Fragmentacja białek mapy peptydowe

Transkrypt

1 Rozdział 8 Fragmentacja białek mapy peptydowe Fundamentalnym krokiem do poznania struktury białka jest enzymatyczna lub chemiczna degradacja białkowej makromolekuły do mniejszych fragmentów, które mogą być dokładnie scharakteryzowane w kontekście ich składu aminokwasowego i sekwencji. bydwa sposoby fragmentacji białek muszą spełniać kryteria stosunkowo wysokiej selektywności, powtarzalności i wydajności. Wymagania te sprawiają, Ŝe tylko niewielka część dostępnych metod fragmentacji białek znalazła szersze zastosowanie w sekwencyjnej praktyce laboratoryjnej Metody enzymatyczne Peptydazy naleŝące do klasy hydrolaz ( E 3.4._._) hydrolizują wiązania peptydowe powodując fragmentacje białek do peptydów i dalej do aminokwasów. Wśród szerokiego spektrum enzymów proteolitycznych tylko niewiele z nich posiada wystarczająco wysoką specyficzność pozwalającą na ich zastosowanie w laboratoryjnej praktyce fragmentacji białek dla celów sekwencyjnych.. aleŝy pamiętać jednak, Ŝe enzymy równieŝ są białkami. Zatem do ich prawidłowego działania konieczne jest zachowanie warunków zapewniających natywną konformację enzymu, która warunkuje jego aktywność. Stworzenie warunków stabilności i aktywności enzymu często nie idzie w parze z koniecznością zdenaturowania trawionego białka natywne białka są z zasady oporne na działanie enzymów proteolitycznych. Kolejnym problemem jest konieczność usunięcia enzymu z mieszaniny poreakcyjnej, co jest często kłopotliwe. aleŝy równieŝ zwrócić uwagę na fakt, Ŝe nie wszystkie białka moŝna strawić w poŝądany sposób. czywistym przykładem moŝe być oporność białkowych inhibitorów proteaz na działanie enzymów proteolitycznych. WaŜnym warunkiem jest takŝe konieczność stosowania bardzo czystych preparatów enzymatycznych by uniknąć niespecyficznego trawienia i dodatkowego zanieczyszczenia trawionego białka. Tu przykładem moŝe być wymóg stosowania preparatu trypsyny pozbawionej aktywności chymotrypsyny. WyŜej wymienione warunki sprawiają, Ŝe tylko kilka enzymów proteolitycznych stosuje się powszechnie do fragmentacji białek dla celów sekwencyjnych.

2 Trypsyna (E ) jest jednym z najbardziej specyficznych i dostępnych enzymów proteolitycznych, a z pewnością najbardziej szeroko uŝywanym. Jest jednym z kilku enzymów trawiennych wydzielanych do przewodu pokarmowego zwierząt. Wytwarzana jest w trzustce w formie proenzymu trypsynogenu. Jego aktywacja następuje poprzez proteolityczną obróbkę innym enzymem enteropeptydazą lub samą trypsyną. Trypsyna trawi specyficznie wiązania peptydowe po -końcowej stronie lizyny i argininy ( Lys-X, Agr- X ). Są jednak wyjątki od tej reguły. Gdy po reszcie lizyny lub argininy występuje prolina to wiązanie jest prawie całkowicie odporne na trawienie trypsyną. becność ujemnie naładowanych grup po którejkolwiek stronie reszty Lys lub Arg moŝe prowadzić do zmniejszenia wydajności trawienia lub nawet do zupełnej oporności wiązania na działanie enzymu. RównieŜ wiązania peptydowe w układach Arg-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys i Lys-Arg nie ulegają hydrolizie pod wpływem trypsyny. Trypsyna jest proteinazą serynową, która maksymalną aktywność wykazuje w p 7 9. MoŜe być odwracalnie inaktywowana poprzez obniŝenie p poniŝej 4. Jest odporna na łagodne warunki denaturujące. Zachowuje 48% aktywności w 4M moczniku i w 2M chlorowodorku guanidyny. Trypsyna jest szybko i nieodwracalnie inaktywowana przez DFP i PMSF. Istnieje teŝ szereg specyficznych białkowych inhibitorów trypsyny (trasylol, STI). Dodatnio naładowane aminokwasy ( Lys, Arg ) występują w sekwencji białek stosunkowo często, (ponad 10%). Trawienie trypsyną prowadzi więc do uzyskania duŝej liczby niewielkich peptydów. Aby zmniejszyć częstotliwość hydrolizy, a przez to zwiększyć długość powstających peptydów naleŝy skrócić czas inkubacji z enzymem lub zabezpieczyć jedne z reszt poprzez odpowiednie modyfikacje. Specyficzność trawienia trypsyny moŝna ograniczyć do reszt argininy przez odwracalne zablokowanie ε-aminowych grup lizyny. MoŜna to osiągnąć poprzez działanie bezwodnikiem kwasu metylomaleinowego lub acetylację bezwodnikiem kwasu octowego. Analogicznie aby uzyskać trawienie jedynie po resztach lizyny naleŝy odwracalnie zablokować reszty argininy 1,2- cykloheksanodionem Trombina (E ), znana takŝe jako czynnik IIa w kaskadzie krzepnięcia krwi, jest proteinazą serynową przekształcającą w warunkach fizjologicznych fibrynogen do fibryny. Wykazano teŝ aktywność tego enzymu w stosunku do troponiny i kalmoduliny. W organizmie jest szybko neutralizowana przez specyficzne inhibitory, antytrombinę i heparynowy czynnik II. ajbardziej skuteczne inhibitory tego enzymu wyizolowano jednak ze zwierząt odŝywiających się krwią hirudynę z pijawki lekarskiej oraz rodninę (ang.

3 rhodniin) z owada Rhodnius prolixus. Trombina trawi wiązanie peptydowe pomiędzy argininą i glicyną. MoŜe jednak trawić teŝ wiązania Arg X, gdzie X to Ala, Arg, Asp, ys, Val lub is. Ta wysoka specyficzność trombiny sprawia, Ŝe tylko niektóre wiązania za resztą argininy będą trawione. Stwarza to moŝliwość uzyskania duŝych fragmentów białek w wyniku ograniczonej proteolizy. Trombina największą aktywność wykazuje w p zbliŝonym do 8. Jony a + zwiększają aktywność tego enzymu w stosunku do fibrynogenu i substratów syntetycznych. Kompleks a + - trombina nazywany bywa szybką formą tego enzymu. Proteinaza V8 (E ), zwana teŝ GluV8 lub Endo Glu, została wyizolowana ze szczepu V8 bakterii Staphylococcus aureus. Trawi głównie wiązania peptydowe po - końcowej stronie kwasu glutaminowego (Glu). Wyjątek stanowi wiązanie Glu Pro. Specyficzność substratowa tego enzymu zmienia się w zaleŝności od zastosowanych warunków i moŝe równieŝ obejmować trawienie po resztach kwasu asparaginowego (Asp). Proteinaza V8 jest aktywna w szerokim zakresie p (4,0 7,8). Zachowuje aktywność w 0,2 % SDS i 50% aktywności w 4M moczniku. Enzym jest nieodwracalnie hamowany przez PMSF i DFP, jednak oprócz α-2 makroglobuliny nie hamuje jej Ŝaden znany inhibitor białkowy. lostripaina (E ) wyizolowana została z medium hodowlanego beztlenowej bakterii lostridium histolyticum. Jest heterodimerem o podjednostkach 43 i 15,4 kda. ydrolizuje wiązania peptydowe głównie po resztach argininy, choć trawienie po resztach lizyny teŝ zachodzi lecz w znacznie mniejszym stopniu. Aktywność clostripainy zaleŝy od obecności wolnej grupy -S cysteiny enzymu. Zatem środowisko reakcji wymaga obecności czynników redukujących. Absolutnie konieczne są równieŝ jony a 2+. Potencjalne inhibitory to czynniki utleniające i jony metali cięŝkich. Bufor cytrynianowy, boranowy i Tris równieŝ częściowo inaktywują enzym. Leupeptyna jest z kolei najbardziej skutecznym odwracalnym inhibitorem. Selektywność hydrolizy wiązań peptydowych przez clostipainę sprawia, Ŝe jest ona uŝytecznym narzędziem w analizie sekwencji aminokwasowej białek. Specyficzność trawienia odpowiada tej uzyskiwanej przy uŝyciu trypsyny po zablokowaniu reszt lizyny w trawionym białku.

4 ligopetydaza prolilowa (E ) (dawna nazwa ang. post-proline cleaving enzyme została odkryta w ludzkiej macicy jako enzym degradujący oksytocynę. Enzym ten występuje jednak szeroko w mikroorganizmach, roślinach i zwierzętach. ligopeptydaza pochodząca z Flavobacterium meningosepticum jest handlowo dostępna. W warunkach fizjologicznych hydrolizuje wiązanie po karboksylowej części reszty proliny (Pro-X) w biologicznie aktywnych peptydach takich jak oksytocyna, wazopresyna, gonadoliberyna, bradykinina i inne. Przydatność enzymu wynika z moŝliwości trawienia białek przy reszcie proliny, to jest w miejscu gdzie zawodzi większość powszechnie stosowanych enzymów proteolitycznych. graniczeniem w zastosowaniu do chemii białek jest niestety oporność na trawienie tym enzymem większych białek. Tabela 8-1: Proteazy o wysokiej specyficzności. Enzym ptimum Główne miejsca p trawienia Wyjątki Trypsyna 7 9 -Lys-X-; -Arg-X-; - -Lys-Pro-; -Lys-Lys-; -Lys- Aec-X- Arg-; -Arg-Arg-; -Arg-Lys- Trombina 8 -Arg-X- (X = Gly, Ala, Val, Asp, ys, Arg) Proteinaza V8 4 & 7,8 -Glu-X-; (-Asp-X-)* -Glu-Pro-; -Glu-Glu- Klostrypaina 7,7 -Arg-X-; (-Lys-X-)* ligopeptydaza prolilowa (ang. post-proline cleaving enzyme) 7,5 8 -Pro-X- -Pro-Pro- * dodatkowe miejsca trawienia, Aec- aminoetylocysteina hymotrypsyna (E ) jest drugim głównym, obok trypsyny, trzustkowym enzymem trawiennym. ydrolizuje ona wiązania peptydowe po -końcowej stronie tyrozyny, fenyloalaniny, tryptofanu i leucyny. W zaleŝności od P1` aminokwasu zaobserwowano równieŝ moŝliwość trawienia przez chymotrypsynę wiązań po reszcie asparaginiy, lizyny,

5 glutaminy, histydyny, izoleucyny, treoniny i seryny. Stwierdzono zupełny brak hydrolizy po reszcie proliny. Karboksypeptydazy (E _) są jednym z klanów metalopeptydaz. aleŝy tu kilkanaście enzymów o właściwościach egzopeptydaz. Wszystkie one zawierają charakterystyczny układ centrum aktywnego w skład którego wchodzi jon cynku koordynowany tetraedrycznie przez cząsteczkę wody, dwie histydyny i kwas glutaminowy. Karboksypeptydazy uwalniają aminokwasy od strony wolnego -końca peptydów i białek. Enzymy te mają kluczowe znaczenie w degradacji białek pokarmowych do wolnych aminokwasów. W warunkach fizjologicznych karboksypeptydazy działają na peptydy powstałe w wyniku działania endopeptydaz takich jak trypsyna, chymotrypsyna czy pepsyna. Karboksypeptydaza A uprzywilejowanie odtrawia aminokwasy aromatyczne i apolarne np. Phe, Tyr, Trp, Leu czy Ile. Karboksypeptydaza B (podobnie U i E) uwalnia aminokwasy dodatnio naładowane Lys, Arg z peptydów powstałych przez trawienie trypsyną. Poprzez kontrolowaną proteolizę za pomocą karboksypeptydaz moŝna zidentyfikować kilka -końcowych aminokwasów w białku. Termolizyna (E ) jest pozakomórkową metaloendopeptydazą wydzielaną przez termofilne bakterie Bacillus thermoproteolyticus. Jest szeroko uŝywaną w chemii białek niespecyficzną proteazą. Trawi ona wiązania peptydowe po -końcowej stronie Leu, Phe, Ile, Val, Tyr i Trp. Zaobserwowano równieŝ hydrolizę wiązań przy innych resztach aminokwasowych. Termolizyna posiada takŝe aktywność syntetazy peptydowej. ptimum działania tego enzymu przypada w okolicach p obojętnego. Podobnie jak w przypadku trypsyny chlorek wapnia w stęŝeniach milimolowych stabilizuje strukturę enzymu i zapobiega jego autolizie. Enzym jest hamowany przez bufor fosforanowy i milimolowe stęŝenia czynników chelatujących jony cynku. EDTA inaktywuje enzym nieodwracalnie poniewaŝ preferencyjnie chelatuje jony a 2+ prowadząc do autolizy. Termolizyna jest enzymem termostabilnym. ie traci aktywności po godzinie inkubacji w 60 0 i zachowuje znaczącą aktywność w temperaturze Enzym jest stabilny w 8M moczniku, 20% etanolu i 0,5% SDS, choć te warunki zwiększają moŝliwość termicznej denturacji. Elastazy definiowane są poprzez ich zdolność do uwalniania peptydów z nierozpuszczalnych włókien elastyny. Elastaza trzustkowa (E ) jest proteinazą serynową wykazującą szeroką specyficzność. Główne miejsca trawienia to wiązania peptydowe po -końcowej

6 części małych hydrofobowych aminokwasów jak alanina.. ptimum działania tego enzymu zbliŝone jest do obojętnego. amowana jest niespecyficznie i nieodwracalnie przez inhibitory proteinaz serynowych (DFP i PMSF) jak równieŝ przez występujące w surowicy alfa-1- proteinazę (α1pi) i alfa-2-makroglibulinę (α2m). Pepsyna (E ) jest podstawową kwaśną proteazą soku Ŝołądkowego. Wykazuje aktywność w zakresie p od 2 do 5. Enzym jest nieodwracalnie inaktywowany powyŝej p 6,0. Aktywność pepsyny hamowana jest przez pepstatynę i inne inhibitory proteinaz aspartylowych. Aktywność pepsyny w niskim p pozwala na wykorzystanie jej do badania procesów tworzenia mostków disiarczkowych w białkach, gdyŝ środowisko takie minimalizuje prawdopodobieństwo rearanŝacji tworzonych mostków. Tabela 8-2: Proteazy o mniejszej specyficzności. Enzym ptimum p Miejsca trawienia Wyjątki hymotrypsyna X- --Pro- = Tyr, Phe, Trp, Leu Termolizyna 7 8 -X-- -X--Pro = Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp Pepsyna 2 -X--Y, -X--Y- jest aromatycznym lub duŝym - Alifatycznym aminokwasem Elastaza Y- = Ser, Ala, Gly, Val, Leu Metody chemiczne hemiczne metody fragmentacji łańcucha polipeptydowego wykorzystują unikalną moŝliwość modyfikacji łańcuchów bocznych poszczególnych aminokwasów w białku powodujących zerwanie, przylegającego do modyfikowanej grupy, wiązania peptydowego. Idealna procedura selektywnej chemicznej fragmentacji musi spełniać kryteria wysokiej specyficzności i wydajności; idealnie bez uzyskiwania produktów ubocznych. iestety wiele z proponowanych metod nie spełnia wyŝej wymienionych warunków w stopniu wystarczającym. Wysoka specyficzność jest istotnym wymaganiem przy fragmentacji białek do celów sekwencyjnych. Jest ona gwarantem uzyskania zakładanych przez badacza, ściśle

7 określonych fragmentów łańcucha polipeptydowego łatwych do późniejszego rozdziału i analizy Fragmentacja po resztach metioniny przy uŝyciu bromocyjanu (Br) Gross i Witkop wykazali, Ŝe bromocyjan reaguje, w środowisku kwaśnym, z siarką łańcucha bocznego reszty metioniny powodując zerwanie wiązania peptydowego po karboksylowej części metioniny. Reakcja jest wysoce specyficzna, a przeciętna wydajność sięga %. Wydajność trawienia białka moŝe zostać obniŝona w wyniku obecności układu Met-Thr lub Met-Ser, gdyŝ wiązanie peptydowe pomiędzy tymi aminokwasami jest bardziej odporne na działanie Br. Zastąpienie kwasu mrówkowego, trifluorooctowym zwiększa wydajność trawienia tych wiązań. Kwaśne środowisko reakcji moŝe powodować hydrolizę wiązania Asp-Pro, co naleŝy uwzględnić podczas planowania i analizy wyników trawienia. Reakcja jest stosunkowo prosta do przeprowadzenia i moŝliwa do zaadoptowania dla niewielkich mikrogramowych ilości białka. Dodatkową zaletą tej metody jest moŝliwość łatwego usunięcia produktów ubocznych poprzez liofilizację. Warto zaznaczyć, Ŝe metionina jest jednym z najrzadziej występujących aminokwasów w białkach. Zatem generowane w reakcji z Br peptydy są odpowiednio duŝe i idealnie nadają się do sekwencjonowania. Mechanizm reakcji przedstawia się następująco: grupa cyjanowa bromocyjanu przeprowadza atak elektrofilowy na atom siarki metioniny (1) tworząc przejściową sól cyjanosulfonową (2). astępnie nukleofilowy atak atomu tlenu grupy karbonylowej metioniny na atom węgla γ łańcucha bocznego prowadzi do uwolnienia tiocyjanku metylu (6) i utworzenia iminolaktonu (3). Iminolakton hydrolizuje dając peptydowy lakton homoseryny (4) ulegający dalszej hydrolizie do peptydowej homoseryny (7). Powstaje teŝ peptyd -końcowy z wolną grupą aminową (5).

8 '''' 2 R '''' ''' 2 R ''' 2 S 3 Br 1 2 S + 3 Br 2 ''' R Br 3 '''' 2 '''' R 4 5 '''' 3 S 6 ''' Rysunek 8-1: Mechanizm reakcji fragmentacji łańcucha polipetydowego przy uŝyciu bromocyjanu. Kwas uŝyty w reakcji powoduje protonację zasadowych grup funkcyjnych w białku chroniąc je przed reakcją z Br. Zapewnia to specyficzność reakcji. ajczęściej uŝywany jest 70% kwas mrówkowy, gdyŝ jest dobrym rozpuszczalnikiem i denaturantem dla białek. Pozwala to na ekspozycję wszystkich reszt metioniny. MoŜe on jednak powodować modyfikacje reszt tryptofanu i tyrozyny oraz formylować grupy aminowe. Modyfikacji tych moŝna uniknąć stosując 50% kwas trifluorooctowy (TFA). W tym środowisku jednak reakcja przebiega wolniej Fragmentacje po resztach asparaginy Wiązanie peptydowe Asp-X- po stronie reszty karboksylowej, a szczególnie wiązanie -Asp- Pro- jest bardzo wraŝliwe na działanie rozcieńczonych kwasów. TakŜe wiązanie peptydowe X-Asp- po stronie aminowej moŝe być rozszczepiane z mniejszą wydajnością. Reakcje te przebiegają wg. schematu przedstawionego na rys. 8-2.

9 Rysunek 8-2: Schemat reakcji fragmentacji łańcucha polipeptydowego po stronie (A) i 2 asparaginy w rozcieńczonych kwasach. Kwas mrówkowy (70%) uŝywany wraz z Br do fragmentacji łańcuchów polipeptydowych po resztach metioniny teŝ powoduje rozszczepianie wiązania -Asp-X- (szczególnie -Asp-Pro). W niskim p następuje teŝ częściowa destrukcja tryptofanu oraz cyklizacja -końcowej reszty kwasu glutaminowego co moŝe być następnie powodem zablokowania degradacji Edmanowskiej przy próbach sekwencjonowania białka Fragmentacje po resztach tryptofanu Tryptofan jest jednym z najrzadziej występujących aminokwasów w polipeptydach, a zatem zerwanie wiązania peptydowego przy resztach tego aminokwasu generuje powstanie duŝych peptydów. Fragmenty te oprócz zastosowania do tworzenia map peptydowych czy do sekwencjonowania moŝna wykorzystać do mapowania miejsc wiązania przeciwciał lub miejsc fosforylacji. Pomimo, Ŝe nie zidentyfikowano dotychczas proteazy trawiącej spcyficznie łańcuch polipeptydowy tylko po resztach tryptofanu, reaktywność pierścienia indolowego tryptofanu stworzyła moŝliwość znalezienia selektywnych chemicznych metod fragmentacji łańcucha polipeptydowego przy resztach tego aminokwasu. Pomimo róŝnorodności odczynników i procedur odkrywanych przez lata, tylko kilka z nich znalazło zastosowanie w praktyce laboratoryjnej.

10 -bromo imid kwasu bursztynowego Większość stosowanych metod opiera się na oksydatywnej halogenacji pierścienia indolu tryptofanu. Pierwsza zaproponowana metoda fragmentacji wykorzystywała -bromo-imid kwasu bursztynowego (BS). Mechanizm tej reakcji przedstawia się następująco: w reakcji fragmentacji uczestniczą dwa dodatnie jonu halogenowe. Pierwszym produktem przejściowym jest związek (2) (rys. 6), który ulega konwersji do oksyindolu (5) w następujących po sobie reakcjach hydrolizy (2 3) i eliminacji (3 4). Drugi etap procesu obejmuje przekształcenie oksyindolu w pochodną 3-halooksyindolową (6) zachodzącą przy udziale drugiego dodatniego jonu halogenowego. ukleofilowy atak atomu tlenu grupy karboksylowej związanej z atomem węgla α reszty tryptofanu na atom węgla z przyłączonym atomem halogenu prowadzi do utworzenia iminolaktamu (8). Powstały iminolaktam ulega hydrolizie do laktonu -acylo-dioksyindoliloalaniny (9), który staje się -końcowym aminokwasem powstałego fragmentu łańcucha peptydowego. W warunkach laboratoryjnych reakcja przebiega w środowisku wysokiego stęŝenia kwasu octowego przez kilka do kilkunastu godzin. Te stosunkowo drastyczne warunki mogą powodować hydrolizę wraŝliwego wiązanie peptydowego Asp-Pro. MoŜliwość tą naleŝy uwzględnić przy planowaniu i analizie wyników fragmentacji łańcucha polipeptydowego.

11 1 2 "" "" X X "" "" """ """ -X, X 2 """ """ 4 3 """ """ """ X + X """ 2 6 """ """ "" """ """ Rysunek 8-3: Schemat reakcji fragmentacji łańcucha polipeptydowego po resztach tryptofanu przy uŝyciu BS (S).

12 Podstawowym problemem przy fragmentacji za pomocą BS jest niska wydajność rzędu kilku procent. Dodatkowo zachodzą niepoŝądane reakcje uboczne. BS jest związkiem niezwykle reaktywnym, który moŝe modyfikować a przez to prowadzić do fragmentacji nie tylko reszty tryptofanu lecz równieŝ tyrozyny i histydyny. W wyniku reakcji utleniona zostaje takŝe metionina i cysteina. By pokonać niedoskonałości poszukiwano innych związków tego typu dąŝąc do zwiększenia wydajności i selektywności fragmentacji. Br Rysunek 8-4: Wzór chemiczny -bromo-imidu kwasu bursztynowego (BS). -chloro-imid kwasu bursztynowego Wiązanie peptydowe po reszcie tryptofanu jest selektywnie rozcinane przez -chloro-imid kwasu bursztynowego (S) w środowisku kwaśnym. Mechanizm reakcji jest analogiczny jak dla BS. Wyniki uzyskane z porównania obu związków wskazują na niŝszą wydajność S i wolniejszy przebieg reakcji. iemniej jednak selektywność S jest duŝo większa. Reszty tyrozyny i histydyny nie są modyfikowane ani nie następuje fragmentacja w miejscu ich występowania. l Rysunek 8-5: Wzór chemiczny -chloro-imidu kwasu bursztynowego (S). BPS-skatol 3-bromo-3metylo-2-(2`-nitrofenylosulfonylo)-indolenina (BPS-skatol) jest znacznie bardziej selektywny niŝ BS. Po inkubacji mieszaniny aminokwasów z 10-krotnym nadmiarem BPS-skatolu w 50% kwasie octowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej, tryptofan był zupełnie nieobecny, metionina została przekształcona do sulfotlenku metioniny, cysteina utleniona do cystyny, a pozostałe aminokwasy odzyskano ilościowo. PoniewaŜ odczynnik jest wraŝliwy na światło i rozkłada się w temperaturze pokojowej, do

13 modyfikacji naleŝy uŝywać świeŝego odczynnika by zminimalizować reakcje uboczne. BPS-skatol moŝe czasami reagować z resztami tyrozyny, jednak dodatek wolnej tyrozyny do mieszaniny reakcyjnej minimalizuje ten efekt. Br 3 S 2 Rysunek 8-6: Wzór chemiczny BPS-skatolu Literatura Literatura źródłowa 1. Rosenberg I.M.: Protein analysis and Purification. Benchtop techniques. Birkhauser, Boston-basel-Berlin The protein protocols. andbook. Red.: J.M. Walker. umana Press Literatura uzupełniająca