data ĆWICZENIE 11 BIOCHEMIA PRZEWODU POKARMOWEGO

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 11 BIOCHEMIA PRZEWODU POKARMOWEGO W celu biochemicznej oceny funkcji przewodu pokarmowego wykorzystuje się m.in.: 1. próby oparte na ocenie wchłaniania węglowodanów: wchłanianie alf-ksylozy próba obciążenia laktozą 2. Próby oparte na ocenie wchłaniania tłuszczów: wchłanianie znakowanego trioleinianu i kwasu oleinowego wchłanianie witaminy A i karotenu 3. Próby oparte na ocenie wchłaniania białek: oznaczanie ilości azotu w kale próba z użyciem znakowanej jodem radioaktywnej albuminy Ponadto w diagnostyce chorób trzustki i chorób wątroby wykorzystuje oznaczanie aktywności enzymów, takich jak: -amylaza trzustkowa (PA, EC ), lipaza trzustkowa (PL, EC ), fosfatazy zasadowej (ALP, EC ), -glutamylotranspeptydaza (GGTP, GGT, EC ), 5 -nukleotydaza (5 -NT, EC ), cholinoesterazy (acetylocholinoesteraza AChE EC oraz butyrylocholinoesteraza BChE, EC ), aminotransferazy (alaninowa ALT, EC oraz asparaginianowa AST, EC ), izoenzym 5 dehydrogenazy mleczanowej (LDH-5, EC ). Występujące w przewodzie pokarmowym człowieka enzymy trawienne należą do klasy hydrolaz. Wykrywa się je w ślinie, soku żołądkowym, soku trzustkowym i jelitowym, a także w błonie komórkowej enterocytów skierowanej do światła jelita (w rąbku szczoteczkowym). Na ich aktywność wpływa ph (bardzo zróżnicowane w przewodzie pokarmowym) i obecność jonów. Doświadczenie 1 Cel: Wykrywanie własności trawiennych śliny (wykazanie aktywności amylazy ślinowej). Ślina zawiera α-amylazę ślinową (EC , glukohydrolaza-1 1,4-α-D-glukanu). Należy ona do klasy hydrolaz (EC 3.), podklasy hydrolaz działających na związki glikozydowe (EC 3.2), podpodklasy hydrolaz glikozydów (EC 3.2.1). α-amylaza działa w ph 6,6-6,8 i w obecności jonów Ca 2+ (utrzymują odpowiednią konformację białka enzymatycznego) i Cl - (aktywator enzymu). W wyniku jej działania jamę ustną opuszczają produkty wstępnej hydrolizy skrobi: dekstryny (zazwyczaj z jednym wiązaniem α-1-6-glikozydowym), maltoza i izomaltoza. str. 1

2 Zawarta w ślinie amylaza ślinowa hydrolizuje skrobię. Obecność skrobi w środowisku wodnym wykrywa się poprzez dodanie do badanej próbki roztworu jodu w KI. Powstaje wówczas produkt o barwie granatowej. O aktywności enzymu w ślinie świadczy ujemna próba z jodem (I2 w wodnym roztworze KI). Przygotowanie materiału do badań Do zlewki należy pobrać około 0,5 cm 3 śliny. Do śliny dodaj 9.5 cm 3 wody destylowanej (aktywność enzymu oznacza się w 20-krotnie rozcieńczonej wodą ślinie). bufor fosforanowy o ph % roztwór wodny NaCl 1% roztwór wodny skrobi I2 w KI 2 mol/l roztwór HCl W probówce należy przygotować wstępną mieszaninę inkubacyjną poprzez zmieszanie: 1.0 cm 3 buforu fosforanowego ph cm 3 0,9% NaCl 2.5 cm 3 1% roztworu skrobi Zawartość probówki należy wymieszać, wstawić probówkę do łaźni o temperaturze 37 o C i pozostawić tam przez cały czas trwania doświadczenia. Po 5 minutach dodać do wstępnej mieszaniny inkubacyjnej będącej w łaźni (37 o C) 0.5 cm 3 rozcieńczonej śliny i wymieszać zawartość probówki (powstaje końcowa mieszanina inkubacyjna). Przygotuj 6 probówek zawierających 1 kroplę I2 w KI i 1 kroplę roztworu HCl o stężeniu 2 mol/l i podpisz je odpowiednio: 0-6. Czasami 7 probówek może nie wystarczyć do oznaczania obecności skrobi, należy wówczas dodać kolejne i wydłużyć czas oznaczenia. oznaczenie probówki I2 w KI 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 2 mol/l roztwór HCl 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla Do kolejnych probówek dodawaj końcową mieszaninę inkubacyjną po wskazanych czasach inkubacji. czas inkubacji w temperaturze 37 o C końcowa mieszanina inkubacyjna bezpośrednio po dodaniu śliny 1 minuta 2 minuty 3 minuty 4 minuty 5 minut 6 minut 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople Obserwacje: str. 2

3 Doświadczenie 2 Cel: Badanie wpływu ph na aktywność pepsyny. Pepsyna jest endopeptydazą soku żołądkowego wykazującą najwyższą aktywność w ściśle określonym ph. Hydrolizuje ona wiązania peptydowe od strony N-końca aminokwasów: Tyr; Phe; Trp; Leu; Glu; Gln. Skrawki ugotowanego białka jaja kurzego umieszcza się w mieszaninach inkubacyjnych różniących się wartością ph. W próbie o odpowiednim dla aktywności pepsyny ph białko jaja kurzego ulegnie strawieniu. 0.2 mol/l roztwór wodny HCl bufor o ph 6.0 bufor o ph 7.0 2% roztwór pepsyny Przygotuj 4 szklane probówki, podpisz odpowiednio jako: 1-4 i wprowadź do nich odpowiednio: numer probówki mol/l HCl 0.5 cm bufor o ph cm bufor o ph cm 3 - woda destylowana cm 3 2% roztwór pepsyny 0.5 cm cm cm cm 3 skrawek białka jaja kurzego Próbki inkubuj w temperaturze 37 C. Zanotuj wynik obserwacji po 5, 15, 30 i 60 minutach inkubacji. Obserwacje: str. 3

4 Doświadczenie 3 Cel: Wykazanie aktywności trypsyny. Sok trzustkowy po połączeniu z treścią pokarmową pochodzącą z żołądka zobojętnia ph soku dwunastniczego (jelitowego). Do dwunastnicy dostaje się też żółć z pęcherzyka żółciowego. W tym środowisku działają: trypsyna, chymotrypsyna, elastaza, karboksypeptydazy, aminopeptydazy, amylaza trzustkowa, nukleazy i disacharydazy (z enterocytów) oraz lipaza trzustkowa. W jelicie wchłaniane są produkty trawienia węglowodanów, białek, tłuszczów, a także jony, witaminy oraz woda. Trypsyna jest endopeptydazą działającą w ph 7-9. Hydrolizuje ona wiązania peptydowe, w których grupy karboksylowe pochodzą od następujących aminokwasów: Liz ; Arg. W hydrolizacie białkowym formalina blokuje grupy aminowe, a wolne grupy karboksylowe są miareczkowane roztworem zasady sodowej (metoda wg Soerensena). Ilość zużytej zasady jest miarą aktywności trypsyny. roztwór żelatyny formalina z fenoloftaleiną roztwór trypsyny w buforze o ph mol/l roztwór NaOH Przygotuj 4 kolbki Erlenmeyera, podpisz odpowiednio jako: 1-4. W kolbie nr 1 przygotuj mieszaninę inkubacyjną: dodaj 10 cm 3 roztworu żelatyny i wstaw kolbę do łaźni o temp. 37 C. Po pięciu minutach do tej samej kolby dodaj 3 cm 3 trypsyny w buforze o ph 8.0, wymieszaj, szybko (bez wyjmowania kolby z łaźni) pobierz 2 cm 3 pełnej mieszaniny inkubacyjnej i przenieś do kolby nr 2 (czas 0). Podobnie postępuj z kolejnymi porcjami ostatecznej mieszaniny inkubacyjnej w odstępach czasu wskazanych w tabeli. Do kolejnych kolb wprowadź odpowiednio: numer kolby formalina z fenoloftaleiną 3 cm 3 3 cm 3 3 cm 3 czas inkubacji pełnej mieszaniny inkubacyjnej 0 minut 5 minut 10 minut pełna mieszanina inkubacyjna 2 cm 3 2 cm 3 2 cm 3 Miareczkuj zawartość kolejnych kolb 0.02 mol/l roztworem NaOH do wystąpienia różowego zabarwienia. Oblicz ilość uwolnionych w procesie trawienia białka grup karboksylowych wiedząc, że objętość (cm 3 ) NaOH zużytego w czasie miareczkowania próbek odpowiada ilości grup karboksylowych zgodnie z następującą zależnością: 1 cm mol/l NaOH 20 µmoli grup karboksylowych. Obliczona dla uzyskanych w trakcie miareczkowania objętości NaOH wartość jest miarą aktywności trypsyny. Obserwacje i obliczenia: str. 4

5 Doświadczenie 4 Cel: Wykazanie aktywności laktazy. Laktoza (O-β-D-galaktopiranozylo-(1 4)-α-D-glukopiranoza, C12H22H11), tzw. cukier mleczny, zbudowana jest z pojedynczych cząsteczek galaktozy i glukozy, połączonych wiązaniem -1,4-glikozydowym. Nietolerancja laktozy z powodu obniżonej aktywności laktazy może być spowodowana: 1. wadą genetyczną 2. uszkodzeniem komórek śluzówki np. w wyniku działania leków, niedoboru białek (np. kwashiorkor). Oznaki nietolerancji laktozy spowodowane brakiem wchłaniania dwucukru to wzrost ciśnienia osmotycznego, gromadzenie wody w odcinku gastro-jelitowym, biegunka. Bakteryjny rozkład laktozy powoduje gromadzenie się gazów, takich jak wodór, dwutlenek węgla i metan, powodując skurcz i, wzdęcia, a ph kału jest kwaśne (należy unikać obecności laktozy w diecie). W buforze o ph 7.0 laktaza hydrolizuje laktozę do glukozy i galaktozy. O aktywności enzymu świadczy obecność glukozy, którą wykrywa się testem paskowym. Test oparty jest na reakcji oksydazy glukozowej utleniającej glukozę do kwasu glukonowego. Reakcji towarzyszy uwalnianie się nadtlenku wodoru, za pomocą którego peroksydaza utlenia znajdujący się na pasku chromogen. 4% roztwór glukozy 2% roztwór laktozy roztwór laktazy w buforze o ph 7.0 Przygotuj 2 probówki, podpisz odpowiednio jako: 1 i 2. Do kolejnych probówek wprowadź odpowiednio: numer probówki 1 2 4% roztwór glukozy 1 cm 3-2% roztwór laktozy - 1 cm 3 roztwór laktazy w buforze o ph cm 3 1 cm 3 Wymieszaj zawartość probówek i inkubuj w temp. 37 o C przez 15 min. Oceń, czy w badanych próbkach można stwierdzić obecności glukozy poprzez nałożenie kilku kropli mieszaniny reakcyjnej na pasek diagnostyczny. Obserwacje: str. 5

6 Doświadczenie 5 Cel: Oznaczanie zawartości witaminy C w homogenacie z owoców. Witamina C (kwas askorbinowy, E300, C6H8C6) jest pochodną węglowodanów. Jest koenzymem oksydoreduktaz, działając jako specyficzny donor wodoru (np. w syntezie kolagenu, adrenaliny, kwasów żółciowych). Jest ona niezbędna dla prawidłowego wchłaniania jonów Fe 3+ w przewodzie pokarmowym. Tabela. Zawartość witaminy C w wybranych warzywach i owocach. Rodzaj rośliny Zawartość witaminy C (mg/100g części jadalnych) pietruszka (liście) 178 papryka czerwona 144 brukselka 94 kalafior 83 kapusta biała 48 pomidor 23 ziemniak 14 cebula 6 czarna porzeczka 182 truskawka 66 cytryna 50 jabłka i banany 9 winogrona 5 Barwnik, 2,6-dwuchloroindofenol, w środowisku zasadowym wykazuje barwę niebieską, a w środowisku kwaśnym - różową. W wyniku redukcji przez witaminę C barwnik ten odbarwia się. Ilość kwasu askorbinowego w homogenacie owoców oznacza się miareczkując homogenat roztworem 2,6-dwuchloroindofenolu w środowisku kwaśnym, aż do uzyskania utrzymującego się różowego zabarwienia. roztwór kwasu fosforowego(v) w kwasie octowym roztwór wzorcowy witaminy C homogenat z owoców Przygotuj 3 małe kolbki Erlenmeyera i podpisz odpowiednio jako: O (próba ślepa), W (próba wzorcowa) i B (próba badana). Do kolejnych kolb wprowadź odpowiednio: roztwór kwasu fosforowego(v) w kwasie octowym oznaczenie kolbki O W B 1 cm roztwór wzorcowy witaminy C - 1 cm 3 - homogenat z owoców cm 3 Miareczkuj zawartość kolb 2,6-dwuchloroindofenolem, aż do uzyskania utrzymującego się różowego zabarwienia. str. 6

7 Oblicz zawartość witaminy C w owocu. Wiadomo, że w 1 cm 3 roztworu wzorcowego zawarte jest 0.12 mg witaminy C, a w 1 cm 3 homogenatu zawarte jest 0.2 g miąższu. Podaj wynik w gramach witaminy C/100g tkanki owocu. Wylicz zawartość witaminy C z następujących proporcji: ilość cm 3 barwnika zużytego na zmiareczkownie 1 cm 3 wzorca ilość cm 3 barwnika zużytego na zmiareczkownie 1 cm 3 homogenatu 0.12 mg witaminy. C X1 mg witaminy C Wyliczone X1 odpowiada ilości mg witaminy C zawartej w 1 cm 3 homogenatu. Do przygotowania 1 cm 3 homogenatu zużyto 0.2 g owocu, tak więc: X1 mg jest zawarte w 0.2 g owocu X2 mg jest zawarte w 100 g owocu X2 to zawartość witaminy C w owocu wyrażona w mg/100g tkanki. Podaj zawartość witaminy C w g/100g gramów owocu. Obserwacje i wyliczenia: str. 7