(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 14/2 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07H 21/02 (06.01) C07H 21/04 (06.01) A01N 63/00 (06.01) A61K 48/00 (06.01) C12N /00 (06.01) C12N /02 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Fitazy, kodujące je kwasy nukleinowe oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 11/1 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 1/08 (73) Uprawniony z patentu: BASF Enzymes LLC, San Diego, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 BRIAN STEER, San Diego, US MARK DYCAICO, San Diego, US KATIE KLINE, San Diego, US AXEL TREFZER, Leidschendam, NL TOM TODARO, San Diego, US ARNE SOLBAK, San Diego, US FATIMA EL-FARRAH, Cardiff, US ALBERTO ALVARADO, San Diego, US GERHARD FREY, San Diego, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 2 3 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek ten dotyczy fitaz, kodujących je polinukleotydów, zastosowania polinukleotydów i polipeptydów według wynalazku, jak również otrzymywania i izolowania takich polinukleotydów i polipeptydów. W szczególności wynalazek dostarcza polipeptydów mających aktywność fitaz w warunkach wysokiej temperatury oraz fitaz, które zachowują aktywność po ekspozycji na wysokie temperatury. Fitazy według wynalazku, oprócz wyższych temperatur, mogą być termotolerancyjne i/lub termostabilne w niskich temperaturach. Fitazy według wynalazku można stosować w paszach w celu poprawy wartości pokarmowej składników bogatych w fitynian. Fitazy według wynalazku można formułować jako karmy lub pasze, lub suplementy do nich obu, np. w celu trawienia fitynianu. Karmy lub pasze według wynalazku mogą być w postaci granulatów, płynów, proszków i tym podobnych. W jednym z przykładów wykonania, fitazy według wynalazku są stabilne względem denaturacji termicznej podczas granulowania; co obniża koszt produktu fitazowego z jednoczesnym zachowaniem wydajności in vivo i wykrywaniem aktywności w paszy. TŁO WYNALAZKU [0002] Minerały są pierwiastkami niezbędnymi do wzrostu wszystkich organizmów. Minerały niezbędne w diecie mogą pochodzić z wielu materiałów źródłowych, obejmujących rośliny. Przykładowo, nasiona roślin są bogatym źródłem minerałów, ponieważ zawierają one jony, które są skompleksowane z grupami fosforanowymi cząsteczek kwasu fitynowego. Te minerały związane z fitynianem mogą, w pewnych przypadkach, spełniać wymagania dietetyczne dla niektórych gatunków organizmów hodowlanych, takich jak przeżuwacze wielożołądkowe. W związku z tym, w niektórych przypadkach przeżuwacze wymagają mniejszej suplementacji diety za pomocą nieorganicznego fosforanu i minerałów, ponieważ mikroorganizmy w żwaczu wytwarzają enzymy, które katalizują konwersję fitynianu (heksafosforan mioinozytolu) do inozytolu i nieorganicznego fosforanu. W procesie tym uwalniane są minerały skompleksowane z fitynianem. Większość gatunków organizmów hodowlanych nie jest jednak zdolna do wydajnego wykorzystywania minerałów związanych z fitynianem. Z tego względu, przykładowo, w produkcji żywca w postaci zwierząt jednożołądkowych (np., świni, ptaków i ryb), pasza jest powszechnie suplementowana minerałami i/lub substancjami antybiotykowymi, które zmieniają środowisko flory trawiennej spożywającego je organizmu, w celu zwiększenia szybkości wzrostu. [0003] Może występować wiele problematycznych obciążeń - dotyczących żywienia, etapów przetwarzania ex vivo, zdrowia i medycyny, ochrony w środowisku i gospodarowania zasobami - które związane są z niewystarczającą hydrolizą fitynianu w wielu zastosowaniach. Następujące, nieograniczające przykłady tych problemów: 1) suplementacja diety za pomocą minerałów nieorganicznych jest kosztowna. 2) Obecność niezhydrolizowanego fitynianu jest niepożądana i problematyczna w wielu zastosowaniach ex vivo (np. przez powodowanie obecności niechcianego osadu). 3) suplementacja diety za pomocą antybiotyków zawiera w sobie zagrożenie medyczne dla ludzi i podobnie dla zwierząt, przez zwiększanie ilości patogenów tolerujących antybiotyk. 4) Usuwanie niezaabsorbowanych minerałów z kału do środowiska zaburza i niszczy ekosystemy otaczających gleb, wód z farm rybnych i wód powierzchniowych ogólnie. ) Wartościowa oferta pożywienia z wielu potencjalnych środków żywnościowych pozostaje w znacznym stopniu nietknięta i zmarnowana. 1

3 1 2 3 [0004] W konsekwencji, środki żywnościowe zawierające fitynian wymagają suplementowania za pomocą egzogennych składników odżywczych i/lub za pomocą źródła aktywności fitazy, w celu poprawienia ich niewystarczających ofert żywieniowych po spożyciu przez bardzo dużą liczbę gatunków organizmów. [000] W konsekwencji istnieje zapotrzebowanie na środki do osiągania wydajnej i opłacalnej ekonomicznie hydrolizy fitynianu w różnych zastosowaniach. W szczególności istnieje zapotrzebowanie na środki do optymalizacji hydrolizy fitynianu w zastosowaniach handlowych. W szczególnym przykładzie wykonania istnieje zapotrzebowanie na optymalizację komercyjnych metod obróbki, które poprawią ofertę żywieniową środków żywieniowych zawierających fitynian do spożywania przez ludzi i zwierzęta hodowlane. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0006] Wynalazek obecny dostarcza polipeptydów o aktywności fitazy, kodujących je polinukleotydów, zastosowania polinukleotydów i polipeptydów według wynalazku, i sposobów otrzymywania i izolowania takich polinukleotydów i polipeptydów. W jednym z przykładów wykonania wynalazek dostarcza polipeptydów o aktywności fitazy w warunkach wysokiej temperatury oraz fitaz, które zachowują aktywność po ekspozycji na wysokie temperatury. Fitazy według wynalazku można stosować w paszach w celu poprawy wartości pokarmowej składników bogatych w fitynian. Fitazy według wynalazku można formułować jako karmy lub pasze, lub suplementy do nich obu, np. w celu trawienia fitynianu. Karmy lub pasze według wynalazku mogą być w postaci granulatów, tabletek, pigułek, płynów, proszków, sprejów i tym podobnych. W jednym z przykładów wykonania, fitazy według wynalazku są stabilne względem denaturacji termicznej podczas granulowania; co obniża koszt produktu fitazowego z jednoczesnym zachowaniem wydajności in vivo i wykrywaniem aktywności w paszy. STRESZCZENIE [0007] Wynalazek dostarcza wyizolowanych, syntetycznych lub rekombinowanych kwasów nukleinowych, zawierających (a) sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą polipeptyd o aktywności fitazy i mający co najmniej 9%, 96% 97%, 98% lub 99% lub powyżej identyczności sekwencji do SEKW. o NR ID.:1 oraz obejmujący modyfikację nukleotydową, przy czym nukleotydy w pozycjach 4 do 47 z SEKW. o NR ID.: 1 są zmienione na TAT lub TAC, przy czym polipeptyd ma termostabilność ulepszoną w stosunku do fitazy o SEKW. o NR ID.:2. Sekwencja może ewentualnie dodatkowo zawierać co najmniej od jednej do wszystkich trzynastu modyfikacji SEKW. o NR ID.:1 1 wybieranych spośród nukleotydów na pozycjach 139 do 141, którymi są TTT lub TTC; nukleotydów na pozycjach 289 do 291, którymi są GTT, GTC, GTA lub GTG; nukleotydów na pozycjach 289 do 291, którymi są GAA lub GAG; nukleotydów na pozycjach 6 6 do 8, którymi są CAT lub CAC; nukleotydów na pozycjach od 47 do 477, którymi są GTT, GTC, GTA lub GTG; nukleotydów na pozycjach od 47 do 477, którymi są GAA lub GAG; nukleotydów na pozycjach od 487 do 489, którymi są CGT, CGC, CGA, CGG, AGA lub AGG; nukleotydów na pozycjach od 490 do 492, którymi są CGT, CGC, CGA, CGG, AGA lub AGG; nukleotydów na pozycjach od 02 do 04, którymi są CGT, CGC, CGA, CGG, AGA lub AGG; nukleotydów na pozycjach od 3 do 37, którymi są CGT, CGC, CGA, CGG, AGA lub AGG; nukleotydów na pozycjach od 676 do 678, którymi są GAT lub GAC; nukleotydów na pozycjach od 697 do 699, którymi są TGG; nukleotydów na pozycjach od 823 do 82, którymi są GTT, GTC, GTA lub GTG; nukleotydów na pozycjach od 86 do 867, którymi są GCT, GCC, GCA lub GCG; oraz nukleotydów na pozycjach od 87 do 89, którymi są CCA, CCC, CCG lub CCT; lub 2

4 1 2 3 (b) polinukleotyd kodujący polipeptyd o aktywności fitazy i mający co najmniej 9%, 96% 97%, 98% lub 99% lub więcej identyczności sekwencji do SEKW. o NR ID.:2 oraz mający sekwencję zawierającą przynajmniej modyfikacje reszty aminokwasowej, przy czym aminokwas treonina na pozycji aminokwasowej 349 SEKW. o NR ID.: 2 jest zmieniony na tyrozynę i przy czym polipeptyd ma termostabilność ulepszoną w stosunku do fitazy o SEKW. o NR ID.:2; (c) sekwencję kwasu nukleinowego z (a) lub (b) kodującą polipeptyd o aktywności fitazy, ale nie mający sekwencji sygnalnej lub sekwencji probiałka, lub homologicznej sekwencji promotorowej; (d) kwas nukleinowy według któregokolwiek spośród od (a) do (c), kodujący polipeptyd o aktywności fitazy i dodatkowo zawierający heterologiczną sekwencję aminokwasową lub kwas nukleinowy według któregokolwiek spośród od (a) do (c), zawierający ponadto heterologiczną sekwencję nukleotydową; (e) kwas nukleinowy według (d), przy czym heterologiczna sekwencja aminokwasowa zawiera lub składa się z sekwencji kodującej heterologiczną (liderową) sekwencję sygnalną lub znacznika lub epitopu lub heterologiczna sekwencja nukleotydowa zawiera heterologiczny promotor lub koduje sekwencję nakierowującą; (f) sekwencję kwasu nukleinowego całkowicie komplementarną do sekwencji kwasu nukleinowego według któregokolwiek spośród od (a) do (e). [0008] Opcjonalnie, identyczności sekwencji określane są za pomocą analizy z zastosowaniem algorytmu do porównywania sekwencji lub przez ocenę wzrokową. Wszystkie spośród tych kwasów nukleinowych są "kwasami nukleinowymi według wynalazku", kodującymi "polipeptydy według wynalazku". [0009] W jednym z przykładów wykonania, algorytmem do porównywania sekwencji jest algorytm BLAST w wersji 2.2.2, w którym ustawienie filtrowania nastawione jest na blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, a wszystkie inne opcje ustawione są na ustawienia domyślne. [00] W jednym z przykładów wykonania aktywność fitazy obejmuje: katalizę fitynianu (heksafosforanu mioinozytolu) do inozytolu i fosforanu nieorganicznego; lub hydrolizę fitynianu (heksafosforanu mioinozytolu). W jednym z przykładów wykonania aktywność fitazy wykazuje termotolerancję i opcjonalnie polipeptyd zachowuje aktywność fitazy po ekspozycji na temperaturę w zakresie pomiędzy od około C do około 70 C lub pomiędzy od około 37 C do około 0 C, lub od ponad 37 C do około 0 C, C, 60 C, 6 C, 70 C, 7 C, 80 C, 8 C, 90 C, 9 C, 0 C lub większą. W jednym z przykładów wykonania aktywność fitazy wykazuję termostabilność i opcjonalnie polipeptyd zachowuje aktywność fitazy w temperaturze z zakresu wynoszącego pomiędzy od około C do około 70 C lub pomiędzy od około 37 C do około 0 C, lub od ponad 37 C do około 0 C, C, 60 C, 6 C, 70 C, 7 C, 80 C, 8 C, 90 C, 9 C, 0 C lub większą. [0011] Wynalazek dostarcza kaset ekspresyjnych, wektorów, nośników do klonowania, wektorów ekspresyjnych, wektorów do klonowania, obejmujących kwas nukleinowy według wynalazku lub zawierających w sobie kwas nukleinowy według wynalazku (który obejmuje kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy według wynalazku), przy czym opcjonalnie wektor do klonowania zawiera lub jest wektorem wirusowym, plazmidem, fagiem, fagemidem, kosmidem, fosmidem, bakteriofagiem lub sztucznym chromosomem, a opcjonalnie wektor wirusowy obejmuje wektor adenowirusowy, wektory retrowirusowe lub wektor wirusowy związany z adenowirusami i opcjonalnie kasetę ekspresyjną, wektor, nośnik do klonowania, wektor ekspresyjny, wektor do klonowania zawiera lub jest zawarty w sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC), plazmidzie, wektorze wyprowadzonym z bakteriofaga P1 (PAC), sztucznym chromosomie drożdżowym (YAC), sztucznym chromosomie ssaczym (MAC). 3

5 1 2 3 [0012] Wynalazek dostarcza transformowanych komórek, transdukowanych komórek, komórek gospodarza i tym podobnych, zawierających kwas nukleinowy według wynalazku lub mających zawarty w sobie kwas nukleinowy według wynalazku (który obejmuje kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy według wynalazku) lub kasetę ekspresyjną, wektor, nośnik do klonowania, wektor ekspresyjny, wektor do klonowania według wynalazku, przy czym opcjonalnie komórka jest komórką bakteryjną, komórką ssaczą, komórką grzybową, komórką drożdżową, komórką owadzią lub komórką roślinną. [0013] Transgeniczne zwierzęta inne niż ludzie mogą zawierać kwas nukleinowy według wynalazku lub mieć zawarty w sobie kwas nukleinowy według wynalazku (który obejmuje kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy według wynalazku) lub kasetę ekspresyjną, wektor, nośnik do klonowania, wektor ekspresyjny, wektor do klonowania według wynalazku, przy czym opcjonalnie zwierzęciem jest mysz, szczur, koza, królik, owca, świnia lub krowa. [0014] Wynalazek dostarcza roślin transgenicznych (obejmujących części roślin, np. przetworzone lub zebrane, np. liście, łodygi, korzenie lub owoce) lub nasion, zawierających kwas nukleinowy według wynalazku lub mających zawarty w sobie kwas nukleinowy według wynalazku (który obejmuje kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy według wynalazku) lub kasetę ekspresyjną, wektor, nośnik do klonowania, wektor ekspresyjny, wektor do klonowania według wynalazku, przy czym opcjonalnie rośliną jest rośliną kukurydzy, rośliną ziemniaka, rośliną pomidora, rośliną pszenicy, rośliną oleistą, rośliną rzepaku, rośliną soi lub rośliną tytoniu i opcjonalnie ziarno jest ziarnem kukurydzy, ziarnem pszenicy, nasionem oleistym, nasionem rzepaku, nasionem soi, ziarnem palmy, ziarnem słonecznika, ziarnem sezamowym, orzechem ziemnym lub nasionem rośliny tytoniu. W alternatywnych przykładach wykonania, roślina lub nasiono wytworzone z nasiona lub rośliny według wynalazku, lub roślina lub nasiono według wynalazku, mogą obejmować rośliny uprawne, przykładowo kukurydzę, alfalfa, słonecznik, Brassica, soję, trzcinę cukrową, bawełnę krokosz, orzech ziemny, sorgo, pszenicę, owies, żyto, proso, jęczmień, ryż, rośliny iglaste, rośliny pastewne, np. groszku, fasoli i soi, skrobiowe bulwy, korzenie, np. ziemniaka, słodkiego ziemniaka, manioku, kolokazji, paciorecznika i buraka cukrowego i tym podobne lub rośliny mogą być rośliną kukurydzy, rośliną ziemniaka, rośliną pomidora, rośliną pszenicy, rośliną oleistą, rośliną rzepaku, rośliną soi lub rośliną tytoniu lub ulistnienie i/lub paszę roślinną dla zwierząt lub dla zwierząt ze żwaczem lub roślina może być lub zawiera ulistnienie lub rośliną pokarmową jest siano, kukurydza, proso, soja, rdestówka, jęczmień, alfalfa, żyto, trawa roczna, sorgo, trawa sudańska, trawa Veldt lub trawa Pennisetum cenchroides; lub ziarnem jest ziarno kukurydzy, ziarno pszenicy, ziarno oleiste, ziarno rzepaku, ziarno soi, ziarno palmowe, ziarno słonecznika,ziarno sezamowe, orzechem ziemnym lub ziarnem orzecha ziemnego, nasionem alfalfa, nasionem bawełny, nasionem krokosza barwierskiego, nasionem sorga, ziarnem owsa, ziarnem żyta, ziarnem prosa, ziarnem jęczmienia, ziarnem ryżu, ziarnem groszku lub ziarnem rośliny tytoniowej, lub rośliną jest kukurydza, alfalfa, słonecznik, kapusta, soja, trzcina cukrowa, bawełna, krokosz barwierski, orzech ziemny, sorgo, pszenica, owies, żyto, proso, jęczmień, ryż, rośliny iglaste, groszek, fasola, soja, ziemniak, słodki ziemniak, maniok, kolokazja, paciorecznik lub burak cukrowy. [001] Oligonukleotydy antysensowne mogą zawierać kwas nukleinowy według wynalazku z określonymi modyfikacjami par zasad sekwencji nukleotydowej do SEKW. o NR ID.:1, przy czym opcjonalnie oligonukleotyd antysensowny ma między około od do 0, około od do 60, około od do 70, około od do 80, około od 60 do 0 lub około od 0 do zasad na długość. Wynalazek zapewnia również rybozymy i/lub irna (np. sirna lub mirna), zawierające sekwencje antysensowne według wynalazku. 4

6 1 2 3 [0016] Wynalazek dostarcza sposobów hamowania translacji informacji o fitazie w komórce, obejmujących podawanie do komórki lub ekspresjonowanie w komórce oligonukleotydu antysensownego według wynalazku. [0017] Wynalazek dostarcza wyizolowanych, syntetycznych lub rekombinowanych polipeptydów, zawierających (a) sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 9%, 96% 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji do SEKW. o NR ID.:2 i kodowaną przez polinukleotyd, zawierający modyfikację nukleotydową SEKW. o NR ID.:1, przy czym nukleotydami na pozycjach od 4 do 47 z SEKW. o NR ID.: 1 są TAT lub TAC, przy czym polipeptyd ma termostabilność ulepszoną w stosunku do fitazy o SEKW. o NR ID.:2. (b) sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 9%, 96% 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji do SEKW. o NR ID.:2 oraz mającą modyfikację aminokwasową, przy czym aminokwas treonina na pozycji aminokwasowej 349 SEKW. o NR ID.: 2 jest zmieniony na tyrozynę, przy czym polipeptyd ma termostabilność ulepszoną w stosunku do fitazy o SEKW. o NR ID.:2. Opcjonalnie, polipeptyd może zawierać co najmniej od 1 do 13 dodatkowych modyfikacji, wybieranych spośród: zamiany aminokwasu alaniny na pozycji aminokwasowej 47 z SEKW. O NR ID.: 2 na fenyloalaninę; zamiany aminokwasu cysteiny na pozycji aminokwasowej 97 z SEKW. o NR ID.:2 na walinę; zamiany aminokwasu cysteiny na pozycji aminokwasowej 97 z SEKW. o NR ID.:2 na kwas glutaminowy; zamiany aminokwasu odpowiadającego treoninie na pozycji aminokwasowej 136 z SEKW. o NR ID.:2 na histydynę; zamiany aminokwasu asparaginy na pozycji aminokwasowej 19 z SEKW. o NR ID.:2 na walinę; zamiany aminokwasu asparaginy na pozycji aminokwasowej 19 z SEKW. o NR ID.:2 na kwas glutaminowy; zamiany aminokwasu odpowiadającego treoninie na pozycji aminokwasowej 163 z SEKW. o NR ID.:2 na argininę; zamiany aminokwasu kwasu asparaginowego na pozycji aminokwasowej 164 z SEKW. o NR ID.:2 na argininę; zamiany aminokwasu kwasu glutaminowego na pozycji aminokwasowej 168 z SEKW. o NR ID.:2 na argininę; zamiany aminokwasu glicyny na pozycji aminokwasowej 179 z SEKW. o NR ID.:2 na argininę; zamiany aminokwasu cysteiny na pozycji aminokwasowej226 z SEKW. o NR ID.:2 na kwas asparaginowy; zamiany aminokwasu waliny na pozycji aminokwasowej 233 z SEKW. o NR ID.:2 na tryptofan; zamiany aminokwasu glutaminy na pozycji aminokwasowej 27 z SEKW. o NR ID.:2 na walinę; zamiany aminokwasu argininy na pozycji aminokwasowej 289 z SEKW. o NR ID.:2 na alaninę; oraz zamiany aminokwasu leucyny na pozycji aminokwasowej 363 z SEKW. o NR ID.:2 na prolinę, przy czym kwasy nukleinowe kodują co najmniej jeden polipeptyd o aktywności fitazy, a opcjonalnie identyczności sekwencji określane są poprzez analizę za pomocą algorytmu do porównywania sekwencji lub za pomocą oceny wzrokowej, a polipeptyd ma aktywność fitazy i opcjonalnie aktywność fitazy obejmuje: katalizę fitynianu (heksafosforanu mioinozytolu) do inozytolu i nieorganicznego fosforanu; lub hydrolizę fitynianu (heksafosforanu mioinozytolu). [0018] Wynalazek dostarcza polipeptydów według wynalazku o aktywności fitazy, których aktywność wykazuję termotolerancję, a opcjonalnie polipeptyd zachowuje aktywność fitazy po ekspozycji na temperaturę w zakresie wynoszącym od około -0 C do około -80 C, od około -80 C do około- C, od około - C do około - C, od około - C do około 0 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około 2 C, od około 2 C do około 37 C, od około 37 C do około 4 C, od około 4 C do około C, od około C do około do około70 C, od około 70 C do około 7 C, od około 7 C do około 8 C, od około 8 C do około 90 C, od około 90 C do około 9 C, od około 9 C do około 0 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około

7 C lub 9 C, 96 C, 97 C, 98 C, 99 C, 0 C, 1 C, 2 C, 3 C, 4 C, C, 6 C, 7 C, 8 C, 9 C, 1 C, 111 C, 112 C, 113 C, 114 C, 11 C lub większą. Polipeptydy termotolerancyjne według wynalazku mogą zachowywać aktywność, np. aktywność fitazy, po ekspozycji na temperaturę w zakresie wynoszącym od około -0 C do około -80 C, od około -80 C do około- C, od około - C do około - C, od około - C do około 0 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około 2 C, od około 2 C do około 37 C, od około 37 C do około 4 C, od około 4 C do około C, od około C do około do około70 C, od około 70 C do około 7 C, od około 7 C do około 8 C, od około 8 C do około 90 C, od około 90 C do około 9 C, od około 9 C do około 0 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około 1 C lub 9 C, 96 C, 97 C, 98 C, 99 C, 0 C, 1 C, 2 C, 3 C, 4 C, C, 6 C, 7 C, 8 C, 9 C, 1 C, 111 C, 112 C, 113 C, 114 C, 11 C lub większą. W niektórych przykładach wykonania polipeptydy termotolerancyjne według wynalazku zachowują aktywność, np. aktywność fitazy, po ekspozycji na temperaturę w zakresach opisanych powyżej, w ph około 3,0, w ph około3,, w ph około 4,0, w ph około 4,, w ph około,0, w ph około,, w ph około 6,0, w ph około 6,, w ph około 7,0, w ph około 7,, w ph około 8,0, w ph około 8,, w ph około 9,0, w ph około 9,, w ph około,0, w ph około,, w ph około 11,0, w ph około 11,, w ph około 12,0 lub wyższym. [0019] Wynalazek dostarcza polipeptydów według wynalazku, które mają aktywność fitazy, których aktywność jest termostabilna. Przykładowo, polipeptyd według wynalazku może być termostabilny. Polipeptydy termostabilne według wynalazku mogą zachowywać wiązanie i/lub aktywność enzymatyczną, np. aktywność fitazy, w warunkach obejmujących zakres temperatury od około -0 C do około -80 C, od około -80 C do około - C, od około - C do około - C, od około - C do około 0 C, od około 0 C do około 37 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około 2 C, od około 2 C do około 37 C, od około 37 C do około 4 C, od około 4 C do około C, od około C do około do około70 C, od około 70 C do około 7 C, od około 7 C do około 8 C, od około 8 C do około 90 C, od około 90 C do około 9 C, od około 9 C do około 0 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około 1 C lub 9 C, 96 C, 97 C, 98 C, 99 C, 0 C, 1 C, 2 C, 3 C, 4 C, C, 6 C, 7 C, 8 C, 9 C, 1 C, 111 C, 112 C, 113 C, 114 C, 11 C lub większą. Polipeptydy termostabilne według wynalazku mogą zachowywać aktywność, np. aktywność fitazy, w temperaturach w zakresie wynoszącym od około -0 C do około -80 C, od około -80 C do około- C, od około - C do około - C, od około - C do około 0 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około 2 C, od około 2 C do około 37 C, od około 37 C do około 4 C, od około 4 C do około C, od około C do około do około70 C, od około 70 C do około 7 C, od około 7 C do około 8 C, od około 8 C do około 90 C, od około 90 C do około 9 C, od około 9 C do około 0 C, od około 0 C do około C, od około C do około 1 C, od około 1 C do około 1 C lub 9 C, 96 C, 97 C, 98 C, 99 C, 0 C, 1 C, 2 C, 3 C, 4 C, C, 6 C, 7 C, 8 C, 9 C, 1 C, 111 C, 112 C, 113 C, 114 C, 11 C lub większą. W niektórych przykładach wykonania polipeptydy termostabilne według wynalazku zachowują aktywność, np. aktywność fitazy, w temperaturze w zakresach opisanych powyżej, w ph około 3,0, w ph około3,, w ph około 4,0, w ph około 4,, w ph około,0, w ph około,, w ph około 6,0, w ph około 6,, w ph około 7,0, w ph około 7,, w ph około 8,0, w ph około 8,, w ph około 9,0, w ph około 9,, w ph około,0, w ph około,, w ph około 11,0, w ph około 11,, w ph około 12,0 lub wyższym. 6

8 1 2 3 [00] Wynalazek dostarcza wyizolowanych, syntetycznych lub rekombinowanych polipeptydów, zawierających sekwencję aminokwasową według wynalazku i (a) niemających sekwencji sygnalnej (peptydu liderowego); (b) niemających sekwencji sygnalnej (peptydu liderowego) i dodatkowo zawierających heterologiczną sekwencję sygnalną (peptyd liderowy); (c) sekwencję aminokwasową z (a) lub (b) i dodatkowo zawierających heterologiczną sekwencję, przy czym opcjonalnie sekwencja heterologiczna zawiera peptyd identyfikacyjny. [0021] W jednym z przykładów wykonania, aktywność fitazy dowolnego polipeptydu według wynalazku obejmuje (ma) aktywność specyficzną: w około 37 C w zakresie od około 0 do około 00 jednostek na miligram białka; lub od około 00 do około 70 jednostek na miligram białka; lub, w 37 C, w zakresie od około 00 do około 10 jednostek na miligram białka; lub, w 37 C w zakresie od około 70 do około 00 jednostek na miligram białka. W jednym z przykładów wykonania, termotolerancyjna aktywność fitazy obejmuje specyficzną aktywność po ekspozycji na temperaturę w około 37 C, w zakresie od około 0 do około 00 jednostek na miligram białka; lub termostabilna aktywność fitazy obejmuje aktywność specyficzną od około 00 do około 70 jednostek na miligram białka; lub termostabilna aktywność fitazy obejmuje aktywność specyficzną w 37 C w zakresie od około 00 do około 10 jednostek na miligram białka; lub termostabilna aktywność fitazy obejmuje aktywność specyficzną w 37 C w zakresie od około 70 do około 00 jednostek na miligram białka. W jednym z przykładów wykonania, termostabilna aktywność fitazy obejmuje specyficzną aktywność w warunkach obejmujących temperaturę wynoszącą około 37 C w zakresie od około 0 do około 00 jednostek na miligram białka; lub termostabilna aktywność fitazy obejmuje aktywność specyficzną od około 00 do około 70 jednostek na miligram białka; lub termostabilna aktywność fitazy obejmuje aktywność specyficzną w 37 C w zakresie od około 00 do około 10 jednostek na miligram białka; lub termostabilna aktywność fitazy obejmuje aktywność specyficzną w 37 C w zakresie od około 70 do około 00 jednostek na miligram białka. [0022] W jednym z przykładów wykonania, polipeptyd według wynalazku zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji, przy czym opcjonalnie glikozylacja jest N-glikozylacją lub O-glikozylacją i opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany po tym, jak zostanie wyekspresjonowany w drożdżach, którymi opcjonalnie są P. pastoris lub S. pombe. [0023] W jednym z przykładów wykonania polipeptyd zachowuje aktywność fitazy w warunkach obejmujących w przybliżeniu ph 6,, ph 6, ph,, ph, ph 4,, ph 4,0, ph 3,, ph 3,0 lub niższe (bardziej kwasowe) ph. Alternatywnie, polipeptyd według wynalazku zachowuje aktywność fitazy w warunkach obejmujących w przybliżeniu ph 7,, ph 8, ph 8,, ph 9, ph 9,, ph,0, ph,, ph 11,0, ph 11,, ph 12, ph 12, lub wyższe (bardziej zasadowe) ph. [0024] Wynalazek dostarcza preparatów białkowych, zawierających polipeptyd według wynalazku, przy czym preparat białkowy zawiera płyn, zawiesinę, proszek, sprej, zawiesinę, kompozycję/formulację liofilizowaną, ciało stałe, tabletkę żelową, pigułkę, implant, żel; lub formulację farmaceutyczną, żywność, karmę, suplement żywności, suplement karmy, dodatek do żywności, dodatek do karmy, suplement odżywczy lub jego suplement dietetyczny. [002] Heterodimery mogą zawierać polipeptyd według wynalazku i w jednym z przykładów wykonania heterodimer zawiera drugą domenę, przy czym opcjonalnie druga domena jest polipeptydem, a heterodimer jest białkiem fuzyjnym oraz opcjonalnie druga domena jest epitopem lub znacznikiem. [0026] Wynalazek dostarcza immobilizowanych polipeptydów obejmujących polipeptyd według wynalazku, przy czym immobilizowany polipeptyd może zawierać homodimer lub heterodimer, przy czym 7

9 1 2 3 opcjonalnie polipeptyd jest immobilizowany na lub wewnątrz komórki, pęcherzyka, liposomu, filmu, membrany, metalu, żywicy, polimeru, ceramiki, szkła, mikroelektrody, cząstki grafitowej, złoża, żelu, płytki, macierzy, rurki kapilarnej, kryształu, tabletki, pigułki, kapsułki, proszku, aglomeratu, powierzchni lub struktury porowatej. Macierze (np. mikromacierze) mogą zawierać immobilizowany polipeptyd, przy czym polipeptyd zawiera polipeptyd według wynalazku lub heterodimer lub kwas nukleinowy według wynalazku lub ich kombinację. [0027] Wyizolowane, syntetyczne lub rekombinowane przeciwciała mogą wiązać się specyficznie do polipeptydu według wynalazku lub do polipeptydu kodowanego przez kwas nukleinowy według wynalazku, przy czym opcjonalnie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym. Hybrydomy mogą zawierać przeciwciało. [0028] Wynalazek dostarcza sposobów otrzymywania rekombinowanego polipeptydu, obejmujących etapy: (a) zapewniania kwasu nukleinowego w sposób operacyjny przyłączonego do promotora; przy czym kwas nukleinowy zawiera sekwencję według wynalazku; i (b) ekspresjonowania kwasu nukleinowego z etapu (a) w warunkach, które pozwalają na ekspresjonowanie polipeptydu, powodując w ten sposób powstanie rekombinowanego polipeptydu i opcjonalnie sposób obejmuje dodatkowo transformowanie komórki gospodarza za pomocą kwasu nukleinowego z etapu (a), po czym następuje ekspresjonowanie kwasu nukleinowego z etapu (a), dzięki czemu powstaje rekombinowany polipeptyd w stransformowanej komórce gospodarza. [0029] Wynalazek dostarcza sposobów identyfikowania polipeptydu o aktywności fitazy, obejmujących następujące etapy: (a) zapewnianie polipeptydu według wynalazku; (b) zapewnianie substratu fitazy; i (c) kontaktowanie polipeptydu lub jego fragmentu lub wariantu z etapu (a) z substratem z etapu (b) i wykrywanie wzrostu ilości substratu lub spadku ilości produktu reakcji, przy czym spadek ilości substratu lub wzrost ilości produktu reakcji wykrywa polipeptyd i aktywności fitazy. [00] Sposoby identyfikowania substratu fitazy obejmują następujące etapy: (a) zapewnianie polipeptydu według wynalazku; (b) zapewnianie substratu testowego; i (c) kontaktowanie polipeptydu z etapu (a) z substratem testowym z etapu (b) oraz wykrywanie wzrostu ilości substratu lub spadku ilości produktu reakcji, przy czym spadek ilości substratu lub wzrost ilości produktu reakcji identyfikuje substrat testowy jako substrat fitazy. [0031] Sposoby określania, czy związek specyficznie wiąże się do polipeptydu, obejmują następujące etapy: (a) ekspresjonowania kwasu nukleinowego lub wektora zawierającego kwas nukleinowy w warunkach pozwalających na translację kwasu nukleinowego na polipeptyd, przy czym kwas nukleinowy zawiera sekwencję według wynalazku; (b) kontaktowania polipeptydu ze związkiem testowym; i (c) określania, czy związek testowy specyficznie wiąże się do polipeptydu, określając zatem, że związek testowy specyficznie wiąże się do polipeptydu. [0032] Sposoby identyfikowania modulatora aktywności fitazy obejmują następujące etapy: (a) zapewnianie polipeptydu fitazy według wynalazku; (b) zapewnianie związku testowego; (c) kontaktowanie polipeptydu z etapu (a) ze związkiem testowym z etapu (b) i mierzenie aktywności fitazy, przy czym zmiana w aktywności fitazy, mierzona w obecności związku testowego w porównaniu do aktywności przy braku związku testowego zapewnia określenie, czy związek testowy moduluje aktywność fitazy, przy czym opcjonalnie aktywność fitazy mierzona jest poprzez zapewnianie substratu fitazy i wykrywanie wzrostu ilości substratu lub spadku ilości produktu reakcji oraz opcjonalnie spadek ilości substratu lub wzrost ilości produktu reakcji ze związkiem testowym w porównaniu do ilości substratu lub produktu 8

10 1 2 3 reakcji bez związku testowego, identyfikuje związek testowy jako aktywator aktywności fitazy i opcjonalnie wzrost ilości substratu lub obniżenie ilości produktu reakcji ze związkiem testowym w porównaniu do ilości substratu lub produktu reakcji bez związku testowego, identyfikuje związek testowy jako inhibitor aktywności fitazy. [0033] Systemy komputerowe mogą zawierać procesor i urządzenie do przechowywania danych, przy czym wspomniane urządzenie do przechowywania danych ma zachowaną w sobie sekwencję polipeptydu lub sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym sekwencja polipeptydu zawiera sekwencję według wynalazku i kwas nukleinowy zawiera sekwencję według wynalazku oraz opcjonalnie system zawiera dodatkowo algorytm do porównywania sekwencji i urządzenie do przechowywania danych, mające co najmniej jedną sekwencję referencyjną przechowywaną na nim oraz opcjonalnie algorytm do porównywania sekwencji zawiera program komputerowy, który wskazuje polimorfizm i opcjonalnie system dodatkowo zawiera identyfikator, który identyfikuje jedną lub większą liczbę cech we wspomnianej sekwencji. Nośnik (nośniki) odczytywane przez komputer mogą przechowywać w sobie sekwencję polipeptydu lub sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym sekwencja polipeptydu zawiera sekwencję aminokwasową według wynalazku, a kwas nukleinowy zawiera sekwencję według wynalazku. Sposoby identyfikowania cechy w sekwencji obejmują etapy: (a) odczytywania sekwencji z zastosowaniem programu komputerowego, który identyfikuje jedną lub większą liczbę cech w sekwencji, przy czym sekwencja obejmuje sekwencję polipeptydu lub sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym sekwencja polipeptydu zawiera sekwencję aminokwasową według wynalazku i kwas nukleinowy zawiera sekwencję według wynalazku; oraz (b) identyfikowania jednej lub większej liczby cech w sekwencji za pomocą programu komputerowego. Sposoby porównywania pierwszej sekwencji do drugiej sekwencji obejmują etapy: (a) odczytywania pierwszej sekwencji i drugiej sekwencji poprzez zastosowanie programu komputerowego, który porównuje sekwencje, przy czym pierwsza sekwencja zawiera sekwencję polipeptydu lub sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym sekwencja polipeptydu zawiera sekwencję aminokwasową według wynalazku i kwas nukleinowy zawiera sekwencję według wynalazku; oraz (b) określania różnic między pierwszą sekwencją i drugą sekwencją za pomocą programu komputerowego, przy czym opcjonalnie etap określania różnic między pierwszą sekwencją i drugą sekwencją obejmuje dodatkowo etap identyfikowania polimorfizmów i opcjonalnie sposób obejmuje ponadto identyfikator, który identyfikuje jedną lub większą liczbę cech w sekwencji oraz opcjonalnie sposób obejmuje odczytywanie pierwszej sekwencji z zastosowaniem programu komputerowego i identyfikowanie jednej lub większej liczby cech w sekwencji. [0034] Wynalazek dostarcza sposobów hydrolizowania heksafosforanu inozytolu do inozytolu i nieorganicznego fosforanu, obejmujących następujące etapy: (a) zapewniania polipeptydu o aktywności fitazy, przy czym polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową według wynalazku lub polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy według wynalazku; (b) zapewniania kompozycji zawierającej heksafosforan inozytolu; oraz (c) kontaktowania polipeptydu z etapu (a) z kompozycją z etapu (b) w warunkach, w których polipeptyd hydrolizuje heksafosforan inozytolu w celu wytworzenia inozytolu i nieorganicznego fosforanu, przy czym opcjonalnie warunki obejmują temperaturę wynoszącą między około 37 C i około 70 C, między około 0 C i około 80 C lub między około 60 C i około 90 C oraz opcjonalnie kompozycja zawiera kwas fitynowy. [003] Wynalazek dostarcza sposobów odgumowywania oleju, obejmujących następujące etapy: (a) zapewnianie polipeptydu o aktywności fitazy, przy czym polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową 9

11 1 2 3 według wynalazku lub polipeptydu kodowanego przez kwas nukleinowy według wynalazku; (b) zapewnianie kompozycji zawierającej olej roślinny; oraz (c) kontaktowania polipeptydu z etapu (a) z olejem roślinnym z etapu (b) w warunkach, w których polipeptyd może rozszczepiać połączenie inozytolnieorganiczny fosforan, odgumiając w ten sposób olej roślinny. [0036] Wynalazek dostarcza sposobów otrzymywania karmy lub żywności, lub suplementu karmy lub żywności, lub dodatku do żywności lub karmy, lub suplementu żywieniowego, lub suplementu diety, obejmujących następujące etapy: (a) transformowania rośliny, części rośliny lub komórki roślinnej za pomocą polinukleotydu kodującego polipeptyd enzymu fitazy, przy czym fitaza zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową według wynalazku lub polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy według wynalazku; (b) hodowanie rośliny, części rośliny lub komórki roślinnej w warunkach, w których enzym fitaza jest ekspresjonowany; oraz (c) przekształcania rośliny, części rośliny lub komórki roślinnej w kompozycję odpowiednią do żywności, karmy, suplementu żywności, suplementukarmy, dodatku do żywności, dodatku do karmy, suplementu żywieniowego lub suplementu diety lub dodawania hodowanej rośliny, części rośliny lub komórki roślinnej do żywności, karmy, suplementu żywności, suplementukarmy, dodatku do żywności, dodatku do karmy, suplementu żywieniowego lub suplementu diety dla wytwarzania w ten sposób żywności, karmy, suplementu żywności, suplementukarmy, dodatku do żywności, dodatku do karmy, suplementu żywieniowego lub suplementu diety, przy czym opcjonalnie polinukleotyd zawarty jest w wektorze ekspresyjnym i opcjonalnie wektor zawiera sekwencję kontroli ekspresji, zdolną do ekspresjonowania kwasu nukleinowego w komórce roślinnej oraz opcjonalnie żywność, karma, suplement żywności, suplement karmy, dodatek do żywności, dodatek do karmy, suplement żywieniowy lub suplement diety jest dla zwierzęcia, i przy czym opcjonalnie zwierzę jest zwierzęciem monogastrycznym, oraz opcjonalnie zwierzę jest przeżuwaczem, oraz opcjonalnie żywność, karma, suplement żywności, suplement karmy, dodatek do żywności, dodatek do karmy, suplement żywieniowy lub suplement diety jest w postaci macierzy dostarczającej, granulatu, tabletki, żelu, płynów, spreju, zmielonego ziarna lub proszku. W jednym z przykładów wykonania enzym fitaza jest glikozylowany dla zapewnienia termotolerancyjności lub termostabilności w warunkach granulowania oraz opcjonalnie macierz dostarczająca tworzona jest poprzez granulowanie mieszaniny zawierającej zarodki ziaren i enzym fitazę dla uzyskiwania cząstki, oraz opcjonalnie granulat jest wytwarzany w warunkach obejmujących stosowanie pary, opcjonalnie granulat jest wytwarzany w warunkach obejmujących stosowanie temperatury powyżej 80 C przez około minut i opcjonalnie granulat zawiera enzym fitazę, która zawiera specyficzną aktywność wynoszącą co najmniej od do około 900 jednostek na miligram enzymu. [0037] Wynalazek dostarcza sposobów dostarczania suplementu enzymu fitazy zwierzęciu lub człowiekowi, przy czym wspomniany sposób obejmuje: (a) otrzymywanie jadalnej macierzy dostarczającej, zawierającej jadalny nośnik i enzym fitazę, zawierający polipeptyd, zawierający sekwencję aminokwasową według wynalazku, przy czym macierz z łatwością dysperguje i uwalnia enzym fitazę, kiedy zostanie umieszczona w medium wodnym oraz (b) podawanie jadalnej macierzy dostarczającej enzym zwierzęciu lub człowiekowi, przy czym opcjonalnie jadalna macierz dostarczająca enzym zawiera granulat jadalnego nośnika i opcjonalnie jadalna macierz dostarczająca jest w postaci granulatu, tabletek, żeli, płynów, sprejów lub proszków i opcjonalnie jadalna macierz dostarczająca zawiera nośnik wybierany z grupy składającej się z zarodków ziaren, siana, alfalfa, tymotki, łupin soi,

12 1 2 3 mączki z ziaren słonecznika, mączki kukurydzianej, mączki sojowej, mączki pszenicznej i opcjonalnie jadalny nośnik zawiera zarodki ziaren z oleju przepracowanego. [0038] Wynalazek dostarcza żywności, karmy, suplementu żywności, suplementu karmy, dodatku do żywności, dodatku do karmy, suplementu żywieniowego lub suplementu diety dla zwierzęcia lub człowieka, zawierających polipeptyd według wynalazku lub homodimer lub heterodimer według wynalazku; przy czym opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany i opcjonalnie aktywność fitazy jest termotolerancyjna lub termostabilna. W jednym z przykładów wykonania, żywność, karma, suplement żywności, suplement karmy, dodatek do żywności, dodatek do karmy, suplement żywieniowy lub suplement diety wytwarzany jest w postaci granulatu, pigułki, tabletki, kapsułki, żelu, tabletki żelowej, spreju, proszku, liofilizowanej formulacji, formulacji farmaceutycznej, postaci płynnej, jako zawiesina lub papka lub wytwarzany jest z zastosowaniem dodatków powlekanych polimerem, lub wytwarzany w postaci granulatu, lub wytwarzany w spreju. [0039] Wynalazek dostarcza jadalnej lub absorbowalnej macierzy (macierzy) dostarczającej(ych), zawierających polipeptyd według wynalazku lub homodimer lub heterodimer według wynalazku; przy czym opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany i opcjonalnie aktywność fitazy jest termotolerancyjna lub termostabilna. W jednym z przykładów wykonania jadalna macierz dostarczająca zawiera granulat lub jadalna lub absorbowalna macierz dostarczająca wytwarzana jest w postaci granulatu, pigułki, tabletki, kapsułki, żelu, tabletki żelowej, spreju, proszku, liofilizowanej formulacji, formulacji farmaceutycznej, postaci płynnej, jako zawiesina lub papka lub wytwarzana jest z zastosowaniem dodatków powlekanych polimerem, lub wytwarzana w postaci granulatu, lub wytwarzana przez osuszanie rozpryskowe. [00] Wynalazek dostarcza jadalnych lub absorbowalnych granulatów, zawierających granulat jadalnego lub absorbowalnego nośnika oraz polipeptyd według wynalazku lub homodimer lub heterodimer według wynalazku; przy czym opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany i opcjonalnie aktywność fitazy jest termotolerancyjna lub termostabilna oraz opcjonalnie granulat wytwarzany jest w postaci granulatu, pigułki, tabletki, kapsułki, żelu, tabletki żelowej, spreju, proszku, liofilizowanej formulacji, formulacji farmaceutycznej, postaci płynnej, jako zawiesina lub papka lub wytwarzany jest z zastosowaniem dodatków powlekanych polimerem, lub wytwarzany w postaci granulatu, lub wytwarzany przez osuszanie rozpryskowe. [0041] Wynalazek dostarcza mączek, np. mączki sojowej, zawierających polipeptyd według wynalazku lub homodimer lub heterodimer według wynalazku i opcjonalnie mączka, np. mączka sojowa, wytwarzana jest jako granulat, pigułka, tabletka, kapsułka, żel, tabletka żelowa, sprej, proszek, liofilizowana formulacja lub postać płynna. [0042] Sposoby zwiększania odporności polipeptydu fitazy na inaktywację enzymatyczną w układzie trawiennym zwierzęcia obejmują glikozylowanie polipeptydu fitazy, zawierającego polipeptyd według wynalazku, co zwiększa w ten sposób odporność polipeptydu fitazy na inaktywację enzymatyczną w układzie trawiennym zwierzęcia, a opcjonalnie glikozylacja jest N-glikozylacją oraz, opcjonalnie, polipeptyd fitazy jest glikozylowany jako wynik ekspresjonowania in vivo polinukleotydu kodującego fitazę w komórce, oraz, opcjonalnie, komórka jest komórką eukariotyczną oraz, opcjonalnie, komórka eukariotyczna jest komórką grzybową, komórką roślinną lub komórką ssaczą. [0043] Wynalazek dostarcza sposobów obróbki ziarna kukurydzy i sorga, obejmujących następujące etapy: (a) zapewnianie polipeptydu o aktywności fitazy, przy czym polipeptyd zawiera polipeptyd według wynalazku; (b) zapewnianie kompozycji zawierającej płyn z rozmiękczania kukurydzy lub płyn z 11

13 1 2 3 rozmiękczania sorga; oraz (c) kontaktowanie polipeptydu z etapu (a) i kompozycji z etapu (b) w warunkach, w których polipeptyd może rozszczepiać połączenie inozytolu-nieorganicznego fosforanu. [0044] Wynalazek dostarcza środków farmaceutycznych lub formulacji żywieniowych, zawierających polipeptyd według wynalazku lub heterodimer; przy czym opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany i opcjonalnie środek farmaceutyczny lub formulacja żywieniowa formułowana jest w postaci granulatu, pigułki, tabletki, kapsułki, tabletki żelowej, spreju, proszku, lotionu lub postaci płynnej lub wytwarzana jest z zastosowaniem dodatków powlekanych polimerem, lub jako implant, lub wytwarzana w postaci granulatu, lub wytwarzana przez osuszanie rozpryskowe. [004] Wynalazek dostarcza kompozycji zawierających polipeptyd według wynalazku lub heterodimer; i (b) jakikolwiek produkt jak określono w Tabeli 2 lub jakąkolwiek kompozycję wymienioną w Tabeli 1; przy czym opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany. [0046] Wynalazek dostarcza jednostki samodzielnej racji żywnościowej [ang. meal ready-to-eat, (MRE), napoju lub środka nawadniającego, zawierającego polipeptyd według wynalazku lub heterodimer; przy czym opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany. [0047] Wynalazek dostarcza kompozycji do łagodzenia (spowalniania postępu, leczenia lub zapobiegania) osteoporozie do podawania osobnikowi, który tego potrzebuje, skutecznej ilości (dawki) kompozycji zawierającej polipeptyd według wynalazku lub heterodimer; przy czym opcjonalnie polipeptyd jest glikozylowany. [0048] Przykłady wykonania wynalazku określono w towarzyszących zastrzeżeniach patentowych. [0049] Szczegóły dotyczące jednego lub więcej spośród aspektów obecnego wynalazku przedstawiono na towarzyszących rysunkach i w poniższym opisie. Inne cechy, przedmioty i korzyści wynalazku będą wynikać z następującego opisu i rysunków oraz z zastrzeżeń. KRÓTKI OPIS RYSUNKU [000] Następujące Figury ilustrują przykłady wykonania wynalazku i nie mają one za zadanie ograniczania zakresu wynalazku objętego zastrzeżeniami. Figura 1 jest diagramem blokowym systemu komputerowego, jak opisano szczegółowo poniżej. Figura 2 jest schematem blokowym ilustrującym jeden z aspektów procesu 0 dla porównania nowej sekwencji nukleotydowej lub białkowej z bazą danych sekwencji, w celu określenia poziomów homologii między nową sekwencją i sekwencjami w bazie danych, jak opisano szczegółowo poniżej. Figura 3 jest schematem blokowym ilustrującym jeden z przykładów wykonania procesu w komputerze, dla określenia, czy dwie sekwencje są homologiczne, jak opisano szczegółowo poniżej. Figura 4 jest schematem blokowym ilustrującym jeden z aspektów procesu identyfikacji dla wykrywania obecności cechy w sekwencji, jak opisano szczegółowo poniżej. Figura ilustruje podsumowanie aktywności reszt z oczyszczonych polipeptydów według wynalazku, przykładowych sekwencji z pojedynczą mutacją według wynalazku, po obróbce cieplnej w różnych temperaturach przez minut; gdzie aktywność fitazy oznaczana jest za pomocą substratu fluorescencyjnego, a wielkości porównano do wielkości każdej z odpowiadających próbek nie poddanych obróbce; jak opisano szczegółowo w Przykładzie 1, poniżej. Figura 6 ilustruje podsumowanie aktywności reszt z oczyszczonych polipeptydów według wynalazku, zawierających "zmieszane" mutacje pojedynczych reszt (fitazy zawierające liczne mutacje), po obróbce cieplnej w termocyklerze; gdzie aktywność fitazy oznaczana jest za pomocą substratu fluorescencyjnego, 12

14 1 2 3 a wielkości porównano do wielkości każdej z odpowiadających próbek nie poddanych obróbce; jak podsumowano na Figurze 6; jak opisano szczegółowo w Przykładzie 1, poniżej. Figura 7 w sposób graficzny podsumowuje dane stosowane do wygenerowania wykresu z Figury 6; jak opisano szczegółowo w Przykładzie 1, poniżej. Figura 8 ilustruje sekwencję wyjściowej fitazy SEKW. o NR ID.:2 i mutacje sekwencji wygenerowane za pomocą mutagenezy opartej na wysyceniu loci genowych [ang. gene site saturation mutagenesis, GSSM], wybrane do konstrukcji biblioteki GeneReassembly ; jak opisano szczegółowo poniżej. Figura 9 ilustruje przykładowe fitazy, mające modyfikacje licznych reszt w stosunku do wyjściowej SEKW. o NR ID.:2; jak niniejszym opisano szczegółowo. Figura ilustruje przykładowe fitazy, mające modyfikacje pojedynczej reszty w stosunku do wyjściowej SEKW. o NR ID.:2; jak niniejszym opisano szczegółowo. Figura 11 w sposób schematyczny ilustruje przykładowe oznaczenie fitazy według wynalazku, z zastosowaniem substratu fluorescencyjnego fosforanu 4-metyloumbelliferylu (fosforan MeUMB); jak opisano szczegółowo w Przykładzie 1, poniżej. Figura 12 w sposób schematyczny ilustruje przykładowe oznaczenie fitazy według wynalazku, z zastosowaniem substratu fluorescencyjnego fosforanu MeUMB; jak opisano szczegółowo w Przykładzie 1, poniżej. Figura 13 w sposób schematyczny ilustruje protokół przykładowego badania przesiewowego biblioteki, jak opisano na Figurze 12, jak opisano szczegółowo w Przykładzie 1, poniżej. Figura 14 ilustruje przykładowy proces alkoholowy, który obejmuje zastosowanie fitaz według tego wynalazku. [001] Podobne symbole odniesienia w różnych rysunkach wskazują podobne elementy. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [002] Wynalazek dotyczy polipeptydów fitazy, zawierających modyfikacje specyficznych reszt w SEKW. o NR ID.:2, jak opisano powyżej oraz kodujące je polinukleotydy (np. zawierające modyfikacje szczególnych par zasad w SEKW. o NR ID.:1, jak opisano powyżej), jak również sposoby zastosowania polinukleotydów i polipeptydów. Figura ilustruje przykładowe fitazy mające modyfikacje pojedynczej reszty w wyjściowej SEKW. o NR ID.:2, a Figura 9 ilustruje przykładowe fitazy mające modyfikacje licznych reszt w wyjściowej SEKW. o NR ID.:2. [003] Aktywność fitazy polipeptydów według wynalazku może obejmować enzymy o aktywności fitazy, przykładowo enzymy zdolne do katalizowania degradacji fitynianu, np. katalizy fitynianu (heksafosforanu mioinozytolu) do inozytolu i nieorganicznego fosforanu. Fitazy według wynalazku obejmują enzymy termotolerancyjne i termoodporne. [004] Fitazy i polinukleotydy kodujące fitazy według wynalazku są użyteczne w procesach, sposobach i kompozycjach. Przykładowo, jak omówiono powyżej, fitaza może być stosowana w karmie dla zwierząt oraz suplementach karmy, jak również w leczeniu dla obniżenia lub usunięcia fitynianu ze środowiska lub próbki. Inne zastosowania będą oczywiste dla znawców stanu techniki w oparciu o zapewniane tam zalecenia, włączając te omówione powyżej. [00] W jednym z aspektów, cząsteczki fitazy według wynalazku - same lub w kombinacji z innymi odczynnikami (włączając, ale w sposób nieograniczający, enzymy, takie jak proteazy, amylazy i tym podobne) - stosowane są w przetwarzaniu żywności, np. dla zapobiegania powstawania niechcianego osadu kukurydzy oraz w innych zastosowaniach, w których pożądana jest hydroliza fitynianu. 13

15 1 2 3 [006] W jednym z aspektów, cząsteczki fitazy według wynalazku stosowane są do eliminowania lub obniżania obecności niezhydrolizowanego fitynianu, szczególnie gdy niezhydrolizowany fitynian prowadzi do konsekwencji problematycznych w procesach ex vivo, włączając - ale w sposób nieograniczający - przetwarzanie żywności. W jednym z aspektów, cząsteczki fitazy według wynalazku stosowane są w procedurach opisanych w EP034-B1I (Vaara et al.), włączając etapy przetwarzania ziaren kukurydzy i sorga, gdzie ziarna twarde są rozmiękczane w wodzie w celu ich zmiękczenia. Substancje rozpuszczalne w wodzie, które są wymywane podczas tego procesu, stają się częścią płynu z rozmiękczania kukurydzy, który jest zatężany przez odparowywanie. Niezhydrolizowany kwas fitynowy w płynie z rozmiękczania kukurydzy, w dużej mierze w postaci soli wapnia i magnezu, związany jest z fosforem i odkłada niepożądany osad z białkami i jonami metali. Ten osad stwarza problemy przy odparowywaniu, transporcie i przechowywaniu płynu z rozmiękczania kukurydzy. Do hydrolizowania tego osadu stosuje się cząsteczki fitazy według wynalazku. [007] W jednym z aspektów, fitazy według wynalazku mogą zapewniać zasadniczo lepsze działanie niż zidentyfikowane uprzednio cząsteczki fitaz, np. cząsteczki fitaz pochodzenia grzybowego. W jednym z aspektów, enzymy według wynalazku mogą mieć w przybliżeniu 40 U/mg lub więcej niż w przybliżeniu między od 0 do 0 lub od 0 do 00 lub od 0 do 00 U/mg białka. [008] Wynalazek dostarcza również sposobów zmieniania cech fitazy według wynalazku, przez mutagenezę i inne metody, jak omówiono szczegółowo poniżej. Generowanie i manipulowanie kwasami nukleinowymi [009] Wynalazek dostarcza kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy i fitazy według wynalazku. Wynalazek dostarcza również kaset ekspresyjnych, wektorów, takich jak wektory ekspresyjne lub do klonowania, nośników do klonowania, takich jak wektor wirusowy, plazmid, fag, fagemid, kosmid, fosmid, bakteriofag lub sztuczny chromosom, które mogą zawierać lub mają zawarty w sobie kwas nukleinowy według wynalazku. [0060] Ujawnienie obejmuje sposoby odkrywania nowych sekwencji fitaz z zastosowaniem kwasów nukleinowych według wynalazku. Sposoby modyfikowania kwasów nukleinowych według wynalazku obejmują np. ponowne składanie za pomocą syntetycznej ligacji, zoptymalizowany system ewolucji ukierunkowanej i/lub mutagenezę wysycania. [0061] W jednym z aspektów wynalazek dostarcza rodzaju kwasów nukleinowych, które są syntetycznie wytworzonymi wariantami wyjściowej SEKW. o NR ID.:1, przy czym kwasy nukleinowe według wynalazku mają co najmniej 9%, 96% 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z "wyjściową" SEKW. o NR ID.:1 i zawierają jedną specyficzną i co najmniej jedną, dwie, trzy, cztery, pięć, sześć, siedem, osiem, dziewięć, dziesięć, jedenaście, dwanaście lub wszystkie trzynaście modyfikacji par zasad w sekwencji nukleotydowej w SEKW. o NR ID.:1, [0062] jak określono powyżej. Jako odnośnik literaturowy, wyjściowa SEKW. o NR ID.1: ujawniona w US 0/ to: 14