(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A01N 6/00 (09.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/29 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Ekstrakty roślinne do zastosowania jako fitochemikalia () Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /21 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/11 (73) Uprawniony z patentu: Indena S.p.A., Milano, IT (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FRANCOIS MAIREL, VOUVRAY, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Sławomir Kotara POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania wyciągów z nasion winogron (Vitis vinifera) jako środków do zwalczania chorób roślin powodowanych przez czynniki chorobotwórcze, w szczególności grzyby i lęgniowce, oraz zapobiegania im. Tło wynalazku 1 2 [0002] Znanych jest szereg chorób roślin powodowanych przez czynniki chorobotwórcze, na przykład grzyby, pleśnie, lęgniowce, bakterie i wirusy. Wiele z nich, zazwyczaj w związku z warunkami pogodowymi sprzyjającymi ich zapoczątkowaniu i rozprzestrzenianiu, ma dramatyczne skutki, powodując straty plonów roślin uprawnych, co może mieć znaczne, a niekiedy katastrofalne konsekwencje dla gospodarki rolnej, w szczególności jeśli choroba przybierze charakter epidemii. [0003] Ważnym historycznie przykładem choroby roślin, która miała niszczące konsekwencje, była zaraza ziemniaka (fitoftoroza) spowodowana przez Phytophthora infestans, co spowodowało wielką klęskę głodu w Irlandii w końcu lat 40. XIX wieku. [0004] Inny lęgniowiec, Plasmopara viticola, jest odpowiedzialny za mączniaka rzekomego winorośli, jedną z najczęściej występujących chorób, która powoduje ogromne szkody u producentów wina i hodowców winogron, wpływając ujemnie na plony, a także ich jakość. [000] Podobną chorobę winorośli, mączniaka prawdziwego winorośli, wywołuje grzyb Erysiphe necator, znany także pod nazwą Uncinula necator. [0006] Podobne zakażenia występują także u innych roślin, na przykład u soi, słonecznika, sałaty, pomidora, ziemniaka, dębu, roślin ozdobnych, owoców, tytoniu, dyniowatych. [0007] Pełną pracą przeglądową dotyczącą chorób roślin jest European Handbook of Plant Diseases, red. I.M. Smith i wsp., 1988, Blackwell Scientific Publications. [0008] Zaproponowano szereg środków naturalnych i syntetycznych służących do zwalczania powyższych chorób roślin i są one dostępne. [0009] Oprócz siarki oraz soli lub kompleksów miedzi, syntetyczne fungicydy do zastosowań agrochemicznych należą do bardzo szerokich i różnych klas związków chemicznych (fenyloamidy, pochodne benzimidazolu, dikarboksyimidy, karbaminiany, karbanilany, ditiokarbaminiany, dinitroaniliny itd.). Zastosowanie tych środków syntetycznych jest ograniczone wskutek dobrze znanego zjawiska oporności, a także

3 3 1 wskutek działania toksycznego, które te środki mogą powodować u ludzi i zwierząt, oraz wskutek możliwości zanieczyszczenia środowiska. [00] W związku z tym prowadzi się prace badawcze nad opracowaniem fungicydów bardziej przyjaznych dla środowiska, możliwie pochodzenia naturalnego, które mogłyby zastąpić znane fungicydy syntetyczne lub które można by co najmniej stosować w połączeniu z nimi, aby zmniejszyć zjawisko oporności i/lub ich wpływ na środowisko. [0011] Znanymi skutecznymi fungicydami jest szereg olejków, takich jak olejek eteryczny z cynamonu, olejek rozmarynowy i olej z miodli indyjskiej. [0012] US 6,174,9 ujawnia ponadto zastosowanie wosku z simondsji kalifornijskiej do zwalczania zakażeń mączniakiem prawdziwym. [0013] Ponadto w CA 2,3,014 podawano, że wyciąg z simondsji kalifornijskiej można stosować w zabiegach wstępnych do zapobiegania zakażeniom mączniakiem prawdziwym, zaś US 07/ ujawnia produkt do zapobiegania i/lub zwalczania zakażeń, otrzymywany przez częściowe lub całkowite zobojętnienie drożdżowego osadu winiarskiego po procesie winifikacji. [0014] WO 06/ ujawnia kompozycję grzybobójczą zawierającą bezwodny tłuszcz mleczny, ewentualnie w połączeniu z jednym lub większą liczbą spośród oleju sojowego, oliwy z oliwek i oleju kokosowego. Opis wynalazku 2 [001] Stwierdzono niedawno, że wyciągi z nasion Vitis vinifera lub wytłoki zawierające nasiona pozwalają skutecznie zwalczać czynniki chorobotwórcze roślin, w szczególności grzyby i lęgniowce. [0016] Z związku z tym wynalazek ujawnia zastosowanie kompozycji fitofarmaceutycznych zawierających wyciąg z nasion Vitis vinifera lub wytłoki zawierające nasiona jako składnik aktywny do zwalczania zakażeń roślin przez organizmy chorobotwórcze i/lub zapobiegania im. [0017] Wynalazek ma bardzo duże znaczenie dla gospodarki światowej, ponieważ w nowy sposób zwiększa wartość ponownego wykorzystania odpadów z wytwórni win przed innymi istniejącymi sposobami wykorzystywania jak odzyskiwanie oleju, destylacja, wytwarzania ciepła przez spalanie biomasy lub kompostowanie, które zawsze są możliwe po ekstrakcji. [0018] Kompozycje są użyteczne do zwalczania zakażeń roślin, w tym winorośli i innych

4 4 roślin uprawnych podatnych na zakażenie przez wspomniane czynniki chorobotwórcze, przez organizmy chorobotwórcze i/lub zapobiegania im. [0019] Wynalazek dotyczy ponadto sposobu zapobiegania lub zwalczania zakażeń roślin przez grzyby lub lęgniowce, obejmującego stosowanie skutecznej ilości wyciągu z nasion Vitis vinifera lub wytłoków zawierających nasiona na rośliny poddawane zabiegowi. [00] W badaniach doświadczalnych omówionych poniżej stwierdzono nadzwyczajną aktywność wyciągów z nasion Vitis vinifera przeciwko dwóm najczęściej występującym u winorośli czynnikom chorobotwórczym, mianowicie Plasmopara viticola i Erysphe necator. Należy jednak rozumieć, że wynalazek nie ogranicza się do zwalczania zakażeń winorośli przez tylko te dwa czynniki chorobotwórcze, ale ma zastosowanie do wielu innych grzybów i lęgniowców atakujących inne ważne rośliny. [0021] Poniżej podano listę przykładowych czynników chorobotwórczych atakujących ważne rośliny. 1 1 Oidium [0022] Erysiphe necator = Uncinula necator (winorośl) Erysiphe graminis (zboża) Podosphaera leucotricha (drzewa uprawne, drzewa owocowe) Sphaerotheca pannosa (róże) 2 Mączniak 2 [0023] Plasmopara viticola (winorośl) Plasmopara helianthi (słonecznik) Phytophthora infestans (ziemniak) Phytophthora parasitica (pomidor) 3 Parch drzew owocowych [0024] Venturia inaequalis (jabłoń) Venturia pirina (grusza) 4 Kędzierzawość liści brzoskwini

5 [002] Taphrina deformans Septorioza [0026] Septoria nodorum i Septoria tritici (zboża) Septoria sp. (rzepak) 6 Rdze [0027] Puccinia graminis, Puccinia recondita i Puccinia striiformis (zboża) 7 Głownie 1 [0028] Ustilago tritici (pszenica) Ustilago maydis (kukurydza) Ustilago hordei (jęczmień) 8 Śnieć [0029] Tilletia tritici, Tilletia caries i Tilletia foetida (zboża) 9 Zgnilizna obrączkowa 2 [00] Phoma lingam (krzyżowe, rzepak) Rhizoctonia solani (ziemniak) Sclerotinia sclerotiorum (pomidor) Antraknoza [0031] Colletotrichum gloeosporioides (groch) Colletotrichum lindemuthianum (fasola) 11 Szara pleśń

6 6 [0032] Botrytis cinerea (winorośl) 1 [0033] Szczególnie interesujące jest działanie wyciągów według wynalazku przeciwko czynnikom chorobotwórczym wymienionym w punktach 1, 2, 3, 4, 9, i 11. [0034] Przykładem innego czynnika chorobotwórczego, który można skutecznie zwalczać za pomocą wyciągu z Vitis vinifera, jest na przykład Phytophthora infestans, powodujący zakażenie wielu przedstawicieli Solanaceae, na przykład ziemniaka, pomidora i niektórych roślin ozdobnych. [003] Wyciągi z nasion Vitis vinifera lub wytłoki zawierające nasiona według wynalazku można otrzymywać na drodze ekstrakcji i oczyszczania nasion lub wytłoków zawierających nasiona, świeżych lub wysuszonych, za pomocą różnych rozpuszczalników, na przykład wody, acetonu, octanu etylu, etanolu, butanolu lub ich mieszanin, w różnych warunkach ekstrakcji i różnymi metodami. [0036] Wiele wyciągów jest znanych i dostępnych w handlu. Na przykład wyciąg z nasion winogron otrzymywany metodą ekstrakcji mieszaniną wody i etanolu ujawniono w WO 07/017037, WO 0/036988, EP [0037] Zastosowanie rozpuszczalników, takich jak woda i etanol, jest rzecz jasna korzystne z uwagi na ich niski koszt i małą toksyczność. Stwierdzono, że wyciąg, który szczególnie dobrze nadaje się do zastosowania według niniejszego wynalazku, można otrzymać sposobem obejmującym: 2 - ekstrakcję nasion winogron gorącą wodą; - usuwanie frakcji nierozpuszczalnej w wodzie; - oczyszczanie na kolumnie z żywicą adsorpcyjną; - zatężanie; - suszenie rozpryskowe. [0038] Wyciąg, który można otrzymać wspomnianym sposobem, ma zawartość katechiny i epikatechiny od do % (HPLC) i całkowitą zawartość polifenoli w zakresie od 90 do 1% (metoda spektrofotometryczna Folina-Ciocalteau). Wspomniany wyciąg jest nowy i stanowi kolejny przedmiot wynalazku. [0039] Wyciągi z nasion Vitis vinifera można stosować w postaci czystej, odpowiednio rozpuszczone lub zawieszone w nośniku odpowiednim do stosowania na rośliny, lub

7 7 1 można z nich otrzymywać preparaty w połączeniu z odpowiednimi substancjami pomocniczymi lub z innymi składnikami aktywnymi, np. ze znanymi fungicydami, związkami miedzi, olejami i podobnymi. [0040] Zawartość wyciągu z nasion V. vinifera w kompozycji może pozostawać w zakresie od do 2 g/litr, jednak zakres ten można zmieniać w zależności od wspomnianej kompozycji, zwalczanego czynnika chorobotwórczego, chronionej rośliny i metody stosowania. [0041] Kompozycję można podać roślinie dowolną odpowiednią metodą, na przykład przez opryskiwanie za pomocą konwencjonalnych urządzeń, przy czym zabieg można wykonywać co tydzień lub w odstępach czasu określonych przez hodowcę w zależności od szeregu czynników, na przykład warunków pogodowych, rozmiarów zakażenia, wirulencji organizmu powodującego zakażenie, stosowania innych fitochemikaliów i podobnych. [0042] Przykładowo, w przypadku zakażenia przez mączniaka rzekomego, wyciągiem z nasion Vitis vinifera opryskuje się zazwyczaj liście z wierzchu i od spodu w ilościach w zakresie od 0,1 do gramów na roślinę i na zabieg, co jeden do trzech tygodni, od wczesnej wiosny do późnego lata, nawet po zbiorach. Dokładna ilość zależy, rzecz jasna, od gęstości roślin, która jest wartością silnie zmienną i zależną od obszaru geograficznego i odmiany winorośli: na przykład 00 roślin/ha w Toskanii, około 700 roślin/ha w Szampanii oraz około 000 roślin/ha w Burgundii. Ponadto całkowita objętość roztworu gotowego do użycia do opryskiwania roślin może zmieniać się w zależności od produktu i metody: od 0 do 70 litrów/ha, co odpowiada g/l x 0 l/ha/000 roślin/ha = 0,1 g/roślinę maksymalnie do 2 g/l x 70 l/ha, co odpowiada 00 roślin/ha = 6,2 g/roślinę. [0043] Wynalazek opisano bardziej szczegółowo na podstawie następujących przykładów. 2 Przykład 1 Otrzymywanie wyciągu wodnego z nasion Vitis vinifera: VITIVAC [0044] 00 g wysuszonych nasion winogron zalewa się gorącą wodą o temperaturze 7 C. Umieszcza na 4 godziny w perkolatorze statycznym z płaszczem lub w reaktorze z płaszczem wyposażonym w mieszadło. [004] Następnie przez biomasę przepuszcza się gorącą wodę o temperaturze 7 C, przy czym odzyskany perkolat odprowadza się do uzyskania objętości całkowitej 7, litra. Najlepiej, jeśli przepływ przy perkolacji wynosi około 1 litra na godzinę. [0046] Całkowity odzyskany perkolat schładza się do C i przesącza przez filtr o wielkości oczek 0 mikronów, aby usunąć drobne cząstki.

8 8 1 [0047] Następnie roztwór wodny wprowadza się w sposób ciągły na kolumnę chromatograficzną zawierającą 1 litr żywicy Rhom and Haas AMBERLITE XAD 7HP lub równoważnej, poddanej wcześniej regeneracji i wypełnionej wodą. Mierzy się przewodnictwo wody wypływającej u dołu kolumny. [0048] Na końcu etapu wiązania żywicę przemywa się, najlepiej 4 litrami wody, a następnie przeprowadza elucję w sposób ciągły, najlepiej za pomocą 4 litrów 70% obj. etanolu i następnie ponownie przemywa 4 litrami wody. Mierzy się przewodnictwo wody wypływającej u dołu kolumny. [0049] Otrzymany roztwór etanolowy zbiera się, zatęża pod próżnią i przemywa wodą w celu usunięcia etanolu. [000] Roztwór zatęża się następnie pod próżnią i suszy rozpryskowo w temperaturze poniżej 8 C. [001] Otrzymany proszek miesza się, poddaje kontroli i pakuje w szczelne, nieprzezroczyste worki. [002] Standardowa wydajność wynosi 93 g i odpowiada wydajności względem materiału wyjściowego wynoszącej 9,% wag. Wydajność może być jednak inna w zależności od zastosowanej biomasy. [003] Zawartość katechiny (katechiny i epikatechiny) w tym produkcie oznaczona metodą HPLC wynosi 8,%, zaś całkowita zawartość polifenoli wynosi 98%. Przykład 2 Działanie grzybobójcze wyciągu z nasion Vitis vinifera: VITIVAC Rośliny 2 [004] W badaniu wpływu fungicydów na mączniaka rzekomego zastosowano Vitis vinifera odmiany Chardonnay. Rośliny hodowano z nasion (jedna roślina na 0,1-1 doniczki) oraz wstawiono do inkubatora (23 C w dzień/19 C w nocy, 0-1 μe.m -2.s -1, 16 h światła na dobę). Siewki zasilano nawozem dwa razy w tygodniu: 0,1 litra 0,2 g/l nawozu N-P-K (--). W badaniu aktywności biologicznej preparatu VITIVAC zastosowano siewki w wieku ośmiu tygodni mające co najmniej cztery w pełni rozwinięte liście. Czynnik chorobotwórczy

9 9 [00] Izolat Plasmopara viticola Pvl, otrzymany w 07 r. z zakażonych roślin w winnicy znajdującej się w Szampanii, Francja, nałożono na oddzielone liście odmiany Chardonnay, których powierzchnię odkażono. Liście umieszczono na płytkach Petriego i wstawiono do inkubatora (23 C w dzień/19 C w nocy, 0-1 μe.m -2.s -1, 16 h światła na dobę). Materiał inokulacyjny otrzymano ze świeżych liści, na których występowała sporulacja 8-12 dni po zaszczepieniu. Zarodnie zawieszono w wodzie destylowanej o temperaturze 4 C i za pomocą hemocytometru stężenie doprowadzono do wartości x zarodni.ml -1 wody. Stosowanie fungicydów 1 2 [006] Produkt naturalny otrzymany zgodnie z opisem w przykładzie 1 (VITIVAC) stosowano w dawce 2 g/l przez cały czas trwania doświadczeń. Skuteczność preparatu VITIVAC porównywano ze skutecznością mieszaniny fungicydów odniesienia Fosetyl-Al (00 g/kg) + Folpel ( g/kg) stosowanej w dawce 4,0 kg preparatu/ha (Mikal Flash WG, Bayer CropScience). [007] Liście odmiany Chardonnay po odkażeniu powierzchni umieszczono stroną odosiową do góry w plastikowych płytkach Petriego o średnicy 14 cm, przy czym każda zawierała bibułę filtracyjną zwilżoną 8 ml wody. Liście opryskano za pomocą spryskiwacza laboratoryjnego (Euro-Pulvé) wyposażonego w dyszę jednostożkową (Teejet XR 101 VS), przy czym ciśnienie powietrza wynosiło 2 bary. Preparaty grzybobójcze stosowano w objętości 400 i 7 l.ha -1 odpowiednio w przypadku Mikal Flash i VITIVAC. Każde badanie powtarzano 3-krotnie. Analizę statystyczną danych przeprowadzono za pomocą testu Newmana-Keulsa (XLS-Stat, Addinsoft). [008] Liście po zabiegu umieszczono pod nawiewem laminarnym na min w celu wysuszenia fungicydu naniesionego na stronę odosiową liści. Po wysuszeniu płytki Petriego zawierające liście poddane zabiegowi i niepoddane (kontrola) wstawiono do inkubatora (23 C w dzień/19 C w nocy, 0-1 μe.m -2.s -1, 16 h światła na dobę) na 24 godziny. Zaszczepianie za pomocą Plasmopara viticola [009] Dziesięć krążków liściowych (o średnicy mm każdy) wycięto za pomocą korkoboru z wszystkich liści poddanych zabiegowi i niepoddanych (kontrola) oraz

10 1 2 umieszczono stroną odosiową do góry w plastikowych płytkach Petriego o średnicy 9 cm, zawierających bibułę filtracyjną zwilżoną 4 ml jałowej wody destylowanej. Dyski zaszczepiono umieszczając jedną kroplę ( μl) materiału inokulacyjnego ( x zarodni.ml -1 ). Po zaszczepieniu płytki Petriego zawierające krążków liściowych inkubowano w 19 C przez 24 h w ciemności, a następnie wstawiono do inkubatora (23 C w dzień/19 C w nocy, 0-1 μe.m -2.s -1, 16 h światła na dobę), aby rozwinęła się choroba. Na koniec doświadczenia płytki Petriego trzymano w 19 C przez 24 h w ciemności, aby nastąpiła sporulacja. [0060] Dziesięć dni po zaszczepieniu dla każdego zestawu warunków wyznaczono liczbę krążków liściowych, na których rozwinął się mączniak rzekomy (częstość zakażenia). Następnie zmiany chorobowe wskutek mączniaka rzekomego, którym towarzyszyły białawe zarodnie, oceniano w skali 0-4, zgodnie z wcześniejszym opisem: Reuveni (Relationship between leaf age, peroxidase and b 1-3 glucanase activity and resistance to downy mildew in s, Journal of Phytopathology 146, 2-): 0, brak zmian; 1, 1- % powierzchni krążka liściowego zakażone i występowała sporulacja; 2, 11-2%; 3, 26-0% oraz 4, >0% (natężenie zakażenia). Oszacowano liczbę zarodni wytworzonych na krążkach liściowych. Zarodnie z krążków liściowych przemyto znaną objętością jałowej wody destylowanej zawierającej 0,01% środka Tween 80 i zliczono za pomocą hemocytometru (sześć zliczeń na krążków liściowych). Obliczono liczbę wytworzonych zarodni na centymetr kwadratowy powierzchni krążka liściowego (natężenie sporulacji). Doświadczenie przeprowadzono jednokrotnie, wykorzystując trzy płytki Petriego na każdy zabieg. Warunki zabiegu Częstość α zakażenia (skuteczność % Te) Plasmopara viticola (1) Obserwacje dni po zaszczepieniu Natężenie β zakażenia (skuteczność % Te) Natężenie sporulacji (liczba sporocyst/cm 2 ) (skuteczność % Te) Roztwór odniesienia 1 +/- 0 2,6 +/- 0 3,22. +/- 0,60. ITV1 0, +/- 0,1 (0%) 1,1 +/- 0,2 (8%) 0,7. +/- 0,. (77%) ITV2 0, +/- 0 (0%) 0,6 +/- 0,0 (7%) 1,21. +/- 0,03. (62%) Wyciąg według US 07/ ,7 +/- 0 (%) 1,4 +/- 0,1 (46%) 1,84. +/- 0,33. (43%) Lieboost 0,7 +/- 0,1 (%) 1,2 +/- 0,1 (2%) 1,07. +/- 0,14. (67%) VITIVAC 0 +/- 0 (0%) 0 +/- 0 (0%) 0 +/- 0 (0%) Mikal 0 +/- 0 (0%) 0 +/- 0 (0%) 0 +/- 0 (0%) α Częstość zakażenia: Liczba zanieczyszczonych zaszczepionych krążków / całkowita liczba krążków ().

11 11 β Natężenie zakażenia: Skala uznaniowa (od 0 do 4) odpowiadająca natężeniu zakażenia dla każdego krążka liściowego. [0061] Wyniki przedstawiono w tabeli. [0062] Podobne korzystne wyniki uzyskano w wyniku traktowania liści zakażonych przez Erysiphe necator. Postępowanie było zasadniczo identyczne, jednak zakażenie przez Erysiphe necator indukowano przez wytrząsanie zanieczyszczonych liści na płytkach Petriego. W tym przypadku okazało się, że postępowanie według wynalazku pozwala szczególnie skutecznie zmniejszyć natężenie sporulacji, określane jako liczba konidiów (P. viticola) na jednostkę powierzchni (cm 2 ). Zastrzeżenia patentowe Zastosowanie kompozycji fitofarmaceutycznych zawierających wyciąg z nasion Vitis vinifera lub wytłoki zawierające nasiona jako składnik aktywny do zwalczania zakażeń roślin przez organizmy chorobotwórcze i/lub zapobiegania im. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, przy czym wyciąg stanowi wyciąg wodno/etanolowy lub wodny. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, obejmujące ponadto inne składniki aktywne mające działanie grzybobójcze. 4. Sposób zapobiegania lub zwalczania zakażeń roślin przez grzyby lub lęgniowce, obejmujący stosowanie skutecznej ilości wyciągu z nasion Vitis vinifera na rośliny poddawane zabiegowi.. Sposób według zastrz. 4, przy czym rośliną jest Vitis vinifera. 6. Sposób według zastrz., przy czym czynnikiem chorobotwórczym jest Plasmopara viticola. Indena S.p.A. Pełnomocnik: