnione są następujące warunki: badane obiekty powinny reprezentować rutynowe obiekty badań (np. rodzaj materiału i zakres wielkości mierzonej) wartości przypisane mają odpowiednie niepewności laboratorium dysponuje wynikami z co najmniej sześciu rund badań

32 Szacowanie obciążenia Aby upewnić się czy rzeczywiście występuje błąd systematyczny i ma istotne znaczenie, czy też można go zaniedbać, należy przeprowadzić porównanie dwóch serii pomiarowych wg Zapewnienie jakości analiz chemicznych, pod redakcją M. Dobeckiego, IMP Łódź 1997, p str. 78

33 Szacowanie obciążenia Wartość przypisana mediana x ia Wynik laboratorium x ib log mediany y ia =log x ia log wyniku laboratorium y ib =log x ib Bias (log) d i =y ia - y ib (d i -d śr ) ,146 2,223-0,077 0, ,146 2,167-0,021 0, ,146 2,255-0,109 0, ,713 2,863-0,150 0, ,713 2,826-0,113 0, ,713 2,819-0,106 0, ,713 2,851-0,138 0,00130 t=6,32 > t (0,05;6) =2,45

34 Szacowanie obciążenia Wartość testowa t jest większa od wartości krytycznej t (0,05;6) odczytanej z tablic, co wskazuje na istotne statystycznie (α=0,95) różnice pomiędzy seriami pomiarowymi czyli na istnienie błędu systematycznego Wyniki uzyskiwane w PT będą nadal monitorowane w celu oszacowania obciążenia