BIOKATALIZATORY I ICH ZASTOSOWANIE W PRZEMYŚLE BIOKATALITYCZNA INWERSJA SACHAROZY W PRZEPŁYWOWYCH REAKTORACH KOLUMNOWYCH

Transkrypt

1 ĆWICZNI 29. BIOKATALIZATORY I ICH ZATOOWANI W PRZMYŚL ĆWICZNI 30. BIOKATALITYCZNA INWRJA ACHAROZY W PRZPŁYWOWYCH RAKTORACH KOLUMNOWYCH OOBY PROWADZĄC: mgr inż. Katarzyna Jodo (po.34, onsultacje: środy , czwarti ) dr hab. Grzegorz Litwinieno (po. 32, onsultacje: środy , czwarti ) LITRATURA:. Atins, P. W. Równowaga chemiczna. W: Chemia fizyczna. PWN 2007, Atins, P. W. zybość reacji chemicznych. W: Chemia fizyczna. PWN 2007, Berg, J. M., Tymoczo, J. L. i L. tryer. nzymy. Podstawowe pojęcia i inetya. W: Biochemia. PWN 2007, Ishiawa, T., Karnowsa, A., Lilpop, J. i J. Urbańsi. łodi świat enzymów. zoła Festiwalu Naui (materiały dostępne na stronie: 5. Walory, J., Pilare, M., Kalinowsa, M. i H. Jaworowsa-Deptuch. Kinetya reacji enzymatycznej. W: Biochemia. Ćwiczenia laboratoryjne. Oficyna Wydawnicza PW 2003, Adamcza, M. Bioataliza i jej zastosowanie. W: Podstawy biotechnologii przemysłowej. Red. W. Bednarsi i J. Fiedure. WNT 2007, Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., i V. Rodwell. rozdz. I.8-I. w: Biochemia Harpera, Wydawnictwo Learsie PZWL Warszawa 995, str Malepszy,. Zabiegi technologiczne zwięszające producję metabolitów wtórnych. W: Biotechnologia roślin. PWN 200,

2 Wymagania do ćwiczeń:. Definicje: szybość / rzędowość / cząsteczowość / stała równowagi reacji chemicznej, równanie Arrheniusa, reguła van t Hoffa, energia atywacji, ataliza homogeniczna i heterogeniczna (przyłady), opis oddziaływań atalizatora z substratem, bioataliza, bioatalizator, enzym, rybozym, ofator, enzymy allosteryczne, teoria omplesu atywnego. 2. Właściwości enzymów / bioatalizatorów: atywność, wydajność syntezy produtu, liczba obrotów enzymu, seletywność substratowa i typu reacji. 3. Mechanizm działania enzymów: modele opisujące działanie enzymów, lasyfiacja enzymów. 4. Kinetya Michaelisa-Menten założenia i wyprowadzenie równania, sens fizyczny stałych obecnych w równaniu, możliwe uproszczenia, sposób wyznaczania parametrów charateryzujących enzym. 5. Regulacja reacji enzymatycznych: inhibicja ompetytywna i nieompetytywna, wpływ parametrów intensywnych na szybość reacji enzymatycznej. 6. Technii instrumentalnej analizy ilościowej (spetrosopia UV-Vis, prawo Lamberta- Beera, sporządzanie rzywej wzorcowej, przeliczanie stężeń). 7. Dodatowo studenci są proszeni o wybranie dowolnego enzymu i samodzielne (pisemne!) opracowanie jego charaterystyi w oparciu o dostępne bazy literaturowe. Opracowanie to powinno obejmować numer wg lasyfiacji.c., typ atalizowanej reacji, znaczenie atalizowanego procesu w organizmie, strutura centrum atywnego (wraz z ofatorem, jeżeli występuje), ewentualne inhibitory i mechanizm ich działania. Postuluje się, żeby studenci z jednej grupy wybierali różne enzymy do scharateryzowania. 2

3 Poniższy wstęp załada znajomość podstawowych definicji i pojęć inetyi chemicznej, z tórymi student zapoznał się podczas ursu chemii fizycznej. Ponadto, studenci są proszeni o zapoznanie się z materiałem dotyczącym enzymów prezentowanym na wyładzie lementy Biotechnologii (Wyłady nr 3-5). I. BIOKATALIZA Procesy biochemiczne, przebiegające w organizmach żywych, są ontrolowane przez bioatalizatory naturalnie występujące cząsteczi przyspieszające bądź hamujące przebieg reacji, do tórych zaliczamy enzymy, hormony i witaminy (często pełniące funcję oenzymów). W analogii do procesów przebiegających in vivo, podejmowane są próby przemysłowego wyorzystania materiału biologicznego do wydajnego prowadzenia reacji chemicznych. Zabieg tai oreśla się mianem bioatalizy, a zachodzącą pod wpływem materiału biologicznego reację biotransformacją lub bioonwersją. Rolę bioatalizatora w procesach przemysłowych mogą pełnić całe omóri (w formie zawiesiny lub immobilizowane), estrat omórowy lub enzymy o różnym stopniu oczyszczenia, wolne lub immobilizowane. Zastosowanie hormonów (zaliczanych do naturalnych bioatalizatorów) do przemysłowego prowadzenia reacji chemicznych nie jest możliwe, gdyż regulują one procesy zachodzące w omórce tylo za pośrednictwem specyficznych receptorów, obecnych we wnętrzu omóre lub umieszczonych śródbłonowo. Bioatalizatory stosowane są w przemyśle na coraz więsza salę - obecnie już ooło 30 procesów z użyciem enzymów lub omóre miroorganizmów zostało opracowanych dla sali producji przewyższającej 00 g. nzymy znajdują zastosowanie głównie w przemyśle spożywczym (przemysł piearniczy, browarnictwo, gorzelnictwo, mleczarstwo, przemysł mięsny), przy producji detergentów (biodetergentów), w przemyśle papierniczym oraz w medycynie (w tym w diagnostyce genetycznej). II. NZYMY nzymy to związi wielocząsteczowe wyazujące właściwości atalityczne, umożliwiające prawidłowe tempo przemian metabolicznych w organizmach żywych i wirusach. Wyazano wpływ enzymów na przebieg wszystich szlaów anabolicznych i atabolicznych w omórce. Przyładowo, fundamentalna w procesach oddychania omórowego i oddychania płucnego reacja: CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 () 3

4 przebiega 0 7 razy szybciej w obecności enzymu anhydrazy węglanowej. Działanie enzymu umożliwia więc wydajne usunięcie dwutlenu węgla, tóry powstaje w procesach metabolicznych poprzez rozpuszczenie go we rwi, a następnie uwolnienie go z rwi do wnętrza pęcherzyów płucnych. Śmiało możemy więc powiedzieć, że atywność atalityczna anhydrazy węglanowej warunuje efetywną wymianę gazową. II.. Budowa enzymów II... Rybozymy jao pozostałość świata RNA Niemal wszystie enzymy są białami. Jedna w świecie RNA (hipotetycznym, wczesnym etapie rozwoju życia na Ziemi) rolę atalizatorów prawdopodobnie pełniły cząsteczi wasu rybonuleinowego (RNA). W latach 80., Thomas Cech i idney Altman niezależnie odryli cząsteczi RNA wyazujące atywność atalityczną - rybozymy (za co w 989 rou otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii). Cech udowodnił, że proces splicingu RNA u jednoomórowego orzęsa Tetrahymena thermophila polega na autoatalitycznym wycinaniu intronów. Katalityczne właściwości RNA wyniają ze zdolności przyjmowania przez te cząsteczi sompliowanych strutur, umożliwiających idealne przestrzenne dopasowanie do siebie enzymu i substratu atalizowanej reacji. Obecnie wiemy, że rybozymy występują w omórach wszystich organizmów i uczestniczą przede wszystim w mechanizmach syntezy białe (na przyład rrna, wchodzący w sład rybosomów, atalizuje reację tworzenia wiązań peptydowych miedzy aminowasami). Odrycie cząstecze RNA o właściwościach atalitycznych potwierdza przedstawioną wyżej hipotezę świata RNA. Należy w tym miejscu podreślić, że w świecie RNA was rybonuleinowy obo funcji atalitycznej, pełnił też rolę nośnia informacji genetycznej, czego pozostałością we współczesnym świecie są retrowirusy (w tym wirus HIV). Postuluje się, że cząsteczę, tóra jest jednocześnie nośniiem informacji i atalizuje swoje własne przemiany, można uznać za pierwszą, nieomórową formę życia na Ziemi. II..2. nzymy białowe Ja już wspomniano, podstawową rolą enzymów w organizmie jest atalizowanie przebiegu ściśle oreślonych reacji metabolicznych. Wobec tego, najbardziej istotnymi właściwościami enzymów, warunującymi prawidłowe pełnienie przez te cząsteczi swojej funcji, będą siła atalityczna (atywność) i seletywność (specyficzność). Porównywanie atywności różnych enzymów stało się możliwe po wprowadzeniu przez Międzynarodową Unię Biochemiczną międzynarodowej jednosti standardowej U. Jest to ilość enzymu, tóra atalizuje przemianę µmola substratu w czasie minuty w temperaturze 30ºC, 4

5 w odpowiednim dla danego enzymu ph i przy optymalnym stężeniu substratu. Wyrażana jest w µmol/min. Inne jednosti atywności, tóre wciąż używane są w analizach biochemicznych to: atywność właściwa, atywność moleularna (inaczej liczba obrotów enzymu) i atal. eletywność enzymu dotyczy zarówno atalizowanej reacji (seletywność typu reacji) ja i substratów biorących w niej udział (seletywność substratowa). eletywność substratowa enzymu polega na wybraniu spośród wielu podobnych substancji tylo tej właściwej, tóra będzie podlegała procesowi enzymatycznemu. Ten typ seletywności jest efetem precyzyjnego dopasowania trójwymiarowej strutury enzymu do cząsteczi substratu. Łańcuch polipeptydowy zbudowany z dwudziestu różnych aminowasów zapewnia więszą seletywność niż cząstecza wasu nuleinowego, tóra jest ombinacją tylo czterech typów nuleotydów. Z powodu więszej różnorodności białe, to właśnie te biocząsteczi stanowią główny materiał z tórego zbudowana jest więszość znanych enzymów. eletywność typu reacji oznacza, że spośród wielu możliwych reacji, jaim ulegać może substrat, enzym atalizuje tylo jeden, ściśle oreślony proces. fetem seletywności enzymu jest właściwie bra zachodzenia reacji ubocznych. Wiele enzymów jest atywnych (albo wyazuje podwyższoną atywność) tylo w obecności niebiałowych cząstecze ofatorów. W przypadu tych enzymów, ich białową część oreślamy mianem apoenzymu, a tworzony atywny omples (apoenzym + ofator) holoenzymem. W roli ofatorów mogą występować cząsteczi nieorganiczne, jony metali, lub małocząsteczowe związi organiczne. W oparciu o chemiczny charater ofatora i moc wiązania, tóre tworzy z białową częścią enzymu, w nietórych opracowaniach ofatory podzielono na dwie grupy: - oenzymy, małe cząsteczi organiczne, tóre w sposób specyficzny łączą się z apoenzymem; często są wiązane tylo na czas reacji i uwalniane wraz z jej produtami. - grupy prostetyczne są silnie (często owalencyjnie) związane z apoenzymem; w tej roli mogą występować jony metali, małe cząsteczi nieorganiczne bądź organiczne. Reacja atalityczna zachodzi w miejscu atywnym enzymu, czyli w obszarze wiązania substratu i ewentualnych ofatorów. W enzymach białowych miejsce atywne słada się z reszt aminowasowych, zwanych grupami atalitycznymi enzymu, tóre biorą bezpośredni udział w zachodzącej reacji. Miejsce atywne enzymu jest często opisywane jao szczelina w struturze enzymu, w tórą wpasowują się substraty biorące udział w reacji. Pełni ono dwojaą funcję: selecjonuje cząsteczi, tóre mogą brać udział w reacji, a ponadto umożliwia właściwe ułożenie reagenta / reagentów względem siebie. 5

6 Miejsce atywne często jest tworzone przez reszty aminowasowe oddalone od siebie w sewencji aminowasowej dopiero przybranie przez biało odpowiednio zwiniętej trzeciorzędowej strutury powoduje zbliżenie tych reszt do siebie i utworzenie miejsca atywnego. Ponadto, miejsce atywne przeważnie zajmuje jedynie małą część w struturze cząsteczi enzymu gdy jedna weźmiemy pod uwagę, ja odległe aminowasy biorą udział w jego tworzeniu, jasne stanie się, że reszta cząsteczi jest niezbędna do przyjęcia przez enzym właściwej strutury, pełniąc rolę rusztowania dla miejsca atywnego. Za wiązanie substratu w miejscu atywnym, w zależności od chemicznego charateru substratu i reszt aminowasowych tworzących miejsce atywne, odpowiedzialne mogą być: oddziaływania eletrostatyczne i hydrofobowe, wiązania wodorowe oraz siły van der Waalsa. II.2. Modele ilustrujące działanie enzymów nzymy w sposób wysoce specyficzny wiążą substraty reacji i ustawiają je w odpowiedniej onformacji przestrzennej, sprzyjającej zajściu atalizowanego procesu. W 890 rou Hermann mil Fischer podjął próbę opisania zjawisa specyficzności substratowej enzymów przy użyciu modelu zama i lucza. Zgodnie z założeniami modelu, enzym (a doładniej jego miejsce atywne) i substrat dosonale odpowiadają sobie przestrzennie. To dopasowanie jest waruniem, po pierwsze, wzajemnego rozpoznania substratu i enzymu, a następnie - zajścia atalizowanej reacji. Według modelu zama i lucza (ang. loc and ey model Rysune a), specyficzność substratowa enzymu zależy od precyzyjnego ułożenia atomów w miejscu atywnym, tóre oddziałują z przylegającą do nich cząsteczą substratu. Obecnie wiemy, że postulowany przez Fischera model nie tłumaczy w sposób właściwy zachodzącego procesu. Dopasowanie przestrzenne, zgodne z modelem zama i lucza uniemożliwiałoby bowiem efetywne obniżenie energii atywacji zachodzącej reacji (czyli w zasadzie bloowałoby działanie enzymu, patrz rozdział II.3). Zgodnie z olejnym modelem, zaproponowanym w 958 przez Daniela. Koshlanda Juniora 2, strutury przestrzenne miejsca atywnego i substratu wyazują względem siebie powinowactwo (umożliwiające ich wzajemne rozpoznanie), ale dopiero podczas wiązania substratu, ształt miejsca atywnego nieznacznie zmienia się i idealnie dopasowuje przestrzennie do substratu. Nieznaczne zmiany onformacyjne w struturze miejsca atywnego są źródłem naprężeń wiązań w struturze enzymu, co obniża energię atywacji atalizowanej reacji chemicznej. W modelu zaproponowanym przez Koshlanda, oreślanym H.. Fisher ostatecznie został laureatem Nagrody Nobla w dziedzinie chemii, ale za prace dotyczące syntezy curów i puryn, a nie za prace nad mechanizmem działania enzymów. 2 Daniel. Koshland Jr. był dziedzicem fortuny Levi traussa 6

7 mianem induowanego dopasowania (ang. induced fit model Rysune b), enzymy tratowane są jao dynamiczne strutury przestrzenne, tóre mogą zmieniać swoją onformację w obecności substratu. Rysune. Mechanizm wiązania substratu (substratów) przez enzym. Na rysunu przedstawiono schematycznie reację rozpadu substratu do produtów P i P 2., zachodzącą w obecności enzymu. Proces przedstawiono za pomocą modelu zama i lucza (A), zgodnie z tórym miejsce atywne enzymu jest omplementarne do ształtu substratu i modelu induowanego dopasowania (B), według tórego wiązanie substratu pociąga za sobą zmiany onformacyjne w obrębie enzymu. II.3. Mechanizm działania enzymów Żeby zrozumieć mechanizm działania enzymów, rozważmy hipotetyczną reację przemiany substratu w produt P, atalizowaną przez enzym : P (2) nzym w tym samym stopniu obniża barierę atywacyjną reacji tworzenia produtu P, co reacji ponownej przemiany produtu P w substrat, a zatem równocześnie przyspiesza reacje zachodzące w obydwu ierunach. Wobec tego obecność enzymu nie zmienia stanu równowagi zachodzącej reacji chemicznej, opisanego przez stałą równowagi K, a jedynie przyspiesza jego osiągnięcie. tała równowagi K zależy od standardowej entalpii swobodnej reacji zgodnie z zależnością: K 0 G = exp (3) RT 7

8 tandardowa entalpia swobodna reacji 0 G jest z olei różnicą pomiędzy standardową entalpią swobodną produtu 0 G P i standardową entalpią swobodną substratu 0 G. Ponieważ obecność enzymu nie wpływa na wartość standardowych entalpii swobodnych związów biorących udział w reacji ( G i 0 P 0 G ), nie może też zmienić wartości 0 G, a co za tym idzie nie może wpłynąć na położenie stanu równowagi oreślonego przez stałą równowagi K. Przebieg zachodzącej reacji można jedna opisać za pomocą innego parametru entalpii swobodnej atywacji G (w literaturze częściej oreślanej mianem energii atywacji Gibbsa, lub po prostu energii atywacji). Parametr ten to różnica pomiędzy entalpią swobodną stanu przejściowego reacji G a standardową entalpią swobodną substratu T tanem przejściowym reacji T (ang. transition state) będzie najrzadziej występujący stan, w tórym mogą się znaleźć związi uczestniczące w reacji, charateryzujący się najwyższą wartością entalpii swobodnej. tan ten należy sobie wyobrazić jao jeden z etapów na drodze przemian prowadzących od substratu do powstania produtu P, zatem równanie (2) przyjmuje postać: T P (4) Osiągnięcie stanu przejściowego T, czyli najmniej orzystnego etapu przemiany, wymaga dostarczenia do uładu energii niezbędnej do poonania bariery energetycznej pomiędzy substratem a stanem przejściowym. Po osiągnięciu stanu przejściowego następuje jego samorzutne przeształcenie w produt reacji 3. Działanie enzymów polega na obniżaniu energii atywacji dla atalizowanej reacji poprzez stabilizację stanu przejściowego (czyli obniżenie entalpii swobodnej i zwięszenie prawdopodobieństwa jego wystąpienia Rysune 2). tabilizacja stanu przejściowego reacji jest możliwa np. poprzez zmianę środowisa reacji (substrat reacji zostaje uryty w szczelinie miejsca atywnego, tóra stabilizuje stan przejściowy reacji). Warto tu podreślić, że centrum atywne często utworzone jest przez hydrofobowe reszty aminowasowe. Wobec tego, w przypadu reacji zachodzących w cytoplazmie (będącej złożonym oloidem wodnym), wejście substratu w szczelinę miejsca atywnego wiąże się ze zmianą środowisa z hydrofilowego na hydrofobowe, co może sprzyjać tworzeniu stanu przejściowego. 0 G. 3 Omawiany tu model jest bardzo uproszczony i załada istnienie tylo jednego stanu przejściowego. W rzeczywistości na współrzędnej reacji można czasem wyodrębnić ila stanów przejściowych a przejście jednego w drugi jest możliwe po poonaniu dodatowych barier energetycznych. Można wtedy powiedzieć, że metastabilne strutury (T ), (T 2 ), (T 3 ) są pewnymi loalnymi masimami energetycznymi. 8

9 Rysune 2. Mechanizm działania enzymów. Na rysunu przedstawiono ja zmienia się energia swobodna G podczas przemiany substratów w produty P, zachodzącej przez stan przejściowy T (2), charateryzujący się najwyższą wartością entalpii swobodnej. nzymy ułatwiają tworzenie stanu przejściowego w ich obecności reacja zachodzi przez stan przejściowy T (). II.4. Kinetya reacji enzymatycznych Najprostszy model matematyczny opisujący inetyę reacji enzymatycznej zaproponowali w 93 rou: niemieci biochemi, Leonor Michaelis i Maud Leonora Menten 4. Forma matematyczna zaproponowanego przez nich równania inetycznego, znanego jao równanie Michaelisa-Menten, oazała się na tyle uniwersalna, że została potem wyorzystana do opisu inetyi wzrostu miroorganizmów 5. Model Michaelisa-Menten załada, że etapem pośrednim w procesie przeształcenia substratu w produt P jest utworzenie omplesu atywnego enzym-substrat -. Na istnienie stanu przejściowego w postaci omplesu - wsazuje fat wysycania enzymu w obecności wysoiego stężenia substratu. Oznacza to, ze jeżeli prowadzimy esperyment przy stałym stężeniu enzymu, to na początu zwięszanie stężenia substratu powoduje wzrost szybości reacji. Jedna po przeroczeniu pewnego stężenia granicznego, dalsze zwięszanie stężenia substratu nie przyspiesza już zachodzącej reacji. Jest to efetem wyorzystania wszystich miejsc atywnych w struturze enzymu. Wówczas, olejne omplesy - mogą być tworzone tylo po rozpadzie już istniejących omplesów, 4 M. L. Menten ( ) jao jedna z pierwszych obiet w Kanadzie zdobyła stopień dotora medycyny. Ponieważ nie mogła pracować nauowo w swoim raju (tytuł learza otrzymała na Uniwersytecie w Toronto w 9 rou na podstawie wyniów badań prowadzonych w Chicago), zdecydowała się na emigrację do Niemiec, gdzie w 96 rou obroniła pracę dotorsą właśnie pod ieruniem Michaelisa. Potem pracowała nauowo w tanach Zjednoczonych a dopiero od 950 rou w Kanadzie. 5 Równanie Monoda (Monod, J. The growth of bacterial cultures. A. Rev. Microbiol. 3, , 949). 9

10 0 prowadzącym do uwolnienia cząstecze enzymu. Ponadto, istnienie stanu przejściowego - zostało wyazane metodami rystalograficznymi i spetrosopowymi. nzym po związaniu substratu (substratów) ustawia je w optymalnej orientacji przestrzennej do zajścia atalizowanej reacji. Zgodnie z założeniami modelu Michaelisa- Menten, po odwracalnej reacji tworzenia omplesu atywnego -, następuje jego nieodwracalny rozpad do produtu P i enzymu : + - +P (5) zybości reacji cząstowych tego procesu wynoszą: 2 2 v v v = = = + + (6) zybość zużywania substratu przedstawia równanie: v v dt d = = + + (7) podczas gdy szybość tworzenia produtu P jest równa: 2 2 v dt P d = = (8) Zmiany stężenia omplesu - w czasie przedstawia zależność: 2 2 v v v dt d = = + + (9) Gdy szybość tworzenia omplesu - (równa v + ) jest równa szybości jego rozpadu w obydwu ierunach (v - +v 2 ), to stężenie omplesu atywnego - nie zmienia się: 0 = dt d (0) W ta zdefiniowanym stanie ustalonym (stacjonarnym) możliwe jest rozwiązanie równań (7) i (8). Zauważmy, że w rozpatrywanym uładzie enzym występuje w formie wolnej i w formie omplesu atywnego -. Wobec tego, całowite stężenie enzymu w uładzie: 0 + = () Z równań (9-) otrzymujemy wyrażenie na stężenie omplesu atywnego -: = (2)

11 Po wstawieniu tej zależności do równania (7) lub (8), otrzymujemy wyrażenie na szybość prowadzonej reacji enzymatycznej (wyrażoną jao szybość zużywania substratu lub szybość powstawania produtu P). Zgodnie z założeniem o stanie ustalonym, szybość zużywania substratu jest równa szybości powstawania produtu - patrz równania (9) i (0): V = (3) 2 + Kolejne założenia, o stałości stężenia 0 w tracie procesu i znacznym nadmiarze substratu w stosunu do ilości enzymu 6 pozwalają nam uprościć równanie (3) do formy zaproponowanej przez Michaelisa i Menten: V + + = 2 0 = 2 0 = Vmax K M + (4) gdzie + 2 K M = stała Michaelisa + V max = 2 0 masymalna szybość reacji, iedy -= 0, czyli gdy cały enzym jest zaangażowany w tworzenie omplesu - proszę porównać z równaniem (8) tała Michaelisa ma wymiar stężenia i z równania (4) wynia, że dla = K M, szybość atalizowanej reacji osiąga połowę szybości masymalnej: = K M V = Vmax (5) 2 Wobec tego, prowadząc serię pomiarów szybości procesu enzymatycznego dla różnych stężeń substratu można wyznaczyć stałą Michaelisa, tóra jest taim stężeniem substratu, przy tórym szybość atalizowanej reacji osiąga połowę wartości masymalnej (Rysune 3) 7. 6 >> 0 proszę się zastanowić, w tórym momencie wyorzystano to założenie? 7 Doładniejsze wyznaczenie parametrów równania Michaelisa-Menten jest możliwe po przeształceniu tego równania do postaci Lineweavera-Bure a, Hanesa lub adie-hofstee a (po dobraniu odpowiedniego uładu współrzędnych otrzymujemy wyresy liniowe).

12 Rysune 3. zybość reacji enzymatycznej V w funcji stężenia substratu dla procesu przebiegającego zgodnie z modelem Michaelisa-Menten. Na wyresie przedstawiono sposób wyznaczenia wartości stałej K M oraz uproszczone formy równania Michaelisa-Menten właściwe dla srajnych stężeń substratu. tała K M jest odwrotnie proporcjonalna do powinowactwa enzymu do substratu - jej małe wartości świadczą o dużym powinowactwie. Na Rysunu 3 przedstawiono ja szybość reacji V zależy od stężenia substratu. Na rzywej możemy wyróżnić dwa obszary inetyczne. Dla bardzo nisich stężeń substratu, równanie (4) można uprościć do postaci: Vmax K M V = (6) K M Przy nisich stężeniach substratu proces przebiega zatem zgodnie z mechanizmem reacji I-rzędowej. Z olei, przy wysoich stężeniach substratu, następuje całowite wysycenie enzymu i reacja zachodzi z szybością masymalną dla danego stężenia enzymu: K M V = V (7) max Należy zaznaczyć że równanie Michaelisa-Menten nie jest właściwe do opisu enzymów allosterycznych, czyli enzymów wielojednostowych, zawierających ila miejsc atywnych w obrębie jednej cząsteczi. W przypadu tego typu enzymów, cząsteczi substratu wiązane są olejno do miejsc atywnych, przy czym związanie substratu z jednym miejscem może za sobą pociągać zmiany onformacyjne w obrębie enzymu, tóre ułatwiają wiązanie substratów do następnych miejsc atywnych. II.5. Regulacja procesów enzymatycznych zybość reacji enzymatycznej zależy od ilości substratu (zgodnie z równaniem Michaelisa-Menten, jeżeli stężenie enzymu jest stałe). Przy nadmiarze substratu, enzym ulega 2

13 wysyceniu i szybość reacji można zwięszyć przez dodanie nowej porcji enzymu. W obszarze masymalnej szybości reacji, jej postęp zależy bowiem liniowo od stężenia enzymu: V = Vmax = 2 0 (8) Zależność ta wyorzystywana jest przy oznaczaniu stężenia enzymów w próbach biologicznych, w celach diagnostycznych. Ponadto, enzymy podlegają regulacji za pomocą wysoce specyficznych mechanizmów ontroli (z wyorzystaniem ta zwanego centrum allosterycznego) oraz niespecyficznie, w efecie zmieniających się parametrów uładu taich ja odczyn ph, temperatura, siła jonowa i innych. Centrum allosteryczne jest miejscem w struturze biocząsteczi, do tórego wiązane są inhibitory bądź atywatory danego enzymu. Istnienie tego miejsca warunuje szybą odpowiedź enzymu na zmieniające się waruni środowisa. Jest to szczególnie ważne w przypadu enzymów regulujących luczowe dla organizmu procesy, gdyż czyni z enzymu precyzyjną maszynę, przyspieszającą dany cyl biochemiczny doładnie wtedy, gdy jest to potrzebne. Zapobiega to niepohamowanemu wzrostowi stężenia metabolitów (co, w myśl zasady Dosis facit venenum może być zabójcze dla organizmu) a przede wszystim zapobiega marnotrawieniu energii na prowadzenie procesów, tóre są zbędne. I ta, w przypadu szlaów metabolicznych, rolę inhibitorów często pełnią ich ońcowe produty, tóre na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego hamują enzym atalizujący pierwszą reację danego szlau (w czym znowu przejawia się oszczędność natury). Inhibicja może być nieodwracalna - polegać na trwałym związaniu cząsteczi inhibitora (I) z enzymem, bądź może mieć charater odwracalny, iedy utworzony omples enzym-inhibitor (-I) szybo dysocjuje. Zjawiso inhibicji nieodwracalnej jest wyorzystywane w działaniu nietórych antybiotyów na przyład penicylina blouje transpeptydazę enzym niezbędny do syntezy bateryjnych ścian omórowych. Podczas inhibicji odwracalnej cząstecza inhibitora jest czasowo wiązana z miejscem atywnym enzymu bądź z innym centrum allosterycznym. W inhibicji o charaterze ompetytywnym, inhibitor, charateryzujący się podobną struturą do substratu, rywalizuje z nim o miejsce w centrum atywnym: 3

14 + - P + + I -I forma zdezatywowana enzymu W zależności od stosunu stężeń substratu i inhibitora, jeden z tych związów wygrywa rywalizację o miejsce atywne. Przy dużym nadmiarze substratu wpływ inhibicji ompetencyjnej może być całowicie zniesiony. W inhibicji nieompetytywnej w struturze enzymu istnieją oddzielne miejsca wiązania substratu i inhibitora, jedna cząstecza ze związanym inhibitorem zmienia swoją onformację ta, że niemożliwe jest już wiązanie substratu, lub związany substrat nie może być przeształcony w produt reacji: P I -I- + I + formy -I zdezatywowane enzymu W inhibicji nieompetytywnej tworzone są dwa typy omplesów enzym - inhibitor: omples -I, w tórego sład wchodzą cząstecza enzymu i inhibitor, oraz omples -I- powstający, gdy z cząsteczą enzymu jest równocześnie związany inhibitor i substrat. Atywność enzymów zależy również od intensywnych parametrów środowisa. I ta, przebieg reacji enzymatycznych, podobnie ja wszystich reacji chemicznych, silnie zależy od temperatury, co jest efetem zmiany atywności biorących w niej udział cząstecze. Wpływ temperatury T na szybość reacji chemicznej opisuje równanie sformułowane przez vante Arrheniusa, szwedziego chemia, w 889 rou 8 : 8 Oprócz ww. równania, na cześć Arrheniusa zostały też nazwane: laboratorium na Uniwersytecie ztoholmsim i rater na siężycu. Wynia to z wszechstronnych zainteresowań nauowca, tóry zajmował się również tosyologią, geologią, astronomią i astrofizyą. Należałoby tu również wspomnieć o czynnym zaangażowaniu Arrheniusa w tworzenie Narodowego Instytutu Biologii Ras w Uppsali (tatens Institut för 4

15 ( RT ) = A exp a / (9) Gdzie A stała (czynni przedwyładniczy) a energia atywacji R stała gazowa Zgodnie z regułą van t Hoffa, wzrost temperatury o ażde 0 C powoduje 2-4-rotny wzrost szybości reacji. Oczywiście, w przypadu reacji enzymatycznych nie jest możliwe nieograniczone zwięszanie temperatury, gdyż prowadziłoby to do dezatywacji enzymu 9. nzymy białowe są szczególnie wrażliwe na denaturację termiczną, tóra prowadzi do zniszczenia ich trzeciorzędowej strutury, luczowej dla działania miejsca atywnego. Rysune 4. Wpływ temperatury na atywność enzymu. Na wyresie przedstawiono ja szybość reacji enzymatycznej zmienia się wraz ze wzrostem temperatury, zaznaczono temperaturę optymalną T opt dla przebiegu reacji enzymatycznej oraz temperaturę masymalną T max, po przeroczeniu tórej następuje denaturacja enzymu. W przypadu enzymów wyorzystywanych przemysłowo, iedy regulacja szybości reacji przy pomocy temperatury wydaje się być uszącym rozwiązaniem, postuluje się stosowanie Rasbiologi). Badania prowadzone w Instytucie wywarły duży wpływ na rozwój nazistowsiej eugenii i stanowiły nauowe uzasadnienie dla programu sterylizacyjnego, realizowanego w zwecji w latach (2 tysięcy przymusowych sterylizacji!) 9 Nawet niewielie zmiany temperatury mogą powodować dramatyczny wzrost lub spade atywności enzymów, odczuwalny wyraźnie przez organizm długotrwałe stany gorączowe lub stany osłabienia organizmu wyniają ze zmiany temperatury ciała tylo o ±2 C! Już ta niewielie zmiany w temperaturze znacząco wpływają na funcjonowanie organizmu jao całości. Dalsze obniżanie temperatury ciała prowadzi do hipotermii, czyli przechłodzenia. Ostre objawy hipotermii, w tym sztywność mięśni i utrata świadomości, pojawiają się, gdy temperatura ciała spadnie do 30 C. Dalsze wychłodzenie, poniżej 28 C prowadzi do śmierci, tórej bezpośrednią przyczyną jest zbyt nisa temperatura serca i mózgu. Wychłodzenie organizmu zachodzi znacznie (o. 20-razy) szybciej w wodzie, ze względu na jej więsze przewodnictwo cieplne. zacuje się, że czas przeżycia człowiea w wodzie o temperaturze poniżej 0 C wynosi tyle minut ile temperatura wody! Dosonale tłumaczy to zasięg jednej z najwięszych tragedii morsich na poładzie zatopionego transatlantyu Titanic zginęło ponad 500 osób. W nocy 4/ , iedy doszło do tragedii, temperatura wody spadła bowiem do 0 C, co znacząco obniżyło szanse przeżycia pasażerów statu. 5

16 enzymów wyizolowanych z organizmów termofilnych. Cały metabolizm termofili jest dostosowany do wysoich temperatur i ich biała są stabilne w temperaturach sięgających 80 C (a nawet 05 C dla hipertermofili!). Czynniiem istotnym dla szybości reacji enzymatycznej jest też stężenie jonów wodorowych w mieszaninie reacyjnej. W zależności od odczynu środowisa różny jest bowiem stopień dysocjacji reszt aminowasowych, co bezpośrednio wpływa na oddziaływanie enzymu z substratem (poprzez zmianę onformacji całego enzymu lub zmianę właściwości jego miejsca atywnego). rajne wartości ph mogą nawet doprowadzić do denaturacji enzymu. Rysune 5. Wpływ ph na atywność enzymu. Na wyresie przedstawiono ja zmiany ph wpływają na szybość reacji enzymatycznej. Zaznaczono optymalną wartość ph ph opt, przy tórej reacja przebiega najszybciej oraz zaresy ph, w tórych zachodzi denaturacja enzymu. nzymy działają więc najefetywniej w ściśle oreślonym przedziale ph, zależnie od ich strutury i charateru oddziaływań enzym-substrat. Umożliwia to na przyład regulację atywności enzymów działających w przewodzie poarmowym (enzymy atywne w silnie waśnym ph żołąda, ja pepsyna czy lipaza żołądowa, są dezatywowane w dwunastnicy, tóra zawdzięcza swoje alaliczne środowiso soowi trzustowemu). III. Immobilizacja enzymów III.. Zalety i wady procesu immobilizacji Ja już wspomniano, enzymy mogą być stosowane w przemyśle w formie zawiesiny (o różnym stopniu czystości) lub w postaci immobilizowanej. Immobilizacja jest procesem polegającym na uwięzieniu enzymu w pewnej oreślonej przestrzeni. nzym immobilizowany powinien charateryzować się atywnością atalityczna i być przeznaczony do wielorotnego stosowania. 6

17 Termin enzym immobilizowany został precyzyjnie zdefiniowany dopiero w 97 rou, w wiele lat po pierwszym pratycznym wyorzystaniu procesu immobilizacji. Już w XVII wieu do producji wasu octowego z etanolu używano bowiem baterii Acetobacter umieszczonych na wiórach buowych. Z olei enzymu immobilizowanego użyto po raz pierwszy podczas I wojny światowej wobec deficytu wasu siarowego przeprowadzono reację inwersji sacharozy w obecności inwertazy immobilizowanej na węglu atywnym (otrzymanym poprzez zwęglenie ości). Immobilizacja enzymów umożliwia zwięszenie wydajności procesów biotechnologicznych 0. Wydajność procesu możemy zdefiniować poprzez wydajność syntezy produtu, czyli stosune masy otrzymanego produtu w stosunu do masy substratu. Wzrost wydajności procesu jest możliwy, ponieważ immobilizacja zwięsza trwałość enzymów i ułatwia ich odzysiwanie z mieszaniny reacyjnej, co z olei umożliwia ich wielorotne używanie w procesach prowadzonych w uładach oresowych lub ciągłych. nzymy immobilizowane charateryzują się zwięszoną stabilnością w zmieniających się warunach ph i temperatury oraz w środowisu rozpuszczalniów organicznych. Z drugiej strony, w tracie procesu immobilizacji może nastąpić częściowa dezatywacja enzymu. nzym immobilizowany często charateryzuje się niższą atywnością niż enzym wolny pracujący w tych samych warunach (atywności enzymu nie należy mylić z ostateczną wydajnością prowadzonego procesu). Może to wyniać ze sterycznego zabloowania centrum atywnego, niewłaściwych naprężeń w obrębie cząsteczi enzymu a taże mechanicznych uszodzeń enzymu. Nie do pominięcia są też opory dyfuzyjne, tóre zmniejszają efetywne stężenie substratu docierającego do atalizatora, i tym samym ograniczają szybość zachodzącej reacji. Należy tez pamiętać o osztach samej immobilizacji, tóre muszą być uwzględnione w analizie eonomicznej całego procesu. 0 Immobilizacja może też wpływać na wzrost wydajności procesów prowadzonych w obecności homogenatów omórowych i całych omóre. Na przyład wydajność reacji reducji odeinonu do odeiny pod wpływem wyciągu z mau learsiego (Papaver somniferum) rośnie z 60% (reacja w zawiesinie) do 70% (bioatalizator unieruchomiony w żelu alginianowym) a nawet do ponad 80% wsute immobilizacji bioatalizatora w piance poliuretanowej. Kodeina (metylomorfina) jest substancją czynną o działaniu przeciwbólowym i przeciwaszlowym. Podczas II wojny światowej była używana jao substytut morfiny. Immobilizacja omóre na nośniach jest z olei wsazana w producji metabolitów wtórnych. Zagęszczenie omóre wywołane immobilizacją imituje waruni panujące w tanach roślinnych (gradient pożywi i metabolitów, zwięszona odporność na uszodzenia mechaniczne). I ta, wzrost producji alaloidów purynowych zaobserwowano po immobilizacji omóre Coffea arabica w alginianie wapnia. Immobilizacja może też wpływać na wzrost atywności enzymów tai efet zaobserwowano w przypadu enzymów atalizujących reacje stereoseletywnej estryfiacji i transestryfiacji, po ich unieruchomieniu metodą sieciowania ryształów enzymu. 7

18 Alternatywną w stosunu do immobilizacji metodą unieruchomienia enzymów, może być prowadzenie procesu w reatorze membranowym, gdzie przestrzeń zajęta przez enzym jest ograniczona przez półprzepuszczalną membranę. III.2. Metody immobilizacji enzymów Metoda immobilizacji i właściwy dobór nośnia determinują właściwości atalityczne związanego enzymu. Decydując się na oreślony typ nośnia należy zwrócić uwagę zarówno na właściwości biochemiczne samego enzymu (w tym jego wielość, charater grup funcyjnych, atywność oraz ph- i termostabilność), typ atalizowanej reacji, ja i charaterystyę fizyochemiczną nośnia (jego stabilność chemiczną i wytrzymałość mechaniczną, dostępne grupy funcyjne, porowatość, stopień rozwinięcia powierzchni). W zależności od wybranej metody immobilizacji, enzym może być zaadsorbowany na nośniu lub związany z nim wsute oddziaływań eletrostatycznych. Jest to immobilizacja fizyczna. nzym może również być immobilizowany chemicznie: tworzyć z nośniiem wiązanie owalencyjne lub być uwięziony w sieci tworzonej przez czynnii sieciujące. Trzeci rodzaj immobilizacji, immobilizacja mechaniczna, polega na unieruchomieniu enzymu w matrycy lub jego oapsułowaniu. Podstawowe metody immobilizacji zostały przedstawione na Rysunu 6. Rysune 6. Główne metody immobilizacji enzymów: A) immobilizacja fizyczna; B) immobilizacja chemiczna; C) immobilizacja mechaniczna. Immobilizacja fizyczna jest efetem niespecyficznych oddziaływań pomiędzy enzymem a nośniiem, tóre są efetem sił van der Waalsa, oddziaływań eletrostatycznych, 8

19 oddziaływań hydrofobowych i powstawania wiązań wodorowych. iła tych oddziaływań jest w ewidentny sposób zależna od środowisa (siły jonowej medium, odczynu ph, stopnia rozwinięcia powierzchni nośnia). Pociąga to za sobą łatwość desorpcji enzymu i ograniczoną trwałość wobec zmieniających się warunów środowisa. Zdecydowaną zaletą immobilizacji chemicznej nad immobilizacją opartą na oddziaływaniach niespecyficznych jest jej więsza trwałość. Wiązanie owalencyjne może być tworzone bezpośrednio pomiędzy grupami funcyjnymi enzymu i nośniiem albo powstawać z udziałem łącznia. Cząsteczi łącznia są niezbędne w procesie sieciowania (oreślane są wówczas mianem czynniów sieciujących). pośród metod immobilizacji mechanicznej na szczególną uwagę zasługuje apsułowanie enzymów w sztucznych liposomach, czyli pęcherzyach lipidowych, co umożliwia łatwą inorporację enzymu w błony biologiczne. IV. Podstawowe informacje o inwertazie Inwertaza (właściwie β-frutofuranozydaza,.c ) jest enzymem z lasy hydrolaz (podlasa: gliozydazy), tóry atalizuje reację rozładu sacharozy do gluozy i frutozy - łatwo przyswajalnych curów prostych. U człowiea, na wewnętrznej powierzchni omóre nabłonowych wyściełających jelito cienie, występują dwa typy enzymów umożliwiających przeprowadzenie dwucurów do łatwo wchłanialnych curów prostych oprócz inwertazy, stwierdzono obecność latazy enzymu, tóry atalizuje reację hydrolizy latozy do gluozy i galatozy. Z olei inwertaza obecna w ślinie pszczół, umożliwia im przeprowadzenie curów złożonych obecnych w netarze wiatowym do postaci monocurów, warunując tym samym proces wytwarzania miodu. Inwertaza jest wyorzystywana do celów omercyjnych głównie w przemyśle spożywczym (w cuiernictwie). Przyładem może być producja czeolade z nadzieniem. Nadzienie w formie stałej, o dużej zawartości sacharozy i z dodatiem inwertazy, jest porywane warstwą czeolady. W tracie iludniowego (a czasami nawet ilutygodniowego) procesu dojrzewania następuje hydroliza sacharozy, prowadząca do uwolnienia curów prostych - w efecie tego procesu nadzienie zostaje upłynnione. Do celów przemysłowych, inwertaza jest otrzymywana z omóre drożdży. Najwyższą atywność tego enzymu stwierdzono w ph 4.5 i w temperaturze 60 C. 9

20 ĆWICZNI 29/30 INTRUKCJA WYKONANIA Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie procesu ciągłej producji curu inwertowanego będącego mieszaniną gluozy i frutozy. Proces ten prowadzony jest metodą chemiczną (na złożu jonitowym) lub bioatalityczną (na złożu zawierającym inwertazę drożdżową) w mirosali w reatorach olumnowych z ciągłym dozowaniem roztworu substratu. Integralną częścią ćwiczenia jest wyonanie złoża zawierającego inwertazę unieruchomioną na żelu alginianowym. Osoby wyonujące ćwiczenie badają wpływ rodzaju atalizatora, temperatury oraz objętościowego natężenia przypływu na wydajność procesu inwersji sacharozy. Detecja gluozy w mieszaninie poreacyjnej odbywa się metodą wstrzyowej analizy przepływowej FIA (ang. Flow Injection Analysis) z użyciem odczynnia zawierającego osydazę gluozową oraz perosydazę (metoda Trindera, nazwa omercyjna zestawu: Glucose GOD-PAP). W tracie laboratorium osoby, tóre zgodnie z planem zajęć wyonują ćwiczenie 30, są odpowiedzialne za proces przebiegający w reatorach olumnowych, podczas gdy osoby, tóre wyonują ćwiczenie 29, przygotowują złoże zawierające immobilizowany enzym i przeprowadzają inwersję sacharozy w uładzie oresowym. Uczestnicy laboratorium zobowiązani są zapoznać się z przebiegiem obydwu prowadzonych doświadczeń (również z informacjami zawartymi w tym srypcie) - wynii esperymentów omawiane są wspólnie. reatory chemiczne bioreator odbiór produtu produt wzorzec pompa FIA rany woda reagent roztwór zasilający pompa zasilająca przepływowa uweta optyczna pętla reacyjna odbiór reagenta MODUŁ FIA (WTRZYKOWJ ANALIZY PRZPŁYWOWJ) Rysune. chemat zestawu do prowadzenia reacji inwersji sacharozy w reatorach olumnowych z unieruchomionym atalizatorem z zaznaczonym modułem analitycznym. 20

21 przęt Odczynnii Zestaw reatorów olumnowych CU (zestaw zawiera termostat, reatory, pompę perystaltyczną, uład wstrzyowej analizy przepływowej, omputer z oprogramowaniem) pompa perystaltyczna roztwór HCl (stęż. 2 M) roztwór sacharozy (stęż. 7,6 g/l) roztwór CaCl 2 (stęż. 2M) gluoza odczynni Trindera (do analizy gluozy) jonity DOWX Buteli L 3 szt. alginian sodu Buteli 00 ml 5 szt. inwertaza drożdżowa lub drożdże Zlewi 00 ml 5 szt. was octowy olba miarowa 0,5 L szt. octan sodu pipeta 20,00 ml szt. pompa do pipety szt. cylinder 00 ml szt. cylinder * ) 500 ml szt. miniaturowy leje szt. zlewa* ) 50 ml szt. zlewa* ) L szt. zlewa szlana L szt. zlewa szlana 600 ml szt. zestaw do sączenia próżniowego *sprzęt polipropylenowy, używany tylo do roztworów wodnych Opis obsługi aparatury oraz olejność wyonywanych czynności proces przebiegający w reatorach olumnowych.. porządzić następujące roztwory: roztwór A: sacharoza o stężeniu 7,6 g L - (3 L) roztwór B: was solny 2 M ( L) roztwór C: gluoza o stężeniu 2,0 g L - (500 ml) Z roztworu C sporządzić w olbce miarowej po 00 ml roztworów gluozy o następujących stężeniach,0, 0,75, 0,5 i 0,25 g L - i przelać do podpisanych butelecze o pojemności 00 ml z narętami zawierającymi otwory do wężyów teflonowych. Wszystie wymienione powyżej roztwory odgazowywać przez 5 minut na myjce ultradźwięowej. W ten sam sposób odgazować L wody destylowanej. 2. Zapoznać się ze schematem przedstawionym na Rysunu oraz oznaczeniami na Rysunu 2. prawdzić ustawienie ranów i prześledzić drogę cieczy, począwszy od naczynia, z tórego jest pobierana, przez pompę zasilającą (3), reatory (4), zawory sterujące ieruniem cieczy pompowanej do reatorów i wypływającej z reatorów (6) aż do naczynia odbierającego produt (Rysune 2). 2

22 Rysune 2. chemat zestawu do prowadzenia reacji w uładzie przepływowym - wido z przodu: () włączni główny; (2) panel sterujący; (3) pompa perystaltyczna zasilająca (dozująca substrat); (4) szlane reatory olumnowe z płaszczami grzejnymi; (5) trzeci, opcjonalny reator z bioatalizatorem; (6) zawory dozujące i odbierające; (7) trójdrożny zawór sterujący wejściem do wstrzyowego analizatora przepływowego (FIA); (8) pompa dozująca reagenty i ciecz nośną do FIA; (9) przepływowa uweta optyczna; (0) zawór FIA; () pętla reacyjna; (2) uweta optyczna (tylo wtedy, gdy nie ma zestawu FIA); (3) zawory odpowietrzające; (6) łaźnia termostatu. 3. Włączyć omputer z oprogramowaniem rejestrującym parametry procesu. 4. Zapoznać się z obsługą panelu sterującego (oznaczony jao 2 na Rysunu 2), sposobem regulacji natężenia objętościowego przepływu i innych parametrów procesu. chemat panelu sterującego przedstawiono na Rysunu 3. Upewnić się, że termostat jest wyłączony (TMPRATUR CONTROL PUMP CIRCULATOR, przełączni 3 w pozycji 0 ). Podobnie, wyłączona powinna być pompa zasilająca reator (FD PUMP, przełączni 7a) i pompa zasilająca analizator przepływowy (FIA PUMP, przełączni 6a) 22

23 2 5 6b 6a 6c 4 3 7a 7b 8 A) B) Rysune 3. (A) chemat panelu sterującego: eran wyświetlający wartość absorbancji, rejestrowanej w module FIA (); regulator zerowania absorbancji (2); ontroler termostatu (4); włączni termostatu (3); eran wyświetlający temperaturę (5); włączni pompy FIA (6a); regulacja szybości pompowania FIA (6b); przycis masymalnej prędości pompowania (6c); włączni pompy zasilającej reatory (7a); regulacja szybości pompowania (7b); gniazdo wyjścia sygnału absorbancji (8). (B) Wygląd eranu ontrolera termostatu: przycisi umożliwiające wprowadzenie żądanej temperatury (9a- 9c). 5. Włączyć zasilanie całego urządzenia (włączni na Rysunu 2). 6. Ustawić temperaturę termostatu: wcisnąć lewy przycis (oznaczony jao 9a na Rysunu 3) aż uaże się napis P (set point), wtedy posługując się przycisami 9b i 9c doprowadzić wyświetlaną wartość temperatury do wartości pożądanej. 7. Włączyć termostat (przycis 3 na Rysunu 3). 8. URUCHOMINI RAKTORÓW Końcówę wężya pompy zasilającej włożyć do buteli z roztworem 2M HCl. Upewnić się, że węży dotya dna buteli i jest nieruchomy. prawdzić drożność uładu (zawór zasilający reator oraz zawór odprowadzający roztwór z reatora powinny być otwarte). Podstawić naczynie odbierające roztwór produtu. Włączyć pompę zasilającą reator. Po przepompowaniu 400 ml roztworu wyonać czynności opisane w puncie URUCHOMINI MODUŁU ANALITYCZNGO sporządzenie rzywej wzorcowej. Wężyi pompy zasilającej FIA (Rysune i 2) podłączyć do trzech butelecze zawierających: wodę destylowaną oraz uprzednio przygotowane roztwory: reagenta i gluozy (wzorca) o najniższym stężeniu (0,25 g L - ). prawdzić ustawienie ranu (oznaczony jao 7 na Rysunu 2) i ustawić go w pozycji umożliwiającej pobieranie roztworu wzorca. Wężyi z odprowadzeniem roztworów (wychodzące z pętli FIA) włożyć do zlewi zbierającej przereagowane substraty. 23

24 0. ontrolować poziomy zanurzenia wężyów teflonowych pobierających roztwory. Włączyć pompę FIA, ustawić odpowiednią szybość pompowania (Rysune 3, przycisi 6a i 6b).. Przed rozpoczęciem pomiarów absorbancji wzorcowego roztworu gluozy, ustawić porętłem 2 (Rysune 3) wartość absorbancji równą zero. Włączyć omputerową ciągłą rejestrację absorbancji (punty pomiarowe w odstępie czasu 2s). 2. POMIARY ZAWARTOŚCI GLUKOZY. Przestawić porętło pętli FIA z pozycji LOAD do pozycji INJCT. Czynność ta spowoduje zmieszanie roztworu nośnego z roztworem reagenta i roztworem badanym (lub roztworem wzorca). Zasadę działania pętli mieszającej przedstawiono na Rysunu 4. Porętło powinno znajdować się w pozycji INJCT przez 60 s, następnie należy je przestawić do pozycji LOAD. Obserwować zmiany absorbancji na wyresie powstającym na monitorze omputera. Zanotować masymalną wartość absorbancji. Pomiar powtórzyć ilurotnie aż do uzysania powtarzających się wyniów. Rysune 4. Obieg cieczy w pętli FIA w pozycji LOAD (roztwory nie mieszają się ze sobą) i w pozycji INJCT (trzy roztwory mieszają się ze sobą zawsze w taich samych proporcjach). 3. Zatrzymać pompę FIA. Zamienić roztwór wzorca na roztwór o wyższym stężeniu. Włączyć pompę, odczeać ila minut i powtórzyć czynności z puntu 2. Wyonać pomiary dla ażdego przygotowanego roztworu gluozy. Wyonać również pomiar dla roztworu sacharozy (pobrać roztwór zasilający reatory, stężenie gluozy powinno wynosić zero). 4. W programie xcel wyreślić rzywą alibracyjną (wyres absorbancji w funcji stężenia gluozy). 5. ZMIANA POMPOWANJ CICZY ZAILAJĄCJ RAKTORY. ontrolować poziom roztworu HCl zasilającego reatory. Jeśli ubyło 400 ml, zatrzymać pompę zasilającą (przycis 7a na Rys. 3). Zamienić butelę z HCl na butelę zawierającą 24

25 odgazowaną wodę destylowaną. Włączyć pompę. Pompować wodę aż roztwór wypływający z reatorów nie będzie wyazywał odczynu waśnego (sprawdzać papieriem wsaźniowym). Jeśli wycie z reatorów jest obojętny, zmienić roztwór zasilający reatory rozpocząć pompowanie roztworu sacharozy. Wyznaczyć natężenie objętościowe przepływu roztworu sacharozy zbierając przez 0 minut roztwór produtu do cylindra o objętości 00 ml- odczytać objętość cieczy i zanotować natężenie przepływu w ml/min. 6. Po upływie 5 minut od czasu rozpoczęcia dozowania roztworu sacharozy zmienić ustawienie ranu (oznaczonego jao 7 na Rysunu 2) w pozycję umożliwiającą pobieranie do analizy roztworu produtu wypływającego z olumny.doonać analizy zawartości gluozy w producie reacji wyonując czynności opisane w puncie 2. Pomiar powtórzyć ilurotnie aż do ustalenia się stałej wartości absorbancji. 7. Obliczyć stężenie gluozy i wydajność procesu inwersji dla danej temperatury i natężenia przepływu. Wynii przedstawić w postaci: RODZAJ KATALIZATORA: TMPRATURA RAKCJI: NATĘŻNI OBJĘTOŚCIOW PRZPŁYWU: PRZYCHÓD g/godz sacharoza gluoza wydajność: ROZCHÓD g/godz 8. Powtórzyć czynności z puntów 6-7 zmieniając temperaturę procesu, rodzaj atalizatora, natężenie objętościowe przepływu lub stężenie surowca. UWAGA: Dla procesu prowadzonego z użyciem immobilizowanej inwertazy, onieczne jest wyonanie czynności z pt Bioreator olumnowy przepłuiwany jest tylo wodą destylowaną! Immobilizowana inwertaza wyazuje optymalne działanie w ph 4,8, dlatego roztwór sacharozy powinien być zawaszony wasem octowym do ph 4,5-5,5. UWAGA: Roztwór ten może być sierowany tylo do bioreatora, nie do reatorów z żywicą jonowymienną. 20. Do opisu ćwiczenia załączyć rzywą alibracyjną, odczytane wartości absorbancji i obliczone stężenie gluozy przy oreślonych warunach reacji. porządzić bilans materiałowy dla jednej godziny ruchu ciągłego dla poszczególnych typów reatorów (chemicznego, z żywicą jonowymienną oraz bioatalitycznego, z unietuchomioną inwertazą) oraz dla różnych warunów prowadzenia procesu. Obliczyć wydajności dla jednej godziny ruchu ciągłego. 25

26 Immobilizacja bioatalizatorów w alginianie wapnia. Jedną z techni unieruchamiania enzymów lub całych omóre jest ich immobilizacja w sieci tworzonej przez polimer (czynni sieciujący). W tracie tego ćwiczenia inwertaza jest u nieruchomiona w alginianie wapnia (soli wasu alginowego). Kwas alginowy jest liniowym polimerem, złożonym z monomerów wasu D-mannuronowego i L-guluronowego, połączonych wiązaniem β--4 gliozydowym (Rysune 5). W obecności jonów dwuwartościowych (w tym jonów wapnia) następuje wytrącanie alginianu wapnia z jednoczesnym sieciowaniem tego polimeru, prowadzącym do utworzenia trójwymiarowego żelu, w tórym mogą zostać uwięzione cząsteczi enzymów bądź całe omóri. Metoda ta jest szeroo stosowana, ponieważ nie prowadzi do uszodzenia immobilizowanych bioatalizatorów. Przy użyciu alginianu wapnia otrzymuje się złoża, tórymi wypełnia się bioreatory. Ponadto, alginian jest powszechnie używany w producji tzw. sztucznych nasion, czyli zarodów somatycznych urytych w ochronnej apsułce zbudowanej z polimeru. Proces unieruchamiania bioatalizatorów w alginianie wapnia polega na wymieszaniu materiału biologicznego z płynnym alginianem sodu, a następnie wropleniu otrzymanej zawiesiny do roztworu zawierającego jony wapnia. Rysune 5. Kwas alginowy liniowy polimer będący sładniiem ścian omórowych alg. Instrucja sporządzenia złoża zawierającego immobilizowany enzym. UWAGA: ażda grupa ćwiczeniowa orzysta z preparatu przygotowanego przez poprzednią grupę studencą (ćwiczenie rozpoczyna się od czynności opisanych puntami 6-7, natomiast w tracie ćwiczenia należy przygotować preparat dla następnej grupy, wyonując czynności z puntów -5).. Rozpuścić 0,5 g inwertazy w 300 ml wody destylowanej, deliatnie mieszając na mieszadle magnetycznym. 2. Do roztworu inwertazy dodać 5 g alginianu sodowego mieszać aż do uzysania jednorodnego, mętnego roztworu (o. jedną godzinę ). 3. Na mieszadle magnetycznym ustawić zlewę L, nalać 500 ml 0,2 M roztworu CaCl 2, zmontować uład do wraplania alginianu (węży z pompy perystaltycznej powinien być o. 20 cm ponad lustrem cieczy). 4. Rozpocząć powolne wraplanie roztworu alginianu sodu zawierającego inwertazę do roztworu chloru wapnia. Obserwować wytrącanie się perełe alginianu wapnia. 5. Po zaończonym wraplaniu pozostawić zawiesinę na jeden dzień. 26