Wykład 2. Kinetyka reakcji enzymatycznych.

Transkrypt

1 Wykład 2 Kinetyka reakcji enzymatycznych.

2 Kofaktory enzymów wd_2 2

3 Ryboflawina witamina B 2 Ryboflawina wit. B 2 FAD dinukleotyd flawinoadeninowy wd_2 3

4 Niacyna witamina PP (B 3 ) NAD + dinukleotyd nikotynamidoadeninowy nikotynoamid kwas nikotynowy 2 P i NADP + wd_2 4

5 Kwas pantotenowy witamina B 5 Kwas pantotenowy 3 Koenzym A wd_2 5

6 Witamina B 6 pirydoksyamina Fosforan pirydoksalu - PAL pirydoksal wd_2 pirydoksyna 6

7 Witamina D - kalcyferol cholekalcyferol witamina D 3 ergokalcyferol witamina D 2 wd_2 7

8 Specyficzność względem wiązań (Phe) (Arg) (Asp) (Phe) Proteazy-hydroliza wiązania peptydowego Arg H 2 Gly Trombina Rozcina wiązanie Arg-Gly miejsce hydrolizy Chymotrypsyna, trypsyna, pepsyna chymotrypsyna (A) katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych położonych po karbonylowej stronie AA aromatycznych, trypsyna (B) wiązania położone po karbonylowej stronie Lys lub Arg, pepsyna (C) między AA aromatycznymi i AA dikarboksylowymi, wd_2 8

9 Międzynarodowa klasyfikacja enzymów. Klasa Typ reakcji Przykład enzymu 1 Oksydoreduktazy Utlenianie-redukcja Dehydrogenaza mleczanowa 2 Transferazy Przenoszenie grup Aminotransferaza asparaginianowa 3 Hydrolazy Reakcje hydrolizy Ureaza EC Liazy Utworzenia wiązań podwójnych poprzez dodanie lub usunięcie grup 5 Izomerazy Izomeryzacja, wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie grup 6 Ligazy Ligacja (połączenie) dwóch substratów na koszt hydrolizy ATP Anhydraza weglanowa Izomeraza triozofosforanowa Syntetaza glutaminowa wd_2 9

10 1. Oksydoreduktazy dehydrogenaza mleczanowa wd_2 10

11 2. Transferazy aminotransferaza asparaginianowa Glutaminian + szczawiooctan asparaginian + 2-oksoglutaran wd_2 11

12 3. Hydrolazy ureaza mocznik wd_2 12

13 4. Liazy anhydraza węglanowa CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 wd_2 13

14 5 Izomerazy: izomeraza triozofosforanowa wd_2 14

15 6. Ligazy syntetaza glutaminowa wd_2 15

16 Kinetyka reakcji enzymatycznych Przykład: anhydraza węglanowa: CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 zwiększa szybkość reakcji 10 milionów razy, jedna cząsteczka enzymu uwalnia cząsteczek CO 2 w ciągu 1 sekundy wd_2 16

17 Modele wyjaśniające wiązanie substratu S E S E ES ES Fischer model zamka i klucza Koshland model indukowanego dopasowania wd_2 17

18 Model Michealisa Menten opisuje właściwości kinetyczne wielu enzymów Założenia teorii Michealisa Menten: tworzenie się kompleksu enzym-substrat ES reakcja jednosubstratowa E + S k 1 k -1 ES k 2 E + P Vo równowaga [S4] [S3] [S2] stężenie molowe substratu [S] wielokrotnie wyższe niż stężenie molowe enzymu, utrzymuje się tzw. stan stacjonarny - stałe stężenie kompleksu ES przy zmieniających się stężeniach substratu (maleje) i produktu (wzrasta) czas [S1] wd_2 18

19 Model Michealisa-Menten k 1 k 2 E + S ES E + k 1 E enzym, S substrat, ES kompleks enzym substrat, P produkt, k 1, k -1, k 2 stałe szybkości reakcji Równanie Michealisa Menten: V o szybkość reakcji, V max wartość maksymalna szybkości reakcji, [S] stężenie substratu, K m stała Michaelisa stężenie substratu [S] (mol/dm 3 ), przy którym V 0 = ½ V max, a połowa miejsc aktywnych na enzymie jest obsadzona, miara stabilności kompleksu ES V 0 V o K m = V K P max m + [ S ] [ S ] a - reakcja 1 rzędu, b - reakcja o mieszanej kinetyce, c - reakcja zerowego rzędu wd_2 wd_5 [S] 19

20 Modyfikacja Lineweaveara Burke'a równania M-M = równanie wykresu podwójnych odwrotności V 0 szybkość reakcji V max wartość maksymalna szybkości reakcji, [S] stężenie substratu, K m stała Michaelisa 1 V 0 = 1 V max + K V m 1 max [ S] wd_2 20

21 Odstępstwa od modelu M-M Główne założenia teorii Michealisa-Menten: Enzym katalizuje reakcję z udziałem 1 substratu, powstaje 1 produkt: V 0 S + E ES E + P Reakcja E + P ES nie zachodzi (lub zachodzi bardzo wolno) Wykres zależności szybkości reakcji V 0 od stężenia substratu [S] jest hiperbolą K m [S] W rzeczywistości: Większość reakcji przebiega z udziałem więcej niż 1 substratu Enzymy allosteryczne (oligomeryczne) działają niezgodnie z kinetyką M-M, wykres zależności szybkości reakcji V 0 od stężenia substratu [S] ma kształt sigmoidalny wd_2 21

22 Wpływ ph na szybkość reakcji enzymatycznej wd_2 22

23 Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej wd_2 23

24 Sposoby regulacji szybkości reakcji enzymatycznej Zmiany stężenia substratu (1), produktów, enzymu (2) Odwracalne modyfikacje kowalencyjne enzymów fosforylacja, acylacja Enzymów nieodwracalne modyfikacje kowalencyjne enzymów proteoliza allosteria Zmiany szybkości syntezy białek enzymatycznych Zmiany szybkości degradacji enzymów Inhibitory i aktywatory Kompartmentacja w komórce 1 2 wd_2 wd_5 24

25 Modyfikacja kowalencyjna modyfikacje odwracalne - fosforylacja Ser/Thr (Tyr) ATP kinaza białkowa ADP Ser/Thr -P (Tyr) P i fosfataza białkowa H 2 O wd_2 25

26 Modyfikacja kowalencyjna cd N-koniec modyfikacje odwracalne acylacja N- końca lub reszty cysteiny w sekwencji białka kwasami tłuszczowymi N-mirystoiloglicyna-N-końca enzymu 14C S-palmitoilocysteina białka 16C Reszta cysteiny wd_2 26

27 Modyfikacja kowalencyjna Modyfikacja nieodwracalna - aktywacja zymogenowa Np.. insulina, trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna, kaspazy, elastazy, karboksypeptydazy, czynniki krzepnienia krwi Zymogen - chymoptrypsynogen (niektywny) Ser 14 -Arg 15 Thr 147 -Asn 148 trypsyna π-chymoptrypsyna (aktywna) π-chymoptrypsyna α-chymoptrypsyna (aktywna) wd_2 27

28 Regulacja allosteryczna ATP - aktywuje Enzymy oligomeryczne, w budowie więcej niż jedno miejsce: regulacyjne i katalityczne Struktura ATCazy, podjednostki zielone regulatorowe (R ), podjednostki niebieskie - katalityczne (C ) CTP - hamuje E: ATCaza karbamoilotransferaza asparaginianowa (I etap biosyntezy pirymidyn) asparaginian + karbamoilofosforan N-karbamoiloasparaginian + P i wd_2 28

29 Regulacja allosteryczna cd Enzymy oligomeryczne, w budowie więcej niż jedno miejsce: regulacyjne i katalityczne, Kinetyka Michealisa-Menten nie ma zastosowania Związanie substratu w jednym CA indukuje zmiany konformacji zwiększające powinowactwo innych CA do substratu (kooperatywność) Niewielka zmiana w stężeniu substratu zmienia istotnie aktywność E wd_2 29

30 sprzężenie zwrotne L-treonina Szlaków metaboliczne regulowane są na zasadzie sprzężenia zwrotnego (feed back regulation). Końcowe produkty szlaku metabolicznego są jednocześnie inhibitorami allosterycznymi enzymu - jednej z pierwszych reakcji danej drogi biosyntetycznej. Sprzężenie zwrotne ujemne. Jednocześnie brak w komórce końcowego produktu szlaku metabolicznego często prowadzi do aktywacji enzymu dla niego kluczowego (limitującego). Sprzężenie zwrotne dodatnie. A B C D E1 E2 E3 E4 E5 dehydrataza treoninowa L-izoleucyna Synteza izoleucyny. Inhibicja na zasadzie sprzężenia zwrotnego ujemnego dehydratazy wd_2 treoninowej. 30

31 Hamowanie aktywności enzymów - inhibicja Inhibitory nieodwracalne -OH -SH diizopropylofluorofosforan - DIPF HF Inhibitor: cząsteczka działająca na enzym, powoduje zmniejszenie jego szybkości katalitycznej, często są to metabolity, czasem ksenobiotyki: leki, toksyny Typy inhibicji: Odwracalna amid kwasu jodooctowego inhibitor wiąże się z enzymem szybko i odwracalnie Nieodwracalna nie można jej przezwyciężyć usuwając w prosty sposób inhibitor z enzymu (np. dializa) inhibitor często wiąże się z enzymem wiązaniami kowalencyjnymi wd_2 31 HI