BIOFILM W KANAŁACH KORZENIOWYCH W ŚWIETLE PIŚMIENNICTWA BIOFILM FORMATION ON ROOT CANAL REVIEW

Transkrypt

1 ANNALES ACADEMIAE MEDICAE STETINENSIS ROCZNIKI POMORSKIEJ AKADEMII MEDYCZNEJ W SZCZECINIE 2008, 54, 1, PAULINA DĘBICKA, MARIUSZ LIPSKI, JADWIGA BUCZKOWSKA-RADLIŃSKA, MATYLDA TRUSEWICZ BIOFILM W KANAŁACH KORZENIOWYCH W ŚWIETLE PIŚMIENNICTWA BIOFILM FORMATION ON ROOT CANAL REVIEW Zakład Stomatologii Zachowawczej Katedry Stomatologii Zachowawczej i Periodontologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, Szczecin Kierownik: dr hab. n. med., prof. PAM Jadwiga Buczkowska-Radlińska Summary It seems likely that one of the reasons for failures in the endodontic treatment is the presence of biofilm in root canals. Biofilm bacteria have a slower metabolism and higher resistance and virulence due to phenotypic changes. The occurrence of biofilms has been reported both inside the canal and on the external root surface. The results of many studies suggest that biofilm may be associated with refractory periapical periodontitis and is often caused by the coronal leakage. K e y w o r d s: biofilm root canal. Streszczenie Jedną z wielu przyczyn niepowodzenia leczenia endodontycznego zębów wydaje się być obecność biofilmu w kanałach korzeniowych. Bakterie tworzące biofilm charakteryzują się zwolnionym metabolizmem i podlegają zmianom fenotypowym, które warunkują ich oporność i zjadliwość. W piśmiennictwie opisano występowanie biofilmu zarówno wewnątrz kanału, jak i na zewnętrznej powierzchni korzenia. Wyniki badań sugerują, że biofilm może być powiązany z refractory periapical periodontitis (przetrwałym zapaleniem tkanek okołowierzchołkowych) i często powstaje na skutek przecieku koronowego. H a s ł a: biofilm kanał korzeniowy. * Biofilmem określa się złożone skupisko bakterii przylegających do powierzchni lub do siebie nawzajem. Bakterie osadzone są w macierzy (matrix) zbudowanej z substancji zewnątrzkomórkowych [1, 2, 3]. W naturze większość bakterii żyje w bliskim połączeniu z powierzchniami, tworząc kompleks zwany błoną biologiczną, w której bakterie posiadają zupełnie inne właściwości niż ich odpowiednie formy planktoniczne [4]. Bakterie wolno występujące w środowisku wodnym, zwane mikroorganizmami planktonicznymi, są konieczne do formowania się biofilmów. Takie biofilmy mogą się tworzyć na jakiejkolwiek organicznej czy nieorganicznej powierzchni, w pobliżu której żyją mikroorganizmy planktoniczne w roztworze wodnym. Biofilm może być zbudowany z bakterii, grzybów, organizmów jednokomórkowych [5]. Badania biofilmu przeszły długą drogę. Wprowadzającą charakterystykę biofilmu zapoczątkował Antoni van Leewenhoek, który już w XVII w. badał płytkę bakteryjną pokrywającą własne zęby. Nazwa biofilm powstała w oparciu o makroskopowe obserwacje tej struktury, wyglądającej jak cienka warstwa śluzu. Ma on wyraźną architekturę składającą się z wieżo- i grzybokształtnych mikrokolonii zamkniętych w uwodnionej macierzy zbudowanej z zewnątrzkomórkowych substancji (polisacharydów i protein, które są produkowane przez mikroorganizmy znajdujące się w biofilmie) [6]. Pierwszym etapem powstania biofilmu jest przyleganie komórki bakteryjnej do powierzchni i zmniejszenie jej ruchliwości. Bakterie mogą przejściowo łączyć się ze sobą lub z powierzchnią stałą. Po wytworzeniu stałego połączenia z powierzchnią tworzą mikrokolonie poprzez podział oraz wytwarzają chemoatraktanty (związki organiczne lub nieorganiczne indukujące procesy chemotaksji dodatniej w komórkach posiadających zdolność do ruchu lub innej spolaryzowanej odpowiedzi na bodźce) i egzopolisacharydy. Biofilm to kompleks z trójwymiarowymi

2 BIOFILM W KANAŁACH KORZENIOWYCH W ŚWIETLE PIŚMIENNICTWA 153 strukturami złożonymi ze zgrupowań komórek bakterii, między którymi tworzą się kanały, a przez nie następuje wymiana substancji odżywczych i metabolitów bakteryjnych [2]. W tej strukturze międzykomórkowa komunikacja zachodzi przez substancje sygnałowe, które dyfundują z jednej komórki do drugiej [7]. Biofilm jest dynamicznym środowiskiem zorganizowanym optymalnie dla komórek w nim występujących [8]. Większa biomasa osiągana przez bakterie, które łączą się w grupy i kooperują przy rozkładzie cząstek używając uzupełniających się profili enzymów zewnątrzkomórkowych, powoduje to, że bakterie funkcjonujące razem są w stanie rozłożyć duże cząstki odżywcze, które nie mogłyby być rozłożone przez pojedynczą bakterię [5]. Drobnoustroje wchodzące w skład biofilmu wykazują różny poziom transkrypcji genów, a w zależności od fazy wzrostu wykazują zmienność fenotypową [2, 9]. Strukturalna adaptacja i wewnętrzna zależność w biofilmie może być odpowiedzialna za ekspresję genów, które w rezultacie zmieniają całkowicie fenotyp od form tych bakterii występujących w postaci planktonicznej [10]. Pewne gatunki bakterii wykazują nową, większą wirulencję oraz zwiększoną odporność na czynniki antybakteryjne w porównaniu z ich formami planktonicznymi. Rozważane są różne mechanizmy, które mogą to powodować, m.in. macierz biofilmu może oddziaływać jak filtr zatrzymujący działanie czynników przeciwbakteryjnych. Inną teorią jest spowolniony wzrost bakterii w biofilmie. Ogólnie wiadomo, że czynniki antybakteryjne nie działają tak skutecznie na biofilm jak na formy planktoniczne bakterii [3, 4, 11]. Jednogatunkowe lub wielogatunkowe biofilmy zbudowane z bakterii lub grzybów mogą być przyczyną wielu chorób, co przedstawiono w tabeli 1 [12]. W jamie ustnej mikroorganizmy występują również w postaci planktonicznej oraz biofilmów. Najlepiej poznanym i zbadanym jest biofilm zapoczątkowujący powstanie płytki nazębnej. W tym wypadku bakterie występujące w ślinie są głównym źródłem powstania tej specyficznej błony biologicznej [13]. Jama ustna jest głównym źródłem bakterii, które mogą kolonizować również kanały korzeniowe. Prawdopodobnie pierwszej identyfikacji struktur biofilmowych w zainfekowanych kanałach dokonał Nair [14], który zbadał 31 zębów z dużym zniszczeniem próchnicowym tkanek korony zęba i z zapaleniem tkanek okołowierzchołkowych. Zaobserwował on, że większa część mikroorganizmów funkcjonowała w postaci luźnych zbiorów ziarenkowców, pałeczek, bakterii nitkowatych i krętków zawieszonych w czymś, co uważał za wilgotną przestrzeń kanału oraz gęste zbiorowiska, które przyczepione były do zębiny i tworzyły różnej grubości warstwy bakterii. Biofilm występujący w kanałach korzeniowych zaobserwowali również inni badacze, posługując się elektronowym mikroskopem skaningowym. Molven i wsp. [15] zbadali w elektronowym mikroskopie skaningowym (scanning electron microscopy SEM) wierzchołki korzeni zębów z zapaleniem tkanek okołowierzchołkowych. Zaobserwowali wewnątrz kanałów ziarenkowce, pałeczki, bakterie nitkowate oraz krętki. Formy nitkowate i ziarenkowce tworzyły charakterystyczne kolby kukurydzy (corn-cob), znane przede wszystkim z występowania w płytce nazębnej. W badaniu Tronstada i wsp. [16] oglądano w SEM powierzchnie wierzchołków korzeni zębów usuniętych podczas zabiegu resekcji. Stwierdzono, że powierzchnia korzenia w okolicy otworu wierzchołkowego pokryta była nieprzerwaną, gładką, amorficzną warstwą. Warstwa ta występowała w zagłębieniach na powierzchni korzenia. Bakterie występowały w skupiskach w substancji zewnątrzkomórkowej. Rozpoznano ziarenkowce, pałeczki oraz formy nitkowate z ziarenkowcami przyczepionymi do ich powierzchni. Siqueira i Lopes [17] zbadali 27 usuniętych zębów z przewlekłymi zmianami zapalnymi w przyzębiu okołowierzchołkowym. W SEM stwierdzono występowanie bakterii w kanałach korzeniowych (tylko w jednym przypadku bakterie występowały poza kanałem). Morfologicznie były to ziarenkowce i pałeczki; rozpoznano również charakterystyczne kolby kukurydzy. W pierwotnych infekcjach endodontycznych agregacje bakterii mogą również zachodzić na zewnętrznej powierzchni korzenia, w okolicy otworu wierzchołkowego. Lomçali i wsp. [18] badali zewnętrzną powierzchnię wierzchołków zębów z przewlekłymi zapaleniami tkanek okołowierzchołkowych. Obserwacje w SEM wierzchołków korzeni zębów wykazały obecność stref resorpcji na ich powierzchniach, a także warstwy bakterii różnej grubości występujące w okolicy otworu wierzchołkowego i w miejscu resorpcji. Bakterie znajdowały się w gładkiej, pozbawionej struktury substancji. Nie określono typów bakterii w niej się znajdujących, natomiast zidentyfikowano w tym badaniu znajdujące się na tych powierzchniach komórki drożdży. Uznano, że ten gładki bezstrukturalny materiał wraz z mikroorganizmami w nim się znajdującymi może stanowić ważny czynnik podtrzymujący stan zapalny tkanek okołowierzchołkowych. Sen i wsp. [19] zbadali nieleczone zęby z zapaleniem tkanek okołowierzchołkowych. Z użyciem SEM zidentyfikowali ziarniaki i pałeczki, które penetrowały kanaliki zębinowe na głębokość mikrometrów. W kilku przypadkach stwierdzono infekcję drożdżakami. Należy również przytoczyć badania Ferreiry i wsp. [20], którzy badali przypadek ponownie leczonego zęba przedtrzonowego w szczęce z przetoką i zapaleniem tkanek okołowierzchołkowych. Ząb był leczony w przeciągu około jednego roku metodą wielowizytową. W trakcie leczenia nie uzyskano poprawy, więc zakwalifikowano go do resekcji wierzchołka i wypełnienia wstecznego kanału. Część zresekowana korzenia została zbadana w SEM. Stwierdzono występowanie bakterii i grzybów. Nie zauważono jednak, by tworzyły one biofilm. Każda z bakterii znajdujących się w jamie ustnej może zainfekować kanały korzeniowe. Jednak istnieje duża różnica pomiędzy potencjalną a faktycznie wykrytą w kanałach korzeniowych florą bakteryjną. Przyczyną tego jest specyficzność środowiska wewnątrzkanałowego, w którym selekcja

3 154 PAULINA DĘBICKA, MARIUSZ LIPSKI, JADWIGA BUCZKOWSKA-RADLIŃSKA, MATYLDA TRUSEWICZ Infekcja lub choroba Infection or disease Próchnica zębów Dental caries Zapalenie tkanek okołowierzchołkowych Periodontitis apicalis Zapalenie ucha środkowego Otitis media Infekcje układu mięśniowo-szkieletowego Musculoskeletal infections Martwicze zapalenie powięzi Necrotizing fasciitis Infekcja dróg żółciowych Biliary tract infection Zapalenie szpiku Osteomyelitis Bakteryjne zapalenie prostaty Bacterial prostatitis Infekcyjne zapalenie wsierdzia w obrębie zastawki własnej Native valve endocarditis Zapalenie płuc w przebiegu mukowiscydozy Cystic fibrosis pneumonia OIOM zapalenie płuc ICU pneumonia Szwy Sutures Wrota wejścia, np. wkłucie Exit sites Przeciek tętniczo-żylny Arteriovenous shunts Szkła kontaktowe Contact lenses Zapalenia pęcherza moczowego po cewnikowaniu Urinary catheter cystitis Zapalenie otrzewnej po dializach otrzewnowych Peritoneal dialysis (CAPD) peritonitis Dotchawicza rurka Endotracheal tube Cewnik Hickmana Hickman catheters Cewniki do wkłucia centralnego żylnego Central venous catheters Mechaniczna proteza zastawki Mechanical heart valves Pomost naczyniowy Vascular grafts Zatkanie stentu w drogach żółciowych Biliary stent blockage Ortopedyczne urządzenia Orthopedic devices Proteza prącia Penile prostheses T a b e l a 1. Częściowa lista infekcji ludzkich związana z biofilmem T a b l e 1. Partial list of human infections involving biofilms Gatunki bakterii powszechnie występujące w biofilmie Common biofilm bacterial species Kwasotwórcze Gram-dodatnie ziarenkowce (np. Streptococcus) Acidogenic Gram-positive cocci (e.g., Streptococcus) Gram-ujemne beztlenowce jamy ustnej Gram-negative anaerobic oral bacteria Nietypowe gatunki Haemophilus influenzae Nontypable strains of Haemophilus influenzae Gram-dodatnie ziarniaki (np. staphylococci) Gram-positive cocci (e.g., staphylococci) Streptokoki grupy A Group A streptococci Bakterie jelitowe (np. Escherichia coli) Enteric bacteria (e.g., Escherichia coli) Różne bakterie i grzyby często wymieszane Various bacterial and fungal species often mixed E coli i inne Gram-ujemne bakterie E. coli and other Gram-negative bacteria Paciorkowce zieleniejące Viridans group streptococci P. aeruginosa i Burkholderia cepacia P. aeruginosa and Burkholderia cepacia Zakażenia szpitalne / Nosocomial infections Gram-ujemne pałeczki Gram-negative rods Staphylococcus epidermidis i S. aureus Staphylococcus epidermidis and S. aureus S. epidermidis i S. aureus S. epidermidis and S. aureus S. epidermidis i S. aureus S. epidermidis and S. aureus P. aeruginosa i Gram-dodatnie ziarenkowce P. aeruginosa and Gram-positive coci E. coli i inne Gram-ujemne pałeczki E. coli and other Gram-negative rods Różnorodne bakterie i grzyby A variety of bacteria and fungi Różnorodne bakterie i grzyby A variety of bacteria and fungi S. epidermidis i C. albicans S. epidermidis and C. albicans S. epidermidis i inne S. epidermidis and other Gram-dodatnie ziarniaki Gram-positive cocci Różnorodne bakterie jelitowe i grzyby A variety of enteric bacteria and fungi

4 BIOFILM W KANAŁACH KORZENIOWYCH W ŚWIETLE PIŚMIENNICTWA 155 biologiczna determinuje przebieg i typ infekcji. Czynniki decydujące o składzie mikrobiologicznym w tym przypadku, to: brak tlenu w środowisku, dostępność pożywienia, interakcje między mikroorganizmami. Badania nad dynamiką infekcji kanału korzeniowego wykazują wzrost w trakcie trwania infekcji organizmów beztlenowych, a spadek fakultatywnych beztlenowców. Tlen i produkty tlenowe odgrywają istotną rolę jako determinanty w rozwoju flory bakteryjnej. Składniki odżywcze mogą być dostarczane z jamy ustnej, ze zdegenerowanej tkanki łącznej, z kanalików zębinowych lub płynu z tkanek okołowierzchołkowych (serum) [21]. Na dostępność składników odżywczych oraz napływ drobnoustrojów ma wpływ przeciek koronowy. Tak więc droga prowadząca do powstania przecieku koronowego (złamanie odbudowy zęba, nieszczelne wypełnienie lub korona) może udostępnić substancje odżywcze, które pomagają odżyć uśpionym organizmom w niewypełnionych przestrzeniach kanałów, ale również wprowadzić nowe organizmy. W ten sposób można również tłumaczyć nawrót zmian zapalnych po leczeniu endodontycznym zaostrzenie zmian ( flare-up lesion). George i Kishen [22] na podstawie przeprowadzonych badań wysnuli wniosek dotyczący przecieku koronowego śliny, który może odgrywać ważną rolę w przyczepianiu i formowaniu się biofilmu w kanałach korzeniowych oraz w dostarczeniu nowych substancji odżywczych dla mikroorganizmów przetrwałych w kanałach. Badania przeprowadzone przez Barrieshiego i wsp. [23] wykazały, że zęby z zamkniętymi kanałami korzeniowymi narażone na działanie beztlenowców są przez nie kolonizowane. Obserwacje w SEM wykazały obecność heterogennego biofilmu z ziarenkowców i pałeczek kolonizujących część wierzchołkową korzeni oraz ściany kanałów korzeniowych. Na tej podstawie można wysnuć wnioski dotyczące możliwości penetracji bakterii również przez wypełnienia kanałów, w tym także gutaperkę. Zostało to potwierdzone w najnowszych badaniach Ferk Luketić i wsp. [24], którzy przebadali 108 zębów wypełnionych różnymi metodami i różnymi materiałami oraz poddanych inokulacji mieszaniną bakterii Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Lactobacilus, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis. Pomimo zastosowania nowoczesnych metod i materiałów do zamknięcia kanałów, autorzy zaobserwowali przeciek bakteryjny w obrębie wypełnień kanałów korzeniowych. Podobne badania dotyczące przecieku bakteryjnego prowadzone były również przez Brosco i wsp. [25]. Nieprawidłowe leczenie endodontyczne polegające na wprowadzeniu narzędzi poza otwór wierzchołkowy korzenia (overinstrumentation) może mieć swoje następstwa w powstawaniu biofilmu na zewnętrznej powierzchni korzenia zęba. Przepchnięcie zawartości zainfekowanego kanału poza otwór wierzchołkowy badali Gutiérrez i wsp. [26], porównując zęby z zainfekowanymi kanałami z zębami, w których była żywa miazga. W obu grupach wykonano leczenie endodontyczne, przechodząc poza wierzchołek, i tylko w grupie zębów z zainfekowanymi kanałami wykryto bakterie w okolicy otworu wierzchołkowego. Zatem błędne opracowanie kanału przenosi infekcję na zewnętrzną powierzchnią korzenia, co może dać początek tworzeniu się biofilmu na tej powierzchni. Powstanie rany tkanek okolicy wierzchołkowej na skutek błędnego opracowania powoduje wytwarzanie wysięku zapalnego, który może doprowadzić do wzrostu bakterii proteolitycznych, dostarczając składników odżywczych mikroorganizmom, które mogły przetrwać proces leczenia endodontycznego. Jak wykazano w badaniach Furusawy i Asai [27], znaczne poszerzenie otworu wierzchołkowego dotyczyło 80% badanych przypadków. Może to być przyczyną powstania resorpcji wierzchołka oraz zmiany przebiegu infekcji, za które jest odpowiedzialny bezpośredni kontakt mikrobów przeniesionych z zainfekowanych kanałów i zakażenie tkanek okołowierzchołkowych. Biofilmowy model wzrostu bakterii jest strategią do przetrwania w ciężkich warunkach. Potwierdzeniem tego jest m.in. badanie przeprowadzone przez Distela i wsp. [28], które wykazało kolonizacje bakteryjną Enterococcus faecalis kanałów korzeniowych leczonych wodorotlenkiem wapnia. Odkryto również charakterystyczne dla tej bakterii grzybokształtne formy biofilmu w zębach po leczeniu wodorotlenkiem wapnia. Oporność bakterii występujących w biofilmie w kanale korzeniowym wykazali także Ozok i wsp. [29]. Mieszany biofilm z Fusobacterium nucleatum i Peptostreptococcus (micromonas) micros cechuje się znacznie większą opornością na działanie podchlorynu sodu niż biofilmy jednogatunkowe badanych bakterii (badania in vitro). Zastosowanie nowoczesnych technik badawczych pozwala na lepsze zrozumienie istoty biofilmu oraz pokazuje potrzebę nowoczesnego podejścia do leczenia endodontycznego, którego głównym celem jest eliminacja mikroorganizmów z kanałów korzeniowych. Piśmiennictwo 1. Beyenal H., Lewandowski Z., Harkin G.: Quantifying biofilm structure: facts and fiction. Biofouling. 2004, 20, 1, Stańkowska D., Kaca W.: Systemy komunikacji międzykomórkowej bakterii gram-ujemnych i ich znaczenie w ekspresji cech fenotypowych. Post. Mikrob. 2005, 44, 2, Donlan R.M., Costerton J.W.: Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15, 2, Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D., Korber D., Lappin-Scott H.M.: Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 1995, 49, Svensäter G., Bergenholtz G.: Biofilms in endodontic infections. Endod. Topics, 2004, 9, Sauer K.: The genomics and proteomics of biofilm formation. Genome Biol. 2003, 4, 6, Lawrence J.R., Korber D.R., Hoyle B.D., Costerton J.W., Caldwell D.E.: Optical sectioning of microbial biofilms. J. Bacteriol. 1991, 173, 20, Sutherland I.W.: The biofilm matrix an immobilized but dynamic microbial environment. Trends Microbiol. 2001, 9, 5, Kolenbrander P.E.: Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 2000, 54,

5 156 PAULINA DĘBICKA, MARIUSZ LIPSKI, JADWIGA BUCZKOWSKA-RADLIŃSKA, MATYLDA TRUSEWICZ 10. Stoodley P., Sauer K., Davies D.G., Costerton J.W.: Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol. 2002, 56, Donlan R.M.: Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO J. 2000, 46, 6, Erratum in: ASAIO J. 2001, 47, 1, Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P.: Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, 1999, 284, 5418, Bowden G.H., Hamilton I.R.: Survival of oral bacteria. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1998, 9, 1, Nair P.N.R.: Light and electron microscopic studies of root canal flora and periapical lesions. J. Endod. 1987, 13, 1, Molven O., Olsen I., Kerekes K.: Scanning electron microscopy of bacteria in the apical part of root canals in permanent teeth with periapical lesions. Endod. Dent. Traumatol. 1991, 7, 5, Tronstad L., Barnett F., Cervone F.: Periapical bacterial plaque in teeth refractory to endodontic treatment. Endod. Dent. Traumatol. 1990, 6, 2, Siqueira J.F. Jr., Lopes H.P.: Bacteria on the apical root surfaces of untreated teeth with periradicular lesions: a scanning electron microscopy study. Int. Endod. J. 2001, 34, 3, Lomçali G., Sen B.H., Cankaya H.: Scanning electron microscopic observations of apical root surfaces of teeth with apical periodontitis. Endod. Dent. Traumatol. 1996, 12, 2, Sen B.H., Piskin B., Demirci T.: Observation of bacteria and fungi in infected root canals and dentinal tubules by SEM. Endod. Dent. Traumatol. 1995, 11, 1, Ferreira F.B., Ferreira A.L., Gomes B.P., Souza-Filho F.J.: Resolution of persistent periapical infection by endodontic surgery. Int. Endod. J. 2004, 37, 1, Figdor D., Sundqvist G.: A big role for the very small understanding the endodontic microbial flora. Aust. Dent. J. 2007, 52, George S., Kishen A.: Effect of tissue fluids on hydrophobicity and adherence of Enterococcus faecalis to dentin. J. Endod. 2007, 33, 12, Barrieshi K.M., Walton R.E., Johnson W.T., Drake D.R.: Coronal leakage of mixed anaerobic bacteria after obturation and post space preparation. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 1997, 84, 3, Ferk Luketić S., Malcić A., Jukić S., Anić I., Segović S., Kalenić S.: Coronal microleakage of two root-end filling materials using a polymicrobial marker. J. Endod. 2008, 34, 2, Brosco V.H., Bernardineli N., Torres S.A., Consolaro A., Bramante C.M., de Moraes I.G. et al.: Bacterial leakage in root canals obturated by different techniques. Part 1: microbiologic evaluation. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 2008, 105, 1, Gutiérrez J.H., Brizuela C., Villota E.: Human teeth with periapical pathosis after overinstrumentation and overfilling of the root canals: a scanning electron microscopic study. Int. Endod. J. 1999, 32, 1, Furusawa M., Asai Y.: SEM observations of resected root canal ends following apicoectomy. Bull. Tokyo Dent. Coll. 2002, 43, 1, Distel J.W., Hatton J.F., Gillespie M.J.: Biofilm formation in medicated root canals. J. Endod. 2002, 28, 10, Ozok A.R., Wu M.K., Luppens S.B., Wesselink P.R.: Comparison of growth and susceptibility to sodium hypochlorite of mono- and dual- -species biofilms of Fusobacterium nucleatum and Peptostreptococcus (micromonas) micros. J. Endod. 2007, 33, 7,